Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

סריג הדמיה ב הידרוג תלת ממדי

doi: 10.3791/54135 Published: August 1, 2016
* These authors contributed equally

Summary

הדמיה תהודה העברת אנרגיה פורסטר (סריג) הוא כלי רב עוצמה עבור מחקרים בביולוגיה של התא בזמן אמת. הנה שיטת תאי הדמית סריג ב פיסיולוגי תלת ממדי (3D) microenvironments הידרוג'ל באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence הקונבנציונלי מוצגת. מניתוח עבור בדיקות ratiometric סריג המניב יחסי ליניארי על פני טווח ההפעלה מתואר.

Abstract

הדמיה של העברת אנרגיה תהודה פורסטר (סריג) הוא כלי רב עוצמה לבחינת ביולוגיה של התא בזמן אמת. מחקרים ניצול סריג נפוץ להעסיק דו מימדי (2D) תרבות, אשר אינו לחקות את microenvironment הסלולר תלת ממדי (3D). שיטה לבצע הדמיה רווה פליטת סריג באמצעות מיקרוסקופ קונבנציונלי widefield epifluorescence של תאים בתוך סביבת הידרוג'ל 3D מוצגת. הנה שיטה לניתוח עבור בדיקות סריג ratiometric מניב יחסי ליניארי על פני טווח הפעלת בדיקה מתוארת. מדידת רמות monophosphate אדנוזין מחזורית התאית (cAMP) מודגמת chondrocytes תחת גירוי forskolin באמצעות בדיקה עבור EPAC1 הפעלה (ICUE1) ואת היכולת לזהות הבדלי cAMP איתות תלוי בסוג החומר הידרוג'ל, בזאת הידרוג photocrosslinking (ג'ל PC, פוליאתילן גליקול dimethacrylate) וכן הידרוג'ל thermoresponsive (TR-ג'ל). בהשוואה לשיטות 2D סריג,שיטה זו דורשת עבודה נוספת קטנה. מעבדות כבר ניצול הדמיה סריג ב 2D יכול בקלות לאמץ שיטה זו לבצע מחקרים הסלולר בתוך microenvironment 3D. זה יכול להיות מיושם נוסף הקרנת סמי תפוקה גבוהה ב microtissues 3D המהונדס. בנוסף, זה תואם עם צורות אחרות של הדמית סריג, כגון מדידת אנאיזוטרופיה והדמית חי קרינה (FLIM), ועם פלטפורמות מיקרוסקופיה מתקדמות באמצעות confocal, פעם, או תאורה מווסתת.

Introduction

איתות הסלולר הוא גם מורכב תוצאתיים עבור בתחומים רבים, כולל פרמקולוגיה, הנדסת רקמות, ורפואה רגנרטיבית. כלים מחקריים שימושיים נדרשים כדי לקדם את ההבנה שלנו של ביולוגיה של התא לפתח חומרים אופטימלי לשחזור רקמות. הדמית תהודת העברת אנרגית פורסטר (סריג) היא כלי חיוני המאפשר ניתוח של הפעלת קולטן, קונפורמציה מולקולרית, ואינטראקציות מולקולריות (למשל., חלבון / DNA complexation) בתאים חיים. סריג הוא סוג של העברת אנרגיה הלא מקרין בין fluorophores 1. יש לו יעיל כי הוא ביחס הפוך הכח שישית של המרחק בין fluorophore תורם fluorophore acceptor. לשם כך היא יכולה לספק מידע על המרחק הפיסי בין שתי מולקולות שונות או בין אזורים של מולקולה אחת על בקנה מידה ננומטרי (בדרך כלל 1 - 10 ננומטר) 2. Fluorophores התורם acceptor עשוי להיות מ שונהסוגי olecule (סריג הטרו), שבו יש לתורם פליטת האנרגיה הגבוהה יותר (אורך גל קצר יותר), או מאותו הסוג (הומו-סריג). הדמית סריג יכולה להתבצע על תאים קבועים או לחיות, אבל באופן כללי תאים קבועים משמשים הדמיה של אינטראקציות מולקולריות ברזולוציה מרחבית גבוהה כאשר מערכות confocal במהירות גבוהה אינן זמינות. תאי חיים משמשים כדי לחקור אינטראקציות ותהליכים מעוכבים או הוחלפו על ידי קיבוע, כגון תאיים בזמן אמת איתות בתגובה 3.

מחקרי תא חיים מעסיקות סריג שימוש הדמיה דו ממדים (2D) תרבויות הסלולר בין שאר בשל פשטות רקע נמוך (לא פליטה מחוץ תאי מטוס). עם זאת, תרבויות 2D גם לשנות תהליכים תאיים רבים לעומת במיקרו-סביבה של פיזיולוגי תלת ממדי (3D) תרבות 4,5. לדוגמה, תא יליד תא ותא לאינטראקציות מטריקס הם שינו באופן דרסטי בתרבות 2D המוביל EASily נצפה שינויים במורפולוגיה תא קוטבי 6. Microdomains ממברנה (למשל., Caveolae ודוברות שומנים בדם) ואיתות קולטן מוסדר במידה רבה על ידי סביבת התרבות, בין שאר משום שהם לאגד רכיבי cytoskeletal 7,8 ואת מבנה צורת cytoskeletal תא מוסדרים במידה רבה על ידי סביבת התרבות מרחבית 9. Mechanotransduction אינה מושפעת רק על ידי מטריקס 3D, אלא על ידי תנאי הטעינה משני המורכבים יותר הולידה בסביבות 3D בהשוואה לתרבויות 2D 10. לבסוף, את החדירות של מטריצות 3D היא פחות מדיום התרבות, בכלל עם ירידת דיפוזיה מוגברת עקדת תא מולקולות איתות בהשוואה לתרבויות 2D. עם תרבויות 3D אחד הוא מסוגל ליצור וצפה microenvironment דומה יותר הפיזיולוגי ביחס דבק, כימי, רמזים מכאניים. תא אינטראקציות תא ניתן לקדם את מאפייני ההדבקה ניתן לשלוט wה- i מבנה, רכב, והאדריכלות (דפוסים) של חומר 3D 11-13. התכונות המכאניות של החומר ניתן להתאים גם על ידי 14,15 הרכב והמבנה. Culturing תאים הידרוג ולכן היתרי סריג מחקרים על תאים ראשוניים שאחרת דה להבדיל או שינוי פנוטיפ באמצעות טכניקות קונבנציונליות, למשל., תאי סחוס במפרק. לפיכך, שיטה נדרשה כדי לאפשר מבחני סריג בתרבויות 3D לחיות.

פיגומים הידרוג'ל הם אידיאליים עבור מחקרים המבוססים 3D סריג כי הם יכולים להיעשות אופטיים שקופים ומותאמים לשלוט microenvironment ולספק רמזים הסלולר. הידרוג עשוי פולימרים טבעיים שמש תרבית תאים במשך עשרות שנים, כוללים ג'לטין הפיברין 16. שליטה רבה יותר על המיקרו-סביבה הסלולר ניתן להשיג עם שינוי כימי של פולימרים אלו ועם השימוש בפולימרים סינתטיים 17,18. hydrogel נוקשות מכנית וחדירות יכול להיות נשלט על ידי שינוי המבנה פולימריות שלהם ואת רשת גודל (פולימר וצפיפות crosslink) 19,20. יתר על כן, ניתן לבצע הידרוג ביו, באמצעות שילוב של גורמי גדילה הליגנדים הסלולר. בגלל האפשרויות הללו, ההתפתחות הידרוג עבור biosensing, אספקת סמים, ויישומי הנדסת רקמות היא אזור מאוד פעיל של מחקר 21. הדפסה של הידרוג 3D גם עוברת פיתוח עבור ייצור של רקמות מיקרו -organs 15. לפיכך, סריג הדמיה של תאים הידרוג הוא לא רק שימושי כאמצעי משוער התנהגות הסלולר פיזיולוגי, אלא גם ככלי ללמוד לייעל צמיחה רקמות מהונדסות.

בדיקות סריג ratiometric בינארי הן מאוד שימושיות בלימוד איתות הסלולר יכולות להיות מנוצלות בתרבויות הידרוג'ל. לקבלת רשימה חלקית של פלורסנט שפורסמו סריג בדיקות, ראה באתר Consortium נדידת תאים (למשל., עקדת יון או מולקולה, מחשוף האנזימטית של האזור), שמשנה את המרחק בין fluorophores ולכן גודל הסריג (לחיוב או לשלילה) 23. סימן פחות סוג בדיקה נפוץ עדיין שימושי מסתמך על שינוי אנליטי רגיש חפיפה ספקטרלית של שני fluorophores, אשר משנה גודל סריג. "Single-שרשרת" בדיקות ratiometric לנצל זוג fluorophore צמוד על מולקולה בודדת. "Dual-שרשרת" בדיקות לנצל זוגות fluorophore על מולקולות נפרדות, אך הביטוי שלהם ניתן בשילוב באותם קלטת ביטוי 24. בשונה ממחקרים עם ביטוי fluorophore היחיד (למשל., חלבוני היתוך ניאון), מחקרים עם ratiometricבדיקות סריג אינם דורשים transfection כפול לשלוט ליעילות transfection או כדאיות התא. בדיקות ratiometric סריג הם רגישים יחסית יעילות transfection כאשר הביעו מעל סף מינימום (ריכוז רגיש) 23,25. הם אינם רגישים לתנודות מקור עירור וגורם סביבה תאית אחרים (למשל., PH, יונים) כל עוד שני fluorophores מגיב באופן דומה. בנוסף, התגובה שלהם אינה כפופה עיכוב תעתיק, בניגוד פלורסנט אמרגן-כתב bioluminescent בונה 26,27.

בדיקות ratiometric סריג הן בקלות מועסקת לעתים קרובות במערכות מיקרוסקופ קונבנציונליות widefield epifluorescence. מיקרוסקופי widefield עדיפים על פני מערכות confocal סריקת קו הדמית תא חייה בגלל חשש עלות מערכת, הלבנת fluorophore, ואת כיבושה שינויי אות עם רזולוציה של זמן מספיק. בנוסף, אנאלי תא בודדיסיס על אוכלוסייה גדולה של תאים אפשרי עם לכידת במה ותמונה ממונעת מעל שדות מרובים של נוף. מיקרוסקופיה widefield דורשת ניתוח מבוסס עוצמת האותות החלליים הטרו-הסריג. למרות ניתוח עוצם אינו דורש חומרה מורכבת כמו שיטות סריג אחרות, יותר עבודה שלאחר רכישה יש צורך לתקן את ההשפעות של התנהגויות fluorophore ותצורות מערכת מיקרוסקופ / הדמיה 28. עוצמת פליטת בשבי של fluorophore היא פונקציה של אנרגית העירור, Fluorophore תשואה קוונטית, ואת המסנן המשולב מצלמה / רגישות ספקטרלית גלאי ליניאריות 2. אלה עשויים להיות שונים עבור התורם acceptor ידרוש כיול עבור ניתוח כמותי. בנוסף, הדמיה של פליטת acceptor מושפעת חפיפה ספקטרלית של fluorophores (עירור של acceptor ידי אור עירור התורם לדמם דרך של פליטת התורם לתוך ספקטרום פליטה acceptor) 2.4; Single-שרשרת "בדיקות הן פנימי מנורמל כי fluorophores שלהם הם equimolar ב הננומטרי, בעוד fluorophores של" כפול שרשרת "חלליות יכולה להתקיים בבית stoichiometries שונים ברחבי תא 25,28 אם fluorophores של." שרשרת אחת " בדיקות הן של בהירות דומה (פונקציה של מקדם הכחדה ואת תשואת קוונטים), את ההשפעות של רגישות גלאי שאינו ליניארי הן תיקון קטן ורק עבור הקרינה רקע ואת רגישות תשואה / גלאי קוונטים המצמידים נדרשת 23. לפיכך "חד שרשרת" בדיקות ratiometric סריג מיושמות ביותר בקלות במיקרוסקופ widefield 24.

מאמר זה מתאר טכניקה פשוטה לבצע הדמיה סריג של תאים חיים בתרבויות הידרוג'ל 3D באמצעות מיקרוסקופ epifluorescent widefield קונבנציונאלי. זה יכול לאמץ בקלות על ידי מעבדות כבר בביצוע ניסויי סריג ב 2D, כמו גם מעבדות מעוניינות היתראיתות הסלולר microtissues. כאן אנו מדגימים את השיטה עם מדידה מבוססת הדמית סריג של monophosphate אדנוזין המחזורי (cAMP) רמות chondrocytes חי בתוך photocrosslinking (PC-ג'ל, dimethacrylate פוליאתילן גליקול) ו thermoresponsive (TR-ג'ל, Matrigel) הידרוג. בדיקת סריג ratiometric נוצל מבוסס על EPAC1 (ICUE1) כדי לזהות רמות cAMP בתגובת forskolin, אגוניסט כימי cyclase adenylyl אשר מזרז את ההמרה של ה- ATP ל cAMP. מחנה הוא אחד השליחים השניים העיקריים בתיווך איתות קולטן המצומד לחלבון G וזה מפעיל גורמים שונים, כוללים חלבוני חליפין במורד זרם מופעלים ישירות על ידי cAMP (EPACs). Fluorophores מתרחק על cAMP מחייב את תחום EPAC וכתוצאה מכך ירידת הסריג. המתואר כאן הוא הכנת החומרים הידרוג'ל, transfection התא עם החללית ICUE1, והטבעה של התאים הידרוג 3D. הליך ניסוי 3D הסריג ועל ניתוח התמונה הכרחילשם הערכת פעילות חללית לכל תא מוסברת. כמו כן נדונו ולמגבלות של ניתוח הסריג ב 2 ד ו 3D באמצעות מיקרוסקופ widefield. הטכניקה המוצגת כאן היא שיפור לעומת השיטות 2D הקיימים מאז שהוא מאפשר ניתוח בהקשר פיזיולוגי יותר ודורש תיקון תמונה פחות וכיול. שירות גדול טמון בעובדה כי חומרים שקופים רבים ניתן להשתמש בם תוך העדפות תא transfection יכולות להישמר.

Protocol

1. חומרי הכנה

  1. הכן dimethacrylate פוליאתילן גליקול (PEGDM, 4,000 MW) על ידי methacrylating פוליאתילן גליקול פי השיטות שתוארו על ידי לין-גיבסון et al. 29. לחלופין, ניתן לרכוש PEGDM.
  2. לסנתז את photoinitiator, ליתיום פניל-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP), באמצעות תהליך בן שני שלבים שבהם phenylphosphonite דימתיל הראשון הוא הגיב עם choride 2,4,6-trimethylbenzoyl באמצעות תגובה מיכאליס-Arbuzov ואז מלח ליתיום נוצר על ידי הוספת ליתיום ברומיד ב-butanone 2, בהתאם אל Majima et. 30.
    הערה: לחילופין, photoinitiators ניתן לרכוש אך LAP תערוכות biocompatibility טוב crosslinking יעילות 31.
  3. Functionalize coverslips זכוכית לאפשר מליטה של ​​הידרוג'ל לזכוכית ובכך למנוע תנועה במהלך ההדמיה.
    1. במנדף כימי עם ציוד מגן אישי נכון, שימוש3- (Trimethoxysilyl) methacrylate propyl פי פרוטוקול של היצרן עבור-ג'לים PC ו silanes אפוקסי (3-Glycidoxypropyltrimethoxysilane) עבור TR-ג'לים 31. הערה: לחילופין, מגלשות precoated ניתן לרכוש. שים לב להחליק את המכסה חייב להיות גדול יותר גם של המנה PDMS בשלב 3.8.

2. Transfection הניידים

  1. במנדף בתרבית רקמה ושימוש בטכניקות סטריליות, הפשרת צלחת התאים הרצויים במהירות תת-confluency (50 - 70%), בזאת chondrocytes שור ב 15,000 תאים / 2 סנטימטר ב 6-היטב מנות התרבות שאינם מטופלים. הערה: כל סוג תא רלוונטי ניתן להשתמש, כולל תאים עצמאיים למעגן.
    1. אפשר תאים להתאושש במשך יום אחד באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס. לפני הצעדים הבאים, להסיר בינוני, לשטוף עם PBS, ולהוסיף 2 מ"ל phenol- ואת סרום ללא בינוני לכל טוב.
  2. למחרת עבור כל טוב, ולהוסיף 100 μl של מדיום phenol- וסרום-חופשי, כמו גם 3מגיב transfection μl אל מבחנת זכוכית autoclaved. לערבב, לנער את הצינור בקלילות. לדגור על RT במשך 5 דקות. להגביל את כל חשיפה לאור.
  3. הוסף 1 מיקרוגרם סריג בדיקת DNA ולנער קל. דגירה את התערובת על RT והרחק מן האור למשך 30 דקות.
    הערה: פלסמיד הניסוי ICUE1 זה (באדיבות ד"ר ג'ין ג'אנג 33) היה בשימוש. Fluorophores ב ICUE1 הם חלבון פלואורסצנטי ציאן (CFP, התורם) ו חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP, acceptor). היחס מגיב transfection כדי פלסמיד דנ"א יצטרך תקנון transfection האופטימלי של סוגי תאים שונים.
  4. הפץ את התערובת המוכנה (~ 104 μl) טיפה חכמה לכל אחד 6 בארות המכילות תאים בתוספת 2 מיליליטר של phenol- ובינוני סרום ללא. אל pipet מעלה ומטה. מערבולת בעדינות את הצלחת לערבב.
  5. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. הערה: confluency מעכב יעיל transfection ושינה ביטוי אנדוגני של קולטנים.

3. ייצור שלתבניות PDMS ליציקת הידרוג'ל ותרבות

  1. כדי להכין שקופיות זכוכית גדולות להטיל את polydimethylsiloxane (PDMS) על, לנקות את הכוס ראשונה עם סבון, לשטוף עם כמות מים בשפע, ולאחר מכן יבשה עם isopropanol ואחריו אוויר.
    1. פנק את הכוס עם ריאגנט siliconizing לפי הפרוטוקול של היצרן כך PDMS ניתן קלף בקלות אחרי הריפוי. לשטוף מגיבים שיורים מעל פני השטח עם טולואן מעל מיכל אגירה. יש לאפשר למשטח האוויר להתייבש לחלוטין לפני או להשתמש בחום של 100 מעלות כדי לקצר את זמן ההמתנה.
  2. בחר בגובה הידרוג'ל (למשל, 1 מ"מ) ולחשב פי 1.2 מהיקף PDMS הדרוש כדי לכסות את השקופית זכוכית עם PDMS של עובי זה באמצעות ממדים של שקופיות הזכוכית וגובה הידרוג'ל. הערה: PDMS אינו נרתע.
    1. מערבבים את מרכיבי ערכת PDMS ב 10: יחס 1 לפי משקל בכוס. ברגע שזה מעורבב היטב, מניח את הכוס תחת ואקום בית הדגה. relieve הוואקום אם בועות להתחיל לגלוש המיכל וחזור.
      הערה: בעוביים הידרוג'ל אחרים עשויים לשמש, אך במחיר של רקע גדילה וגדילה אטים אם צנטריפוגה (שלב 6.2) אינו בשימוש.
  3. עוטפים בנייר אלומיניום ברחבי הבסיס דפנות הכוס להכיל את PDMS. יוצקים בזהירות את הכמות הרצויה של PDMS degassed על זכוכית זה מוקף רדיד. מדדו את גובה PDMS. זכור כי הגובה של PDMS יהיה הגובה המקסימאלי של הידרוג'ל. אם בועות כל נוצרות כאשר ממוזגים, דגה שוב או פופ אותם עם מרית או מחט.
  4. מניחים את PDMS דפוקה על משטח ישר בתנור על 100 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות, או להשאיר ב RT למשך 24 שעות.
  5. מוציאים בזהירות את PDMS מפני השטח ברגע שהוא ריפא. פונץ 'את הצורה הרצויה (למשל, ניקוב גלילי של 3 מ"מ) עבור הידרוג.
    הערה: Photocrosslinking יניב צר מעט בלוני PC-ג'ל מאשר קוטר העובש בשלמרווה של התגובה על ידי חמצן מולקולרי של PDMS.
  6. לעקר את PDMS אגרוף. בניסויים בטווח הקצר, לצלול PDMS באתנול 70% במשך שעה 1.
  7. הרכב את התבנית על ידי התאמת הבסיס של PDMS מעוקר עם coverslip זכוכית סטרילית בעובי המתאים תיקון מיקרוסקופ האובייקטיבי. מניחים בצד לשימוש שלב 6.
  8. לפברק צלחת PDMS גדולה באמצעות השיטות לעיל (עם רחב יותר טוב גבוה יותר הידרוג'ל) להכיל את הידרוג'ל ובינוני. להכיל נפח בינוני לפחות 10x יותר הידרוג'ל לטבול את הידרוג'ל ולמזער דילול של חומר אנליטי.

4. הכנת פתרונות מבשר הידרוג'ל

  1. במנדף בתרבית רקמה ושימוש בטכניקות סטריליות, להכין את המתאים פתרונות מבשר הידרוג'ל לחקר מיד לפני הוספת תאים. כן-ג'ל PC מן מבשר הפולימר כדלקמן.
    1. מערבבים אבקת PEGDM לתוך בופר פוספט (PBS, pH 7.2) בשעה 10% (w / v).
    2. מוסיפים את photoinitiator (למשל, LAP) בריכוז סופי של 0.005 - 0.01% (w / v) ומערבבים על ידי pipetting. מכסה את הפתרון בנייר כסף או מגן אלומיניום מן האור כמו LAP הוא רגיש לאור.
      הערה: כאן מטריקס TR-ג'ל מופחת צמיחת הגורם משמש כפי שסופק על ידי היצרן.

5. השעית תא פתרונות הידרוג'ל

  1. במנדף בתרבית רקמה ושימוש בטכניקות סטריליות, לשאוב את המדיום מהבארות.
  2. להוסיף PBS על הבארות ולאחר מכן סר לשטוף monolayers תא מצורף ביסודיות.
  3. לנתק את התאים מן המצע התרבות באמצעות 2 עד 3 מ"ל לכל 25 ס"מ 2 של פתרון התא דיסוציאציה. רוק בעדינות, ואז לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 - 20 דקות או עד ניתק. בתוקף להקיש צלחת במידת הצורך כדי לסלק תאים.
    הערה: פתרונות תא דיסוציאציה חלופיים זמינים עם מבחר מוגבל כאלו שלא אניmpact את מסלול איתות תחת ניתוח על ידי ביקוע קולטנים של עניין.
  4. אחרי התאים מנותקים, להוסיף 2 מ"ל של מדיום phenol- ואת סרום ללא, להשעות את התאים, ולספור תאים עם hemocytometer. הערה: בינוני חופשי בסרום הגדרה כימית (למשל, השלימו עם אינסולין, transferrin וסלניום) עשוי לשמש גם.
  5. Aliquot את המספר הרצוי של תאים בהתבסס על סוג התא לתוך צלוחיות סטריליים גלולה (למשל, 2.0 x 10 6 תאים לכל בקבוקון).
  6. הסר את supernatant, להוסיף נפח הרצוי של מבשר הידרוג'ל ו להשעות את התאים על ידי pipetting. השתמש נפח מבשר שיניבו 2 x 10 5 תאים / 2 ס"מ במישור xy כאשר לדמיין את ציר z של הידרוג'ל כמו קרס (למשל, 1.0 מ"ל לכל בקבוקון עבור הידרוג'ל 1 מ"מ עובי המכיל 2 x 10 6 תאים / מ"ל). יש להיזהר שלא לייצר בועות.
    1. במהירות לעבור לשלב הבא כדי להגביל את ההשפעות השליליות על 34 כדאיות התא </ Sup>.

6. הכנת הידרוג'ל

  1. במנדף בתרבית רקמה ושימוש בטכניקות סטריליות, מוסיף את מבשר הידרוג'ל המכיל תאים אל תבניות היציקה מוכנות בשלב 3 (למשל, 7.1 μl לכל בקוטר 3 מ"מ x 1 מ"מ גבוה עובש). צור הידרוג'ל נוסף, על פי אותו השיטות שתוארו, להשתמש לצורך כיול מערכת הדמית מיקרוסקופ לחקור כיול (אם יעילות הבדיקה הגלומות אינן ידועות).
  2. צנטריפוגה מבשר הידרוג'ל המוכן המכיל תא לפני gelation / crosslinking לייעל הדמיה ידי כליאה לתאי מטוס בודד מוקדים ומזעור מתוך אות מטוס (איור 1). התאם זמן צנטריפוגה וכוח לסוג התא וצמיגות של המבשר (400 גרם במשך 4 דקות).
  3. ג'ל או crosslink הפתרון
    1. עבור הידרוג'ל PC-ג'ל, מקרין את המבשר המכיל תאים עם UV-A מקור אור (λ = 365 ננומטר) עבור זמן חשיפה שווה3.2 J / cm 2 לכל עובי מילימטר photocrosslink.
      הערה: השתמש בעובי מינימלי 1 מ"מ בחישוב. כיוונים צריך ליפול בטווח 1-5 דקות. השתמש זמן החשיפה למינימום. הימנע יתר irradiating התאים כמו זו פחתה כדאיות להלבין את תורם CFP. עם זאת, פעמי חשיפה פחות מ 60 שניות אינן מומלצות בשל קרינה בעצמה גבוהה מובילה מרווה עצמית רדיקלית כדאי תא עני.
    2. עבור הידרוג'ל TR-ג'ל, למקם את התבנית מולא בצלחת פטרי ולעבור באינקובטור כדי gelate תרמית. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  4. לאחר gelling או crosslinking הידרוג, להסיר את תבנית ליהוק הידרוג'ל PDMS ולהחליף אותו עם צלחת PDMS המוכנה הגדולה (משלב 3.5). לחצו על PDMS למטה על משטח הזכוכית עם מרית סטרילי כדי להדביק אותו.
    1. מניחים זה PDMS צלחת עם coverslip לתוך מיכל סטרילי, כגון צלחת פטרי. הוסף בינוני סרום ללא פנול-חינם או כימי מוגדר ליdium (בינוני חופשי בסרום בתוספת אינסולין, transferrin וסלניום (שלב 5.4)) אל נוצר היטב עם המנה coverslip PDMS לשמור על הידרוג'ל שקוע. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
      הערה: אם אתה משתמש מנה מיוחדת עם coverslip, ולאחר מכן למקם את coverslip בכך ובדומה להוסיף בינוני.
    2. לחלופין, לבצע שלב זה היום לפני הדמית הסריג לאפשר הבדיקות להתאושש כמו אורכי גל קרינת החפיפה עם ספקטרום עירור תורם CFP.

7. הדמיה 3D סריג

  1. מוציאים את המאפה PDMS עם הידרוג'ל מצלחת פטרי, מוכן בשלב 6.4, ולאבטח אותו בעל הדגימה מתכווננת הבמה מיקרוסקופ XY (איור 2). מקם את מחזיק הדגימה על הבמה מיקרוסקופ. החל שמן אל המטרה במידת הצורך. השתמש מטרה של לפחות 40X ושל צמצם מספרי גבוה (NA) (כלומר, 1.3 NA) כדי ללכוד את fluorophor החלש יחסיתפליטת ה.
  2. הגדר את שדות מבט (FOVs) לרכישת תמונה: בחרו את תאי הדמיה באמצעות דימות אור המועבר ולאמת transfection עם דימות פלואורסצנטי. בחר לפחות 15 תאים שונים.
    1. בחרו את תאים כי הם לא בהירים מדי ולא עמומים מדי (שעלולים להוביל בדיקת הצפת יתר או רגישות נמוכה) ועם יחס הסריג בין 0.0 ו -1.0 (אשר אחרת מציין ניזק או ריקבון של החללית בינארי). ואז לכבות את האור כדי להגביל את החשיפה.
    2. FOVs בחר קרוב למרכז של הידרוג'ל ועם התאים בעלי עניין בתחום התאורה השטוח יחסית (ראה איור 3B ו שלב 9.2 להלן).
  3. הגדר את גדרות מצלמה עבור ערוצי תמונת סריג. תוכל לבחור בין מספר תאים בסמוך למרכז של FOV כדי לייעל את "תצורות אופטיות" (כלומר., חשיפה ורווחת לכל ערוץ תמונה).
    הערה: המינוח מתחת משתנה תלוי,g על תוכנה המשמשת לתפעול מיקרוסקופ ומצלמה. תוכנת מיקרוסקופ, ש"ח- Elements, משמשת כאן עבור לכידת תמונה וניתוח.
    1. לניתוח סריג של בדיקות שרשרת אחת, לבחור שני ערוצי תמונה לכל FOV: פליטת רווה (QE), המהווה את פליטת התורם תחת עירור תורם ופליטה המקבל תחת עירור acceptor (AEM).
      הערה: החללית CFP-YFP ICUE1, עירור CFP ו מסנן פליטה זוג עבור QE (418 - 442 לשעבר, 458 - 482 em) וכן עירור YFP ופליטה זוג עבור AEM (490 - 510 לשעבר, 520 - 550 em) משומשים.
    2. הגדר את החשיפה עבור QE ו AEM לרכוש את עוצמת האות המרבי ללא רוויה (ואם באמצעות CCD, עם רווח מינימלי) כדי למזער את הרעש ברקע. שמור על התצורות האופטיות זהה עבור שני fluorophores ו לאורך הניסוי, כמו גם בקרב קבוצות ניסוי כדי למנוע הטיית התוצאות (כלומר, כוח העירור, גודל איריס, חשיפה, ורווח מצלמה) (איור3A יור).
    3. רוכש ערוצי תמונה נוספים כדי לאפשר אפשרויות ניתוח יותר לאחר הרכישה (למשל, פליטה רגישה תיקן (CSE הדמיה) (ראה דיון)). עבור חללית CFP-YFP ICUE1, לרכוש את העירור (Ex) ופליטה (Em) ערוצי תורם אקס - תורם Em (QE, בחר CFP-CFP בתוכנת מיקרוסקופ), תורם אקס - acceptor Em (SE, CFP- בוחר YFP), acceptor אקס - acceptor Em (AEM, בחר YFP-YFP), ואת acceptor אקס - התורם Em (YFP-CFP) תצורות (ראה איור 3 א).
  4. הגדר את שיעור ללכוד לרכישת התמונה זמן לשגות.
    1. להקטין את השיעור ללכוד אם מוגבל על ידי החומרה. עבור מבחני בטווח הקצר (למשל, 30 - 60 דק '), מציינים כ -12 רכישות לדקה לכל FOV (קצב הדגימה 5 שניות) כדי ללכוד קינטיקה איתות. השתמש בקצב הדגימה המינימלי הדרוש כדי למנוע משמעותיficantly photobleaching החללית.
    2. הגדר את קצב הרכישה ידי הקלדת המחזוריות של הלוכדת בתוכנת מיקרוסקופ. עבור מבחנים לטווח ארוכים (למשל., 24 שעות), להתחיל עם רכישה בשיעור הגבוה כדי ללכוד את התגובה הדופקת הראשונית ולאחר מכן לעבור רכישה בשיעור נמוך, למשל, כל 5 עד 10 דקות.
  5. בחר באפשרות "הפעל כעת" בתוכנת מיקרוסקופ ליזום תמונות רכישה לכידות תמונה במשך 5 דקות כדי לקבוע קו בסיס לתגובת בדיקה בבית FOVs המיועד.
  6. אחרי 5 דקות של רכישת תמונה, pipet ב אנליטי אגוניסט או אנטגוניסט הרצוי (למשל, Forskolin ב 100 ננומטר), ומערבבים על ידי pipetting, ולהמשיך הדמיה.

8. כיול סריג

  1. כיול מערכת: השתמש הידרוג'ל כיול הנוסף, מפוברק כמתואר בשלב 6, לרכוש תמונות AEM של לפחות 6 תאי נציג באמצעות אותם הקריטריונים FOV, תצורות אופטיות, וערכת מצלמהטינג המשמש סריג הדמיה לעיל (שלבים 7.1, 7.2, ו -7.3).
    הערה: כימות של תשואת הקוונטים והרגיש ספקטרלי (QS) עבור בדיקה המשולבת מיקרוסקופ הדמיה דרוש "מוחלט" סריג ניתוח אבל לא עבור "קרוב" סריג.
    1. Photobleach את fluorophore acceptor על ידי בחירה בחשיפה ארוכה 5 דקות אל אור העירור בעצמה מלאה (עירור בערוץ AEM). השתמש בצמצם יחסית סגור כדי להלבין רק את התאים של עניין. ודא כי אות AEM הוא לפחות 10% נמוך יותר מאשר האות המקורי על ידי השוואת היסטוגרמה עוצמת האות (חלון "LUT") לפני ואחרי photobleaching. המשך photobleaching אם אובדן אות הוא פחות מ -90%.
      הערה: ודא fluorophore מתורם הזר אינו מולבן במהלך הליך זה באמצעות מסנני עירור AEM שאינו חופף עם ספקטרום העירור התורם.
    2. תורם פליטה רוכש תחת עירור תורם עם fluorophore acceptor שהולבן (Dem) לנוing בתצורה אופטית זהה עבור QE בשלב 7.3.
    3. חישוב QS לפיקסל כמו Dem מחולק AEM לאחר תיקון הרקע, כמו בסעיף 9 להלן. QS = Dem / AEM
    4. חישוב ממוצע QS בין התאים מן הממוצעים הסלולר.
  2. להעריך את יעילות הסריג הטבועה של החללית (EI) באמצעות מדגם הכיול. להשרות מקסימלית סריג של החללית ולחשב Ei = 1 - QE / (AEM x QS) כאמור בסעיף 9 להלן. לחלופין, להשתמש Ei = CSE / AEM, או Ei מחושב באמצעות assay קצה קונבנציונלי עבור סריג יעיל עם Ei = 1 - (QE / Dem).
    הערה: Ei נדרש לכמת את השבר המוחלט של בדיקות מופעלות (FAP, כלומר, חלק של בדיקות מחייב אנליטי), אך לא הכרחי "קרוב" סריג ניתוח.
    1. להרוות בתגובת בדיקה על ידי גירוי התרבות עם אגוניסט של הפעלת ייצור אנליטי / עבור בדיקות המגבירים ב סריג על אינטראקציה עם אנליטי.
    2. לעכב בדיקת interaction עם אנליטי באמצעות אנטגוניסט של איתות עבור בדיקות כי ירידת סריג על כבילת אנליטי. הערה: במקרה של החללית ICUE1, לדכא רמות cAMP עם מעכבי cyclase adenyl כגון 2 ', 5'-Dideoxyadenosine (ספציפי) או 3-isobutyl-מתיל-xanthine (לא ספציפי).

9. חישוב יחס סריג

  1. צייר לייעד אחד באזור של עניין (ROI) לכל FOV ליד התאים כדי להגדיר את רמת רקע (איור 3B) בכל FOV לאורך זמן, אך להגביל את ההחזר על ההשקעה לאזור של תאורה הומוגנית יחסית לאורך מרכז התמונה (איור 4 א ). ראה דיון הסבר אפשרויות תיקון ברקע.
    1. בעזרת תוכנת מיקרוסקופ: בחר בחץ על "אייקון ROI רקע" ובחר "צייר ROI רקע הסגלגל" (צורות אחרות תעבודנה). ודא כי "שמור עדכון רקע אופסט" מסומן. הפעל vieכנף של ROI רקע על ידי לחיצה על סמל ROI רקע. לחלופין, השתמש "אייקון ROI" ואת מאפייני ROI להגדיר בתור "השתמש כמו ROI רקע" ו "ROIs שונה בכל מרובות".
    2. עם ImageJ: השתמש בסרגל הכלים כדי לבחור את כלי ציור המעגליים. לאחר מכן להוסיף את הצורה למנהל ROI דרך התפריט "נתח → כלי → מנהל ROI". גדר בצבע שונה עבור ROI רקע במנהל ROI אם תרצה בכך.
    3. עבור כל ערוץ FOV ותמונה (למשל, QE ו AEM), להפחית את הערך הממוצע בתוך ROI רקע שידורי נקודת זמן כדי ליצור תמונת תיקן לכל ערוץ, למשל, לא SQE, p = QE t, p - t bQE, עמ ' כאשר t הוא הזמן הרכישה, p הוא FOV (כלומר, העמדה XY), ו bQE ו bAem הם הערכים סקלר של האות בתוך ROI רקע. השתמש פעולות חשבוניות התמונה זמינות בתוכנה.
      1. Wה- i התוכנה מיקרוסקופ, השתמש "אייקון רקע ROI" ובחר "רקע פחת שימוש ROI". בחלון המוקפץ, בחר "כל תמונה" תחת "ROI רקע פחת על" ובחר "כל המסגרות" תחת "החל על".
        הערה: ROI רקע חייב להיות מוגדר בכל FOV עבור בפונקציה זו כדי לעבוד כמו שצריך (למשל, הפונקציה אינה מפחיתה רקע כראוי FOV עם ROIs רקע אם יש כמה FOV ROIs רקע מוגדר.).
      2. עם ImageJ, השתמש "חיסור BG מהחזר ROI" מאקרו נכתב על ידי מייקל Cammer (http://microscopynotes.com/imagej/macros/).
    4. שמור את סדרת הזמן המתוקנת של תמונות על ידי בחירה באפשרות "שמור בשם" על צעדי הניתוח הבאים.
  2. הגדר ROI סביב התא באמצעות מסיכת בינארי עבור כל תא תחת ניתוח בכל FOV (איור 4B). השתמשו בערוץ AEM לסף התמונה לכל FOV על o תחילתf הניסוי, לזהות את גבולות התא, והגדיר את ROIs. שמור את ROIs.
    1. בעזרת תוכנת מיקרוסקופ: עבור כל מסגרת (כלומר, FOV), ראשון להשתמש בתפריט "בינארי → גדר סף" ובחר "חל על מסגרת נוכחית". התאם את ערך הסף התחתון כדי לבחור את התאים. ואז להשתמש בפונקציה "סגור → בינארי" למלא חורים המסכה בינארי במידת הצורך. הבא השתמש בסמל ROI כדי לבחור "בינארי העתק ROI"; שכבת בינארי נמחקת אוטומטית.
      1. צרף ROIs עבור מסגרות לאחר המאגר הקיים של ROIs. מחק את כל ROIs מזויף. הבא "לחצן ימני" על ROIs ולוודא תכונותיהם הם "משתמשים כמו ROI הרגיל" ו "ROIs שונה בכל מרובות".
      2. עם ImageJ: עבור כל FOV, הראשונה להשתמש בתפריט "תמונה → התאם → סף". לאחר מכן השתמש "נתח → לנתח חלקיקים" עם קווי מתאר הצג הוסף מנהל הנבחר. להשתמש"סגור → בינארי" למלא "חורים" המסכה בינארי במידת הצורך. מחק ROIs מזויף. תוספים חינם זמינים כדי להפוך את התהליך הזה.
  3. חשב את יחס סריג מבוסס QE על כל פיקסל, SQE / Saem לניתוח יחסית (ראה שלב 10) ו- E QE = SQE / (QS x Saem) לניתוח המוחלט (ראה שלב 10) עם QS שהושגו בשלב 8.1. השתמש בחלוקת נקודה צפה של תמונות. ראה פרטים בפרק דיון הסבר על נגזרות היחס.
    1. בעזרת התוכנה מיקרוסקופ: השתמש "תפעול תמונה → תמונה" בתפריט ובחר "נקודה צפה".
    2. עם ImageJ: השתמש באחת הפונקציה "תהליך → תמונה מחשבון" או תוסף "Calculator_Plus.java". הערה: לחילופין, המאקרו "pH_ratioMacro" .txt "עשוי להיות מותאם כדי לחשב את יחס סריג היא מעסיקה המאקרו תיקון הרקע שתוארו לעיל והוא זמין.
  4. יצא את היחס הממוצע לכל תא (כלומר, לכל ROI) לתוך תוכנת גיליון אלקטרוני גרפים.
    1. בעזרת תוכנת מיקרוסקופ: השתמש באחת על כפתור יצוא ND בבקרת הניתוח "סטטיסטיקת ROI" או על הכפתור "יצוא גיליון אלקטרוני" בבקרת הניתוח "ניתוח הזמן".
    2. עם ImageJ: ראשית לבחור בתפריט "נתח → מדידות הגדר" ולוודא "ערך Mean" ו "סטיית תקן" נבחרים. ולאחר מכן השתמש במנהל ROI ובחר את כפתור "מדוד". שמור את חלון תוצאות שנוצר.

ניתוח יחס 10. סריג

  1. חשבתי את יחס סריג הסלולר הממוצע לאורך זמן מן יחסי ממוצע לכל תא (יוצא בשלב 9.4). קחו למשל את הבסיס סריג יחסי (היחס לפני מתן אנליטי) בחישוב זה.
    הערה: גיליון אלקטרוני ותוכנת גרפים משמשים כאן עלילה-subtr הבסיסממוצע פעל יחסי סריג ואת סטיית התקן שלהם של הממוצע (SEM) באמצעות רגרסיה ליניארית על הבסיס כמו בשלב 10.1.2 10.1.3 להלן (איורים 5, 6).
    1. ניתוח יחסית (גודל של תגובה): לנרמל כל עקומת מדגם התייחסות משותפת (למשל, מדגם מטופל.).
    2. Absolute ניתוח (זמן כמובן של תגובה): העבר את קימורי נקודת התחלה נפוצה ידי נרמול כל עקומה עם הבסיס שלה סריג יחס.
      1. ב תוכנת הגיליון האלקטרונית גרפים, לשלב את הנתונים (העמודות של יחסי ממוצע לכל תא) עם עמודות חדשות, כך שכל עמודה מקורית היא זיווג עם עמודה חדשה המכילה נתוני יחס רק לתקופת הבסיס (יחסים לפני אנליטי אינו במקור). בחר "טור הוספה" להכניס עמודה ריקה לאחר כל עמודה של נתונים. ואז להעתיק את נתוני הבסיס לתוך העמודות לזווג ריקות.
      2. ב תוכנת גיליון אלקטרוני גרפים, בחר "→ ניתוח חדש הכנס → Transfoהסר rm בסיס "ולאחר מכן להגדיר" עמודה נבחרה "כדי" כל האחרים ", בוחרים" להניח את הבסיס הוא ליניארי ", ובחר" הבדל "תחת" חישוב ".
      3. חשב את היחס הסלולר הממוצע וסטטיסטיקה תיאורית. ב תוכנת גיליון אלקטרוני גרפים, בחר "ניתוח XY → ניתוח חדש הכנס → → שורה אמצעי עם SD או SEM" ולאחר מכן בחר "שורה אומר עם SEM" בחלון המוקפץ.

Representative Results

כל מבשרי הידרוג'ל, תאים, תבניות יציקה הוכנו כפי שתואר לעיל. הפתרונות מבשר תא עמוס שנוצקו בתבניות PDMS ולאחר מכן centrifuged לפני gelation / photocrosslinking לשתק תאי ליד coverslip ולהקל סריג ניתוח הדמיה (איור 1). את הידרוג עם coverslips המצורפת הושם בתוך בארות הדמית PDMS מוכנות הדמיה מיקרוסקופית (איור 2). התצורות אופטי ופרמטרים רכישת התמונה שנקבעו אז כפי שמוצג באיור 3 א. לכידה של כל ערוצי תמונת הארבעה הקשורים סריג עבור זוגות fluorophore CFP-YFP מודגמת (ראה תחת "Conf האופטי." באיור 3), כפי שנדרש עבור בדיקות לא בינאריות. עם זאת בעבודה זו רק שתי תמונות נדרשות עבור חללית ICUE1 בינארי שרשרת האחת, QE = "CFP CFP" ו AEM = "YFP YFP" (פליטת עירור). FOVs המרובה (מיקום XYים) נבחרו שבו מספר תאים התגוררו בתחומי שטח התאורה הומוגנית (איור 3 ב). לאחר רכישת הזמן לשגות, נתוני האות החללית יוצאים. ROIs לתיקון רקע של אותות ערוץ לניתוח תא יועדו באמצעות תמונות AEM thresholded מההתחלה של הניסויים (איור 4). תאים נבחרו מקרב ברכת התא כמו המביעים מספיק (לא יותר מדי עמום), אבל לא גבוה מדי בדיקה (בהירה מדי) (איור 4 ב). יחסי QE ו SE סריג לפיקסל בכל רכישה חושבו באמצעות חלוקת נקודה צפה של ערוצי התמונה מופחתים ברקע. יחס הסריג הממוצע לכל תא (כלומר, לכל ROI) חושב, מנורמל אות הבסיס לפני הגירוי (כלומר, נסיגה על קו הבסיס מופחת כל נקודות הזמן), ו זמם עם ברי שגיאה כטעות התקן של אומר (SEM). שניהם יחסי סריג דה QE ו CSE מבוססtect פעילות cAMP המוגברת chondrocytes תחת גירוי forskolin (100 ננומטר, איור 5). יחס סריג QE היה רגיש יותר תיקון רקע מייחס CSE הסריג כי את אות QE הייתה נמוכה בשל רמת בסיס פעילות הנמוכה מחנה chondrocytes מוטבע בתוך הידרוג. שני הסוגים הידרוג'ל (TR-ג'ל ג'ל PC) הראו עלייה יחס סריג לאורך זמן (איור 6), מה שמעיד על תגובה איתות cAMP עלה ל תוספת של Forskolin. כפי שצוין על ידי יחס סריג QE, chondrocytes ב הידרוג ג'ל PC להראות שינוי גדול יותר cAMP (מוצג) ורמת בסיס גבוהה של cAMP (E QE = 0.19 ג'ל PC לעומת E QE = 0.09 ב TR-ג'ל, לא מוצג באיור בסיס מופחת).

איור 1
איור 1: חלוקת התא ב Photocrosslinked הידרוג'ל (PC-ג'ל) ת: מבשר הידרוג'ל עמוס התא centrifuged כדי למקסם את מספר התאים בכל מישור המוקד ליד coverslip. B: זה מגדיל את מספר תאי FOV וממזער אות רקע מחוץ תאי מטוס. (סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: הידרוג'ל בצלחת PDMS
הידרוג הוצב בתוך PDMS גבוה היטב (10x היקף הידרוג'ל) עם בסיס coverslip הדמיה מיקרוסקופית וגירוי אנליטי. הידרוג PC-ג'ל שקוף מלוכד אל coverslip כך הם נשארים במקום לאורך כל assay. את PDMS גם יכול להתבצע גדול להכיל בינוני 10x יותר מאשר נפח הידרוג'ל באמצעות אגרוף ביופסיה רחב יותר בנוסף עלגיליון hicker PDMS. (סרגל קנה מידה = 2 מ"מ) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: תצורת רכישת הדמית הסריג
ת: הרכישה הוגדרה עבור לכידת תמונה כל 7 שניות במקומות מרובים. בחישוב יחס QE סריג, רק שני ערוצים תמונה נדרשים החללית ICUE1 משמש כאן (בדיקה שרשרת אחת בינארי), QE = "CFP CFP" ו AEM = "YFP YFP" (פליטת עירור) תחת "Conf אופטי." עמודות בכרטיסייה λ של תוכנת מיקרוסקופ. B: FOVs ( "XY" עמדות) נבחרו שבו מספר תאים התגוררו בתחומי השטח תאורה הומוגנית. העלילה מתחת לתמונה מראה את עוצמת התאורה לאורך הכחול מחודדת קושחוצה דרך המרכז של FOV. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: מבחר ROIs עבור ניתוח הדמיה סריג
ת: אזור של (ROI) הריבית חסר תאים נבחר לתקן אות רקע על כל ערוץ. דמות של הידרוג'ל תא ללא עשויה במקום לשמש רקע חיסור אם צפיפות או נדידת תאים היא גבוהה, או אם מסכת הצללה אינה משמשת כאשר תאים לא משקרים בתוך שדה תאורה הומוגנית. B: ROIs תא נבחרו באמצעות thresholding התמונה מיסוך בינארי של ערוץ AEM. בחירת ROI גדול יותר תאים ישפיע לרעה חישוב יחס סריג הממוצע לכל תא בשל הכללת יחסי תאיים המופק n רקעoise. חישוב יחס הסלולר סריג באמצעות הממוצע של כל ערוץ לכל תא אינה מומלצת מכיוון שהדבר אינו מעריך נכון את היחס. (סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר) אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5: השוואה בין יחסי סריג ב Thermoresponsive הידרוג'ל (TR-ג'ל)
שניהם QE ויחסי סריג מבוסס SE לזהות את פעילות cAMP מוגברת chondrocytes תחת גירוי forskolin. Forskolin הוא אגוניסט cyclase adenyl אשר גורם ייצור cAMP. סריג פוחתת כאשר החללית ICUE1 נקשר cAMP, ובכך יחס סריג QE (E QE = SQE / (Saem x QS)) עולה. לעומת זאת, יחס סריג SE פוחתת וכך הוא זמם כמו E SE = 1 - CSE / Saem. בשנת chondrocytes מוטבע הידרוג'ל, את QE Fיחס RET רגיש יותר תיקון רקע מייחס SE הסריג כי את אות QE היא נמוכה בשל פעילות cAMP בסיס הנמוכה. ברי שגיאה = SEM, n = 25. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6: השוואת יחס הסריג ב הידרוג שונה
Chondrocytes בשני סוגי הידרוג'ל הגיב לגירוי forskolin עם עלייה בפעילות cAMP כפי שהפגין יחס QE הסריג המוגבר לאורך זמן. ההשפעות סוג הידרוג'ל התגובה התאית באמצעות מספר אפקטים, כולל הבדלים בחדירות כדי forskolin ובפעילות cAMP הסלולר הבזליים (E QE = 0.19 ג'ל PC לעומת E QE = 0.09 ב TR-ג'ל, לא מוצג). ברי שגיאה = SEM, n עבור TR-ג'ל= 25, n עבור ג'ל PC = 15. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

עבודה זו ממחישה כיצד הדמיה סריג ניתן להשתמש כדי לנתח איתות הסלולר ב הידרוג 3D. בעוד מחקרים קודמים הוכיחו הדמית סריג של תאים שנזרעו על מצעים הידרוג'ל 35-37, של אינטראקציות תאיות עם הידרוג 38, ושל מולקולות לכודות בתוך הידרוג 39-41, זהו הפרסום הראשון לתאר ניתוח תאי מבוסס הדמית הסריג של תאים המוטבעים בתוך הידרוג 3D. העבודה פותרת מספר בעיות ביישום כאשר תרגום הדמית סריג מ 2D ל 3D. ראשית, מטרות צמצם מספריות גבוהות נדרשות עבור הדמית הסריג לאסוף אות פליטה מספיק, אבל הם מגבילים את עומק השדה. התאים כאן מותר להתיישב מעט באמצעות צנטריפוגה כדי להגדיל את מספר תאי מטוס מוקד ליד הזכוכית כדי לפצות על זה. שנית, פיגומי הידרוג'ל 3D עשויים לסטות פני שדה הראייה במהלך הדמיה אשר מסבכת ניתוח. הידרוג כאן מודבקים אל coverslip כך שהם נשארים קבועים לאורך כל הניסוי. בחירה שלישית, של יצירות הידרוג'ל מתאימות 3D סריג חיונית כי הידרוג'ל עלול לעכב הדמיה של התאים. הנה הידרוג שקוף של ג'ל PC ו- TR-ג'ל משמש. עם זאת, איסוף התאים עם צנטריפוגה מטוס מוקד ליד coverslip יכול לשמש תאים התמונה ב הידרוג עם גבוה הבחירה diffraction.The של הידרוג'ל תלוי בתנאי microenvironment כי חייב להיות מדומה, אשר ניתן למצוא סקירה על הידרוג'ל 42 . רביעית, חישוב חלופי מועסק כאן ליחס סריג של החללית ICUE1 שרשרת אחת (כלומר, E QE = QE / cAem) כדי למזער את מספר הערוצים תמונה הנדרש לניתוח ובכך למזער photobleaching. יחס הסריג הממוצע לכל תא מחושב כממוצע של היחסים לפיקסל בתוך תא למזער הערכה נמוכה מדי של יחס הסריג בפועל. לבסוף, ניתוח ratiometric ליניארי ואמצעיכדי לחשב את החלק היחסי המופעל של בדיקות בינארי שרשרת אחת מתואר.

ישנם כמה היבטים קריטיים של ביצוע ניסויי סריג מוצלחים באמצעות מיקרוסקופ widefield. עם כל כבוד לחומרה, המצלמה חייבת להיות רגישה מספיק כדי לפתור שינויים לאות קטנים, משאיר מצלמות CMOS מדעיות חדשות ועיבוד ממוחשב הכפלת אלקטרונים טובים CCDs מתאים יותר קונבנציונלי. כדי טוב ביותר לנתח את הפריסה המרחבית של יחס הסריג, המצלמה חייבת לכל הפחות להחזיק פעמים את הרזולוציה המרחבית של פונקצית התפשטות נקודת המטרה (קריטריון נייקוויסט). זה עושה מערכות תצוגה כפולה פחות מתאימות למשימה. גורם משמעותי יותר הוא לבחור רכישה בשיעור חשיפה ותמונה מתאימה עבור זוג הסריג הנתון כדי למזער photobleaching של fluorophores. רכישה בשיעור ירד מומלץ ככל מגדיל את משך ניסוי. שימוש גלגלים מסננים מהירים מגביר את קצב רכישה ומספר FOVs לניתוח בעוד להימנעing את והרשמת תמונה עם תצוגה כפולה וקוביות מסנן צריח. שדה תאורת הומוגניות מסבך תיקון עבור קרינת רקע נובעת autofluorescence מדגם ורעש מערכת מצלמה. הידרוג חלק, במיוחד אלה המכילים חלבונים collagenous הם מאוד autofluorescent 43,44. יחסי הסריג הם זלזלו ללא צורך בתיקון ברקע. כאן אנחנו מעסיקים שיטת תיקון רקע פשוט המסתמכת על מגרש התאורה השטוח יחסית אשר יכול להיות מוגדר לעתים קרובות עם תאורת עלית קרינה על מרכז התמונה (האיור 3B, שלב 7.2). שיטה זו ולכן מגביל תאים לעניין את אלו בתוך שדה הארה זו. תיקון הרקע המתואר כאן אינו לוקח בחשבון autofluorescence הסלולר של אורכי הגל לקריאה מתוך החללית בינארי. במקרה כזה, תאים ללא תווית (לא transfection בדיקה) צריכים להיות צלמו באותם התנאים והרקע מופחתים. זרקix של תאים שכותרתו ללא תווית ניתן להשתמש והתאים ללא התווית נבחרו לארח את ההחזר על ההשקעה ברקע. שיטות חלופיות המספקות לניתוח תא לאורך כל מגרש התמונה כולה כוללות שימוש במסכת הצללה, ROIs רקע מרובה, או דגימות זהות ללא תאי פרוטוקול זמין על פי בקשה.

ספציפית הדמית 3D סריג, בתגובת בדיקה רגישה מאוד חדיר הידרוג'ל אל אנליטי (איור 6). לכן באותו האזורים הידרוג'ל מושווים פני טיפולים ניסיוניים, רצויה בנקודת סימטריה גיאומטרית כמו למשל בסמוך למרכז הפיגום כפי שמוצג כאן. לחלופין, תאי microfluidic / מתקני הגידול עשוי להיות מועסק על מנת במהירות אחידה perfuse הידרוג עם פתרון אנליטי 45. אות סריג לא תזוהה (יחס האות לרעש נמוכה מדי) כאשר של autofluorescence הידרוג'ל הוא גבוה מדי; הידרוג מדלל או בדיקה אחרת (fluorophores השונה) אמור לשמש.עם כל כבוד הדמית 3D סריג ב הידרוג photocrosslinked, שימוש חשיפת הקרנת מינימום אורכי גל מחוץ ספקטרום העירור של fluorophores הבדיקה מומלץ. LAP ניתן להשתמש עם מקור האור הנראה ב 405 ננומטר כדי לצמצם עוד יותר נזק לתאים פוטנציאל 31,46. עם זאת, LAP משתמש עם 365 הקרנת ננומטר מומלץ כי זה ממזער הלבנת חללית. 365 ננומטר שוכן בקצה הזנב של ספקטרום עירור תורם CFP, ואילו 405 ננומטר עומד עירור השיא. לחלופין, הביטוי החללי יורשה להתאושש במשך יום אחד. שימוש בדיקות בינארי ממזער בעיות של רגישות להבדלים ברמות ביטוי ב דיפוזיה מולקולרית של fluorophores תורם acceptor. בדיקות ללא בינארי ניתן להשתמש, אבל עם SE במקום הדמיה QE ותיקון נוסף לדמם דרך ספקטרלי של ספקטרום עירור ופליטה (ראה להלן). יתר על כן, הזמינות המסחרית הנמוכה ואת המורכבות בעיצוב בדיקות סריגעשוי להיות מכשול. הגורם הקריטי ביותר עבור ניסויים מוצלחים נשאר תיקון ראוי וניתוח של אותות הקרינה.

חישוב חלופי של יחס סריג מנוצל מכמה סיבות נוספות מלבד ומזעור photobleaching. עבור בדיקות חד שרשרת בינארי, היחס מדווח כלל היא פליטת acceptor תחת עירור תורם (פליטה רגישה, SE) כדי פליטת תורם תחת עירור תורם (פליטת רווה, QE), כלומר, סריג יחס = SE / QE 25,47,48. SE / QE היא יחסית שאינו ליניארי לשינויי סריג יעיל 21,22,47. כלומר, היחס יש יחסים שאינו ליניארי אקספוננציאלית ליעילות סריג הטבועה של החללית (EI) (Donius, AE, Taboas, פורסם העבודה JM. (2015)), עם ליניארי ביותר יחס Ei פחות כ 15%. SE / QE יהיה גם לזלזל השבריר של בדיקות מופעלות (FAP, כלומר, חלק של בדיקות מחייב אנליטי). Therefoמחדש, ניתוח של SE / QE דורש מחקר תגובת שיווי משקל מנה מסורבלת עקומה. למרבה המזל, את היחס של SE או QE כדי פליטת acceptor תחת עירור acceptor (AEM) הם ליניאריים ביחס Ei ואת FAP, כלומר, יחסי סריג SE / AEM ו QE / AEM. SE / AEM משמש לעתים קרובות עבור בדיקות בינארי ורק דורש כיול נקודת סיום (ללא פעילות חללית ופעילות בדיקה מלאה), אבל איתות הסלולר הבזליים מקשה. כדי לבטל את הצורך בכיול נקודות קצה, SE ניתן לתקן (CSE) עבור חפיפה ספקטרלית של ספקטרום תורם acceptor עירור ופליטה (דרך לדמם ספקטרלי) ועבור תשואת הקוונטים והרגיש ספקטרלי (QS) של fluorophores הבדיקה המשולב מיקרוסקופ מערכת הדמיה. יחס SE סריג התיקן המבוסס על מנוע חיפוש מותאם אישית מגדיר את יעילות הסריג הנצפית של החלליות בתוך כל פיקסל של תמונה, כלומר, E SE = CSE / AEM. תוכנה מסחרית ללא תשלום זמינה כדי לתקן SE עבור השפעות אלוהקורא נקרא לעבודת חן Periasamy 2006 הסבר מפורט של שיטות 50. עם זאת, חישוב E SE דורש לכידה של שלושה ערוצים תמונה לכל נקודת זמן (SE, QE, AEM). לכן, בעבודה זו אנו גם מפעילים יחס סריג חלופי E QE = 1 - QE / cAem, מחייב חטיפת שני רק ערוצי תמונה (QE ו AEM). חישוב E QE מערוצים אלה רק דורש תיקון AEM עבור QS (cAem = AEM x QS). QS = Dem / AEM מוערך בקלות באמצעות שתי תמונות מן המדגם כיול אחד, שבו Dem הוא פליטת התורם תחת עירור התורם עם השיער המחומצן acceptor. FAP בכל רגע יכול להיות מחושב על ידי השוואת E SE או E QE אל Ei של החללית.

בסופו של דבר, בחירת יחס סריג (E SE = CSE / AEM לעומת E QE = QE / cAem) צריך להתבסס על שיקול מהסוג החללי לבין הערוצים עם האות הטוב ביותר. הואpproaches כוללת תיקון רעש רקע של תמונות לכל מסגרת כמתואר לעיל לחשבון לשינויים autofluorescence לאורך זמן. הם מניחים ללא חפיפה של אור עירור AEM לספקטרום עירור Dem, אשר לעיתים קרובות את התיק בשל לחקור תצורת מסנן עיצוב ומיקרוסקופ. בדיקות חד שרשרת יכולות להשתמש גם ובחירה מבוססת על האות החללית הטובה ביותר (בהירות) לרעש מצלמה כדי אות רקע על SE וערוצי QE. עבור חללית ICUE1 תנאי ניסוי משמשים כאן (סוגי תאים ו הידרוג'ל), יש SE אות חזקה יותר QE. בדיקות Dual-שרשרת דורשות שימוש E SE בשל חלוקה הלא equimolar של fluorophores תורם acceptor. עבור בדיקות כי ירידת הסריג על מחייב אנליטי כגון ICUE1, סריג יעילות ניתן "הפוך" להציג שינוי איתות חיובי על כבילת אנליטי כפי שאנו עושים כאן, עם E SE = 1 - CSE / AEM או E QE = QE / (AEM x QS).

ניתוח של הדואר FAP רגישה תיקון תקין של יחסי סריג וכדי אומדן Ei. ניתן להעריך עם מדגם זהה כיול המשמש QS ו נקודת קצה קונבנציונאלי סריג assay יעילות כמו Ei = 1- (QE / Dem) (תמונה QE ואחריו photobleaching acceptor ותמונה Dem) 28, אך יש לנקוט זהירות כדי למזער הלבנה מקרית של התורם. אנו מתארים גירסה שונה שבו האומדן של Dem מבוסס על AEM המותאמת QS מוחלף, כלומר, Ei = 1 - (QE / (AEM x QS)). לחילופין, Ei = CSE / AEM ניתן להשתמש. הערכת Ei בתאים חיים דורשת שכל הבדיקות שתסייענה מלא סריג. זה קשה להשיג בפועל עבור בדיקות, כגון ICUE1 כי ירידת סריג על כבילת אנליטי. חישוב המבוסס חוץ גופית של Ei באמצעות lysates התא אנליטי מטוהרים הוא הכי טוב, אבל מחוץ להיקף עבודה זו. כאן אנו ממליצים להשתמש 2 ', 5'-Dideoxyadenosine להקטין cAMP בתאים. עם זאת, קרוב משפחה FAP עשוי bדואר מחושב תוך שימוש באומדן Ei נגזר מרמת הבסיס של איתות. מסיבות אלה, רוב המחקרים מדווחים לעתים קרובות יחס סריג (כפי שנעשה כאן) או קרוב משפחה FAP מבוסס על כיול נקודת הסיום, שבו הבסיס איתות לפני הוספת אגוניסט הוא החסם התחתון ואת האות לאחר הוספת אגוניסט השני כי מרווה האיתות היא העליונה כָּרוּך. Forskolin לעתים קרובות משמש אגוניסט מלא להרוות אות cAMP. לחלופין, אנלוגי cAMP ניתן להשתמש כגון 8-Bromoadenosine 3 ', monophosphate 5'-מחזורי. בקרות חיוביות בשימוש על סיום הלימודים לזהות שינויים אפשריים מסלול האיתות בין טיפולים ניסיוניים מומלצות.

חישוב תגובת האיתות הממוצעת לכל תא דורש שיקול של מספר גורמים. ראשית, יחס הסריג הממוצע יחושב כממוצע של היחסים על כל פיקסל בתוך תא, כלומר, (Σ (QE/cAem)) / (מספר הפיקסלים), במקום raטיו של QE הממוצע AEM בתא, כלומר, (ΣQE) / (ΣcAem). למרות שהאחרון אינו מחייב מיסוך להיזהר כמו רעש רקע נמוך, זה חמור מזלזל יחס סריג הממוצע האמיתי. עם זאת, יחסי פיקסל נקבעו שיש לחשב נקודה צופה ו מיסוך בינארי הזהיר של שטח התא להגדיר את ROIs ולהימנע הכללת יחסים מזויפים המופקים רעשי רקע מחוץ לתא. אזור כל התא חייב להיות לכמת כדי למנוע תוצאות הטיית על צורת התא. המיסוך ייתכן שיהיה צורך להגדיר מחדש לאורך זמן בהתאם לשינויים בצורת התא הגירה. לחלופין, גדול ROIs מאשר התא עשוי לשמש אם קריטריוני הדרה מוגדרים להסיר יחסי פיקסל QE ו AEM אותות לרדת מתחת רמות הסלולר הם רמות רקע קרובות. פרט שיטות ניתוח תאר את הצעדים הבסיסיים המשמשים בעבודה זו לניתוח סריג ללא תוכנה / plugins מיוחד. יצרני מיקרוסקופ וספקים אחרים למכור התוספת על מודולים עבור תוכנת מיקרוסקופ שלהם, אשר תומכת ratiometric אוטומטי סריג ניתוח. כמו כן, תוכנת ImageJ ברשות הציבור יש כמה תוספים זמינים חלקיקים וניתוח סריג, כגון RiFRET. שנית, היחס סריג הממוצע פיקסל מבוססת מזלזלת היחס הממוצע האמיתי של המבנה התאי 3D כי תמונת 2D משמש. אותות 2D מצהירים ממוצע לאורך ציר ה- z. חישוב הפריסה המרחבית 3D של יחסי סריג בתאים חיים אינו אפשרי ללא הדמיה 3D במהירות גבוהה (למשל., באמצעות ספינינג מיקרוסקופיה דיסק confocal). זוהי בעיה עבור שתי תרבויות 2D and 3D, אבל יש השפעה גדולה יותר ב 3D כמו יותר של המבנה התאי קיים מתוך מטוס. זהו מקור לדאגה רבה עבור בדיקות כי למקם מבנים הסלולר, כגון PM-ICUE החללית EPAC1 קרום הפלזמה. ראה ואח Spiering. 2013 הצעות לתקן תופעות עובי תא על חישובי יחס 24. ניתוח של חלוקת AEM יכול לשמשלזהות אם חללית מצטברת באזורים של מטוס תא הדמיה המותאם. זה גם יעזור לפרש את הפריסה המרחבית של יחסי סריג ולבער תוצאות מזויפות, למשל., זיהוי רווית בדיקה (כלומר, אזור AEM נמוך יצטרך ריכוז חללית נמוך עשוי להפגין רוויה חללית ויחס סריג גבוה). רמות שלישיות, מחקר סריג שונה עשויות להצביע על הבדל ביעילות transfection, לחקור ביטוי, או איתות הבזליים בין קבוצות ניסוי. "ניתוח יחסית" (שלב 10.1.1) מסייע להסיר סחף יחס הסריג לאורך זמן אם הוא קיים. הוא מאפשר השוואות של הגודל היחסי של תגובות בין דגימות, אך מעכב בהשוואת הזמן כמובן תגובה למדגם ההפניה (עלילת שליטה היא קו ישר). "Absolute ניתוח" (שלב 10.1.2) מאפשר השוואה של שיעור ההיענות ברחבי דגימות, אך סלי השוואה של עוצמת תגובה כי כל שורה תשתנה ידי dissimקבוע ilar. מחקרים מרבים להשתמש רגרסיה ליניארית על קו הבסיס לתקן סחף יחס הסריג לאורך זמן.

השיטה 3D סריג תיאר היא דרך יעילה ומעשית לפברק ולבצע הדמיה זמן לשגות של הידרוג 3D עמוס התא, אשר יכול להיות מיושם על בדיקות אחרות שיטות הדמיה. מערכת סריג אחרת מלבד בדיקות בינארי שרשרת אחת תדרוש תיקון מורכב יותר של אותות מבוססים בעצמה, כפי שפורטה לעיל. לחלופין, הדמית חי קרינה של סריג (FLIM-סריג) ניתן להשתמש כדי לחשב סריג יעיל באמצעות שינוי בחי פליטה של ​​התורם החללי. בניגוד מבוסס עוצמת סריג, FLIM סריג הוא רגיש לרעשי רקע, לדמם דרך ספקטרלי, יעילות קוונטית, ואת רגישות ספקטרלית גלאי 2. עם זאת, מערכות FLIM יקרות, מורכבות, ונדירות, ולעבוד בצורה טובה ביותר עם ​​fluorophores עם ריקבון מעריך יחיד ואין FLIM ניגר 49. השיטה המתוארת עשויה לשמש גם עם מומחדש פלטפורמות מיקרוסקופ מתקדמות (למשל., סריג TIRF, אנאיזוטרופיה קרינה, סריג קורלציה רפאים). ע"פ שיטה זו הדמיה 3D עם confocal במהירות גבוהה מיקרוסקופיה multiphoton יקל ניתוח התפלגות המשנה הסלולר של בתגובה איתות להגביר את הדיוק של איתות ניתוח. שיטת 3D סריג זה יאפשר מחקרים בביולוגיה של התא מתקדמים microenvironments הסלולר 3D מדומה. ככזה, הוא יכול בקלות להיות מיושם פרמקולוגיה וצרכי ​​הרפואה רגנרטיבית, כולל לימוד איתות אינטר וסינון בתגובת תרופת microtissues הידרוג'ל המבוסס המהונדס.

Acknowledgments

המחברים מודים על התמיכה הכספית של בית הספר לרפואת שיניים באוניברסיטת פיטסבורג, ה- National Institutes of Health בפרס K01 AR062598, ו DE030740 P30 מענק. המחברים גם להודות לד"ר ג'ין ג'אנג עבור פלסמיד ICUE1, וויין Rasband לפיתוח ImageJ ומיכאל Cammer עבור מאקרו ImageJ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polydimethylsiloxane (PDMS) [Sylgard 184 Elastomer Kit] Fisher Scientific (Ellsworth Adhesives) NC0162601 Reagents
Polyethylene glycol dimethacrylate (PEGDM) Prepared according to Lin-Gibson with PEG from Sigma Aldrich 95904 Reagents
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate Sigma Aldrich M6514 Reagents
3-glycidoxypropyltrimethoxysilane Sigma Aldrich 440167 Reagents
Dimethyl Phenylphosphonite Sigma Aldrich 149470-5g Reagents
2,4,6-trimethylbenzoyl Chloride Fisher Scientific AC244280100 Reagents
2-Butanone Fisher Scientific AC149670010 Reagents
Lithium Bromide Fisher Scientific AC199871000 Reagents
Isopropanol Sigma Aldrich 190764 Reagents
Sigmacote (siliconizing reagent) Sigma Aldrich SL2 Reagents
Toluene  Fisher Scientific AC36441-0010 Reagents
Phosphate Buffered Saline (PBS) Hyclone SH3025601 Reagents
Opti-MEM Reduced Serum Medium, no phenol red (phenol- and serum-free medium) Life Technologies 11058-021 Reagents
FuGENE HD Transfection Reagent (transfection reagent) Promega E2311 Reagents
Cellstripper (cell dissociation solution) Corning 25-056-CI Reagents
Growth Factor Reduced Matrigel, Phenol Free Corning 356231 Reagents
Forskolin Sigma Aldrich F6886 Reagents
Pipette Tips (10,200,1,000 μl)  Fisher Scientific 02-707-474, 02-707-478, 02-707-480 Disposable lab equipment
Powder Free Examination Gloves Fisher Scientific 19-149-863B Disposable lab equipment
Aluminum foil Fisher Scientific 01-213-100 Disposable lab equipment
Biopsy punch (3 mm) Miltex 3332 Disposable lab equipment
Glass coverslips Fisher Scientific 12-544C Disposable lab equipment
Precoated glass coverslips (epoxysilane) Arrayit CCSL Disposable lab equipment
Glass slide Fisher Scientific 12550D Disposable lab equipment
Sterile vials (15 ml, 50 ml conical) Fisher Scientific 14-959-70C, 14-959-49A Disposable lab equipment
Cell culture dish (6-well) Falcon 351146 Disposable lab equipment
Epifluorescent Microscope with motorized stage Nikon MEA53100 (Eclipse TiE Inverted) Large/non-disposable lab equipment
Adjustable Specimen Holder for XY Stage Nikon 77011393 Non-disposable lab equipment
60X (1.3 NA) objective (CFI Plan Apochromat 60XH Lamda) Nikon MRD01605 Non-disposable lab equipment
CFP/YFP light source and excitation / emission filter holders (Lambda light source & wheel, Lambda emission filter system) Nikon (Sutter Instrument reseller) 77016231, 77016088 Non-disposable lab equipment
CYF/YFP filter set Nikon (Chroma Technology Corp) 77014928 Non-disposable lab equipment
Camera (ORCA Flash 4.0 v1) Nikon (Hamamatsu reseller) 77054076 Non-disposable lab-equipment
NIS-Elements 40.20.02 microscope software) Nikon MQS31100  Non-disposable lab equipment
Prism (spreadsheet and graphing software) GraphPad Software, Inc Version 6 Non-disposable lab equipment
OmniCure S1000 UV Spot Curing Lamp System with 365nm filter or other light source (λ = 365 or 405) OmniCure S1000 Large/non-disposable lab equipment
Pipette Aid  Drummond Scientific Co.  DP-100 Non-disposable lab equipment
Hemacytometer Hausser Scientific Reichert Bright-Line 1475 Non-disposable lab equipment
Vacuum desiccator chamber/degasser  Any Large/non-disposable lab equipment
Tissue Culture Hood  Any Large/non-disposable lab equipment
Chemical Fume Hood  Any Large/non-disposable lab equipment
Oven Any Large/non-disposable lab equipment
Spatula Any Non-disposable lab equipment
Beaker Any Non-disposable lab equipment
Incubator  Any Large/non-disposable lab equipment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. Imaging molecular interactions in living cells by FRET microscopy. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, (5), 409-416 (2006).
  2. Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Curr. Opin. Biotechnol. 16, (1), 19-27 (2005).
  3. Lohse, M. J., Nuber, S., Hoffmann, C. Fluorescence/bioluminescence resonance energy transfer techniques to study G-protein-coupled receptor activation and signaling. Pharmacol Rev. 64, (2), 299-336 (2012).
  4. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J. Cell Sci. 125, (13), 3015-3024 (2012).
  5. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol. Bioeng. 103, (4), 655-663 (2009).
  6. Mseka, T., Bamburg, J. R., Cramer, L. P. ADF/cofilin family proteins control formation of oriented actin-filament bundles in the cell body to trigger fibroblast polarization. J. Cell Sci. 120, (24), 4332-4344 (2007).
  7. Holowka, D., Sheets, E. D., Baird, B. Interactions between Fc(epsilon)RI and lipid raft components are regulated by the actin cytoskeleton. J. Cell Sci. 113 (Pt 6), 1009-1019 (2000).
  8. Alenghat, F. J., Ingber, D. E. Mechanotransduction: all signals point to cytoskeleton, matrix, and integrins. Sci Signaling. (119), (2002).
  9. Guilak, F., et al. Control of stem cell fate by physical interactions with the extracellular matrix. Cell stem cell. 5, (1), 17-26 (2009).
  10. Polacheck, W. J., Li, R., Uzel, S. G., Kamm, R. D. Microfluidic platforms for mechanobiology. Lab Chip. 13, (12), 2252-2267 (2013).
  11. Burdick, J. A., Anseth, K. S. Photoencapsulation of osteoblasts in injectable RGD-modified PEG hydrogels for bone tissue engineering. Biomaterials. 23, (22), 4315-4323 (2002).
  12. Benoit, D. S. W., Schwartz, M. P., Durney, A. R., Anseth, K. S. Small functional groups for controlled differentiation of hydrogel-encapsulated human mesenchymal stem cells. Nat. Mater. 7, (10), 816-823 (2008).
  13. Tsang, V. L., et al. Fabrication of 3D hepatic tissues by additive photopatterning of cellular hydrogels. FASEB J. 21, (3), 790-801 (2007).
  14. Zhu, J., Marchant, R. E. Design properties of hydrogel tissue-engineering scaffolds. Expert Rev. Med. Devices. 8, (5), 607-626 (2011).
  15. Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering. Biomaterials. 33, (26), 6020-6041 (2012).
  16. Kumbar, S. G., Laurencin, C. T., Deng, M. Natural and Synthetic Biomedical Polymers. Elsevier. (2014).
  17. Kirschner, C. M., Anseth, K. S. Hydrogels in Healthcare: From Static to Dynamic Material Microenvironments. Acta Mater. 61, (3), 931-944 (2013).
  18. Guvendiren, M., Burdick, J. A. Engineering synthetic hydrogel microenvironments to instruct stem cells. Curr Opin Biotechnol. 24, (5), 841-846 (2013).
  19. Gulrez, S. K. H., Al-Assaf, S., Phillips, G. O. Progress in Molecular and Environmental Bioengineering - From Analysis and Modeling to Technology Applications, Ch. 5. Capri, A. InTech. Europe. 117-149 (2011).
  20. Iza, M., Stoianovici, G., Viora, L., Grossiord, J. L., Couarraze, G. Hydrogels of poly(ethylene glycol): mechanical characterization and release of a model drug. J. Controlled Release. 52, (1-2), 41-51 (1998).
  21. Deligkaris, K., Tadele, T. S., Olthuis, W., van den Berg, A. Hydrogel-based devices for biomedical applications. Sens. Actuators, B. 147, (2), 765-774 (2010).
  22. Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophys. J. 16, (9), 1055-1069 (1976).
  23. Yuan, L., Lin, W., Zheng, K., Zhu, S. FRET-Based Small-Molecule Fluorescent Probes: Rational Design and Bioimaging Applications. Acc. Chem. Res. 46, (7), 1462-1473 (2013).
  24. Spiering, D., Bravo-Cordero, J. J., Moshfegh, Y., Miskolci, V., Hodgson, L. Quantitative ratiometric imaging of FRET-biosensors in living cells. Methods Cell Biol. 114, 593-609 (2013).
  25. Kikuchi, K. Ch 42, Nano/Micro Biotechnology. Advances in Biochemical Engineering Biotechnology. Nagamune, I. E. 119, Springer. Berlin Heidelberg. 63-78 (2010).
  26. Van Dyk, T. K., et al. Rapid and sensitive pollutant detection by induction of heat shock gene-bioluminescence gene fusions. Appl Environ Microbiol. 60, (5), 1414-1420 (1994).
  27. Park, M., Tsai, S. L., Chen, W. Microbial biosensors: engineered microorganisms as the sensing machinery. Sensors. 13, (5), 5777-5795 (2013).
  28. Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem Sci. 32, (9), 407-414 (2007).
  29. Lin-Gibson, S., et al. Synthesis and characterization of PEG dimethacrylates and their hydrogels. Biomacromolecules. 5, (4), 1280-1287 (2004).
  30. Majima, T., Schnabel, W., Weber, W. Phenyl-2,4,6-Trimethylbenzoylphosphinates as Water-Soluble Photoinitiators - Generation and Reactivity of O=P(C6h5)(O-) Radical-Anions. Makromol Chem. 192, (10), 2307-2315 (1991).
  31. Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30, (35), 6702-6707 (2009).
  32. Zhou, J., Ellis, A. V., Voelcker, N. H. Recent developments in PDMS surface modification for microfluidic devices. Electrophoresis. 31, (1), 2-16 (2010).
  33. DiPilato, L. M., Cheng, X., Zhang, J. Fluorescent indicators of cAMP and Epac activation reveal differential dynamics of cAMP signaling within discrete subcellular compartments. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, (47), 16513-16518 (2004).
  34. Occhetta, P., et al. Fabrication of 3D cell-laden hydrogel microstructures through photo-mold patterning. Biofabrication. 5, (3), 035002 (2013).
  35. Kubow, K. E., et al. Crosslinking of cell-derived 3D scaffolds up-regulates the stretching and unfolding of new extracellular matrix assembled by reseeded cells. Integr. Biol. 1, (11-12), 635-648 (2009).
  36. Legant, W. R., Chen, C. S., Vogel, V. Force-induced fibronectin assembly and matrix remodeling in a 3D microtissue model of tissue morphogenesis. Integr. Biol. 4, (10), 1164-1174 (2012).
  37. Cameron, A. R., Frith, J. E., Gomez, G. A., Yap, A. S., Cooper-White, J. J. The effect of time-dependent deformation of viscoelastic hydrogels on myogenic induction and Rac1 activity in mesenchymal stem cells. Biomaterials. 35, (6), 1857-1868 (2014).
  38. Kong, H. J., Polte, T. R., Alsberg, E., Mooney, D. J. FRET measurements of cell-traction forces and nano-scale clustering of adhesion ligands varied by substrate stiffness. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, (12), 4300-4305 (2005).
  39. Poehler, E., et al. Microchamber arrays with an integrated long luminescence lifetime pH sensor. Anal. Biochem. 1-9 (2015).
  40. Son, K. J., Shin, D. S., Kwa, T., Gao, Y., Revzin, A. Micropatterned Sensing Hydrogels Integrated with Reconfigurable Microfluidics for Detecting Protease Release from Cells. Anal. Chem. 85, (24), 11893-11901 (2013).
  41. Aimetti, A. A., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Human Neutrophil Elastase Responsive Delivery from Poly(ethylene glycol) Hydrogels. Biomacromolecules. 10, (6), 1484-1489 (2009).
  42. Grieshaber, S. E., Jha, A. K., Farran, A. J. E., Jia, X. Biomaterials for Tissue Engineering Applications: A Review of the Past and Future Trends, Ch 2. Burdick, J. A., Mauck, R. L. Springer-Verlag. 9-46 (2011).
  43. Chiu, Y. C., Brey, E., Pérez-Luna, V. A Study of the Intrinsic Autofluorescence of Poly (ethylene glycol)-co (L -Lactic acid) Diacrylate. J. Fluoresc. 22, (3), 907-913 (2012).
  44. Dewitt, D. D., Kaszuba, S. N., Thompson, D. M., Stegemann, J. P. Collagen I-Matrigel Scaffolds for Enhanced Schwann Cell Survival and Control of Three-Dimensional Cell Morphology. Tissue Eng., Part A. 15, (10), 2785-2793 (2009).
  45. Taboas, J. M., Tuan, R. S., Hudson, S. D. Bioreactor device, and method and system for fabricating tissues in the bioreactor device. United States patent. PCT/US2006/028417 (2014).
  46. Fedorovich, N. E., et al. The effect of photopolymerization on stem cells embedded in hydrogels. Biomaterials. 30, (3), 344-353 (2009).
  47. Vandame, P., et al. Optimization of ERK activity biosensors for both ratiometric and lifetime FRET measurements. Sensors. 14, (1), 1140-1154 (2013).
  48. Ponsioen, B., et al. Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. EMBO Rep. 5, (12), 1176-1180 (2004).
  49. Klarenbeek, J. B., Goedhart, J., Hink, M. A., Gadella, T. W., Jalink, K. A mTurquoise-based cAMP sensor for both FLIM and ratiometric read-out has improved dynamic range. PLoS ONE. 6, (4), e19170 (2011).
  50. Chen, Y., Periasamy, A. Intensity range based quantitative FRET data analysis to localize protein molecules in live cell nuclei. J. Fluoresc. 16, (1), 95-104 (2006).
סריג הדמיה ב הידרוג תלת ממדי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Donius, A. E., Bougoin, S. V., Taboas, J. M. FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels. J. Vis. Exp. (114), e54135, doi:10.3791/54135 (2016).More

Donius, A. E., Bougoin, S. V., Taboas, J. M. FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels. J. Vis. Exp. (114), e54135, doi:10.3791/54135 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter