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Immunology and Infection

कापा (Vκ) के लिए एंटीबॉडी बंधन विशिष्टता प्रकाश श्रृंखला युक्त मानव (आईजीएम) एंटीबॉडी: Polysialic एसिड (पीएसए) एक केस स्टडी के रूप में NCAM से जुड़ी

Published: June 29, 2016 doi: 10.3791/54139
Automatic Translation
1,2,3, 1,3,5, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 3,4, 1,2,3
1Department of Neurology, Mayo Clinic, 2Mayo Clinic Center for Multiple Sclerosis and Autoimmune Neurology, Mayo Clinic, 3Center for Regenerative Medicine, Neuroregeneration, Mayo Clinic, 4Division of Neonatal Medicine, Mayo Clinic, 5Department of Pediatric and Adolescent Medicine, Mayo Clinic

Introduction

आईजीएम निर्धारण के एंटीबॉडी कैंसर और सीएनएस विकारों 1-7 सहित विभिन्न रोगों के उपचार के लिए महान चिकित्सीय क्षमता प्रदर्शित करता है। Vollmers 'समूह ट्यूमर विशिष्ट बायोमार्कर या सक्रिय चिकित्सा विज्ञान है कि apoptotic रास्ते 4,8,9 उत्प्रेरण द्वारा घातक कोशिकाओं को मारने में सक्षम हैं के रूप में संभावित इस्तेमाल के लिए कैंसर के रोगियों में कई एंटीबॉडी की पहचान की। दिलचस्प है, चिकित्सीय क्षमता के साथ सभी की पहचान एंटीबॉडी आईजीएम निर्धारण के हैं और "प्राकृतिक स्वप्रतिपिंडों" (nabs) के समूह के हैं।

इसी तरह, रोड्रिगेज के समूह माउस और मानव एंटीबॉडी कि मल्टिपल स्क्लेरोसिस (एमएस) के मॉडल में चिरकाल demyelinated रीढ़ की हड्डी घावों में remyelination को प्रोत्साहित पहचान की। विरोधी कैंसर प्रभाव के साथ एंटीबॉडी के लिए समान है, सभी remyelination को बढ़ावा देने के एंटीबॉडी nabs हैं और आईजीएम निर्धारण 1,6,7,10 की। सबसे पहचान IgMs के लिए सटीक एंटीजन अभी भी undetermine हैंएमएस रोगियों 11 के लिए मैं क्लिनिकल परीक्षण मानव remyelination को बढ़ावा देने के एंटीबॉडी rHIgM22, चरण में वर्तमान सहित घ। दोनों शैक्षणिक सेटिंग में और उद्योग 11 के साथ साझेदारी में लिपिड और कार्बोहाइड्रेट अनुसंधान के क्षेत्र में विशेषज्ञों के लगातार प्रयासों के बावजूद, की पहचान करने के rHIgM22 के प्रतिजन सफल नहीं किया गया है प्रयास करता है। मानक आईजीएम एंटीबॉडी के साथ काम करने के लिए आईजीजी के एंटीजन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल की तकनीक की विफलता ये एंटीबॉडी कि सबसे अधिक संभावना लक्ष्य कार्बोहाइड्रेट या लिपिड एंटीजन के लिए विशिष्ट तरीके को निखारने के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता को पहचानती है।

इस पांडुलिपि का ध्यान केंद्रित मानव पुनर्योजी एंटीबॉडी HIgM12 और प्रयोगात्मक अपने प्रतिजन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया प्रक्रियाओं है। एंटीबॉडी HIgM12 Waldenstrom के macroglobulinemia के साथ रोगियों से पहचान की थी, इन विट्रो 12-14 में neurite परिणाम को बढ़ावा देने और polysialic एसिड (पीएसए) तंत्रिका कोशिका आसंजन अणु (पीएसए एनसीए से जुड़ी लक्षित करता हैएम) 15,16। HIgM12 ए एल एस 17 के एक माउस मॉडल में फैली जीवन-काल और Theiler के murine encephalomyelitis वायरस (TMEV) -infected चूहों में कार्यात्मक परिणाम में सुधार। विशेष रूप से, HIgM12 चिरकाल demyelinated चूहों और बढ़ जाती है छोटे और मध्यम व्यास रीढ़ की हड्डी एक्सोन आठ सप्ताह की संख्या में सहज क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर मोटर गतिविधियों को बढ़ावा देने के लिए एक एकल, intraperitoneal की कम खुराक इंजेक्शन एंटीबॉडी 18 के बाद।

तंत्रिका कोशिका आसंजन अणु (NCAM) इम्युनोग्लोबुलिन (आईजी) superfamily न्यूरॉन्स, glia, कंकाल की मांसपेशी, और प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं 19-25 की कोशिका की सतह पर व्यक्त की एक ग्लाइकोप्रोटीन है। तीन प्रमुख NCAM isoforms करार दिया NCAM180, NCAM140, और NCAM120, एक प्राथमिक प्रतिलेख के वैकल्पिक ब्याह वेरिएंट कि उनके cytoplasmic डोमेन में ही भिन्न हैं। सीएनएस के भीतर, NCAM प्रमुख polysialylated अणु (> 95%) लंबे, नकारात्मक आरोप लगाया सियालिक एसिड homopolymers के साथ है। Polysialic एकn> 10 के साथ सीआईडी ​​पीएसए कहा जाता है, लेकिन कम oligomeric संरचनाओं का अस्तित्व भी है कि जैविक रूप से प्रासंगिक हैं। अन्य polysialylated सीएनएस में व्यक्त प्रोटीन SynCAM1 26, Neuropilin -2 (NRP -2) 27,28 रहे हैं और एक सोडियम चैनल सबयूनिट 25 (समीक्षा के लिए 29 देखें)।

यहाँ वर्णित विधियों विशिष्ट कापा (Vκ) प्रकाश चेन (मानव एंटीबॉडी और माउस एंटीबॉडी के लिए VκI प्रकाश श्रृंखला के लिए VκI, VκIII या VκIV प्रकाश चेन) युक्त मानव और माउस इम्युनोग्लोबुलिन के लिए प्रतिजन पहचान की अनुमति एंटीबॉडी का निर्धारण (जैसे, आईजीजी, आईजीएम की परवाह किए बगैर , आईजी ऐ, आईजीडी या आईजीई)। इस सीमा आईजीएम निर्धारण के एंटीबॉडी के साथ immunoprecipitations के लिए प्रोटीन एल agarose के उपयोग पर आधारित है। वैकल्पिक रणनीतियों mannose बाध्यकारी lectins और covalently मोती agarose से जुड़े माध्यमिक आईजीजी विरोधी आईजीएम एंटीबॉडी, जो अधिक आईजीएम एंटीबॉडी के लिए इस पद्धति के प्रयोग व्यापक हो सकता है शामिल हो सकते हैं इंकलैम्ब्डा (λ) प्रकाश चेन के साथ उन luding (चर्चा देखने के लिए)। 1 30: आईजीएम λ प्रकाश स्वस्थ व्यक्तियों से निकाली गई चेन की तुलना में सीरम आईजीएम Vκ प्रकाश चेन का अनुपात 1.5 रहे हैं।

Chromatographic यहां इस्तेमाल किया, अलग समृद्ध, और प्रतिरक्षा के कुछ अणुओं का पता लगाने के 31 कार्यप्रणाली के आधार पर, सभी एंटीजन कम से कम एक छोटे प्रोटीन डोमेन शामिल करने के लिए आवश्यक हैं। एंटीबॉडी के विशिष्ट बंधन मिलान के भीतर या प्रोटीन डोमेन (जैसे, ग्लाइकोप्रोटीन, लिपो प्रोटीन में) के बाहर हो सकता है। प्रारंभिक जैव रासायनिक HIgM12 के लिए विशिष्ट प्रतिजन पहचान करने के लिए संभावित उम्मीदवारों की सूची को कम करने के लिए संबंधित इस्तेमाल किया कदम, इस विधि में सबसे महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। सेल प्रकार विशिष्ट तैयारियाँ और सेल आकृति विज्ञान आधारित अभिलक्षण glial कोशिकाओं के लिए वर्णित हैं लेकिन इस पद्धति के भीतर या बाहर सीएनएस अन्य प्रकार की कोशिकाओं को समायोजित करने के लिए extrapolated किया जा सकता है।

वहाँ एक जरूरी हैविशेष रूप से उन मामलों में अलग-अलग मानव विकारों के लिए चिकित्सीय क्षमता (आईजीएम एंटीजन के बहुमत) के साथ आईजीएम एंटीबॉडी जहां एंटीबॉडी लक्ष्यों कार्बोहाइड्रेट या लिपिड संरचनाओं हैं की बढ़ती संख्या के लिए लागू नई या संशोधित तकनीक विकसित करने की जरूरत है।

Protocol

पशु प्रोटोकॉल और प्रक्रियाओं के स्वास्थ्य के दिशा निर्देशों के राष्ट्रीय संस्थानों के अनुसार आयोजित की और मेयो क्लीनिक के संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समितियों (मेयो IACUC प्रोटोकॉल संख्या # A51912) द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. सामान्य सीएनएस ऊतक तैयार

  1. उत्पन्न NCAM की कमी (KO) C57 / BL6 पृष्ठभूमि heterozygotes पार करके, विषमयुग्मजी NCAM चूहों और जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) littermates (C57 / BL6) (कृपया डा लिन Landmesser, केस वेस्टर्न रिजर्व विश्वविद्यालय, क्लीवलैंड, ओहियो द्वारा प्रदान की) पर चूहों। NCAM को चूहों की जीनोटाइपिंग पहले से वर्णित किया गया था 32-34 और आगे विस्तार से समझाया नहीं किया जाएगा।

नोट: 1.2 कदम - 1.6 वैकल्पिक हैं।

  1. सर्जरी से पहले, एक pentobarbital समाधान के लिए प्रशासन (स्टॉक: 25 मिलीग्राम / एमएल, जल्दी प्रसव के बाद संबंधित वयस्क चरणों के लिए pentobarbital के 50/100 μl) intraperitoneal इंजेक्शन (27 गेज सुई और 1 मिलीलीटर के माध्यम सेसिरिंज)।
  2. 2 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें या जानवर तक संज्ञाहरण के एक शल्य चिकित्सा विमान तक पहुँच गया है। प्रत्येक आपरेशन के दौरान आवश्यक के रूप में अतिरिक्त संवेदनाहारी प्रशासन संज्ञाहरण के एक शल्य चिकित्सा विमान बनाए रखने के लिए। संज्ञाहरण की गहराई का निर्धारण करने के लिए पैर की अंगुली चुटकी-प्रतिक्रिया विधि का प्रयोग करें। पशु जारी रखने से पहले अनुत्तरदायी होना चाहिए।
  3. आवरण और पेट की दीवार सिर्फ रिब पिंजरे के नीचे के माध्यम से 1 सेमी पार्श्व चीरा - एक 0.5 बनाओ। ध्यान से डायाफ्राम से जिगर अलग। एक घुमावदार, कुंद कैंची का उपयोग डायाफ्राम में एक छोटा सा चीरा। रिब पिंजरे के पूरी लंबाई के साथ डायाफ्राम चीरा जारी फुफ्फुस गुहा का पर्दाफाश करने के लिए।
  4. घुमावदार, कुंद कैंची रिब पिंजरे के एक पक्ष के साथ प्लेस, ध्यान से फेफड़ों विस्थापित, और हंसली के लिए रिब पिंजरे के माध्यम से एक काट कर। contralateral पक्ष पर एक समान कटौती करें। उरोस्थि भारोत्तोलन दूर, इसे ध्यान से दिल को जोड़ने के किसी भी ऊतक ट्रिम।
  5. पशु के लिए एक चीरा'सही आलिंद आईरिस कैंची का उपयोग संभव के रूप में बड़े रूप में एक दुकान बनाने के लिए है। धीरे-धीरे पशु के बाएं वेंट्रिकल में फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 10 मिलीलीटर इंजेक्षन (प्रकाश लाल, प्रवाह दर: 1 मिलीग्राम / मिनट) एक 10 मिलीलीटर 27 गेज सुई के साथ सुसज्जित सिरिंज का उपयोग करके। ऊतक विनाश से बचने के लिए छिड़काव के दौरान दबाव / पीबीएस के प्रवाह में वृद्धि नहीं करते।
  6. शल्य कैंची का उपयोग करके नवजात चूहों सिर काटना।
  7. एक संदंश के साथ आँख कुर्सियां ​​हथियाने के द्वारा और स्पाइनल कॉलम में एक छोटे से कैंची डालने से मस्तिष्क निकालें। कान के स्तर पर सामने की ओर खोपड़ी कट। पील वापस खोपड़ी और धीरे से एक 60 मिमी पेट्री बर्फ पर ठंडा विदारक माध्यम के 10 मिलीलीटर (तालिका 1) के साथ भरा डिश में मस्तिष्क जगह है। एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में प्रत्येक मस्तिष्क की जगह और तुरंत सूखी बर्फ पर दुकान (-79 डिग्री सेल्सियस)।
  8. बर्फ पर एक साफ रेजर ब्लेड का उपयोग जमे हुए दिमाग से सेरिबैलम और मस्तिष्क स्टेम काटकर अलग कर देना। जल्दी से काम ऊतक विगलन से बचने के लिए।
  9. तौलनाजमे हुए मस्तिष्क, बर्फ पर एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में डाल दिया है और 150 μl lysis बफर प्रति ग्राम के मस्तिष्क के ऊतकों की एक अंतिम एकाग्रता के लिए ठंडा lysis बफर (1 टेबल देखें) जोड़ें। शेष प्रमस्तिष्क के लिए दोहराएँ। कदम 1.9 के लिए हर समय बर्फ पर दिमाग रखें - 1.11।
  10. 1 मिलीलीटर विंदुक टिप (10 बार) एक 5 मिलीलीटर 27 गेज सुई (10 बार) के साथ सुसज्जित सिरिंज के माध्यम से विचूर्णन के द्वारा पीछा के माध्यम से विचूर्णन द्वारा lysis बफर में दिमाग Homogenize। बर्फ पर अतिरिक्त 30 मिनट के लिए मस्तिष्क lysates सेते पूरा ऊतक सेल की अनुमति है।
  11. (4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 19,000 XG पर चार राउंड) सीरियल centrifugation के माध्यम से डिटर्जेंट अघुलनशील सामग्री और मस्तिष्क लिपिड निकालें। त्यागें (सफेद) माइलिन और सेल गोली युक्त मलबे लेकिन हर centrifugation कदम के बाद सतह पर तैरनेवाला बरकरार रहती है। अशेष मस्तिष्क lysates और दुकान -80 डिग्री सेल्सियस पर।

2. मानव IgMs (HIgM12 और निर्धारण नियंत्रण आईजीएम) का उपयोग करना Immunoprecipitations के रूप में एक "पुल से नीचे" सेरीब्रा से एजेंटगुम्मट के एल lysates और NCAM को चूहों

  1. प्रोटीन एल agarose मनका तैयारी 9,35,36
    1. बीएसए (1 टेबल देखें) सहित आईपी बफर के 200 मिलीलीटर की तैयारी। बीएसए के बिना ही आईपी बफर के एक और 200 मिलीलीटर की तैयारी।
    2. प्रति immunoprecipitation प्रतिक्रिया हस्तांतरण प्रोटीन एल Agarose एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में एक 200 μl पिपेट का उपयोग घोल के 100 μl। नहीं भंवर प्रोटीन एल agarose मोती करो! आईपी ​​बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ें प्रत्येक ट्यूब (1 टेबल देखें)। मिक्स प्रोटीन एल agarose और उलटा के माध्यम से आईपी बफर स्वयं (पांच बार)।
    3. धो प्रोटीन एल agarose मोती centrifugation द्वारा चार बार एक benchtop अपकेंद्रित्र में (1000 XG, 2 मिनट, 25 डिग्री सेल्सियस)। agarose गोली परेशान बिना एक 200 μl पिपेट का उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला उतारो। दोहराएँ धोने 2.1.2 2.1.3 से तीन अतिरिक्त बार दोहराएँ।
    4. प्रोटीन एल agarose 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर एक रोलर पर हौसले से जोड़ा आईपी बफर के 1 मिलीलीटर में संतुलित करना।
  2. एंटीबॉडी प्रतिजन-Agarose एल जटिल गठन और पश्चिमी blots में एंटीजन जांच
    1. lysed मस्तिष्क के ऊतकों (~ 200 μl lysate) का 30 मिलीग्राम ठंडा आईपी बफर के 1 मिलीलीटर में आईजीएम एंटीबॉडी (HIgM12) के 20 माइक्रोग्राम के साथ एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में रात भर एक रोलर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    2. नीचे 1,000 XG, 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए एक benchtop अपकेंद्रित्र में (कदम 2.1.4 से) प्रोटीन एल agarose मोती स्पिन। agarose गोली परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला एक 200 μl पिपेट का उपयोग त्यागें। ठंडा एंटीबॉडी मस्तिष्क lysate प्रोटीन एल agarose करने के लिए (कदम 2.2.1 से) समाधान के लिए एक 1 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कर जोड़ें।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर एक रोलर पर 2 घंटे के लिए एंटीबॉडी प्रतिजन प्रोटीन एल agarose निलंबन सेते हैं। 2 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 1,000 XG पर centrifugation के माध्यम से एल agarose से जुड़ी एंटीबॉडी प्रतिजन जटिल धो लें। ध्यान से गोली परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला त्यागें और ठंडा आईपी 0.2% BSA युक्त बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
    4. ठंडा आईपी 0.2% BSA और दो अतिरिक्त समय बीएसए बिना ठंडा आईपी बफर का उपयोग युक्त बफर का उपयोग धोने कदम दोहराएँ एक बार और।
    5. एंटीबॉडी प्रतिजन 2 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 1,000 XG पर एल agarose से जुड़ी जटिल स्पिन। सतह पर तैरनेवाला त्यागें पूरी तरह से पहले तक ~ समाधान के 50 μl प्रोटीन एल agarose गोली एक 10 μl पिपेट के द्वारा पीछा के शीर्ष पर छोड़ दिया जाता है एक 200 μl पिपेट का उपयोग। बर्फ पर नमूने रखें।
    6. आईपी ​​क्षालन बफर के 40 μl जोड़े 95 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए प्रति 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब, उंगली झटका नलियों 6 बार और गर्मी (1 टेबल देखें)। 2 मिनट के लिए बर्फ पर नमूने रखो और 13,000 XG, 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड के लिए नीचे स्पिन।
    7. गोली परेशान बिना एक ताजा 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में एक 10 μl पिपेट (~ 35 μl कुल) का उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण। भीतरी ट्यूब दीवार पर eluted नमूने की एक छोटी राशि के नीचे rinsing द्वारा प्रोटीन एल agarose मोती के अभाव की पुष्टि करें।
      नोट: "दानेदार"प्रोटीन एल agarose मोती स्पष्ट रूप से मौजूद है, तो दिखाई दे रहे हैं।
    8. प्रोटीन एल agarose मोती मौजूद हैं, तो नीचे 13,000 XG पर एक और 30 सेकंड के लिए नमूना स्पिन और ट्यूब साफ करने के लिए सतह पर तैरनेवाला हस्तांतरण। दोहराएँ चरण तक कोई agarose मोती का पता लगता है।
    9. लोड 10 - एक Tris / ग्लाइसिन / एसडीएस बफर सिस्टम में एसडीएस polyacrylamide जेल पर अच्छी तरह से प्रति eluted नमूने के 20 μl (1 टेबल देखें)।
      नोट: - 8.6 x 6.7 x 0.1 सेमी) 7.5% या 4 का उपयोग पीएसए NCAM या NCAM isoforms (जेल आयाम (डब्ल्यू एक्स एल एक्स मोटाई का पता लगाने के लिए अच्छी तरह से प्रति 50 μl लोड हो रहा है मात्रा के साथ 20% ढाल जैल।
    10. Benchtop पर 100 वी पर ~ 1 घंटे के लिए चलाने के लिए जैल (1.74 वी / 2 सेमी)। अतिरिक्त ठंडा इस कदम 37,38 के लिए आवश्यक नहीं है।
    11. PVDF के लिए स्थानांतरण प्रोटीन (polyvinylidene फ्लोराइड) झिल्ली 100 वी पर ठंडे कमरे में 2.5 घंटा (1.74 वी / सेमी 2) ठंड स्थानांतरण बफर उपयोग करने के लिए (ताकना आकार 0.45 माइक्रोन) (5 - 10 डिग्री सेल्सियस) (1 टेबल देखें)।
    12. ब्लॉक झिल्ली with 10% (w / v) सूखे दूध एक benchtop कक्षीय प्रकार के बरतन पर 25 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए पीबीएस-टी में पाउडर, झिल्ली दो बार पीबीएस-टी के साथ 10 मिनट और जांच के लिए रात भर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ 5% BSA में PBS- में धो ठंडे कमरे में एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर टी।
    13. अगली सुबह धोने झिल्ली एक बार अतिरिक्त पीबीएस-टी के साथ संक्षिप्त 25 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर प्रत्येक (80 आरपीएम) के लिए पीबीएस-टी के साथ 3 washes के द्वारा पीछा (ढक्कन और कंटेनर में शामिल हैं) (सभी धोने कदम 25 पर प्रदर्शन कर रहे हैं डिग्री सेल्सियस)।
    14. माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ें (हॉर्सरैडिश peroxidase (एचआरपी) HIgM12 के लिए विरोधी मानव विरोधी आईजीएम एंटीबॉडी () (कमजोर पड़ने 1 संयुग्मित: 1hr के लिए पीबीएस-टी में 5% शुष्क दूध पाउडर में 30,000) एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर 25 डिग्री सेल्सियस पर (70 आरपीएम )।
    15. धो झिल्ली बड़े पैमाने पर एक बार अतिरिक्त पीबीएस-टी के साथ संक्षिप्त 25 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर प्रत्येक (80 आरपीएम) के लिए पीबीएस-टी के साथ 3 washes के द्वारा पीछा (ढक्कन और कंटेनर में शामिल हैं) (सभी धोने कदम 25 डिग्री सेल्सियस पर प्रदर्शन कर रहे हैं) ।
    16. ठंडा बढ़ाया chemiluminescen के 1 मिलीलीटर मिक्ससीई एचआरपी सब्सट्रेट घटक ए (बढ़ाया luminol अभिकर्मक) 25 डिग्री सेल्सियस पर घटक बी (ऑक्सीकरण अभिकर्मक) (प्रति मिनी धब्बा) के 1 मिलीलीटर के साथ।
    17. अतिरिक्त तरल दूर करने के लिए (उन्हें बहुत किनारों पर पकड़) एक कागज तौलिया पर झिल्ली हस्तांतरण करने के लिए प्लास्टिक संदंश का प्रयोग करें। कागज तौलिए और डाल झिल्ली वापस कंटेनरों में साथ सूखी कंटेनर (प्रत्येक झिल्ली के लिए एक)। इसके तत्काल बाद पूर्व मिश्रित बढ़ाया chemiluminescence एचआरपी सब्सट्रेट (यौगिक ए + बी) (कदम 2.2.16।) प्रत्येक झिल्ली के 2 मिलीलीटर जोड़ने के लिए और एक कक्षीय प्रकार के बरतन (90 आरपीएम) पर 25 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए सेते हैं। यकीन झिल्ली बनाओ समान रूप से chemiluminescence अभिकर्मक से सिक्त कर रहे हैं।
    18. एक पारदर्शी प्लास्टिक आस्तीन में स्थानांतरण झिल्ली और कागज तौलिये के साथ अतिरिक्त तरल और हवा के बुलबुले को हटा दें। एक फिल्म कैसेट में प्लास्टिक आस्तीन में झिल्ली रखो और अंततः कैसेट में प्लास्टिक आस्तीन टेप। कैसेट बंद करें।
    19. कैसेट, फिल्म, टाइमर और darkroom में कैंची ले लो। प्रत्येक फाई से ऊपरी दाहिने कोने कटउन्मुखीकरण प्रयोजनों के लिए एलएम, (अलग) समय के विभिन्न अवधियों के लिए फिल्में (10 सेकंड, 1 मिनट, 10 मिनट) बेनकाब और एक फिल्म डेवलपर में फिल्मों का विकास।

3. Endoneuraminidase-एनएफ पीएसए के पाचन NCAM 39 से जुड़ी

  1. डाइजेस्ट प्रसव के बाद दिन (पी) 7 WT चूहों और P7 NCAM को चूहों से lysed मस्तिष्क के ऊतकों endoneuraminidase-एनएफ (एंडो एनएफ) का उपयोग कर बर्फ पर 2 घंटे के लिए (कदम 1.12 से तैयार) के रूप में 2 टेबल 39 में सचित्र।
  2. 3.1 कदम (तालिका 2) से - प्रत्येक ट्यूब (6 1) के लिए 4x Laemmli नमूना बफर के 5 μl जोड़ें।
  3. एक 4 पर लोड नमूने - 20% ढाल एसडीएस polyacrylamide जेल और दोहराने 2.2.19 के लिए 2.2.10 कदम। पीबीएस में 5% BSA में HIgM12 (1 माइक्रोग्राम / एमएल), व्यावसायिक रूप से उपलब्ध विरोधी पीएसए एमएबी (क्लोन 2-2B) (1 माइक्रोग्राम / एमएल) और β-actin एंटीबॉडी (लोडिंग नियंत्रण) (1 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ जांच झिल्ली -टी।

4. चूहा और माउस सीएनएस संस्कृति की तैयारी

  2. 4 के लिए 60 डिग्री सेल्सियस - - 50 में 1 एम एचसीएल में एसिड धोने 25 मिमी कांच coverslips एक धूआं हुड में 16 घंटा एक ग्लास कंटेनर का उपयोग कर। कभी कभी कोमल घूमता माध्यम से coverslips आंदोलन।
  3. धो गिलास बड़े पैमाने पर आसुत जल (3x) में coverslips। खड़ी coverslips के बीच एसिड बाहर धोने के लिए सुनिश्चित करें।
  4. 100% इथेनॉल में coverslips कुल्ला और एक सेल संस्कृति हुड में Parafilm पर उन्हें सूखी। उपयोग से पहले एक दिन, 24 एक ओवन में 100 डिग्री सेल्सियस पर ढक्कन के साथ एक ग्लास कंटेनर में घंटे के लिए कांच coverslips गर्मी।
  5. कांच coverslips 6 अच्छी तरह से पकवान और कोट में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए बाँझ पानी में 40 माइक्रोग्राम / एमएल पाली डी lysine के 3 मिलीलीटर के साथ रखो।
  6. बाँझ पानी के साथ दो बार धोएं, सेल संस्कृति हुड के तहत पूरी तरह से सूखे और 20 मिनट के लिए यूवी प्रकाश लागू होते हैं।
  • सीएनएस प्रकोष्ठों के लिए टिशू कल्चर प्लास्टिक की तैयारी
    1. कोट 60 मिमी सेल संस्कृति व्यंजन या 75 सेमी 3 के साथ 2 टिशू कल्चर बोतलमिलीलीटर या 10 मिलीलीटर, क्रमश: 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 40 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर बाँझ पानी में पाली-D-लाइसिन की।
    2. पानी के साथ दो बार धोएं, सेल संस्कृति हुड के तहत पूरी तरह से सूखे और 20 मिनट के लिए यूवी प्रकाश लागू होते हैं।
  • चूहा मिलाया Glia अलगाव 40
    1. नवजात चूहों में IACUC अनुमोदित सीओ 2 गैस की आपूर्ति (पूरी तरह से automatized) के साथ कृंतक इच्छामृत्यु चैम्बर anesthetize। जानवर के unresponsiveness निर्धारित करने के लिए पैर की अंगुली चुटकी-प्रतिक्रिया विधि का प्रयोग करें। (- एक समय में 10 पिल्ले 6) नवजात Sprague Dawley चूहे (P0P1) सिर काटना।
    2. एक संदंश के साथ आँख कुर्सियां ​​हथियाने के द्वारा और स्पाइनल कॉलम में एक छोटे से कैंची डालने से मस्तिष्क निकालें। कान के स्तर पर सामने की ओर खोपड़ी कट। पील वापस खोपड़ी और धीरे से एक 60 मिमी पेट्री बर्फ पर ठंडा विदारक माध्यम के 10 मिलीलीटर से भरा डिश में मस्तिष्क जगह (1 टेबल देखें)।
    3. (- 10 पिल्ले 6) चूहा पिल्ले शेष के लिए दोहराएँ। 4.3.7 - कदम 4.3.2 के लिए बर्फ पर ऊतक रखें। दो मस्तिष्क गोलार्द्धों में midline के साथ मस्तिष्क फूट डालो और बाद में घ्राण बल्ब, सेरेब्रल कॉर्टेक्स नीचे बेसल ganglia और Dumont संदंश के साथ हिप्पोकैम्पस काट दिया। बर्फ पर मध्यम विदारक युक्त एक साफ पेट्री डिश में पृथक सेरेब्रल कॉर्टेक्स रखें।
    4. एक कोर्टेक्स ले लो। एक विच्छेदन खुर्दबीन के तहत ठीक सुझावों के साथ संदंश के साथ तानिका निकालें।
    5. शेष cortices के साथ दोहराएँ। सभी तानिका मुक्त cortices बर्फ पर एक साफ पेट्री डिश में रखें।
    6. एक 60 मिमी पेट्री डिश में सभी पिल्ले से cortical गोलार्द्धों का मिश्रण है और 1 मिमी कीमा टुकड़ों में मस्तिष्क के ऊतकों पासा के लिए एक बाँझ धार का उपयोग करें।
    7. एक बाँझ, uncoated 500 मिलीलीटर कांच फ्लास्क में एक 10 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कीमा मस्तिष्क के ऊतकों स्थानांतरण और चूहे के मस्तिष्क के प्रति ठंडा विदारक माध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़ें। धीरे कुप्पी ज़ुल्फ़, जबकि चूहे के मस्तिष्क प्रति HBSS के 9 मिलीलीटर HBSS (हांक बैलेंस्ड नमक समाधान) (5 मिलीग्राम / एमएल trypsin) में trypsin समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ने। 2 जोड़ेDNase मैं समाधान (1 मिलीग्राम / एमएल) और MgSO 4 समाधान में कुल मात्रा का 2% में कुल मात्रा का% (HBSS में 3.82% MgSO 4 (डब्ल्यू / वी)) मस्तिष्क के ऊतकों निलंबन के लिए और धीरे ज़ुल्फ़।
    8. कोमल के तहत Trypsinize ऊतक 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए एक बारी-बारी से एक प्रकार के बरतन पर मिलाते हुए। सुनिश्चित करें कि ऊतक के टुकड़े इस कदम के दौरान चल रहे हैं और नीचे करने के लिए तलछट नहीं करते हैं। घूर्णन गति यदि आवश्यक बढ़ाएँ।
    9. भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) 10% (वी / वी) के अंतिम एकाग्रता में जोड़ें और 10 सेकंड के लिए कुप्पी 10 बार घूमता द्वारा मिश्रण। 15 मिनट के लिए बर्फ के पानी में ऊतक निलंबन शांत हो जाओ। भंवर धीरे पांच बार हर दूसरे मिनट फ्लास्क।
    10. धीरे 200 XG, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 25 मिलीलीटर या 50 मिलीलीटर pipettes और सेंट्रीफ्यूज का उपयोग कर बाँझ 50 मिलीलीटर ट्यूब में ऊतक निलंबन हस्तांतरण।
    11. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और धीरे 15 ठंडा विदारक मध्यम भ्रूण गोजातीय सीरम के 5 मिलीलीटर के साथ पूरक की मिलीलीटर में पच सीएनएस ऊतक resuspend, 0.4 मिलीग्राम MgSO 4 समाधान (3.82%HBSS में MgSO 4) और DNase मैं (1 मिलीग्राम / एमएल) के 1.6 मिलीलीटर।
    12. दो बाँझ 15 मिलीलीटर ट्यूबों में विभाजित ऊतक निलंबन समान रूप से (~ 10 मिलीलीटर प्रत्येक) और धीरे धीरे एक 10 मिलीलीटर पिपेट (10 बार) का उपयोग triturate जब तक निलंबन पंकिल / दूधिया बन जाता है। अगले ट्यूब प्रसंस्करण जबकि बर्फ पर निलंबित कर दिया कोशिकाओं रखें। 3 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें जब तक शेष पचा सीएनएस ट्यूब के नीचे तलछट ऊतकों। स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला गोली अंश को परेशान किए बिना 50 मिलीलीटर ट्यूब साफ करने के लिए।
    13. वैकल्पिक रूप से, 40 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से परेशान supernatants के पास है और बर्फ पर बाँझ 50 मिलीलीटर ट्यूब में जिसके परिणामस्वरूप एकल कक्ष निलंबन गठबंधन।
    14. 200 XG, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेल घोल स्पिन।
    15. धीरे सतह पर तैरनेवाला एक 10 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग को दूर तक ~ 2 मध्यम विदारक मिलीलीटर सेल गोली के शीर्ष पर छोड़ दिया जाता है।
    16. 50 मिलीलीटर ट्यूब (~ 10 बार) में फिंगर झटका सेल छर्रों। धीरे धीरे गर्म मध्यम विकास के 5 मिलीलीटर जोड़ने जबकि धीरे सेल निलंबन के लिए (1 टेबल देखें)हाथ ट्यूब घूमता।
    17. वैकल्पिक रूप से, एक अतिरिक्त 10 नए सिरे से DNase मैं समाधान और MgSO 4 -solution दिखाई ऊतक समूहों या डीएनए झुरमुटों के मामले में साथ बर्फ पर मिनट के लिए DNase कदम 4.3.12 को दोहराएँ। भंवर ट्यूब मैन्युअल 5 बार हर दूसरे मिनट।
    18. प्लेट 6 अच्छी तरह से थाली में 400 μl मध्यम विकास की एक पोखर में प्रति 25 मिमी कांच coverslip 50,000 कोशिकाओं और कोशिकाओं को एक सेल कल्चर इनक्यूबेटर (5% सीओ 2, 37 डिग्री सेल्सियस) में 30 मिनट के लिए देते हैं।
    19. मिला हुआ के लिए (24 के भीतर - चढ़ाना के बाद 48 घंटा) 60 मिमी सेल संस्कृति व्यंजन और 75 सेमी 2 टिशू कल्चर बोतल, थाली 500,000 कोशिकाओं (60 मिमी पकवान) या 2 लाख कोशिकाओं (75 सेमी 2 बोतल)।
    20. धीरे (प्रति खैर, 6 अच्छी तरह से थाली में 25 मिमी कांच coverslips), 3 मिलीलीटर (60 मिमी व्यंजन) या प्रत्येक के लिए गर्म मध्यम विकास के 10 मिलीलीटर (75 सेमी 2 बोतल) अच्छी तरह से 2 मिलीलीटर जोड़ें। रात भर कोशिकाओं को सेते हैं और अगली सुबह मध्यम पूरी तरह से बदल जाते हैं। तब हर दूसरे दिन (दिन 3, 5 दिन, 7 दिन, आदि) मध्यम बदलें।
      नहींते: - चढ़ाना के बाद 48 घंटा चूहा मिश्रित संस्कृतियों glia 24 immunocytochemistry या जैव रसायन के लिए उपयोग करने के लिए तैयार हैं।
  • माउस मिश्रित glial संस्कृतियों
    1. 4.3.1 4.3.6 करने के लिए वर्गों में वर्णित नवजात चूहे के दिमाग के विच्छेदन, C57 / BL6 पृष्ठभूमि के साथ P0 नवजात WT और NCAM को चूहों सिर काटना, दिमाग को हटाने और उन्हें ठंडा विदारक माध्यम में डाल करने के लिए समान है (1 टेबल देखें)। हर समय बर्फ पर ऊतक रखें।
    2. दो मस्तिष्क गोलार्द्धों में midline के साथ मस्तिष्क फूट डालो और बाद में घ्राण बल्ब, सेरेब्रल कॉर्टेक्स नीचे बेसल ganglia और Dumont संदंश के साथ हिप्पोकैम्पस काट दिया। बर्फ पर HBSS युक्त एक साफ पेट्री डिश में पृथक सेरेब्रल कॉर्टेक्स रखें।
    3. एक कोर्टेक्स ले लो। एक विच्छेदन खुर्दबीन के तहत ठीक सुझावों के साथ संदंश के साथ तानिका निकालें। शेष cortices के साथ दोहराएँ। सभी तानिका मुक्त cortices बर्फ पर एक साफ पेट्री डिश में रखें।
    4. cortical hemisphe स्थानांतरणअलग, बाँझ 15 मिलीलीटर ट्यूबों में प्रत्येक माउस से 1 मिलीलीटर विंदुक के साथ रेस। प्रत्येक मस्तिष्क के लिए 1.2 मिलीलीटर ठंडा विदारक मध्यम जोड़ें और यंत्रवत् यह 2 बार pipetting और 1 मिलीलीटर विंदुक टिप का उपयोग कर नीचे मस्तिष्क के ऊतकों को बाधित।
    5. 150 μl papain समाधान (10 मिलीग्राम / पीबीएस में मिलीलीटर), 100 μl DNase मैं समाधान (1 मिलीग्राम / मिलीलीटर HBSS में) और 50 μl MgSO 4 (HBSS में 3.82%) प्रत्येक मस्तिष्क में जोड़ें और उंगली flicking द्वारा मिश्रण।
    6. एक पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए मस्तिष्क निलंबन सेते हैं और मस्तिष्क निलंबन मिश्रण उंगली flicking द्वारा हर दूसरे मिनट। ट्यूब प्रति FBS के 1 मिलीलीटर जोड़ें, मिश्रण और बर्फ पर 10 मिनट के लिए ऊतक निलंबन शांत हो जाओ।
    7. 200 XG, 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 मिनट के लिए मस्तिष्क के ऊतकों नीचे स्पिन और DNase मैं समाधान के 70 μl (1 मिलीग्राम / HBSS में एमएल) के 30 μl के साथ पूरक ठंडा विदारक बफर के 1 मिलीलीटर में ऊतक गोली resuspend MgSO 4 समाधान (HBSS में 3.82%)।
    8. एक का उपयोग कर मस्तिष्क के ऊतकों Triturate FBS लेपित 1 मिलीलीटर विंदुक टिप(~ 5 बार) जब तक सतह पर तैरनेवाला परेशान हो जाता है। एक 40 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला पास और बर्फ पर एक साफ ट्यूब में हस्तांतरण।
    9. 200 XG, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए centrifugation के माध्यम से मिश्रित glial कोशिकाओं गोली। माध्यम की सतह पर तैरनेवाला महाप्राण ~ तक 100 μl सेल गोली के शीर्ष पर छोड़ दिया जाता है। उंगली flicking (~ 5 बार) और गर्म माउस मध्यम विकास के 1 मिलीलीटर जोड़ने के द्वारा Resuspend सेल गोली (1 टेबल देखें)।
    10. वैकल्पिक रूप से, दिखाई सेल समूहों और lysed कोशिकाओं को भंग / धीरे सेल निलंबन ऊपर और नीचे (पांच बार) pipetting द्वारा डीएनए उपजी।
    11. 4.3.21 - प्लेट माउस पीडीएल लेपित गिलास coverslips या 60 मिमी बर्तन पर मिश्रित glial कोशिकाओं कदम 4.3.19 में वर्णित है। गर्म माउस मध्यम विकास और बाद में हर दूसरे दिन के साथ अगली सुबह कोशिकाओं को धो लें। चढ़ाना के बाद 72 घंटा - माउस मिश्रित glia immunocytochemistry 48 के लिए उपयोग करने के लिए तैयार है।
  • चूहा Microglia अलगाव
    1. संस्कृति चूहा मिलायामध्यम विकास में 75 सेमी 2 टिशू कल्चर बोतल में glia 10 दिनों के लिए (1 टेबल देखें)। 1 घंटे के लिए 140 rpm पर एक सेल कल्चर इनक्यूबेटर (5% सीओ 2, 37 डिग्री सेल्सियस) के अंदर एक घूर्णी प्रकार के बरतन पर मिश्रित glial संस्कृतियों से microglial सेल समूहों हिला दिया था।
    2. मिश्रित glia संस्कृतियों से microglia युक्त सतह पर तैरनेवाला उतारो, एक 40 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से इसे पारित और बाँझ 50 मिलीलीटर ट्यूब में सेल निलंबन रहते हैं।
      नोट: microglial संस्कृतियों कुछ दूषित OPCs और बहुत कुछ astrocytes के साथ इस कदम के बाद आम तौर पर> 95% शुद्ध कर रहे हैं।
    3. वैकल्पिक रूप से, भविष्य microglial हिला-नापसंद के लिए मिश्रित glia संस्कृतियों पर मध्यम विकास की जगह। आमतौर पर मिश्रित glial संस्कृतियों से (एक बार प्रति सप्ताह) कई microglial हिला-नापसंद करते हैं।
    4. वैकल्पिक रूप से, purities उच्च 95% प्लेट microglia युक्त सतह पर तैरनेवाला (कदम 4.5.2) प्रति 100 मिमी पेट्री डिश के 10 मिलीलीटर पाने के लिए और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए एक सेल कल्चर इनक्यूबेटर में सेते हैं। केवल microglआइए पेट्री डिश के लिए देते हैं, जबकि astrocytes और OPCs सतह पर तैरनेवाला में रहते हैं।
    5. धीरे पेट्री डिश दक्षिणावर्त और वामावर्त सेल संस्कृति हुड में (प्रत्येक पांच बार) हिला। महाप्राण सेल संस्कृति के माध्यम से पूरी तरह से और मध्यम विकास के 10 मिलीलीटर के साथ बदलें। परिणामस्वरूप microglia संस्कृतियों> 98% शुद्ध कर रहे हैं।
    6. DMEM में अप करने के लिए 7 दिनों के लिए संस्कृति microglia 1% FBS और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक।
  • चूहा ओपीसी / oligodendrocyte अलगाव
    1. प्राप्त करने के लिए अत्यधिक समृद्ध संस्कृतियों ओपीसी 1 घंटे के लिए 140 rpm पर एक सेल कल्चर इनक्यूबेटर (5% सीओ 2, 37 डिग्री सेल्सियस) के भीतर एक घूर्णी प्रकार के बरतन पर 75 सेमी 2 बोतल में उगाई 10 दिन पुराने मिश्रित glial संस्कृतियों से पहले microglial कोशिकाओं हिला दिया था। त्यागें microglia केवल युक्त सतह पर तैरनेवाला या microglia-विशिष्ट प्रयोगों (5.5 कदम देखें) के लिए इस्तेमाल करते हैं।
    2. 10 मिलीलीटर मध्यम विकास के साथ microglial युक्त सतह पर तैरनेवाला बदलें और मिश्रित glial संस्कृतियों से हिला200 आरपीएम (5% सीओ 2, 37 डिग्री सेल्सियस) पर एक घूर्णी प्रकार के बरतन पर एक और 18 घंटा।
    3. मिश्रित glia संस्कृतियों से microglia- और ओपीसी युक्त सतह पर तैरनेवाला लीजिए और एक 40 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से गुजरती हैं। बाँझ 50 मिलीलीटर ट्यूब में सेल निलंबन लीजिए।
    4. वैकल्पिक रूप से, भविष्य ओपीसी हिला-नापसंद के लिए मिश्रित glia संस्कृतियों पर मध्यम विकास की जगह।
      नोट: OPCs कम पैदावार के साथ astrocytic फीडर परतों पर पैदा जारी है और हिल बंद किया जा सकता है एक दूसरी और तीसरी बार (एक बार प्रति सप्ताह), यद्यपि।
    5. प्लेट microglia- और 100 मिमी पेट्री डिश में ओपीसी युक्त सतह पर तैरनेवाला और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेल कल्चर इनक्यूबेटर में सेते के 10 मिलीलीटर। Microglia पेट्री डिश के लिए देते हैं, जबकि OPCs और astrocytes सतह पर तैरनेवाला में रहते हैं।
    6. धीरे पेट्री डिश दक्षिणावर्त और वामावर्त एक सेल संस्कृति हुड में (5 बार प्रत्येक) हिला। सेल संस्कृति इनक्यूबेटर से एक समय में केवल कुछ ही पेट्री डिश बाहर ले जाओ (microglia पालतू पशु से dislodging शुरू कर देंगेरी व्यंजन जब कूलर माध्यम में सख्ती हिल)।
    7. लीजिए और 50 मिलीलीटर ट्यूब में ओपीसी युक्त सतह पर तैरनेवाला गठबंधन। वैकल्पिक रूप से, microglia-विशिष्ट प्रयोगों में इस्तेमाल के लिए पेट्री डिश के लिए संस्कृति के माध्यम जोड़ें।
    8. वैकल्पिक रूप से, आगे ओपीसी संस्कृतियों की पवित्रता ओपीसी तैयारी में microglia की हद तक कम करने के लिए नए सिरे से पेट्री डिश के साथ एक बार कदम 5.6.5 और 5.6.6 दोहराने बढ़ाने के लिए।
    9. 250 XG, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज में समृद्ध ओपीसी युक्त सतह पर तैरनेवाला स्पिन। धीरे सेल गोली परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला aspirate। गोली के शीर्ष पर सतह पर तैरनेवाला के 3 मिलीलीटर छोड़ दो और उंगली flicking (10 बार) द्वारा OPCs resuspending शुरू करते हैं।
    10. (- 10 बार 5) एक 10 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग करके धीरे Triturate ओपीसी सेल समूहों।
    11. कोशिकाओं की गणना और 6 अच्छी तरह से थाली में 400 μl मध्यम विकास की एक पोखर में प्रति 25 मिमी कांच coverslip (पीडीएल-लेपित) 50,000 OPCs थाली और कोशिकाओं को एक सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए देते हैं (5% सीओ 2, 376; सी)। धीरे अच्छी तरह से गर्म प्रसार मध्यम (1 टेबल देखें) प्रत्येक के 2 मिलीलीटर जोड़ें। के लिए पीडीएल लेपित 60 मिमी सेल संस्कृति बर्तन, प्लेट 1 - 1.5 दस लाख प्रसार माध्यम के 3 मिलीलीटर में OPCs।
    12. ध्यान से OPCs चढ़ाना के बाद नए सिरे से प्रसार मध्यम 3 घंटा के साथ प्रसार मध्यम FBS युक्त जगह (यकीन है कि ठीक से जुड़ी OPCs बनाने के लिए और मध्यम परिवर्तन के दौरान जगह देना नहीं है)। एक्सचेंज मध्यम हर दूसरे दिन।
      नोट: चूहा ओपीसी संस्कृतियों इस प्रोटोकॉल का उपयोग आम तौर पर प्रमुख contaminating सेल प्रकार, astrocytes द्वारा पीछा के रूप में microglia के साथ 90% शुद्ध कर रहे हैं तैयार।

    • 5. Immunocytochemistry प्राथमिक glial कोशिकाओं में HIgM12 का प्रयोग

    1. ट्रिपल-लेबल इम्यूनोफ्लोरेसेंस HIgM12, विरोधी पीएसए एमएबी, और सेल प्रकार WT और NCAM को चूहों से प्राथमिक glial कोशिकाओं में विशिष्ट मार्कर का उपयोग
      1. जीवित कोशिका शर्तों के तहत, लेबल 60% मिला हुआ माउस पीडीएल-लेपित पर हो WT और NCAM को चूहों से glia संस्कृतियों मिलाया25 HIgM12 (10 माइक्रोग्राम / एमएल) और विरोधी पीएसए एमएबी (क्लोन 2-2B) (10 माइक्रोग्राम / एमएल) पीबीएस के साथ मिमी कांच coverslips 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 10% FBS के साथ पूरक।
      2. कोशिकाओं और 20 सेकंड ठंडा पीबीएस के साथ प्रत्येक 10% FBS के साथ पूरक के लिए तीन बार धोएं 25 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए पीबीएस में 4% paraformaldehyde, पीएच 7.4 के साथ तय कर लो।
      3. तय कोशिकाओं और 25 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए पीबीएस, पीएच 7.4 में 0.1% ट्राइटन-X100 के साथ कोशिकाओं permeabilize 1 मिनट पीबीएस के साथ प्रत्येक 10% FBS के साथ पूरक के लिए दो बार धोएं। और 1 मिनट के लिए दो बार कोशिकाओं को धो लें glial मार्कर GFAP (astrocytes) या आईबीए-1 (microglia) (1 माइक्रोग्राम / एमएल) पीबीएस में साथ लेबल ठंडे कमरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर 10% FBS के साथ पूरक।
      4. सहित DAPI युक्त बढ़ते मध्यम 31 मानक immunofluorescence शर्तों के साथ आगे बढ़ें।
        नोट: उपयोग की fluorescently मानव के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी (HIgM12) और माउस (विरोधी पीएसए एमएबी, क्लोन 2 - 2 बी) के रूप में फैब लेबल 2 टुकड़े IgMs पुरजोर सिफारिश की है।
      5. फ्लोरिडा ले लो60X या 100X बढ़ाई uorescent छवियों। सभी छवियों और प्रक्रिया छवियों हूबहू के लिए एक ही साधन सेटिंग्स का प्रयोग करें।
    2. HIgM12 एक प्राथमिक एंटीबॉडी के रूप में उपयोग करते हुए एंडो एनएफ इलाज गुम्मट Glia प्रकोष्ठों के immunofluorescence लेबलिंग
      1. संस्कृति WT माउस मिलाया Neurobasal ए में 3 दिनों के लिए उगाया glia 10% FBS और पीडीएल लेपित 25 मिमी कांच coverslips पर B27 पूरक (1:50) के साथ पूरक। एंडो एनएफ (30 माइक्रोग्राम / एमएल) 1 मिलीलीटर संस्कृति के माध्यम से जोड़ें और एक सेल कल्चर इनक्यूबेटर में रातोंरात सेते (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2)।
      2. लेबल कोशिकाओं HIgM12 और निर्धारण और permeabilization के बाद आंतरिक astrocytic मार्कर GFAP के साथ ठंड में रहते 5.1.1 5.1.5 के लिए कदम में वर्णित है। 60X या 100X बढ़ाई फ्लोरोसेंट छवियों ले लो। सभी छवियों के लिए एक ही साधन सेटिंग्स का प्रयोग करें और हूबहू प्रक्रिया।

    Representative Results

    यह खंड कि सीएनएस में मानव आईजीएम विशेष पीएसए एंटीजन का अध्ययन करके प्राप्त किया जा सकता परिणामों का उदाहरण दिखाता है। जैव रासायनिक सेटिंग्स में और फ्लोरोसेंट immunocytochemistry द्वारा विशिष्ट Vκ प्रकाश चेन युक्त मानव आईजीएम एंटीबॉडी का उपयोग दिखाया गया है।

    HIgM12 मस्तिष्क मस्तिष्क lysates से अपने प्रतिजन immunoprecipitates और पश्चिमी blots में एक एजेंट का पता लगाने (प्राथमिक एंटीबॉडी) के रूप में कार्य करता है। न तो निर्धारण नियंत्रण एंटीबॉडी और न ही agarose एल मोती एक समान प्रतिजन, जो (चित्रा 1) नीचे खींच की विशिष्टता को दर्शाता है immunoprecipitate। WT और NCAM को चूहों से सीएनएस lysates का उपयोग करते हुए पश्चिमी blots पीएसए युक्त NCAM (2A चित्रा) के लिए HIgM12 बाध्यकारी की विशिष्टता प्रदर्शित करता है। एंडो एनएफ का उपयोग कर गुम्मट चूहों से सीएनएस ऊतक के enzymatic पाचन HIgM12 के लिए विशिष्ट बंधन मिलान (चित्रा 2 बी के रूप में NCAM से जुड़ी पीएसए पहचानती)। विधि के साथ साथ उल्लिखित का उपयोग करना, उच्च शुद्धता की आईबीए -1 पॉजिटिव चूहे microglial संस्कृतियों प्राप्त कर रहे हैं (चित्रा 3)। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध विरोधी पीएसए एंटीबॉडी (क्लोन 2-2B) तय की कोशिका की सतह या आंतरिक पीएसए पूल लेबल और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा आईबीए -1 पॉजिटिव microglial कोशिकाओं permeabilized नहीं है। पहले प्रकाशित साहित्य, जो microglia 16,41 में पीएसए NCAM का कोई सेल सतह अभिव्यक्ति HIgM12 शुद्ध चूहे microglia में कोशिका की सतह एंटीजन लेबल नहीं है रिपोर्टों के अनुरूप। दिलचस्प है, एक intracellular में तय की और permeabilized microglia परिणाम, perinuclear पैटर्न है कि विशिष्ट अंगों (चित्रा 3) तक ही सीमित नहीं है HIgM12 लेबलिंग। परिणाम एक विरोधी पीएसए आईजीजी एंटीबॉडी (क्लोन 735) 26 है, जो Golgi 41 के स्तर पर microglia में पीएसए SynCAM लक्ष्य का उपयोग प्राप्त उन लोगों के विपरीत हैं।

    microglia के विपरीत, HIgM12और जीवित कोशिका की स्थिति (चित्रा 4) के तहत अत्यधिक समृद्ध चूहे ओपीसी संस्कृतियों में A2B5 लक्ष्य कोशिका की सतह एंटीजन। ओपीसी संस्कृतियों ~ 5% microglial कोशिकाओं को दूषित होते हैं। चित्रा 5 GFAP पॉजिटिव astrocytes में HIgM12 और विरोधी पीएसए एमएबी (क्लोन 2-2B) के बीच एक लगभग समान सेल सतह धुंधला पैटर्न (चित्रा 5 ए) को दिखाता है। एंडो एनएफ-पच गुम्मट astrocytes की Immunofluorescent लेबलिंग HIgM12 astrocytic पीएसए (चित्रा 5 ब) की उपस्थिति दर्शाता का उपयोग कर नियंत्रण का इलाज गुम्मट astrocytes बफर करने के लिए की तुलना में। विवो में पीएसए पॉजिटिव astrocytes की मौजूदगी अभी भी इस बात की पुष्टि की जानी है।

    आकृति 1
    चित्रा 1:। HIgM12 के रूप में एक "पुल से नीचे" HIgM12 का उपयोग कर तीन महीने की उम्र में चूहों के मस्तिष्क की कुल lysate से Immunoprecipitations Immunoprecipitations में एजेंट, मानव निर्धारण नियंत्रण HIgM में कार्य करता हैकेवल "नीचे खींच" एजेंट के रूप में 126 या agarose एल मोती। Eluted प्रोटीन HIgM12 के खिलाफ जांच की झिल्ली के साथ पश्चिमी blots में चलाए जा रहे थे। (- 73 केडीए ~ 65) IgMs भारी श्रृंखला के अलावा 200 केडीए - HIgM12 लिपटे मोतियों से eluted प्रोटीन की आणविक भार 160 की रेंज में थे। यह आंकड़ा जे से संशोधित किया गया है Neurochem। 15। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्र 2

    चित्रा 2: HIgM12 लक्ष्य Polysialic एसिड (पीएसए) आधा भाग NCAM पर। P7, P13, P16 और p27 NCAM से ए मस्तिष्क homogenates को चूहों और विषमयुग्मजी littermate नियंत्रण HIgM12, पीएसए और β-actin लोडिंग नियंत्रण के रूप खिलाफ जांच की झिल्ली के साथ पश्चिमी blots में चलाए जा रहे थे कुल। जे से संशोधित किया गया है Neurochem। 15। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्र तीन
    चित्रा 3: चूहा Microglia पर पीएसए की अनुपस्थिति HIgM12 लेबलिंग की कमी से नजर आता है चूहा microglia पाली डी lysine लेपित गिलास coverslips पर 48 घंटे के लिए सुसंस्कृत थे और या तो HIgM12 के साथ या HIgM12 या विरोधी के साथ निर्धारण के बाद बर्फ पर लाइव लेबल। -PSA एमएबी (क्लोन 2-2B)। टी कोशिकाओं थेriple साथ microglia मार्कर आईबीए -1 (हरा), HIgM12 / पीएसए (लाल) और DAPI (नीला) लेबल। छवियाँ microglial कोशिका की सतह HIgM12 (ऊपरी पंक्ति) का उपयोग बंधन और बाध्यकारी (क्लोन 2-2B) कोशिका की सतह और प्राथमिक चूहे microglia (कम पंक्ति) में आंतरिक स्टोर करने के लिए विरोधी पीएसए की कमी की कमी दिखाने के लिए। द्विध्रुवी आकृति विज्ञान और आईबीए -1 धुंधला की अनुपस्थिति के आधार पर, छोटे पीएसए पॉजिटिव सेल (कम पंक्ति) एक ओपीसी होने का सुझाव दिया गया था। तय कोशिकाओं में, HIgM12 धुंधला एक चितला, perinuclear पैटर्न है कि विशिष्ट अंगों तक ही सीमित नहीं किया गया था और गैर विशिष्ट बंधन (मध्य पंक्ति) माना जाता था में हुई। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्रा 4
    चित्रा 4: HIgM12 चूहा OPCs पर कोशिका की सतह पीएसए NCAM लक्ष्य चूहा OPCs और microglia cultu थे।पाली डी lysine लेपित गिलास coverslips और ट्रिपल पर प्रसार माध्यम में 4 दिनों HIgM12 या A2B5 (हरा), आंतरिक बृहतभक्षककोशिका / monocyte मार्कर CD68 के साथ बर्फ पर लाइव लेबल के लिए लाल (क्लोन ED-1) (लाल) और DAPI (नीला) । छवियाँ सेल आबादी majorly ओपीसी मार्कर A2B5 (ऊपरी पंक्ति) और HIgM12 (कम पंक्ति) कुछ CD68 पॉजिटिव microglia के साथ (~ 5%) के लिए सकारात्मक दिखा। चरण विपरीत और DAPI छवियों सेल अखंडता और प्रत्येक आबादी के लिए सेल नंबर प्रकट करने के लिए जोड़ा गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्रा 5
    चित्रा 5: HIgM12 और विरोधी पीएसए एमएबी माउस मिश्रित glia में एक astrocytic उप-जनसंख्या सह-लेबल। WT और NCAM से ए माउस मिश्रित glial कोशिकाओं कुल astrocytes, oligodendrocyte-वंश कोशिकाओं और microg युक्त KO जानवरोंlia 3 दिनों के लिए सुसंस्कृत थे और HIgM12 (हरा), विरोधी पीएसए एमएबी (क्लोन 2-2B) (लाल) और बाद में astrocytic मार्कर GFAP (बैंगनी) और DAPI (नीला) के लिए के साथ बर्फ पर लाइव लेबल। HIgM12 और विरोधी पीएसए GFAP पॉजिटिव गुम्मट astrocytes पर एक आभासी समान धुंधला पैटर्न का पता चलता है, लेकिन NCAM को चूहों से सुसंस्कृत astrocytes के लिए बाध्य की कमी है। यह आंकड़ा जे से संशोधित किया गया है Neurochem। 15। बी मिश्रित glia हूबहू ए के तहत वर्णित और endoneuraminidase-एनएफ (कृपया डा मार्टिना Muehlenhoff द्वारा प्रदान की) या पीबीएस नियंत्रण के साथ रात भर इलाज के रूप में सुसंस्कृत थे। प्रकोष्ठों HIgM12 (हरा) और बाद में आंतरिक मार्कर GFAP (लाल) और DAPI (नीला) के लिए दाग के साथ बर्फ पर लाइव लेबल रहे थे। HIgM12 पीबीएस नियंत्रण पर कोशिका की सतह एंटीजन मिश्रित glial संस्कृतियों का इलाज किया, लेकिन नहीं endoneuraminidase-एनएफ मिश्रित glia इलाज किया निशाना बनाता है। यह आंकड़ा JNSCI 16 से संशोधित किया गया है। Plयह आंकड़ा कम करने का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    सभी छवियों को एक ही साधन सेटिंग्स का उपयोग 60X बढ़ाई लिया और हूबहू प्रोसेस किया गया।

    तालिका एक
    तालिका 1:। बफर और समाधान व्यंजनों कृपया यहाँ इस तालिका डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें।

    सीएनएस ऊतक एंडो एनएफ / पीबीएस लिसेस बफ़र कुल मात्रा
    1. WT माउस 67 माइक्रोग्राम (0.45 μl) 2 μl (12 माइक्रोग्राम) एंडो एनएफ 7.55 μl 10 μl
    2. WT माउस 67 माइक्रोग्राम (0.45 μl) 2 μl पीबीएस 7.55 μl 10 μl
    3. WT माउस 67 माइक्रोग्राम (0.45 μl) कोई पीबीएस या एंडो एनएफ 9.55 μl 10 μl
    4. NCAM KO माउस 67 माइक्रोग्राम (0.45 μl) 2 μl (12 माइक्रोग्राम) एंडो एनएफ 7.55 μl 10 μl
    5. NCAM KO माउस 67 माइक्रोग्राम (0.45 μl) 2 μl पीबीएस 7.55 μl 10 μl
    6. NCAM KO माउस 67 माइक्रोग्राम (0.45 μl) कोई पीबीएस या एंडो एनएफ 9.55 μl 10 μl

    तालिका 2: P7 WT और NCAM को चूहों से सीएनएस ऊतक के एंडो एनएफ पाचन।

    Discussion

    मानव प्राकृतिक आईजीएम स्वप्रतिपिंडों immunotherapies के लिए उम्मीदवारों अपील कर रहे हैं और कैंसर और सीएनएस विकारों 1-7 सहित विभिन्न रोगों के उपचार के लिए चिकित्सीय क्षमता का प्रदर्शन किया है। हितकर, ये एंटीबॉडी एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में जो निष्क्रिय करने एंटीबॉडी की पीढ़ी काफी हद तक प्रभावी चिकित्सीय खुराक और प्रभावकारिता को कम कर देता बटोर नहीं होंगे। महत्वपूर्ण बात है, चिकित्सीय क्षमता के साथ सभी एंटीबॉडी आईजीएम निर्धारण के लिए किया गया है और एनएबी प्रदर्शनों की सूची 3-5,8,9,37,40,42-45 करने के लिए संबंधित है। आईजीएम एंटीबॉडी के संभावित नैदानिक ​​अनुप्रयोग के लिए एक बड़ी बाधा उनकी एंटीजन, जो कई मामलों में अनिर्धारित कर रहे हैं की पहचान है। आईजीजी के लिए कार्यरत मानक तकनीक अक्सर एक आईजीएम के प्रतिजन की पहचान करने के लिए लागू नहीं कर रहे हैं।

    इस प्रोटोकॉल पुनर्योजी मानव आईजीएम एंटीबॉडी HIgM12 के लिए प्रतिजन के रूप में पीएसए NCAM की पहचान, पशु मॉडल में प्रभावी का वर्णनएमएस और ए एल एस 15-18 की। इस्तेमाल किया पद्धति मुख्यतः विशिष्ट Vκ प्रकाश चेन VκI, VκIII और VκIV और VκI प्रकाश चेन के साथ माउस एंटीबॉडी के साथ सभी मानव एंटीबॉडी के लिए लागू है, एंटीबॉडी के निर्धारण की परवाह किए बगैर है।

    इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी अनुप्रयोगों में आईजीएम एंटीबॉडी का इस्तेमाल होता है। अधिक विशेष रूप से, सफल एंटीबॉडी immunoprecipitations में पुल से नीचे एजेंट के रूप में कार्य करने के लिए अलग-थलग करने या जटिल ऊतक या सेल संस्कृति lysates के बाहर एक प्रतिजन संतुष्ट करने के लिए आवश्यक हैं। समृद्ध प्रतिजन अंशों निर्धारण नियंत्रण एंटीबॉडी से immunoprecipitations तुलना में किया जा सकता है और बाद में मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा मतभेद के लिए विश्लेषण किया। एक अनिवार्य आवश्यकता है या इस कदम की सीमा सही एंटीबॉडी Vκ प्रकाश श्रृंखला और मेजबान (मानव, माउस) की उपस्थिति प्रोटीन एल agarose के लिए बाध्य एंटीबॉडी के लिए सक्षम है। मन्नान बाध्यकारी प्रोटीन agarose के लिए बाध्य का उपयोग (यह भी calleघ mannose बाध्यकारी लेक्टिन) प्रोटीन एल agarose की बजाय विशिष्ट Vκ प्रकाश चेन बिना IgMs immunoprecipitate के लिए एक संभावित विकल्प नहीं है। हालांकि, के रूप में द्वारा अर्नोल्ड एट अल। 35 में कहा गया है, प्रतिजन बाध्य आईजीएम एंटीबॉडी मन्नान बाध्यकारी प्रोटीन के लिए बाध्य नहीं है, लक्ष्य glycan दुर्गम हो दिखाई देते हैं के रूप में एक बार आईजीएम अपने प्रतिजन के लिए बाध्य किया है। इन निष्कर्षों के आधार पर मन्नान बाध्यकारी प्रोटीन एक बाध्यकारी मैट्रिक्स प्रतिजन लोड आईजीएम अणुओं 35 immunoprecipitate के रूप में इस्तेमाल नहीं किया जा सकता। अन्य संभावित विकल्प के माध्यमिक agarose बाध्य विरोधी आईजीएम आईजीजी 46,47 या सतह सक्रिय चुंबकीय मोती 48 के उपयोग का उपयोग किया जा सकता है। IgMs के खिलाफ निर्देशित आईजीजी रासायनिक आदेश ब्याज की प्रतिजन के साथ एक साथ eluted एंटीबॉडी की हद तक कम करने में एक या agarose जी agarose को crosslinked हो सकता है। एक उचित सफलतापूर्वक पहचान एंटीजन के संबंध में आईजीएम immunoprecipitation के विभिन्न वेरिएंट के बीच तुलना मैंमुश्किल है, क्योंकि ज्यादातर immunoprecipitations को अलग-थलग या उनके एंटीजन में आगे ब्याज के बिना IgMs व्यय करना प्रदर्शन किया गया। इसके अलावा, IgMs का उपयोग कर immunoprecipitations मुख्य रूप से शुद्ध एंटीजन 49 एंटीबॉडी जोखिम के साथ एक पहले से ही जाना जाता है या उम्मीद एकल प्रतिजन पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया गया। Immunoprecipitated सीरम आईजीएम अणुओं की - (15% 10) जब प्रारंभिक सामग्री 50 की तुलना में मानव IgMs के खिलाफ निर्देशित agarose युग्मित IgGs का एक नुकसान यह एक बहुत कम उपज है। इसके विपरीत, सतह सक्रिय चुंबकीय मोती सफलतापूर्वक स्क्रैपी जुड़े तंतुओं 48 immunoprecipitate के लिए आईजीएम सहित विभिन्न isotypes के एंटीबॉडी के लिए लागू किया गया। इस विधि विशिष्ट कापा (Vκ) या लैम्ब्डा (λ) चेन या एक विशेष होस्ट करने के लिए सीमित नहीं है और काफी हद तक immunoprecipitations में इस्तेमाल आईजीएम एंटीबॉडी के स्पेक्ट्रम व्यापक हो सकता है।

    प्रोटोकॉल में एक और महत्वपूर्ण कदम एंटीबॉडी के एक Det के रूप में कार्य करने की क्षमता हैपश्चिमी blots या अन्य स्क्रीनिंग प्लेटफार्मों में एंटीबॉडी (प्राथमिक एंटीबॉडी) ecting। सफल एंटीबॉडी प्रतिजन गैर ईओण या संभवतः ईओण डिटर्जेंट की मौजूदगी में बाध्यकारी अनुमति देने के लिए पर्याप्त रूप से उच्च आत्मीयता के साथ उनकी प्रतिजन लक्ष्य होगा। उच्च संबंध एंटीबॉडी समानता-maturated आईजीजी के बीच आम है, लेकिन आईजीएम निर्धारण, जो वजहों से वहाँ अपेक्षाकृत जैव रासायनिक सेटिंग्स में एजेंट का पता लगाने के रूप में कुछ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आईजीएम एंटीबॉडी हैं में से एक है के एंटीबॉडी के बीच कम आम हैं। उच्च संबंध एंटीबॉडी के बंधन आणविक एंटीजन की immunoprecipitations के लिए और पश्चिमी सोख्ता के लिए एक आवश्यकता है। डिटर्जेंट सांद्रता या आईपी buffers और सेल बफ़र्स में डिटर्जेंट का पूर्ण अभाव को कम प्रतिजन अपने फैब डोमेन के माध्यम से कम आत्मीयता एंटीबॉडी द्वारा लक्षित करने की अनुमति देता है। इसके विपरीत, एंटीबॉडी के अपने एफसी भाग के माध्यम से प्रोटीन एल agarose लक्षित करने की क्षमता काफी हद तक अलग डिटर्जेंट ध्यान केंद्रित की एक सीमा से अधिक निर्धारण नियंत्रण के बीच में प्रभावित नहीं हैtrations। हालांकि, lysis बफर और आईपी बफर में कम डिटर्जेंट एकाग्रता कोशिका झिल्ली विघटन और विशिष्ट अणुओं के अलगाव से बचाता है। इसी तरह, पश्चिमी धब्बा धोने बफ़र्स में एक कम डिटर्जेंट एकाग्रता (जैसे, पीबीएस-टी) कम आत्मीयता एंटीबॉडी के बंधन प्रतिजन की अनुमति देता है, लेकिन एक ही समय में गैर विशिष्ट बंधन को बढ़ाता है और इसलिए एक विकल्प नहीं है।

    एक प्रतिजन प्रोटीन कोर की उपस्थिति इस विधि के लिए एक और आवश्यकता है। Posttranslational संशोधनों (जैसे, ग्लाइकोप्रोटीन, लिपो प्रोटीन) और असंशोधित प्रोटीन, लेकिन नहीं एकमात्र लिपिड या कार्बोहाइड्रेट के साथ प्रोटीन, पश्चिमी blots में पता लगता है। यह उपस्थिति या डिटर्जेंट के अभाव में ऊतक या सेल lysates से लिपिड (जैसे, sphingolipids) immunoprecipitate करने के लिए संभव नहीं है। डिटर्जेंट और लिपिड के भौतिक गुणों, बहुत ही चयनात्मक लिपिड एंटीबॉडी बातचीत अनुमति देने के लिए इसी तरह के हैं, जबकि एक ही समय में डिटर्जेंट बाधित करने के लिए आवश्यक हैंआदेश में झिल्ली विशिष्ट अणुओं के चुनिंदा अलगाव की अनुमति है। हमारी सबसे अच्छा ज्ञान, immunoprecipitations पूरी तरह कार्बोहाइड्रेट के शामिल, एक प्रोटीन कोर के अभाव में करने के लिए, पहले से सूचित नहीं किया गया है। क्योंकि आईजीएम एंटीबॉडी अक्सर कार्बोहाइड्रेट और glycolipids, जो जरूरी नहीं कि एक प्रोटीन इकाई से जुड़े नहीं हैं लक्ष्य यह विशेष रूप से प्रासंगिक हो जाता है। अन्य chromatographic तकनीक एक प्रोटीन कोर के अभाव में वसा और कार्बोहाइड्रेट की जुदाई और immunologic पहचान के लिए आवश्यक हैं। उदाहरण के लिए, टीएलसी प्लेट (इम्युनो-टीएलसी) पर बाद में एंटीबॉडी का पता लगाने के साथ सेलुलर लिपिड की पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी) 51,52 से लागू किया जा सकता है।

    अन्य विरोधी पीएसए एंटीबॉडी पिछले अध्ययनों और परिणाम में वर्णित किया गया है की तुलना में HIgM12 के साथ ही व्यावसायिक रूप से उपलब्ध विरोधी पीएसए आईजीएम के रूप में (क्लोन 2-2B)। सबसे अधिक इस्तेमाल किया पीएसए के क्षेत्र में एंटीबॉडी एक आईजीजी एंटीबॉडी (क्लोन 735) माउस monoc रूप में उपलब्ध हैlonal या खरगोश पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी 53। यह विरोधी पीएसए आईजीजी एंटीबॉडी microglial कोशिकाओं 41 सहित विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं सीएनएस पर SynCAM और NCAM पर पीएसए का पता लगाता है। विरोधी पीएसए आईजीजी एंटीबॉडी के विपरीत, मानव आईजीएम एंटीबॉडी HIgM12, HIgM42 और विरोधी पीएसए माउस आईजीएम (क्लोन 2-2B) चूहों में विभिन्न भ्रूण और जल्दी प्रसव के बाद के चरणों में SynCAM पर पीएसए लक्षित करने में असमर्थ है (लेकिन NCAM पर) , आसानी से पहचाने जा जबकि गैर polysialylated SynCAM है 15। इस्तेमाल किया आईजीएम एंटीबॉडी भी microglial कोशिकाओं (आंकड़े 3 + 4) पर पीएसए का पता लगाने में सक्षम नहीं हैं। एंटीबॉडी isotypes के बीच मनाया मतभेद के लिए एक संभावित व्याख्या यह पीएसए NCAM के स्तर के संभावित कम आत्मीयता के विरोधी पीएसए आईजीजी की तुलना में आईजीएम एंटीबॉडी के बंधन के साथ संयुक्त की तुलना में कम पीएसए SynCAM स्तरों हो सकता है। इस परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए, हम SynCAM वर्तमान में बड़ी मात्रा भ्रूण चरण E17 पर NCAM KO पशुओं में immunoprecipitations प्रदर्शन किया और HIgM12 एक "पुल से नीचे एजेंट 'के रूप में इस्तेमाल किया <sup> 15। E17 गुम्मट littermate में HIgM12 हद तक कि IgMs भारी श्रृंखला के रूप में बाद पश्चिमी धब्बा eluted एंटीजन का उपयोग करने में डेन्टिसिटोमीटरी द्वारा पता लगाया की तुलना में पीएसए NCAM "नीचे खींच लिया" के समान तीव्रता से पता चला है immunoprecipitated नियंत्रण पीएसए NCAM। इस परिणाम के अपने लक्ष्य को पीएसए के लिए कम से कम HIgM12 की पर्याप्त समानता का सुझाव दिया। गुम्मट littermate के विपरीत नियंत्रित HIgM12 NCAM KO पशुओं में SynCAM से जुड़ी पीएसए पता नहीं लगा था। समान परिणाम मानव विरोधी पीएसए आईजीएम HIgM42 का उपयोग कर immunoprecipitations में प्राप्त किया गया। HIgM12 और HIgM42, साथ ही माउस विरोधी पीएसए आईजीएम (क्लोन 2-2B) भ्रूण और प्रसव के बाद विकास के चरणों में WT और NCAM KO जानवरों से पश्चिमी blots में SynCAM पर पीएसए लक्षित करने में असमर्थ थे। HIgM12 की कम राशि की आवश्यकता (0.1 माइक्रोग्राम / एमएल) के लिए विशेष रूप से पश्चिमी blots सीएनएस ऊतक (0.1 माइक्रोग्राम प्रति अच्छी तरह से सीएनएस ऊतक) की थोड़ी मात्रा का उपयोग करने में NCAM से जुड़ी पीएसए पता लगाने के लिए 15 यह संभावना कम समानताएं अकेले हैं कि प्रतीत होता है को देखते हुएतीन अलग अलग तरीकों में HIgM12 द्वारा पीएसए SynCAM का पता लगाने की पूरी कमी के लिए जिम्मेदार है।

    हम निष्कर्ष विरोधी पीएसए आईजीएम एंटीबॉडी और अक्सर प्रकाशित विरोधी पीएसए आईजीजी एंटीबॉडी (क्लोन 735) के बीच महत्वपूर्ण मतभेद हैं। यह स्पष्ट नहीं है कि क्यों व्यावसायिक रूप से उपलब्ध विरोधी पीएसए आईजीएम एंटीबॉडी अतीत में अधिक बार इस्तेमाल नहीं किया गया antiPSA आईजीजी एंटीबॉडी 735 के साथ प्राप्त परिणामों यह विशेष रूप से दिलचस्प है क्योंकि HIgM12 पहले से ही विभिन्न रोग मॉडल में क्षमता साबित कर दी पुष्टि करने के लिए है। अन्य विरोधी पीएसए आईजीएम एंटीबॉडी समान चिकित्सीय प्रभाव पड़ सकता है हालांकि यह स्पष्ट नहीं हुआ है विरोधी पीएसए आईजीजी एंटीबॉडी (क्लोन 735) एमएस और ए एल एस के मॉडल में एक समान चिकित्सीय परिणाम है या नहीं।

    संक्षेप में, यहाँ वर्णित विधि पुनर्योजी मानव एंटीबॉडी HIgM12 के प्रतिजन एमएस के लिए संभावित क्लिनिकल परीक्षण और संभवतः अन्य neurodegenerative रोगों का समर्थन करने के लिए की पहचान करने के लिए मुख्य रूप से इस्तेमाल किया गया। चींटी की पहचानजैविक गतिविधि के साथ एंटीबॉडी के लिए igens कार्रवाई के अपने तंत्र को समझने के रूप में आवश्यक कदम है। यह कई मोनोक्लोनल एंटीबॉडी वर्तमान में सुरक्षा और मानव परीक्षणों में प्रभावकारिता के लिए परीक्षण किया जा रहा है के संदर्भ में विशेष रूप से प्रासंगिक हो जाता है। तिथि करने के लिए चिकित्सकीय परीक्षण आईजीएम एंटीबॉडी की संख्या कम है, वहीं इस एंटीबॉडी वर्ग 1-10,37,40,42-45 की चिकित्सीय क्षमता पर प्रकाश डाला अध्ययन के एक बढ़ती हुई संख्या के साथ हाइब्रिडोमा प्रौद्योगिकी एक साथ हाल के अग्रिमों में नए या के विकास का आग्रह संशोधित तरीकों गैर प्रोटीन आईजीएम एंटीजन की पहचान करने के लिए लागू है।

    Acknowledgments

    इस काम के स्वास्थ्य (R01 GM092993, R01 NS048357 और R21 NS073684) के राष्ट्रीय संस्थानों से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (कैरियर पुरस्कार), जैव प्रौद्योगिकी के लिए मिनेसोटा भागीदारी पुरस्कार और मेडिकल जीनोमिक्स, राष्ट्रीय मल्टीपल स्केलेरोसिस सोसायटी (CA1060A) और नैदानिक ​​और translational विज्ञान के लिए मेयो क्लीनिक केंद्र (CCaTS)। लेखकों Applebaum, हिल्टन, पीटरसन और सैनफोर्ड मूलाधार, चंद्रमा और मर्लिन पार्क निदेशक कोष और McNeilus परिवार से समर्थन स्वीकार करते हैं।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    DMEM Fisher Scientific MT-10-013-CVRF High glucose, with glutamine, with sodium pyruvate, 500 ml
    DMEM/F-12, HEPES Life Technologies 11330-032 500 ml, L-glutamine, sodium pyruvate, high glucose
    Penicillin-Streptomycin Life Technologies 15140-122 10,000 U/ml, 100 ml
    N-2 Supplement (100x) Life Technologies 17502-048 5 ml
    B-27 Supplement (50x) Life Technologies 17504-044 serum free, 10 ml
    Fetal Bovine Serum - Optima Atlanta Biologicals S12450 500 ml
    Sterile water for irrigation Baxter Healthcare #2F7114 USP-1,000 ml, 12/CA
    Poly-D-lysine hydrobromide Sigma P7886-50MG D-Lys-(D-Lys)n-D-Lys · xHBr, Molecular Weight 30,000-70,000 g/mol, 50 mg
    bovine serum albumin fraction V Sigma A-3294-100G heat shock fraction, protease free, pH 7,  purity 98%, 100 g
    D-(+)-Glucose Sigma G5767-500G C6H12O6, Molecular Weight: 180.16 g/mol, ACS reagent, 500 g
    Trypsin from bovine pancreas Sigma T9935-100mg essentially salt-free, lyophilized powder, 9,000 BAEE units/mg protein
    Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma D5025-150KU Type IV, lyophilized powder, 2,000 Kunitz units/mg protein
    Recombinant Rat FGF basic Protein R&D systems 3339-FB-025 BSA as a carrier protein, 25 µg, lyophilized, > 95%, 16.2 kDa
    Recombinant Rat PDGF-AA Protein R&D systems 1055-AA-50 carrier free, 50 µg, lyophilized, > 97%, E. coli-derived, 12.5 kDa
    Neurobasal-A Life Technologies 10888-022 500 ml, No Glutamine, No Aspartic Acid, No Glutamic Acid
    Paraformaldehyde Sigma P6148-1KG crystalline, 1 kg, reagent grade, Molecular Weight 30.03 g/mol (as monomer)
    Tris[hydroxymethyl]aminomethane (Tris bas Biorad #1610719 1 kg, 99.8% pure, powder
    Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Biorad #1610302 1 kg, powder
    Glycine Fisher Scientific BP-381-5 C2H5NO2, Molecular weight: 75.07 g/mol, White crystalline Powder, 5 kg
    Sodium chloride Sigma S7653-5KG NaCl, Molecular Weight: 58.44 g/mol, 5 kg
    Sodium phosphate monobasic Sigma S0751-500G NaH2PO4, Molecular Weight: 119.98 g/mol, 500 g
    Phosphate-buffered Solution 1x (PBS) Cellgro MT-21-040-CV Without Calcium and Magnesium, 6 x 500 ml
    Falcon 60 mm TC-Treated Cell Culture Dish Corning Life Sciences #353002 60 mm Cell Culture Dish, TC-treated polystyrene, 20/pack, sterile
    Falcon 60 mm x 15 mm Petri dish Corning Life Sciences #351007 Not TC-Treated Bacteriological Petri Dish, 20/Pack
    6 well cell culture plates Corning Costar CLS3516 6 well, flat bottom (Individually wrapped), gamma-irradiated, growth area 9.5 c
    75 cm² tissue culture flask Corning Life Sciences 430720U 75 cm² U-Shaped Canted Neck Cell Culture Flask with Plug Seal Cap
    Pierce™ Protein L Plus Agarose ThermoFisher Scientific #20520 2 ml, crosslinked 6% beaded agarose (CL-6B), binding capacity: 10 to 20 mg IgG
    4 - 20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel Biorad 456-1094 10-well, 50 µl, for use with Mini-PROTEAN electrophoresis cells
    Immobilon-P Membrane Millipore IPVH00010 PVDF, 0.45 µm, 26.5 cm x 3.75 m roll
    Anti-Polysialic Acid-NCAM Antibody, clone Millipore MAB5324 50 microliters, Host: mouse, monoclonal IgM
    4x Laemmli Sample Buffer Biorad #1610747 10 ml, 4x premixed protein sample buffer
    2-mercaptoethanol Biorad #1610710 25 ml, 98 % pure, 14.2 M
    Endoneuraminidase-N (Endo-N) ABC Scientific ABC0020 50 microliters, 200 µg/ml, 3,500 U/mg
    25 mm glass coverslips Fisher Scientific 12-545-102 Circles No. 1; Thickness: 0.13 to 0.17 mm; Size: 25 mm
    HEPES buffer solution ThermoFisher Scientific 15630-080 100 ml, 1 M
    Hanks' Balanced Salt Solution 1x (HBSS) Cellgro MT-21-022-CV 500 ml, without Calcium, Magnesium, Phenol Red
    Papain Worthington Biochemical Cooperation LS003119 lyophilized powder, 100 mg
    Magnesiumsulfate Sigma M-2643-500G powder, 500 g
    L-Glutamine Gibco #25030-081 100 ml, 200 mM 

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    References

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    इम्यूनोलॉजी अंक 112 मस्तिष्क संबंधी रोग उत्थान प्रतिजन आईजीएम एंटीबॉडी polysialic एसिड (पीएसए) तंत्रिका कोशिका आसंजन अणु (NCAM) एकाधिक काठिन्य (एमएस) प्रतिरक्षा
    कापा (Vκ) के लिए एंटीबॉडी बंधन विशिष्टता प्रकाश श्रृंखला युक्त मानव (आईजीएम) एंटीबॉडी: Polysialic एसिड (पीएसए) एक केस स्टडी के रूप में NCAM से जुड़ी
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    Watzlawik, J. O., Kahoud, R. J.,… More

    Watzlawik, J. O., Kahoud, R. J., Wootla, B., Painter, M. M., Warrington, A. E., Carey, W. A., Rodriguez, M. Antibody Binding Specificity for Kappa (Vκ) Light Chain-containing Human (IgM) Antibodies: Polysialic Acid (PSA) Attached to NCAM as a Case Study. J. Vis. Exp. (112), e54139, doi:10.3791/54139 (2016).

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