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Biology

FRET Imaging in idrogel tridimensionali

doi: 10.3791/54135 Published: August 1, 2016
* These authors contributed equally

Abstract

Imaging di Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET) è un potente strumento per l'esame biologia cellulare in tempo reale. Studi utilizzando FRET comunemente impiegano cultura bidimensionale (2D), che non imitano tridimensionale (3D) microambiente cellulare. Un metodo per eseguire le emissioni spento l'imaging FRET usando la microscopia convenzionale widefield epifluorescenza delle cellule all'interno di un ambiente idrogel 3D è presentato. Ecco un metodo di analisi per sonde FRET raziometriche che produce rapporti lineare nell'ambito delle di attivazione della sonda è descritta. La misurazione dei livelli intracellulari adenosina monofosfato ciclico (cAMP) è dimostrato in condrociti sotto stimolazione forskolina utilizzando una sonda per EPAC1 attivazione (ICUE1) e la capacità di rilevare le differenze di cAMP segnalazione dipende dal tipo di materiale idrogel, qui un idrogel photocrosslinking (PC-gel, polietilene glicole dimetacrilato) e un idrogel thermoresponsive (TR-gel). Rispetto ai metodi 2D FRET,questo metodo richiede poco lavoro supplementare. Laboratori già utilizzano immagini FRET in 2D possono facilmente adottare questo metodo per eseguire studi cellulari in un microambiente 3D. Può inoltre essere applicato a vaglio di farmaci ad alto rendimento in microtissues 3D ingegnerizzati. Inoltre, è compatibile con le altre forme di immagini FRET, come la misurazione anisotropia e di imaging di fluorescenza vita (FLIM), e con le piattaforme avanzate di microscopia confocale utilizzando, ad impulsi, o l'illuminazione modulata.

Introduction

segnalazione cellulare è al tempo stesso complessa e consequenziale per numerosi campi, tra cui la farmacologia, l'ingegneria dei tessuti e della medicina rigenerativa. strumenti di sperimentazione utili sono necessari per migliorare la nostra comprensione della biologia cellulare e di sviluppare materiali ottimali per la rigenerazione dei tessuti. Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET) di imaging è uno strumento essenziale che consente l'analisi di attivazione del recettore, la conformazione molecolare, e le interazioni supramolecolari (ad es., Proteine ​​/ DNA complessazione) in cellule vive. FRET è un tipo di trasferimento di energia non radiativa tra fluorofori 1. Ha una efficienza che è inversamente proporzionale alla sesta potenza della distanza tra un fluoroforo donatore e accettore fluoroforo. Quindi, può fornire informazioni sulla distanza spaziale tra due molecole differenti o tra le regioni di una molecola alla scala nanometrica (tipicamente 1 - 10 nm) 2. I fluorofori donatore e accettore possono essere diversi mtipi olecule (etero-FRET), in cui il donatore ha la emissione di energia più elevata (più corta lunghezza d'onda), o dello stesso tipo (omo-FRET). FRET di immagini può essere eseguita su cellule fissate o vivi, ma in generale cellule fissate sono utilizzati per l'imaging di interazioni molecolari ad alta risoluzione spaziale quando i sistemi confocale ad alta velocità sono disponibili. Cellule vive sono utilizzati per studiare le interazioni ei processi che sono inibiti o alterato da fissaggio, come ad esempio il tempo reale di segnalazione intracellulare di risposta 3.

studi cellule vive che impiegano FRET uso di immagini bidimensionali (2D) colture cellulari in parte a causa della semplicità e minore sfondo (nessuna emissione di fuori delle cellule piane). Tuttavia, culture 2D alterano anche numerosi processi cellulari rispetto al microambiente fisiologica e tridimensionali (3D) coltura 4,5. Ad esempio, la cella originaria cellula e cellula di interazioni della matrice extracellulare sono drasticamente alterato nella cultura 2D che porta alle easglia cambiamenti nella morfologia cellulare e la polarità 6 osservato. Microdomini di membrana (ad es., Caveolae e lipidi zattere) e segnalazione dei recettori sono fortemente regolati dalla cultura ambiente, in parte perché si legano i componenti del citoscheletro 7,8 e la struttura delle cellule e la forma del citoscheletro sono fortemente regolati dalla cultura ambiente spaziale 9. Meccanotrasduzione non solo è influenzata dalla matrice 3D, ma più complesse condizioni di carico secondarie generato in ambienti 3D rispetto alle colture 2D 10. Infine, la permeabilità delle matrici 3D è inferiore al mezzo di coltura, in generale, con diminuzione diffusione e aumentato legame della cellula molecole di segnalazione rispetto alle colture 2D. Con culture 3D si è in grado di creare e osservare un microambiente più simile alla fisiologica rispetto al collante, chimica, e segnali meccanici. Cella per le interazioni delle cellule può essere promosso e le proprietà adesive possono essere controllati with la struttura, composizione e architettura (patterning) del materiale 3D 11-13. Le proprietà meccaniche del materiale possono altresì essere adattati dalla composizione e struttura 14,15. Coltura di cellule in idrogel pertanto permessi Fret studi su cellule primarie che sarebbero altrimenti de-differenziare o variazione fenotipo utilizzando tecniche convenzionali, ad es., Le cellule dalla cartilagine articolare. Pertanto, è necessario un metodo per consentire test FRET in colture 3D vivi.

ponteggi idrogel sono ideali per studi basati 3D FRET perché possono essere resi otticamente trasparente e adattati per controllare il microambiente e per fornire segnali cellulari. Gli idrogel a base di polimeri naturali sono stati utilizzati in coltura cellulare per decenni, tra gelatina e fibrina 16. Maggiore controllo microambiente cellulare può essere raggiunto con la modificazione chimica di questi polimeri e con l'uso di polimeri sintetici 17,18. hydrogel rigidità meccanica e permeabilità può essere controllata cambiando la composizione polimerica e dimensione (polimero e densità di reticolazione) 19,20 maglia. Inoltre, gli idrogel possono essere fatte bioattivo attraverso l'incorporazione di fattori di crescita e ligandi cellulari. A causa di queste possibilità, lo sviluppo di idrogel per biosensing, somministrazione di farmaci, e applicazioni di ingegneria tissutale è un'area di ricerca molto attiva 21. Stampa 3D di idrogel è inoltre in fase di sviluppo per la realizzazione di micro-tessuti e -organs 15. Così, FRET imaging cellule in idrogel non è solo utile come mezzo per approssimare comportamento cellulare fisiologica, ma anche come strumento per studiare e ottimizzare la crescita tessutale.

Binary sonde FRET raziometriche sono molto utili nello studio segnalazione cellulare e possono essere utilizzati in idrogel culture. Per un elenco parziale di fluorescenza pubblicato e ti agiti sonde, consultare il sito web del Consorzio cellulare migrazione (ad es., Legame di uno ione o molecola, taglio enzimatico della regione) che altera la distanza tra fluorofori e quindi la grandezza FRET (superiori o inferiori) 23. Un tipo di sonda meno comune ma utile si basa su un cambiamento sensibile analita nella sovrapposizione spettrale dei due fluorofori, che altera FRET grandezza. "Single-chain" sonde raziometriche utilizzano una coppia fluoroforo legato su una singola molecola. "Dual-catena" sonde utilizzano coppie fluorofori su molecole separate, ma la loro espressione possono essere accoppiati con lo stesso cassetta di espressione 24. A differenza di studi con l'espressione unico fluoroforo (ad es., Proteine ​​di fusione fluorescenti), studi con raziometricosonde FRET non richiedono doppio trasfezione per il controllo di efficienza di trasfezione o vitalità cellulare. Sonde raziometriche FRET sono relativamente insensibili a efficienza di trasfezione quando espresso di sopra di una soglia minima (concentrazione insensitive) 23,25. Essi sono insensibili alle fluttuazioni sorgente di eccitazione e di altri fattori ambientali intracellulare (ad es., PH, ioni) così a lungo in quanto entrambi i fluorofori sono altrettanto reattivo. Inoltre, la risposta non è soggetta a ritardi trascrizionale, a differenza fluorescenti e bioluminescenti promotore-reporter di costrutti 26,27.

sonde raziometriche FRET sono facilmente e frequentemente utilizzati nei sistemi microscopio widefield epifluorescenza convenzionali. microscopi grandangolari sono preferiti rispetto ai sistemi confocale a scansione linea per l'imaging cellulare dal vivo a causa di preoccupazioni per i costi di sistema, fluoroforo candeggio, e la cattura di cambiamenti di segnale con risoluzione temporale sufficiente. Inoltre, singola cella analeYsis su una vasta popolazione di cellule è possibile con uno stadio e l'immagine di acquisizione motorizzato su più campi di vista. Widefield microscopia richiede un'analisi basata intensità dei segnali delle sonde etero-tasto. Anche se l'analisi intensità non richiede hardware complesse come altri metodi tasto, è necessario un maggiore lavoro di post-acquisizione per correggere gli effetti di comportamenti fluoroforo e configurazioni di sistema microscopio / di imaging 28. L'intensità di emissione catturato di un fluoroforo è una funzione dell'energia di eccitazione, fluoroforo resa quantica, e il filtro combinato e fotocamera / rivelatore di sensibilità spettrale e linearità 2. Questi possono essere dissimile per il donatore e accettore e richiederanno di calibrazione per l'analisi quantitativa. Inoltre, l'imaging dell'emissione accettore è influenzata dalla sovrapposizione spettrale dei fluorofori (eccitazione di accettore da donatore luce di eccitazione e sanguinare-through di emissione del donatore in spettri di emissione accettore) 2.4, a catena singola "sonde sono internamente normalizzati perché i loro fluorofori sono equimolare su scala nanometrica, mentre i fluorofori di" "possono esistere sonde in diversi stoichiometries tutta una cella 25,28 Se i fluorofori di." Dual-catena a catena singola " sonde di luminosità simile (funzione del coefficiente di estinzione e la resa quantica), gli effetti di sensibilità del rivelatore non lineari sono piccole e solo correzione per la fluorescenza di fondo e il quantum sensibilità rendimento / rivelatore accoppiato è necessario 23. Così "single-chain" sonde raziometriche FRET sono più facilmente implementati in widefield microscopia a 24.

Questo articolo descrive una tecnica semplice per eseguire FRET immagini di cellule vive in culture idrogel 3D utilizzando un microscopio convenzionale widefield epifluorescente. Può essere facilmente adottata dai laboratori già conducendo esperimenti FRET in 2D, ma anche laboratori interessati in Intersegnalazione cellulare in microtissues. Qui mostriamo il metodo con misurazione a base di imaging tasto della monofosfato ciclico adenosina (cAMP) livelli in condrociti vivi all'interno photocrosslinking (PC-gel, polietilene glicole dimetacrilato) e thermoresponsive (TR-gel, Matrigel) idrogel. Una sonda FRET raziometrica è utilizzato sulla base di EPAC1 (ICUE1) per rilevare i livelli di cAMP in risposta a forskolin, un agonista chimico per ciclasi che catalizza la conversione di ATP al campo. Camp è uno dei principali secondi messaggeri che mediano G protein-coupled segnalazione dei recettori e attiva vari fattori, tra cui le proteine ​​di scambio a valle direttamente attivati ​​da cAMP (EPACs). I fluorofori allontanano upon cAMP legame al dominio EPAC conseguente diminuzione FRET. Qui descritto è la preparazione dei materiali idrogel, trasfezione delle cellule con la sonda ICUE1, e l'inclusione delle cellule in idrogel 3D. La procedura esperimento 3D tasto e l'analisi delle immagini necessarieper valutare l'attività della sonda per cella sono spiegati. Discutiamo anche i limiti intrinseci di analisi FRET in 2D e 3D utilizzando la microscopia widefield. La tecnica qui presentata è un miglioramento rispetto ai metodi 2D esistenti in quanto consente l'analisi in un contesto più fisiologico e richiede meno correzione dell'immagine e la calibrazione. Grande utilità consiste nel fatto che molti materiali trasparenti possono essere utilizzati durante preferenze cellulari e trasfezione possono essere mantenute.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polydimethylsiloxane (PDMS) [Sylgard 184 Elastomer Kit] Fisher Scientific (Ellsworth Adhesives) NC0162601 Reagents
Polyethylene glycol dimethacrylate (PEGDM) Prepared according to Lin-Gibson with PEG from Sigma Aldrich 95904 Reagents
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate Sigma Aldrich M6514 Reagents
3-glycidoxypropyltrimethoxysilane Sigma Aldrich 440167 Reagents
Dimethyl Phenylphosphonite Sigma Aldrich 149470-5g Reagents
2,4,6-trimethylbenzoyl Chloride Fisher Scientific AC244280100 Reagents
2-Butanone Fisher Scientific AC149670010 Reagents
Lithium Bromide Fisher Scientific AC199871000 Reagents
Isopropanol Sigma Aldrich 190764 Reagents
Sigmacote (siliconizing reagent) Sigma Aldrich SL2 Reagents
Toluene  Fisher Scientific AC36441-0010 Reagents
Phosphate Buffered Saline (PBS) Hyclone SH3025601 Reagents
Opti-MEM Reduced Serum Medium, no phenol red (phenol- and serum-free medium) Life Technologies 11058-021 Reagents
FuGENE HD Transfection Reagent (transfection reagent) Promega E2311 Reagents
Cellstripper (cell dissociation solution) Corning 25-056-CI Reagents
Growth Factor Reduced Matrigel, Phenol Free Corning 356231 Reagents
Forskolin Sigma Aldrich F6886 Reagents
Pipette Tips (10,200,1,000 μl)  Fisher Scientific 02-707-474, 02-707-478, 02-707-480 Disposable lab equipment
Powder Free Examination Gloves Fisher Scientific 19-149-863B Disposable lab equipment
Aluminum foil Fisher Scientific 01-213-100 Disposable lab equipment
Biopsy punch (3 mm) Miltex 3332 Disposable lab equipment
Glass coverslips Fisher Scientific 12-544C Disposable lab equipment
Precoated glass coverslips (epoxysilane) Arrayit CCSL Disposable lab equipment
Glass slide Fisher Scientific 12550D Disposable lab equipment
Sterile vials (15 ml, 50 ml conical) Fisher Scientific 14-959-70C, 14-959-49A Disposable lab equipment
Cell culture dish (6-well) Falcon 351146 Disposable lab equipment
Epifluorescent Microscope with motorized stage Nikon MEA53100 (Eclipse TiE Inverted) Large/non-disposable lab equipment
Adjustable Specimen Holder for XY Stage Nikon 77011393 Non-disposable lab equipment
60X (1.3 NA) objective (CFI Plan Apochromat 60XH Lamda) Nikon MRD01605 Non-disposable lab equipment
CFP/YFP light source and excitation / emission filter holders (Lambda light source & wheel, Lambda emission filter system) Nikon (Sutter Instrument reseller) 77016231, 77016088 Non-disposable lab equipment
CYF/YFP filter set Nikon (Chroma Technology Corp) 77014928 Non-disposable lab equipment
Camera (ORCA Flash 4.0 v1) Nikon (Hamamatsu reseller) 77054076 Non-disposable lab-equipment
NIS-Elements 40.20.02 microscope software) Nikon MQS31100  Non-disposable lab equipment
Prism (spreadsheet and graphing software) GraphPad Software, Inc Version 6 Non-disposable lab equipment
OmniCure S1000 UV Spot Curing Lamp System with 365nm filter or other light source (λ = 365 or 405) OmniCure S1000 Large/non-disposable lab equipment
Pipette Aid  Drummond Scientific Co.  DP-100 Non-disposable lab equipment
Hemacytometer Hausser Scientific Reichert Bright-Line 1475 Non-disposable lab equipment
Vacuum desiccator chamber/degasser  Any Large/non-disposable lab equipment
Tissue Culture Hood  Any Large/non-disposable lab equipment
Chemical Fume Hood  Any Large/non-disposable lab equipment
Oven Any Large/non-disposable lab equipment
Spatula Any Non-disposable lab equipment
Beaker Any Non-disposable lab equipment
Incubator  Any Large/non-disposable lab equipment

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References

  1. Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. Imaging molecular interactions in living cells by FRET microscopy. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, (5), 409-416 (2006).
  2. Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Curr. Opin. Biotechnol. 16, (1), 19-27 (2005).
  3. Lohse, M. J., Nuber, S., Hoffmann, C. Fluorescence/bioluminescence resonance energy transfer techniques to study G-protein-coupled receptor activation and signaling. Pharmacol Rev. 64, (2), 299-336 (2012).
  4. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J. Cell Sci. 125, (13), 3015-3024 (2012).
  5. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol. Bioeng. 103, (4), 655-663 (2009).
  6. Mseka, T., Bamburg, J. R., Cramer, L. P. ADF/cofilin family proteins control formation of oriented actin-filament bundles in the cell body to trigger fibroblast polarization. J. Cell Sci. 120, (24), 4332-4344 (2007).
  7. Holowka, D., Sheets, E. D., Baird, B. Interactions between Fc(epsilon)RI and lipid raft components are regulated by the actin cytoskeleton. J. Cell Sci. 113 (Pt 6), 1009-1019 (2000).
  8. Alenghat, F. J., Ingber, D. E. Mechanotransduction: all signals point to cytoskeleton, matrix, and integrins. Sci Signaling. (119), (2002).
  9. Guilak, F., et al. Control of stem cell fate by physical interactions with the extracellular matrix. Cell stem cell. 5, (1), 17-26 (2009).
  10. Polacheck, W. J., Li, R., Uzel, S. G., Kamm, R. D. Microfluidic platforms for mechanobiology. Lab Chip. 13, (12), 2252-2267 (2013).
  11. Burdick, J. A., Anseth, K. S. Photoencapsulation of osteoblasts in injectable RGD-modified PEG hydrogels for bone tissue engineering. Biomaterials. 23, (22), 4315-4323 (2002).
  12. Benoit, D. S. W., Schwartz, M. P., Durney, A. R., Anseth, K. S. Small functional groups for controlled differentiation of hydrogel-encapsulated human mesenchymal stem cells. Nat. Mater. 7, (10), 816-823 (2008).
  13. Tsang, V. L., et al. Fabrication of 3D hepatic tissues by additive photopatterning of cellular hydrogels. FASEB J. 21, (3), 790-801 (2007).
  14. Zhu, J., Marchant, R. E. Design properties of hydrogel tissue-engineering scaffolds. Expert Rev. Med. Devices. 8, (5), 607-626 (2011).
  15. Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering. Biomaterials. 33, (26), 6020-6041 (2012).
  16. Kumbar, S. G., Laurencin, C. T., Deng, M. Natural and Synthetic Biomedical Polymers. Elsevier. (2014).
  17. Kirschner, C. M., Anseth, K. S. Hydrogels in Healthcare: From Static to Dynamic Material Microenvironments. Acta Mater. 61, (3), 931-944 (2013).
  18. Guvendiren, M., Burdick, J. A. Engineering synthetic hydrogel microenvironments to instruct stem cells. Curr Opin Biotechnol. 24, (5), 841-846 (2013).
  19. Gulrez, S. K. H., Al-Assaf, S., Phillips, G. O. Progress in Molecular and Environmental Bioengineering - From Analysis and Modeling to Technology Applications, Ch. 5. Capri, A. InTech. Europe. 117-149 (2011).
  20. Iza, M., Stoianovici, G., Viora, L., Grossiord, J. L., Couarraze, G. Hydrogels of poly(ethylene glycol): mechanical characterization and release of a model drug. J. Controlled Release. 52, (1-2), 41-51 (1998).
  21. Deligkaris, K., Tadele, T. S., Olthuis, W., van den Berg, A. Hydrogel-based devices for biomedical applications. Sens. Actuators, B. 147, (2), 765-774 (2010).
  22. Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophys. J. 16, (9), 1055-1069 (1976).
  23. Yuan, L., Lin, W., Zheng, K., Zhu, S. FRET-Based Small-Molecule Fluorescent Probes: Rational Design and Bioimaging Applications. Acc. Chem. Res. 46, (7), 1462-1473 (2013).
  24. Spiering, D., Bravo-Cordero, J. J., Moshfegh, Y., Miskolci, V., Hodgson, L. Quantitative ratiometric imaging of FRET-biosensors in living cells. Methods Cell Biol. 114, 593-609 (2013).
  25. Kikuchi, K. Ch 42, Nano/Micro Biotechnology. Advances in Biochemical Engineering Biotechnology. Nagamune, I. E. 119, Springer. Berlin Heidelberg. 63-78 (2010).
  26. Van Dyk, T. K., et al. Rapid and sensitive pollutant detection by induction of heat shock gene-bioluminescence gene fusions. Appl Environ Microbiol. 60, (5), 1414-1420 (1994).
  27. Park, M., Tsai, S. L., Chen, W. Microbial biosensors: engineered microorganisms as the sensing machinery. Sensors. 13, (5), 5777-5795 (2013).
  28. Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem Sci. 32, (9), 407-414 (2007).
  29. Lin-Gibson, S., et al. Synthesis and characterization of PEG dimethacrylates and their hydrogels. Biomacromolecules. 5, (4), 1280-1287 (2004).
  30. Majima, T., Schnabel, W., Weber, W. Phenyl-2,4,6-Trimethylbenzoylphosphinates as Water-Soluble Photoinitiators - Generation and Reactivity of O=P(C6h5)(O-) Radical-Anions. Makromol Chem. 192, (10), 2307-2315 (1991).
  31. Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30, (35), 6702-6707 (2009).
  32. Zhou, J., Ellis, A. V., Voelcker, N. H. Recent developments in PDMS surface modification for microfluidic devices. Electrophoresis. 31, (1), 2-16 (2010).
  33. DiPilato, L. M., Cheng, X., Zhang, J. Fluorescent indicators of cAMP and Epac activation reveal differential dynamics of cAMP signaling within discrete subcellular compartments. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, (47), 16513-16518 (2004).
  34. Occhetta, P., et al. Fabrication of 3D cell-laden hydrogel microstructures through photo-mold patterning. Biofabrication. 5, (3), 035002 (2013).
  35. Kubow, K. E., et al. Crosslinking of cell-derived 3D scaffolds up-regulates the stretching and unfolding of new extracellular matrix assembled by reseeded cells. Integr. Biol. 1, (11-12), 635-648 (2009).
  36. Legant, W. R., Chen, C. S., Vogel, V. Force-induced fibronectin assembly and matrix remodeling in a 3D microtissue model of tissue morphogenesis. Integr. Biol. 4, (10), 1164-1174 (2012).
  37. Cameron, A. R., Frith, J. E., Gomez, G. A., Yap, A. S., Cooper-White, J. J. The effect of time-dependent deformation of viscoelastic hydrogels on myogenic induction and Rac1 activity in mesenchymal stem cells. Biomaterials. 35, (6), 1857-1868 (2014).
  38. Kong, H. J., Polte, T. R., Alsberg, E., Mooney, D. J. FRET measurements of cell-traction forces and nano-scale clustering of adhesion ligands varied by substrate stiffness. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, (12), 4300-4305 (2005).
  39. Poehler, E., et al. Microchamber arrays with an integrated long luminescence lifetime pH sensor. Anal. Biochem. 1-9 (2015).
  40. Son, K. J., Shin, D. S., Kwa, T., Gao, Y., Revzin, A. Micropatterned Sensing Hydrogels Integrated with Reconfigurable Microfluidics for Detecting Protease Release from Cells. Anal. Chem. 85, (24), 11893-11901 (2013).
  41. Aimetti, A. A., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Human Neutrophil Elastase Responsive Delivery from Poly(ethylene glycol) Hydrogels. Biomacromolecules. 10, (6), 1484-1489 (2009).
  42. Grieshaber, S. E., Jha, A. K., Farran, A. J. E., Jia, X. Biomaterials for Tissue Engineering Applications: A Review of the Past and Future Trends, Ch 2. Burdick, J. A., Mauck, R. L. Springer-Verlag. 9-46 (2011).
  43. Chiu, Y. C., Brey, E., Pérez-Luna, V. A Study of the Intrinsic Autofluorescence of Poly (ethylene glycol)-co (L -Lactic acid) Diacrylate. J. Fluoresc. 22, (3), 907-913 (2012).
  44. Dewitt, D. D., Kaszuba, S. N., Thompson, D. M., Stegemann, J. P. Collagen I-Matrigel Scaffolds for Enhanced Schwann Cell Survival and Control of Three-Dimensional Cell Morphology. Tissue Eng., Part A. 15, (10), 2785-2793 (2009).
  45. Taboas, J. M., Tuan, R. S., Hudson, S. D. Bioreactor device, and method and system for fabricating tissues in the bioreactor device. United States patent. PCT/US2006/028417 (2014).
  46. Fedorovich, N. E., et al. The effect of photopolymerization on stem cells embedded in hydrogels. Biomaterials. 30, (3), 344-353 (2009).
  47. Vandame, P., et al. Optimization of ERK activity biosensors for both ratiometric and lifetime FRET measurements. Sensors. 14, (1), 1140-1154 (2013).
  48. Ponsioen, B., et al. Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. EMBO Rep. 5, (12), 1176-1180 (2004).
  49. Klarenbeek, J. B., Goedhart, J., Hink, M. A., Gadella, T. W., Jalink, K. A mTurquoise-based cAMP sensor for both FLIM and ratiometric read-out has improved dynamic range. PLoS ONE. 6, (4), e19170 (2011).
  50. Chen, Y., Periasamy, A. Intensity range based quantitative FRET data analysis to localize protein molecules in live cell nuclei. J. Fluoresc. 16, (1), 95-104 (2006).
FRET Imaging in idrogel tridimensionali
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Donius, A. E., Bougoin, S. V., Taboas, J. M. FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels. J. Vis. Exp. (114), e54135, doi:10.3791/54135 (2016).More

Donius, A. E., Bougoin, S. V., Taboas, J. M. FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels. J. Vis. Exp. (114), e54135, doi:10.3791/54135 (2016).

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