Introduction
Antikroppar av IgM-isotyp demonstrera stor terapeutisk potential för behandling av olika sjukdomar inklusive cancer och CNS-störningar 1-7. Den Vollmers 'gruppen som talrika antikroppar i cancerpatienter för potentiell användning som tumörspecifika biomarkörer eller aktiva terapeutiska medel som är i stånd att döda maligna celler genom att inducera apoptotiska reaktionsvägar 4,8,9. Intressant nog alla identifierade antikroppar med terapeutisk potential är av IgM-isotyp och tillhör gruppen "naturliga autoantikroppar" (NABS).
På liknande sätt identifierat Rodriguez gruppen mus och humana antikroppar som stimulerar remyelinisering hos kroniskt demyelinerade ryggmärgslesioner i modeller av multipel skleros (MS). Identisk med antikroppar med anti-cancereffekter, alla remyelinisering främjande antikroppar är alkoholfria drycker och IgM isotyp 1,6,7,10. De exakta antigener för de flesta identifierade IgM är fortfarande undetermined inklusive mänskliga remyelinisering främjande antikropp rHIgM22, för närvarande i fas I kliniska studier för MS-patienter 11. Trots upprepade försök av experter på området av lipid och kolhydrat forskning både i akademisk miljö och i samarbete med industrin 11, försöker identifiera rHIgM22 antigen har inte varit framgångsrika. Misslyckandet i standardtekniker som används för att identifiera antigener av IgG-antikroppar för att arbeta med IgM-antikroppar identifierar ett kritiskt behov av att förfina metoder som är specifika för dessa antikroppar som troligen mål kolhydrater eller lipid antigener.
Fokus i detta manuskript är den mänskliga regenerativ antikropp HIgM12 och de experimentella metoder som används för att identifiera dess antigen. Antikropp HIgM12 identifierades från patienter med Waldenströms makroglobulinemi, stimulerar neuritutväxt in vitro 12-14 och riktar polysialinsyra (PSA) som är fäst till det neurala cellvidhäftningsmolekyl (PSA-NCAM) 15,16. HIgM12 förlänger livslängden i en musmodell av ALS 17 och förbättrar funktionell utfall Theiler s mus encefalomyelit virus (TMEV) infekterade möss. Specifikt HIgM12 stimulerar spontan horisontell och vertikal motorisk aktivitet hos kroniskt demyelinerade möss och ökar antalet små och medelstora diameter ryggmärgs axoner åtta veckor efter en enda låg dos av intraperitoneal injicerad antikropp 18.
Den neurala celladhesionsmolekyl (NCAM) är ett glykoprotein av immunoglobulin (Ig) super uttrycks på cellytan av neuroner, glia, skelettmuskel, och naturliga mördarceller 19-25. De tre stora NCAM isoformer benämnda NCAM180, NCAM140 och NCAM120, finns alternativa splitsvarianter av en primärt transkript som varierar bara i deras cytoplasmadomän. I CNS, är NCAM huvud polysialylated molekyl (> 95%) med långa, negativt laddade sialinsyra-homopolymerer. polysialinsyra encid med n> 10 kallas PSA men kortare oligomera strukturer finns som också är biologiskt relevant. Andra polysialylated proteiner som uttrycks i CNS är SynCAM1 26, Neuropilin-2 (NRP-2) 27,28 och en natriumkanal subenhet 25 (för granskning se 29).
De metoder som beskrivs här tillåter antigen identifiering av humana och mus immunoglobuliner som innehåller specifika kappa (Vk) lätta kedjor (VκI, VκIII eller VκIV lätta kedjor för humana antikroppar och VκI lätta kedjor för musantikroppar) oberoende av antikroppens isotyp (t.ex. IgG, IgM , IgA, IgD eller IgE). Denna begränsning bygger på användning av protein L agaros för immunoutfällningar med antikroppar av IgM-isotyp. Alternativa strategier kan inkludera mannosbindande lektiner och sekundära IgG anti-IgM-antikroppar kovalent kopplade till agarospärlor, som kan bredda tillämpningen av denna metod för att fler IgM-antikroppar including de med lambda (λ) lätta kedjor (se diskussion). Förhållanden av serum IgM VK lätta kedjor jämfört med IgM λ lätta kedjor härledda från friska individer är 1,5: 1 30.
Baserat på det kromatografiska metod som används för att separera, berika och immunologiskt detektera vissa molekyler 31 alla antigener måste innehålla åtminstone en liten proteindomän. Antikroppens specifika bindnings epitop kan vara inom eller utanför den proteindomän (t.ex. i glykoproteiner, lipoproteiner). Inledande biokemiska steg som används för att identifiera det specifika antigenet för HIgM12, respektive att begränsa listan över potentiella kandidater, är de mest avgörande stegen i denna metod. Cell typspecifika preparat och cellmorfologin baserade karakterisering beskrivs för gliaceller men denna metod kan extrapoleras för att rymma andra celltyper inom eller utanför CNS.
Det finns ett trängandebehöver utveckla nya eller ändrade metoder som tillämpas för det ökande antalet IgM-antikroppar med terapeutisk potential för olika mänskliga sjukdomar särskilt i de fall (majoriteten av IgM antigen) där antikropps mål är kolhydrat- eller lipid strukturer.
Protocol
Djur protokoll och förfaranden genomfördes i enlighet med National Institutes of Health riktlinjer och godkänts av Mayo Clinic institutionella djurvård och använda utskott (Mayo IACUC protokoll nummer # A51912).
1. Allmänt CNS Vävnadsberedning
- Generera NCAM bristfällig (KO) möss på C57 / BL6 bakgrund (vänligen tillhandahållen av Dr. Lynn Landmesser, Case Western Reserve University, Cleveland, Ohio), heterozygota NCAM möss och vildtyp (WT) syskon (C57 / BL6) genom att korsa heterozygoter. Genotypning av NCAM KO möss beskrevs tidigare 32-34 och kommer inte att förklaras i ytterligare detalj.
Obs: Steg 1,2-1,6 är tillval.
- Före operation, administrera en pentobarbital lösning (Lager: 25 mg / ml; 50/100 il pentobarbital för tidig postnatal respektive adulta stadier) via intraperitoneal injektion (27 gauge nål och 1 mlspruta).
- Vänta två minuter eller till dess att djuret har nått en kirurgisk plan av anestesi. Administrera ytterligare bedövningsmedel som behövs under varje operation för att upprätthålla en kirurgisk plan av anestesi. Använd tå nypa respons metod för att bestämma djupet av anestesi. Djuren måste vara svarar innan du fortsätter.
- Gör en 0,5 - 1 cm lateralt snitt genom integument och bukväggen alldeles under bröstkorgen. Försiktigt loss levern från membranet. Göra ett litet snitt i membranet med hjälp av ett krökt, trubbig sax. Fortsätta membranet snitt längs med hela längden av bröstkorgen för att exponera pleurahålan.
- Placera böjd, trubbiga saxen längs ena sidan av bröstkorgen, försiktigt förskjuta lungorna, och göra ett snitt genom bröstkorgen upp till nyckelbenet. Göra en liknande snitt på den kontralaterala sidan. Lyfta bröstbenet bort, försiktigt trimma någon vävnad ansluter den till hjärtat.
- Gör ett snitt till djuret'S höger förmak med hjälp av iris sax för att skapa en så stor utlopp som möjligt. Injicera långsamt 10 ml av fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i djurets vänstra ventrikeln (ljusröd; flödeshastighet: 1 ml / min) med användning av en 10 ml spruta utrustad med 27-gauge nål. Inte öka trycket / PBS flöde under perfusion för att undvika vävnadsnedbrytning.
- Decapitate neonatala möss genom att använda kirurgiska saxar.
- Ta bort hjärnan genom att ta tag ögonhålarna med en pincett och genom att sätta in en liten sax in i ryggraden. Skär skallen mot framsidan på öronhöjd. Dra av skallen och försiktigt placera hjärnan i en 60 mm petriskål fylld med 10 ml iskall dissekera medium på is (tabell 1). Placera varje hjärna i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör och omedelbart lagra på torris (-79 ° C).
- Incisionsfilm lillhjärnan och hjärnstammen från frusna hjärnor med en ren rakblad på is. Arbeta snabbt för att undvika tina vävnaden.
- Väg denfryst hjärnan, lägg i en 15 ml rör på is och tillsätt iskall lysbuffert (se tabell 1) till en slutlig koncentration av 150 mikrogram hjärnvävnad per il lysbuffert. Upprepa för återstående cerebra. Håll hjärnor på is vid alla tidpunkter för steg 1,9 - 1,11.
- Homogenisera hjärnor i lysbuffert genom triturering genom en 1 ml pipettspets (10 gånger) följt av finfördelning genom en 5 ml spruta utrustad med 27-gauge nål (10 gånger). Inkubera hjärnan lysates för ytterligare 30 minuter på is för att möjliggöra fullständig vävnad lys.
- Avlägsna detergent-olösliga materialet och hjärn lipider genom seriell centrifugering (fyra rundor på 19.000 xg under 10 min vid 4 ° C). Släng (vit) myelin och cellrester innehållande pellets men behålla supernatanten efter varje centrifugeringssteg. Alikvotera hjärnan lysat och förvara vid -80 ° C.
2. Immunutfällningar användning av humana IgM (HIgM12 och isotypkontroll IgM) som en "pull-down" Agent från Cerebral Lysat av WT och NCAM KO möss
- Protein L Agarose Bead Framställning 9,35,36
- Bered 200 ml IP-buffert inklusive BSA (se tabell 1). Förbered ytterligare 200 ml av samma IP-buffert utan BSA.
- Per immunoprecipitation reaktions överföring 100 pl Protein L Agarose slammet med hjälp av en 200 l pipett i en 1,5 ml mikrocentrifugrör. Inte virvel protein L agarospärlor! Tillsätt 1 ml IP-buffert (se tabell 1) till varje rör. Blanda Protein L agaros och IP buffert manuellt genom inversion (fem gånger).
- Tvätta protein L agarospärlor fyra gånger genom centrifugering i en bordscentrifug (1000 xg, 2 min, 25 ° C). Ta bort supernatanten med hjälp av en 200 l pipett utan att störa den agarosen pellet. Upprepa tvätt steg 2.1.2 till 2.1.3 ytterligare tre gånger.
- Jämvikt protein L agaros i 1 ml färskt tillsatt IP buffert på en vals över natten vid 4 ° C.
- Antikropp-antigen-Agarose L komplexbildning och Antigen Detection i western-blottar
- Inkubera 30 mg lyserade hjärnvävnad (~ 200 l lysat) i 1 ml iskall IP buffert med 20 mikrogram av IgM-antikropp (HIgM12) i en 1,5 ml mikrocentrifugrör över natten på en vals vid 4 ° C.
- Spinn ner protein L agarospärlor (från steg 2.1.4) i en bordscentrifug under 2 min vid 1000 xg, 4 ° C. Kassera supernatanten med användning av en 200 | j, l pipett utan att störa den agaros pelleten. Lägg den kylda antikropps hjärnan lysat lösning (från steg 2.2.1) till protein L agarosen med hjälp av en 1 ml pipett.
- Inkubera antikropp-antigen-protein L-agaros suspension under 2 h på en vals vid 4 ° C. Tvätta antikropp-antigenkomplexet fäst till agaros L genom centrifugering vid 1000 x g under 2 min, 4 ° C. Noggrant kassera supernatanten utan att störa pelleten och tillsätt 1 ml iskall IP buffert innehållande 0,2% BSA.
- Upprepa tvättsteget en gång med hjälp av iskall IP buffert innehållande 0,2% BSA och ytterligare två gånger med iskall IP buffert utan BSA.
- Spinn ner antikropp-antigenkomplex fäst till agaros L vid 1000 xg under 2 min, 4 ° C. Kassera supernatanten fullständigt först med användning av en 200 | j, l pipett tills ~ 50 | il av lösningen är kvar på toppen av protein L-agaros-pelleten, följt av en 10 | j, l pipett. Håll prover på is.
- Tillsätt 40 pl IP elueringsbuffert (se tabell 1) per 1,5 ml mikrorör, finger flick rör 6 gånger och värme i 5 minuter vid 95 ° C. Sätt prover på is under 2 min och spinn ner i 30 sekunder vid 13.000 xg, 4 ° C.
- Överför supernatanten med användning av en 10 | j, l pipett (~ 35 | il totalt) i en färsk 1,5 ml mikrocentrifugrör utan att störa pelleten. Bekräfta frånvaron av Protein L agaroskulor genom att skölja ner en liten mängd av eluerat prov vid den inre rörväggen.
Obs: "Granular"protein L agarospärlor syns tydligt om de är närvarande. - Om protein L agarospärlor är närvarande, spinn ner prov för en annan 30 sekunder vid 13.000 xg och överföra supernatanten till rengöra röret. Upprepa steg tills inga agarospärlor är detekterbara.
- Belastning 10 - 20 | j, l av eluerade prover per brunn på SDS-polyakrylamidgel i ett Tris / glycin / SDS-buffertsystemet (se tabell 1).
Obs: Använd 7,5% eller 4-20% gradientgeler med 50 pl lastvolymen per brunn för detektering av PSA-NCAM eller NCAM isoformer (gel mått (B x L x tjocklek: 8,6 x 6,7 x 0,1 cm). - Köra geler för ~ 1 h vid 100 V (1,74 V / cm 2) på bänk. Extra kylning krävs inte för detta steg 37,38.
- Överförings proteiner till PVDF (polyvinylidenfluorid) -membran (porstorlek 0,45 | im) under 2,5 timmar i kylrummet vid 100 V (1,74 V / cm 2) med användning av kall överföringsbuffert (5-10 ° C) (se tabell 1).
- Segmentmembran wed 10% (vikt / volym) torrmjölkspulver i PBS-T under 1 timme vid 25 ° C på en bords orbitalskakare, tvätta membranen två gånger i 10 min med PBS-T och sonden över natten med primär antikropp i 5% BSA i PBS T på en orbital shaker i kylrummet.
- Nästa morgon tvätta membranen en gång kortvarigt med överskott av PBS-T vid 25 ° C (inkluderar locket och behållaren) följt av 3 tvättar med PBS-T under 10 minuter vardera på en orbital skakapparat (80 rpm) (alla tvättsteg utförs vid 25 ° C).
- Lägg sekundär antikropp (pepparrotsperoxidas (HRP) -konjugerad anti-human-anti-IgM-antikropp (för HIgM12) (spädning 1: 30.000) i 5% torrmjölkspulver i PBS-T under 1 timme vid 25 ° C på en orbital skakanordning (70 varv per minut ).
- Tvätta membran i stor utsträckning en gång kort med ett överskott PBS-T vid 25 ° C (inklusive lock och behållare) följt av 3 tvättar med PBS-T under 10 minuter vardera på en skakapparat (80 rpm) (alla tvättsteg utförs vid 25 ° C) .
- Blanda 1 ml kyld förbättrad chemiluminescence HRP-substrat komponent A (förstärkt luminol reagens) med 1 ml av komponent B (oxidationsreagens) (per mini blot) vid 25 ° C.
- Använd plastpincett för att överföra membranen på en pappershandduk för att avlägsna överskottsvätska (hålla dem vid själva kanter). Torra behållare med hushållspapper och sätta membran tillbaka till behållarna (en för varje membran). Omedelbart till 2 ml av den förblandade förstärkt kemiluminescens HRP-substrat (förening A + B) (steg 2.2.16.) Till varje membran och inkubera i 2 minuter vid 25 ° C på en orbital skakanordning (90 varv per minut). Kontrollera membran är jämnt fuktade av kemiluminiscens reagens.
- Överföring membran i en genomskinlig plasthylsa och ta bort överskottsvätska och luftbubblor med hushållspapper. Sätt membran i plasthylsa i en filmkassett och så småningom tejpa plasthylsa i kassetten. Stänga kassett.
- Ta kassetten, film, timer och sax i mörkrummet. Kapa övre högra hörnet från varje film för orienteringsändamål, exponera (olika) filmer för olika tidsperioder (10 sekunder, 1 minut, 10 min) och utveckla filmer i en film utvecklare.
3. Endoneuraminidase-NF Digestion av PSA Bifogat till NCAM 39
- Digest lyserade hjärnvävnad från postnatal dag (P) 7 WT möss och P7 NCAM KO möss (framställd från steg 1,12) under 2 h på is med hjälp av endoneuraminidase-NF (ENDO-NF) som visas i tabell 2 39.
- Tillsätt 5 | il 4x Laemmli-provbuffert till varje rör (1 - 6) från steg 3,1 (tabell 2).
- Belastningsprover på en 4 - 20% gradient SDS-polyakrylamidgel och upprepa steg 2.2.10 till 2.2.19. Sond membraner med HIgM12 (1 | ig / ml), kommersiellt tillgänglig anti-PSA-mAb (klon 2-2B) (1 | j, g / ml) och β-aktin antikropp (laddningskontroll) (1 | j, g / ml) i 5% BSA i PBS -T.
4. Framställning av råtta och mus CNS kulturer
- Syratvätt 25 mm täckglas i 1 M HCl vid 50-60 ° C under 4-16 timmar i ett dragskåp med hjälp av en glasbehållare. Agitera täck ibland genom försiktig rotering.
- Tvätta täckglas av glas i stor omfattning i destillerat vatten (3x). Se till att tvätta ut syran mellan staplade täck.
- Skölj täckglas i 100% etanol och torka dem på Parafilm i en cellkultur huva. En dag före användning, värma glastäck under 24 timmar i en glasbehållare med lock på 100 ° C i en ugn.
- Sätta glas täckglas i 6-brunnars skål och päls med 3 ml av 40 pg / ml poly-D-lysin i sterilt vatten under 1 timme vid 37 ° C.
- Tvätta två gånger med sterilt vatten, torka fullständigt under cellodling huva och applicera UV-ljus under 20 min.
- Coat 60 mm cellodlingsskålar eller 75 cm 2 vävnadsodlingskolvar med 3ml eller 10 ml, respektive, av 40 | j, g / ml poly-D-lysin i sterilt vatten under 1 timme vid 37 ° C.
- Tvätta två gånger med vatten, torka fullständigt under cellodling huva och applicera UV-ljus under 20 min.
- Söva neonatala råttor i IACUC godkända gnagare dödshjälp kammare med CO2 gasförsörjning (helt automatiserad). Använd tå nypa respons metod för att bestämma djurets reaktioner. Decapitate neonatal Sprague Dawley-råtta (P0P1) (6 - 10 valpar åt gången).
- Ta bort hjärnan genom att ta tag ögonhålarna med en pincett och genom att sätta in en liten sax in i ryggraden. Skär skallen mot framsidan på öronhöjd. Dra av skallen och försiktigt placera hjärnan i en 60 mm petriskål fylld med 10 ml iskall dissekera medium på is (se tabell 1).
- Upprepa för återstående råttungar (6 - 10 valpar). Håll vävnad på is för steg 4.3.2 - 4.3.7. Fördela hjärnan längs mittlinjen i två hjärnhalvorna och därefter avbröt lukt glödlampor, basala ganglierna under hjärnbarken och hippocampus med Dumont pincett. Placera den isolerade hjärnbarken i en ren petriskål med dissekera medium på is.
- Ta ett cortex. Ta bort hjärnhinnorna med pincett med fina spetsar enligt en dissektion mikroskop.
- Upprepa med de återstående cortex. Placera alla mening-free cortex till en ren petriskål på is.
- Kombinera kortikala halvklot från alla valpar i en 60 mm petriskål och använda en steril rakblad för att tärna hjärnvävnad i 1 mm malet bitar.
- Överför det malda hjärnvävnaden med hjälp av en 10 ml pipett i en steril, obestruket 500 ml glaskolv och tillsätt 10 ml iskall dissekera medium per råtthjärna. Snurra försiktigt kolven samtidigt tillsätta 1 ml trypsin lösning i HBSS (Hanks balanserade saltlösning) (5 mg / ml trypsin) till 9 ml av HBSS per råtthjärna. Tillsätt 2% Av den totala volymen i DNas I-lösning (1 mg / ml) och 2% av den totala volymen i MgSO 4-lösning (3,82% MgSO 4 i HBSS (vikt / volym)) till hjärnvävnaden fjädring och snurra försiktigt.
- Trypsinize vävnad under försiktig skakning på en roterande skakanordning under 30 min vid 37 ° C. Se till att vävnadsbitar flyter under detta steg och inte sedimenterar till botten. Öka rotationshastigheten vid behov.
- Lägga fetalt bovint serum (FBS) till en slutkoncentration av 10% (vol / vol) och blanda genom att snurra kolven 10 gånger i 10 sek. Svalna vävnadssuspension i isvatten under 15 min. Swirl kolv försiktigt fem gånger varannan minut.
- Försiktigt över vävnaden suspensionen i sterila 50 ml rör med användning av 25 ml eller 50 ml pipetter och centrifugera under 5 minuter vid 200 xg, 4 ° C.
- Kassera supernatanten och försiktigt återsuspendera diger CNS-vävnad i 15 ml iskall dissekera-medium kompletterat med 5 ml fetalt bovint serum, 0,4 ml MgSO 4-lösning (3,82%MgSO 4 i HBSS) och 1,6 ml DNas I (1 mg / ml).
- Split vävnadssuspension lika i två sterila 15 ml rör (~ 10 ml vardera) och långsamt mal sönder med hjälp av en 10 ml pipett (10 gånger) tills suspensionen blir grumlig / mjölkig. Håll suspenderade celler på is vid bearbetning av nästa röret. Vänta i 3 min tills återstående digererad CNS vävnader sediment till botten av röret. Överför supernatanten till rengöra 50 ml rör utan att störa pelleten fraktionen.
- Eventuellt passerar grumliga supernatanterna genom 40-micron cell sil och kombinera den resulterande enda cellsuspensionen i sterila 50 ml rör på is.
- Spin cell slurry under 5 minuter vid 200 xg, 4 ° C.
- Försiktigt bort supernatanten med användning av en 10 ml pipett tills ~ 2 ml dissekera mediet är kvar på toppen av cellpelleten.
- Finger flick cellpelletar i 50 ml rör (~ 10 gånger). Långsamt tillsätt 5 ml varm tillväxtmedium (se tabell 1) till cellsuspensionen under försiktighanden virvlande röret.
- Eventuellt upprepas DNas steg 4.3.12 för ytterligare 10 minuter på is med färsk DNas I-lösning och MgSO 4 -lösning vid synliga vävnads kluster eller DNA klumpar. Virvelröret manuellt 5 gånger varannan minut.
- Plattan 50000 celler per 25 mm täckglas i en pöl av 400 | il tillväxtmedium i en 6-brunnars skål och låta cellerna fästa under 30 min i en cellkultur inkubator (5% CO2, 37 ° C).
- För sammanflytande (inom 24-48 timmar efter plätering) 60 mm cellodlingsskålar och 75 cm 2 vävnadsodlingskolvar, plåt 500.000 celler (60 mm skål) eller 2 miljoner celler (75 cm 2 kolvar).
- Försiktigt tillsätt 2 ml (per brunn, 25 mm täckglas i 6-bra maträtt), 3 ml (60 mm skålar) eller 10 ml (75 cm 2 kolvar) varmt odlingsmedium till varje brunn. Inkubera cellerna över natten och ändra medel helt nästa morgon. Ändra sedan medel varannan dag (dag 3, dag 5, dag 7, etc.).
Nejte: Rat blandad Glia kulturer är redo att användas för immunocytokemi eller biokemi 24-48 timmar efter plätering.
- Identisk med dissekering av neonatala råtthjärnor som beskrivs i avsnitt 4.3.1 till 4.3.6, halshugga P0 neonatal WT och NCAM KO möss med C57 / BL6 bakgrund, ta bort hjärnan och placera dem i iskallt dissekera medium (se tabell 1). Håll vävnad på is hela tiden.
- Fördela hjärnan längs mittlinjen i två hjärnhalvorna och därefter avbröt lukt glödlampor, basala ganglierna under hjärnbarken och hippocampus med Dumont pincett. Placera den isolerade hjärnbarken i en ren petriskål med HBSS på is.
- Ta ett cortex. Ta bort hjärnhinnorna med pincett med fina spetsar enligt en dissektion mikroskop. Upprepa med de återstående cortex. Placera alla mening-free cortex till en ren petriskål på is.
- Överföra kortikal hemispheres med en ml pipett från varje mus i separata, sterila 15 ml rör. Tillsätt 1,2 ml iskall dissekera medium till varje hjärna och mekaniskt störa hjärnvävnad genom att pipettera den 2 gånger upp och ned med hjälp av en 1 ml pipettspets.
- Lägg 150 pl papain-lösning (10 mg / ml i PBS), 100 | il DNas I-lösning (1 mg / ml i HBSS) och 50 | j, l MgSO 4 (3,82% i HBSS) till varje hjärna och blanda genom finger rulla.
- Inkubera hjärnan suspensionen under 30 min vid 37 ° C i ett vattenbad och blanda hjärn suspensioner varannan minut genom finger rulla. Tillsätt 1 ml FBS per rör, blanda och kyla ner vävnadssuspension i 10 min på is.
- Spinn ner hjärnvävnaden under 4 minuter vid 200 xg, 4 ° C och suspendera vävnaden pelleten i 1 ml iskall dissekera buffert kompletterad med 70 | il DNas I-lösning (1 mg / ml i HBSS) och 30 pl MgSO 4 lösning (3,82% i HBSS).
- Triturera hjärnvävnaden med användning av en FBS belagd en ml pipettspets(~ 5 gånger) tills supernatanten blir grumlig. Passera supernatanten genom ett 40-micron cellfilter och överför till ett rent rör på is.
- Pellets blandade gliaceller genom centrifugering under 5 minuter vid 200 xg, 4 ° C. Aspirera supernatanten tills ~ 100 | il av mediet är kvar på toppen av cellpelleten. Resuspendera cellpelleten genom finger snärta (~ 5 gånger) och tillsätt 1 ml varmt tillväxt mus-medium (se tabell 1).
- Eventuellt lösa upp synliga cellkluster och lyserade celler / utfälld DNA genom att försiktigt pipettera cellsuspensionen upp och ner (fem gånger).
- Platta mus blandade gliaceller på PDL-belagda glastäck eller 60 mm skålar som beskrivs i steg 4.3.19 - 4.3.21. Tvätta cellerna nästa morgon med varmt tillväxt mus medium och därefter varannan dag. Mus blandad Glia är klar att använda för immuncytokemi 48-72 timmar efter plätering.
- Kultur råtta blandasGlia i 75 cm 2 vävnadsodlingsflaskor i tillväxtmedium (se tabell 1) i 10 dagar. Skaka av mikrogliaceller cellkluster från blandade gliaceller kulturer på en rotationsskakanordning inuti en cellkultur inkubator (5% CO2, 37 ° C) vid 140 rpm under 1 h.
- Ta av mikroglia-innehållande supernatanten från blandade Glia kulturer, passera genom en 40-micron cell sil och hålla cellsuspensionen i sterila 50 ml rör.
Obs: mikrogliaceller kulturer är typiskt> 95% ren efter detta steg med några förorenande OPCs och mycket få astrocyter. - Eventuellt ersätta odlingsmedium på blandade Glia kulturer för framtida microglial shake-offs. Typiskt utföra flera microglial shake-offs (en gång per vecka) från blandade gliaceller kulturer.
- Eventuellt, för att få renheter högre 95% plattan 10 ml av mikroglia-innehållande supernatanten (steg 4.5.2) per 100 mm petriskålar och inkubera i en cellkultur inkubator under 30 min vid 37 ° C. endast microglia kommer att fästa till Petriskålar, medan astrocyter och OPCs förblir i supernatanten.
- Skaka försiktigt petriskålar medurs och moturs (fem gånger vardera) i cellkultur huva. Sug cellodlingsmedium fullständigt och ersätta med 10 ml odlingsmedium. Resulterande mikroglia kulturer> 98% ren.
- Kultur mikroglia för upp till 7 dagar i DMEM kompletterat med 1% FBS och 1% penicillin / streptomycin.
- För att få höganrikat OPC kulturer skaka av mikrogliaceller först från 10 dagar gamla blandade gliaceller kulturer odlade i 75 cm 2 kolvar på en roterande shaker inom en cellkultur inkubator (5% CO2, 37 ° C) vid 140 rpm under en timme. Kasta mikroglia endast innehållande supernatant eller använda för mikroglia specifika experiment (se steg 5,5).
- Byt microglial innehållande supernatanten med 10 ml tillväxtmedium och skaka av blandade gliaceller kulturer fören annan 18 timmar på en roterande skakanordning vid 200 rpm (5% CO2, 37 ° C).
- Samla upp microglia- och OPC-innehållande supernatanten från blandade Glia kulturer och passera genom en 40-micron cell sil. Samla cellsuspensionen i sterila 50 ml rör.
- Eventuellt ersätta odlingsmedium på blandade Glia kulturer för framtida OPC shake-offs.
Obs: OPCs fortsätter att föröka sig på astrocytiska matarskikt och kan skakas-off en andra och tredje gången (en gång per vecka), om än med lägre avkastning. - Plattan 10 ml av den microglia- och OPC-innehållande supernatanten i 100 mm petriskålar och inkubera i cellodling inkubator under 30 min vid 37 ° C. Mikroglia kommer att fästa till petriskålar, medan OPCs och astrocyter kvar i supernatanten.
- Skaka försiktigt petriskålar medurs och moturs (5 gånger vardera) i en cellkultur huva. Ta ut endast ett fåtal petriskålar i taget från cellkultur inkubator (mikroglia startar lösgöring från Petri rätter när skakas kraftigt i kallare medium).
- Samla och kombinera OPC-innehållande supernatanten i 50 ml rör. Du kan också lägga odlingsmedium till petriskålar för användning i mikroglia specifika experiment.
- Eventuellt för att ytterligare öka renheten hos OPC kulturer upprepa steg 5.6.5 och 5.6.6 gång med färska petriskålar för att sänka graden av mikroglia i OPC preparat.
- Spinn ner anrikad OPC-innehållande supernatanten i centrifug under 5 min vid 250 xg, 4 ° C. aspirera försiktigt supernatanten utan att störa cellpelleten. Lämnar 3 ml av supernatanten ovanpå pelleten och börja återsuspendering OPCs från finger snärta (10 gånger).
- Försiktigt Mal sönder OPC cellkluster med hjälp av en 10 ml pipett (5 - 10 gånger).
- Räkna celler och platta 50.000 OPCs per 25 mm täckglas (PDL-belagda) i en pöl av 400 | il tillväxtmedium i en 6-brunnars skål och låt cellerna fästa under 30 min i en cellkultur inkubator (5% CO2, 376, C). Försiktigt tillsätt 2 ml varm proliferation medium (se tabell 1) till varje brunn. För PDL-belagda 60 mm cellodlingsskålar, tallrik 1 - 1,5 miljoner OPCs i 3 ml spridningsmedium.
- Noggrant ersätta FBS-innehållande spridning medium med färskt spridningsmediet 3 h efter plätering av OPCs (se till att OPCs fästa ordentligt och inte lossnar under medel förändring). Växlingsmedium varannan dag.
Obs: Rat OPC kulturer ställdes med användning av detta protokoll är typiskt 90% ren med mikroglia som de stora förorenande celltyp, följt av astrocyter.
5. Immuncytokemi Använda HIgM12 i Primär Glial celler
- Triple-etikett immunofluorescens med användning av HIgM12, anti-PSA-mAb, och celltyp specifika markörer i primär Glial celler från WT och NCAM KO möss
- Under levande cellförhållanden, etikett 60% sammanflytande mus blandad Glia kulturer från WT och NCAM KO möss odlas på PDL-belagda25 mm glastäckglas med HIgM12 (10 | j, g / ml) och anti-PSA-mAb (klon 2-2B) (10 ^ g / ml) i PBS supplementerat med 10% FBS vid 4 ° C i 30 min.
- Tvätta cellerna tre gånger under 20 s vardera med iskall PBS som kompletterats med 10% FBS och fixera med 4% paraformaldehyd i PBS, pH 7,4 i 15 min vid 25 ° C.
- Tvätta fixerade celler två gånger under vardera 1 min med PBS som kompletterats med 10% FBS och permeabilisera celler med 0,1% Triton-X100 i PBS, pH 7,4 i 2 min vid 25 ° C. Tvätta cellerna två gånger under 1 minut och etikett med gliaceller markörer GFAP (astrocyter) eller IBA-1 (mikroglia) (1 ng / ml) i PBS kompletterad med 10% FBS över natten vid 4 ° C i kylrummet.
- Fortsätt med standardimmunfluorescensförhållanden inklusive DAPI-innehållande monteringsmedium 31.
Obs: Användning av fluorescerande Fab 2-fragment som sekundära antikroppar för human (HIgM12) och mus (anti-PSA-mAb, klon 2 - 2B) IgM rekommenderas starkt. - ta fluorescent bilder på 60X eller 100X förstoring. Använd samma inställningar instrument för alla bilder och processbilder på samma sätt.
- Immunofluorescens Märkning av ENDO-NF-behandlade WT gliaceller använder HIgM12 som en primär antikropp
- Kultur WT mus blandas glia odlas för 3 dagar i Neurobasal A kompletterat med 10% FBS och B27 supplement (1:50) på PDL-belagda 25 mm täckglas. Lägga ENDO-NF (30 | j, g / ml) till 1 ml odlingsmedium och inkubera över natten i en cellkultur inkubator (37 ° C, 5% CO2).
- Etikett celler bor i kylan med HIgM12 och intern astrocytisk markör GFAP efter fixering och permeabilisering som beskrivs i steg 5.1.1 till 5.1.5. Ta fluorescerande bilder på 60X eller 100X förstoring. Använd samma instrumentinställningar för alla bilder och bearbeta identiskt.
Representative Results
Det här avsnittet visar exempel på resultat som kan erhållas genom att studera humana IgM-specifika PSA-antigener i CNS. Användningen av humana IgM-antikroppar som innehåller specifika VK lätta kedjor i biokemiska inställningar och genom fluorescerande immuncytokemi visas.
HIgM12 immunoprecipitat dess antigen från cerebrala hjärn lysat och fungerar som ett detekteringsmedel (primär antikropp) i Western blotting. Varken isotypkontrollantikropp eller agaros L pärlor immunfälla ett liknande antigen, vilket visar specificiteten för dra ner (Figur 1). Western-blottar med användning av CNS-lysat från WT- och NCAM KO möss visa specificiteten av HIgM12-bindning till PSA-innehållande NCAM (Figur 2A). Enzymatisk nedbrytning av CNS-vävnad från WT möss med användning av ENDO-NF identifierar PSA fäst NCAM som det specifika bindande epitopen för HIgM12 (Figur 2B). Med användning av metoden som beskrivs häri, är IBA-1-positiva råtta microglial kulturer av hög renhet som erhållits (Figur 3). Kommersiellt tillgängliga anti-PSA-antikropp (klon 2-2B) inte märka cellytan eller inre PSA pooler i fasta och permeabiliserades IBA-1-positiva mikrogliaceller genom fluorescensmikroskopi. I överensstämmelse med tidigare publicerad litteratur, som rapporterar ingen cellytan uttryck av PSA-NCAM i mikroglia 16,41 HIgM12 inte märka cellyteantigener i renade rått mikroglia. Interestingly, HIgM12 märkning av fasta och permeabiliserade mikroglia resulterar i en intracellulär, perinukleära mönster som inte är begränsad till specifika organeller (Figur 3). Resultat är i motsats till de som erhållits med användning av en anti-PSA-IgG-antikropp (klon 735) 26, som riktar PSA-SynCAM i mikroglia vid nivån för Golgi 41.
I motsats till mikroglia, HIgM12och antigener A2B5 målcellytan i höganrikat råtta OPC kulturer enligt levande cellförhållanden (Figur 4). OPC kulturer innehåller ~ 5% kontaminerande mikrogliaceller. Figur 5 illustrerar en i stort sett identisk cell-ytan färgningsmönster mellan HIgM12 och anti-PSA-mAb (klon 2-2B) i GFAP-positiva astrocyter (figur 5A). Immunofluorescerande märkning av ENDO-NF-digere WT astrocyter jämfört med buffertkontrollbehandlade WT astrocyter genom att använda HIgM12 visar närvaron av astrocytisk PSA (figur 5B). Närvaron av PSA-positiva astrocyter in vivo har ännu inte bekräftats.
Figur 1: HIgM12 fungerar som en "pull-down" Agent i Immunutfällningar Immunutfällningar från total hjärn lysat av tre månader gamla möss med användning av HIgM12, mänsklig isotypkontroll HIgM.126 eller agaros L pärlor endast som "pull down" agenter. Eluerade proteiner kördes i Western blöts med membran sonderade mot HIgM12. Molekylvikter för eluerade proteiner från HIgM12-belagda pärlor var i området av 160-200 kDa utöver den IgM tunga kedjan (~ 65-73 kDa). Denna siffra har ändrats från J. Neurochem. 15. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: HIgM12 riktar sig polysialinsyra (PSA) delen på NCAM. A. hjärnhomogenater från P7, P13, P16 och P27 NCAM total KO möss och heterozygota kull kontroller kördes i Western blöts med membran sonderade mot HIgM12, PSA och β-aktin som laddningskontroll.
Figur 3: Avsaknad av PSA på råtta mikroglia speglas av en brist på HIgM12 Labeling Rat mikroglia odlades under 48 timmar på poly-D-lysin belagda täckglas och antingen märkt live på is med HIgM12 eller efter fixering med HIgM12 eller anti. -PSA mAb (klon 2-2B). Celler var triple märkt med mikroglia markör IBA-1 (grön), HIgM12 / PSA (röd) och DAPI (blå). Bilderna visar brist på microglial cellytan bindning med användning av HIgM12 (övre raden) och brist på anti-PSA-bindning (klon 2-2B) till cellytan och intern butiker i primär råtta mikroglia (nedre raden). Baserat på bipolär morfologi och frånvaro av IBA-1 färgning, var den lilla PSA-positiv cell (nedre raden) föreslagits vara en OPC. I fasta celler, HIgM12 färgning resulterade i en punctated, perinukleär mönster som inte begränsas till vissa organeller och ansågs icke-specifik bindning (mellersta raden). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: HIgM12 Mål cellytan PSA-NCAM på råtta OPCs Rat OPCs och mikroglia var Cultu.röd i 4 dagar i spridningsmediet på poly-D-lysin belagda täckglas och trippel märkta live på is med HIgM12 eller A2B5 (grön), interna makrofag / monocyt markör CD68 (klon ED-1) (röd) och DAPI (blå) . Bilderna visar cellpopulationer majorly positivt för OPC markör A2B5 (övre raden) och HIgM12 (nedre raden) med några CD68-positiva mikroglia (~ 5%). Faskontrast och DAPI bilder sattes för att avslöja cell integritet och cellantal för varje population. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: HIgM12 och anti-PSA-mAb co-märka en astrocytisk subpopulation i mus Mixed Glia. A. Mouse blandade gliaceller från WT och NCAM total KO djur som innehåller astrocyter, oligodendrocyt-härstamning celler och mikrogramlia odlades under 3 dagar och märkas direkt på is med HIgM12 (grön), anti-PSA-mAb (klon 2-2B) (röd) och därefter för astrocytisk markör GFAP (lila) och DAPI (blå). HIgM12 och anti-PSA visar en virtuell identiskt färgningsmönster på GFAP-positiva WT astrocyter men saknar bindning till odlade astrocyter från NCAM KO möss. Denna siffra har ändrats från J. Neurochem. 15. B. Blandade glia odlades på samma sätt som beskrivs under A. och behandlades över natten med endoneuraminidase-NF (vänligen tillhandahållen av Dr. Martina Muehlenhoff) eller PBS-kontroll. Celler märktes direkt på is med HIgM12 (grön) och därefter färgas för intern markörer GFAP (röd) och DAPI (blå). HIgM12 riktar cellyteantigener på PBS-kontroll behandlade blandade gliaceller kulturer men inte endoneuraminidase-NF behandlade blandad glia. Denna siffra har modifierats JNSCI 16. Pllätta klicka här för att se en större version av denna siffra.
Alla bilder togs vid 60X förstoring med samma inställningar instrument och behandlas på samma sätt.
Tabell 1:. Buffert och lösning Recept Klicka här för att ladda ned den här tabellen.
| CNS-vävnad | ENDO-NF / PBS | lysbuffert | Total volym | |
| 1. WT mus | 67 ^ g (0,45 ^ il) | 2 | il (12 | ig) ENDO-NF | 7,55 | j, l | 10 pl |
| 2. WT mus | 67 ^ g (0,45 ^ il) | 2 pl PBS | 7,55 | j, l | 10 pl |
| 3. WT mus | 67 ^ g (0,45 ^ il) | ingen PBS eller ENDO-NF | 9,55 | j, l | 10 pl |
| 4. NCAM KO-mus | 67 ^ g (0,45 ^ il) | 2 | il (12 | ig) ENDO-NF | 7,55 | j, l | 10 pl |
| 5. NCAM KO-mus | 67 ^ g (0,45 ^ il) | 2 pl PBS | 7,55 | j, l | 10 pl |
| 6. NCAM KO-mus | 67 ^ g (0,45 ^ il) | ingen PBS eller ENDO-NF | 9,55 | j, l | 10 pl |
Tabell 2: ENDO-NF nedbrytning av CNS-vävnad från P7 WT och NCAM KO möss.
Discussion
Mänskliga naturliga IgM autoantikroppar är tilltalande kandidater för immunterapier och har visat terapeutisk potential för behandling av olika sjukdomar, inklusive cancer och sjukdomar i centrala nervsystemet 1-7. Med fördel kommer dessa antikroppar inte framkalla ett immunsvar, i vilken genereringen av neutraliserande antikroppar reducerar väsentligt den effektiva terapeutiska dosen och effekt. Viktigare är att alla antikroppar med terapeutisk potential varit av IgM-isotyp och tillhör NAB repertoaren 3-5,8,9,37,40,42-45. Ett stort hinder för den potentiella kliniska användningen av IgM-antikroppar är identifieringen av deras antigener, vilka inte är fastställd i många fall. Standardtekniker används för IgG-antikroppar är ofta inte är tillämpliga för att identifiera en IgM antigen.
Detta protokoll beskriver identifieringen av PSA-NCAM som antigen för den regenerativa human IgM-antikropp HIgM12, effektivt i djurmodellerMS och ALS 15-18. Den metod som användes är i huvudsak tillämpas på alla humana antikroppar med specifika Vk lätta kedjor VκI, VκIII och VκIV och musantikroppar med VκI lätta kedjor, oberoende av antikroppens isotyp.
Det mest kritiska steget i detta protokoll är användningen av IgM-antikroppar vid affinitetskromatografi-applikationer. Närmare bestämt är framgångsrika antikroppar som krävs för att fungera som rullgardinsmedel i immunoprecipitationer att isolera eller för att berika ett antigen av komplexa vävnads- eller cellkultur lysat. Anrikade antigenfraktioner kan jämföras med immunoutfällningar från isotyp kontrollantikroppar och analyserades därefter för skillnader genom masspektrometri. Ett väsentligt krav eller begränsning av detta steg är förekomsten av den korrekta antikroppen Vk lätt kedja och värd (människa, mus) för att möjliggöra antikroppsbindning till protein L-agaros. Användning av mannanbindande protein bundet till agaros (också called mannosbindande lektin) i stället för protein L-agaros är ett potentiellt alternativ till immunoprecipitera IgM utan specifika VK-lätta kedjor. Men enligt uppgift från Arnold et al. 35, antigenbundna IgM-antikroppar inte binder till mannanbindande protein, som mål glykan verkar bli otillgängliga när IgM har bundits till dess antigen. Baserat på dessa upptäckter mannanbindande protein kan inte användas som en bindande matris för att immunoprecipitera antigen-laddade IgM-molekyler 35. Andra potentiella alternativ skulle kunna vara användningen av sekundära agaros bundna anti-IgM IgG-antikroppar 46,47 eller användning av ytaktiverade magnetiska kulor 48. IgG-antikroppar riktade mot IgM kan vara kemiskt tvärbundet till agaros A eller agaros G för att minska omfattningen av eluerad antikropp tillsammans med antigenet av intresse. En korrekt jämförelse mellan olika varianter av IgM immunoutfällning med avseende på framgångsrikt identifierade antigener iär svårt eftersom de flesta immunoprecipitationer utfördes för att isolera eller utarma IgM utan vidare intresse för sina antigener. Dessutom har immunoutfällningar använder IgM främst används för att bekräfta en redan känd eller förväntad enda antigen med antikropp exponering för renade antigener 49. En nackdel med agaros-kopplade IgG riktad mot humant IgM är ett mycket lågt utbyte (10 - 15%) av immunoutfällt serum-IgM-molekyler i jämförelse med utgångsmaterialet 50. Däremot var ytaktiverade magnetiska pärlor med framgång tillämpas på antikroppar av olika isotyper, inklusive IgM att immunoutfälla skrapie-associerade fibriller 48. Denna metod är inte begränsad till särskilda kappa (Vk) eller lambda (λ) kedjor eller en viss värd och kan väsentligt bredda spektrumet av IgM-antikroppar som används i immunoprecipitationer.
Ett annat viktigt steg i protokollet är antikroppens förmåga att fungera som en Detecting antikropp (primär antikropp) i Western blotting eller andra screening plattformar. Framgångsrika antikroppar måste rikta sina antigen med tillräckligt hög affinitet för att medge antigen bindning i närvaro av icke-joniska eller möjligen joniska rengöringsmedel. Antikroppar med hög affinitet är vanliga bland affinitets maturated IgG-antikroppar, men mindre vanligt bland antikroppar av IgM-isotyp, som är ett av skälen till att det finns relativt få kommersiellt tillgängliga IgM-antikroppar som detekterande medel i biokemiska inställningar. Högaffinitetsbindning av antikroppar är ett krav för immunoutfällningar av molekylära antigener och för Western blotting. Sänkning tvättmedelskoncentrationer eller total avsaknad av rengöringsmedel i IP buffertar och lys buffertar kan antigen inriktning på låg affinitet antikroppar via dess Fab-domänen. Däremot är antikroppens förmåga att målprotein L agaros via sin Fc-delen inte väsentligt påverkas bland isotypkontrollerna över en rad olika tvättmedels kontrationer. Men låg koncentration tvättmedel i lysbuffert och IP buffert förhindrar cellmembranet avbrott och isolering av specifika molekyler. På liknande sätt, en låg koncentration detergent i Western blot-tvättbuffertar (t.ex. PBS-T) medger antigenbindning av låg affinitet antikroppar men samtidigt ökar icke-specifik bindning och är därför inte ett alternativ.
Närvaron av ett antigen-protein kärnan är ett annat krav för den här metoden. Proteiner med posttranslationella modifieringar (t.ex., glykoproteiner, lipoproteiner) och omodifierade proteiner, men inte enda lipider eller kolhydrater, är detekterbara i Western blöts. Det är inte möjligt att immunoprecipitera lipider (t.ex. sfingolipider) från vävnad eller cellysat i närvaro eller frånvaro av detergenter. De fysikalisk-kemiska egenskaperna hos tvättmedel och lipider är alltför liknar tillåta selektiva lipid-antikropp interaktioner, medan samtidigt tvättmedel är avgörande för att störamembran i syfte att möjliggöra selektiv isolering av specifika molekyler. Såvitt vi vet, immunoutfällningar enbart består av kolhydrater, i avsaknad av en proteinkärna, inte tidigare har rapporterats. Detta blir särskilt relevant, eftersom IgM-antikroppar rikta ofta kolhydrater och glykolipider, som inte nödvändigtvis är kopplade till ett protein enhet. Andra kromatografiska tekniker behövs för separation och immunologisk identifiering av lipider och kolhydrater i frånvaro av en proteinkärna. Till exempel kan tunnskiktskromatografi (TLC) av cellulära lipider med efterföljande detektionsantikropp på TLC-platta (immun TLC) genomförs 51,52.
Andra anti-PSA-antikroppar har beskrivits i tidigare studier och resultat jämfört med HIgM12 samt den kommersiellt tillgängliga anti-PSA IgM (klon 2-2B). Det mest använda antikroppen inom området för PSA är en IgG-antikropp (klon 735) tillgängligt som mus monoclonal eller kanin polyklonal antikropp 53. Denna anti-PSA-IgG-antikropp upptäcker PSA på SynCAM och NCAM på olika CNS celltyper inklusive mikrogliaceller 41. I motsats till den anti-PSA-IgG-antikropp, humana IgM-antikroppar HIgM12, HIgM42 och anti-PSA-mus-IgM (klon 2-2B) är oförmögna att rikta PSA på SynCAM (men på NCAM) vid olika embryonala och första tiden efter födseln hos möss , medan icke-polysialylated SynCAM är lätt att upptäcka 15. IgM-antikroppar som används är inte heller kunna upptäcka PSA på mikrogliaceller (figurer 3 + 4). En möjlig förklaring till skillnaderna mellan antikroppsisotyper kan vara låga PSA-SynCAM nivåer jämfört med nivåer av PSA-NCAM i kombination med potentiellt lägre affinitet bindningen av IgM-antikroppar jämfört med anti-PSA-IgG. För att testa denna hypotes, genomförde vi immunoutfällningar i NCAM KO djur på fosterstadiet E17 med stora mängder SynCAM närvarande och används HIgM12 som en "pull-down agent" <sup> 15. I E17 WT kull kontroller HIgM12 immunutfälldes PSA-NCAM i en omfattning som visade liknande intensiteter av "dras ner" PSA-NCAM jämfört med IgM tung kedja såsom detekteras genom densitometri i efterföljande Western blöt med användning eluerade antigenerna. Detta resultat antydde åtminstone en tillräcklig affinitet HIgM12 till sitt mål PSA. Till skillnad från WT kull styr HIgM12 inte upptäcka PSA bifogas SynCAM i NCAM KO djur. Identiska resultat erhölls i immunoutfällningar med användning av den humana anti-PSA IgM HIgM42. HIgM12 och HIgM42, samt mus-anti-PSA IgM (klon 2-2B) kunde inte rikta PSA på SynCAM i Western blöts från WT och NCAM KO djur på embryonala och postnatal utvecklingsstadier. Med tanke på den låga mängden HIgM12 krävs (0,1 | j, g / ml) för att specifikt detektera PSA fäst NCAM i Western blöt med användning av små mängder av CNS-vävnad (0,1 | j, g CNS-vävnad per brunn) 15 den verkar vara osannolikt att låga affiniteter ensamma äransvarig för total avsaknad av PSA-SynCAM upptäckt av HIgM12 i tre olika metoder.
Vi drar slutsatsen att det finns betydande skillnader mellan anti-PSA-IgM-antikroppar och ofta publicerade anti-PSA-IgG-antikropp (klon 735). Det är inte klart varför kommersiellt tillgängliga anti-PSA IgM-antikroppar inte användas oftare i det förflutna för att bekräfta resultat som erhållits med antiPSA IgG-antikropp 735. Detta är särskilt intressant eftersom HIgM12 redan har bevisad effekt i olika sjukdomsmodeller. Medan andra anti-PSA IgM-antikroppar kan ha liknande terapeutiska effekter är det fortfarande oklart om den anti-PSA-IgG-antikropp (klon 735) har en liknande terapeutisk resultatet i modeller av MS och ALS.
I korthet var metoder som beskrivs här i första hand användas för att identifiera antigenet av de regenerativa HIgM12 humana antikropp för att stödja potentiella kliniska prövningar för MS och eventuellt andra neurodegenerativa sjukdomar. Identifieringen av antigens för antikroppar med biologisk aktivitet är lika viktigt steg för att förstå deras verkningsmekanism. Detta blir särskilt relevant i samband med ett stort antal monoklonala antikroppar för närvarande testas för säkerhet och effekt i mänskliga prov. Medan antalet av kliniskt testade IgM-antikroppar som hittills är liten, senaste framstegen inom hybridomteknologi tillsammans med ett ökande antal studier som belyser den terapeutiska potentialen av denna antikroppsklass 1-10,37,40,42-45 uppmanar utvecklingen av nya eller modifierade metoder som tillämpas för att identifiera icke-protein IgM antigen.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats med bidrag från National Institutes of Health (R01 GM092993, R01 NS048357 och R21 NS073684), National Science Foundation (KARRIÄR Award), Minnesota Partnership Award för bioteknik och medicinteknik Genomics, National Multiple Sclerosis Society (CA1060A) , och Mayo Clinic centrum för klinisk och Translationell Science (CCaTS). Författarna erkänner stöd från Applebaum, Hilton, Peterson och Sanford stiftelser, månen och Marilyn Park Styrelseuppdrag fonden och McNeilus familjen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Fisher Scientific | MT-10-013-CVRF | High glucose, with glutamine, with sodium pyruvate, 500 ml |
| DMEM/F-12, HEPES | Life Technologies | 11330-032 | 500 ml, L-glutamine, sodium pyruvate, high glucose |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | 10,000 U/ml, 100 ml |
| N-2 Supplement (100x) | Life Technologies | 17502-048 | 5 ml |
| B-27 Supplement (50x) | Life Technologies | 17504-044 | serum free, 10 ml |
| Fetal Bovine Serum - Optima | Atlanta Biologicals | S12450 | 500 ml |
| Sterile water for irrigation | Baxter Healthcare | #2F7114 | USP-1,000 ml, 12/CA |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7886-50MG | D-Lys-(D-Lys)n-D-Lys · xHBr, Molecular Weight 30,000-70,000 g/mol, 50 mg |
| bovine serum albumin fraction V | Sigma | A-3294-100G | heat shock fraction, protease free, pH 7, purity 98%, 100 g |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G5767-500G | C6H12O6, Molecular Weight: 180.16 g/mol, ACS reagent, 500 g |
| Trypsin from bovine pancreas | Sigma | T9935-100mg | essentially salt-free, lyophilized powder, 9,000 BAEE units/mg protein |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D5025-150KU | Type IV, lyophilized powder, 2,000 Kunitz units/mg protein |
| Recombinant Rat FGF basic Protein | R&D systems | 3339-FB-025 | BSA as a carrier protein, 25 µg, lyophilized, > 95%, 16.2 kDa |
| Recombinant Rat PDGF-AA Protein | R&D systems | 1055-AA-50 | carrier free, 50 µg, lyophilized, > 97%, E. coli-derived, 12.5 kDa |
| Neurobasal-A | Life Technologies | 10888-022 | 500 ml, No Glutamine, No Aspartic Acid, No Glutamic Acid |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148-1KG | crystalline, 1 kg, reagent grade, Molecular Weight 30.03 g/mol (as monomer) |
| Tris[hydroxymethyl]aminomethane (Tris bas | Biorad | #1610719 | 1 kg, 99.8% pure, powder |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Biorad | #1610302 | 1 kg, powder |
| Glycine | Fisher Scientific | BP-381-5 | C2H5NO2, Molecular weight: 75.07 g/mol, White crystalline Powder, 5 kg |
| Sodium chloride | Sigma | S7653-5KG | NaCl, Molecular Weight: 58.44 g/mol, 5 kg |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S0751-500G | NaH2PO4, Molecular Weight: 119.98 g/mol, 500 g |
| Phosphate-buffered Solution 1x (PBS) | Cellgro | MT-21-040-CV | Without Calcium and Magnesium, 6 x 500 ml |
| Falcon 60 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning Life Sciences | #353002 | 60 mm Cell Culture Dish, TC-treated polystyrene, 20/pack, sterile |
| Falcon 60 mm x 15 mm Petri dish | Corning Life Sciences | #351007 | Not TC-Treated Bacteriological Petri Dish, 20/Pack |
| 6 well cell culture plates | Corning Costar | CLS3516 | 6 well, flat bottom (Individually wrapped), gamma-irradiated, growth area 9.5 c |
| 75 cm² tissue culture flask | Corning Life Sciences | 430720U | 75 cm² U-Shaped Canted Neck Cell Culture Flask with Plug Seal Cap |
| Pierce™ Protein L Plus Agarose | ThermoFisher Scientific | #20520 | 2 ml, crosslinked 6% beaded agarose (CL-6B), binding capacity: 10 to 20 mg IgG |
| 4 - 20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Biorad | 456-1094 | 10-well, 50 µl, for use with Mini-PROTEAN electrophoresis cells |
| Immobilon-P Membrane | Millipore | IPVH00010 | PVDF, 0.45 µm, 26.5 cm x 3.75 m roll |
| Anti-Polysialic Acid-NCAM Antibody, clone | Millipore | MAB5324 | 50 microliters, Host: mouse, monoclonal IgM |
| 4x Laemmli Sample Buffer | Biorad | #1610747 | 10 ml, 4x premixed protein sample buffer |
| 2-mercaptoethanol | Biorad | #1610710 | 25 ml, 98 % pure, 14.2 M |
| Endoneuraminidase-N (Endo-N) | ABC Scientific | ABC0020 | 50 microliters, 200 µg/ml, 3,500 U/mg |
| 25 mm glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-102 | Circles No. 1; Thickness: 0.13 to 0.17 mm; Size: 25 mm |
| HEPES buffer solution | ThermoFisher Scientific | 15630-080 | 100 ml, 1 M |
| Hanks' Balanced Salt Solution 1x (HBSS) | Cellgro | MT-21-022-CV | 500 ml, without Calcium, Magnesium, Phenol Red |
| Papain | Worthington Biochemical Cooperation | LS003119 | lyophilized powder, 100 mg |
| Magnesiumsulfate | Sigma | M-2643-500G | powder, 500 g |
| L-Glutamine | Gibco | #25030-081 | 100 ml, 200 mM |
References
- Asakura, K., Miller, D. J., Pease, L. R. Targeting of IgMkappa antibodies to oligodendrocytes promotes CNS remyelination. J Neurosci. 18 (19), 7700-7708 (1998).
- Bieber, A. J., Warrington, A., Asakura, K. Human antibodies accelerate the rate of remyelination following lysolecithin-induced demyelination in mice. Glia. 37 (3), 241-249 (2002).
- Vollmers, H. P., Brandlein, S.
- Vollmers, H. P., Brandlein, S.
- Vollmers, P. H., Brandlein, S. Natural monoclonal antibodies and cancer. Recent Pat Anticancer Drug Discov. 3 (2), 84-87 (2008).
- Warrington, A. E., Asakura, K., Bieber, A. J. Human monoclonal antibodies reactive to oligodendrocytes promote remyelination in a model of multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci. 97 (12), 6820-6825 (2000).
- Warrington, A. E., Bieber, A. J., Ciric, B. A recombinant human IgM promotes myelin repair after a single, very low dose. J Neurosci Res. 85 (5), 967-976 (2007).
- Brandlein, S., Pohle, T., Ruoff, N. Natural IgM antibodies and immunosurveillance mechanisms against epithelial cancer cells in humans. Cancer Res. 63 (22), 7995-8005 (2003).
- Pohle, T., Brandlein, S., Ruoff, N. Lipoptosis: tumor-specific cell death by antibody-induced intracellular lipid accumulation. Cancer Res. 64 (11), 3900-3906 (2004).
- Miller, D. J., Sanborn, K. S., Katzmann, J. A. Monoclonal autoantibodies promote central nervous system repair in an animal model of multiple sclerosis. J Neuro. 14 (10), 6230-6238 (1994).
- Acorda Therapeutics Inc. An Intravenous Infusion Study of rHIgM22 in Patients With Multiple Sclerosis (Clinical Trials Identifier - NCT01803867). , Available from: http://1.usa.gov/1N2gsHJ (2015).
- Warrington, A. E., Bieber, A. J., Van Keulen, V. Neuron-binding human monoclonal antibodies support central nervous system neurite extension. J Neuropathol Exp Neurol. 63 (5), 461-473 (2004).
- Xu, X., Warrington, A. E., Wright, B. R. A human IgM signals axon outgrowth: coupling lipid raft to microtubules. J Neurochem. 119 (1), 100-112 (2011).
- Xu, X., Wittenberg, N. J., Jordan, L. R. A patterned recombinant human IgM guides neurite outgrowth of CNS neurons. Sci Rep. 3, 2267 (2013).
- Watzlawik, J. O., Kahoud, R. J., Ng, S. Polysialic acid as an antigen for monoclonal antibody HIgM12 to treat multiple sclerosis and other neurodegenerative disorders. J Neurochem. 134 (5), 865-878 (2015).
- Watzlawik, J. O., Painter, M. M., Wootla, B. A human anti-polysialic acid antibody as a potential treatment to improve function in multiple sclerosis patients. J Nat Sci. 1 (8), (2015).
- Xu, X., Denic, A., Jordan, L. R. A natural human IgM that binds to gangliosides is therapeutic in murine models of amyotrophic lateral sclerosis. Dis Model Mech. 8 (8), 831-842 (2015).
- Denic, A., Macura, S. I., Warrington, A. E. A single dose of neuron-binding human monoclonal antibody improves spontaneous activity in a murine model of demyelination. PLoS One. 6 (10), e26001 (2011).
- Lanier, L. L., Chang, C., Azuma, M. Molecular and functional analysis of human natural killer cell-associated neural cell adhesion molecule (N-CAM/CD56). J Immunol. 146 (12), 4421-4426 (1991).
- Moore, S. E., Thompson, J., Kirkness, V. Skeletal muscle neural cell adhesion molecule (N-CAM): changes in protein and mRNA species during myogenesis of muscle cell lines. J Cell Biol. 105 (3), 1377-1386 (1987).
- Pollerberg, E. G., Sadoul, R., Goridis, C. Selective expression of the 180-kD component of the neural cell adhesion molecule N-CAM during development. J Cell Biol. 101 (5 Pt 1), 1921-1929 (1985).
- Seilheimer, B., Persohn, E., Schachner, M. Neural cell adhesion molecule expression is regulated by Schwann cell-neuron interactions in culture. J Cell Biol. 108 (5), 1909-1915 (1989).
- Trotter, J., Bitter-Suermann, D., Schachner, M. Differentiation-regulated loss of the polysialylated embryonic form and expression of the different polypeptides of the neural cell adhesion molecule by cultured oligodendrocytes and myelin. J Neuro Res. 22 (4), 369-383 (1989).
- Yazaki, T., Asou, H., Arimoto, K. Decrease of NCAM expression and astrocyte-neurone interaction in long-term cultured astrocytes. Neuroreport. 6 (8), 1085-1088 (1995).
- Zuber, C., Lackie, P. M., Catterall, W. A. Polysialic acid is associated with sodium channels and the neural cell adhesion molecule N-CAM in adult rat brain. J Biol Chem. 267 (14), 9965-9971 (1992).
- Galuska, S. P., Rollenhagen, M., Kaup, M. Synaptic cell adhesion molecule SynCAM 1 is a target for polysialylation in postnatal mouse brain. Proc Natl Acad Sci. 107 (22), 10250-10255 (2010).
- Curreli, S., Arany, Z., Gerardy-Schahn, R. Polysialylated neuropilin-2 is expressed on the surface of human dendritic cells and modulates dendritic cell-T lymphocyte interactions. J Biol Chem. 282 (42), 30346-30356 (2007).
- Rollenhagen, M., Buettner, F. F., Reismann, M. Polysialic acid on neuropilin-2 is exclusively synthesized by the polysialyltransferase ST8SiaIV and attached to mucin-type o-glycans located between the b2 and c domain. J Biol Chem. 288 (32), 22880-22892 (2013).
- Schnaar, R. L., Gerardy-Schahn, R., Hildebrandt, H. Sialic acids in the brain: gangliosides and polysialic acid in nervous system development, stability, disease, and regeneration. Physiol Rev. 94 (2), 461-518 (2014).
- Abe, M., Goto, T., Kosaka, M. Differences in kappa to lambda (kappa:lambda) ratios of serum and urinary free light chains. Clin Exp Immunol. 111 (2), 457-462 (1998).
- Bhattacharyya, D., Hammond, A. T., Glick, B. S.
- Cremer, H., Lange, R., Christoph, A. Inactivation of the N-CAM gene in mice results in size reduction of the olfactory bulb and deficits in spatial learning. Nature. 367 (6462), 455-459 (1994).
- Polo-Parada, L., Bose, C. M., Plattner, F. Distinct roles of different neural cell adhesion molecule (NCAM) isoforms in synaptic maturation revealed by analysis of NCAM 180 kDa isoform-deficient mice. J Neurosci. 24 (8), 1852-1864 (2004).
- Tomasiewicz, H., Ono, K., Yee, D. Genetic deletion of a neural cell adhesion molecule variant (N-CAM-180) produces distinct defects in the central nervous system. Neuron. 11 (6), 1163-1174 (1993).
- Arnold, J. N., Wormald, M. R., Suter, D. M. Human serum IgM glycosylation: identification of glycoforms that can bind to mannan-binding lectin. J Biol Chem. 280 (32), 29080-29087 (2005).
- Bjorck, L., Protein, L. A novel bacterial cell wall protein with affinity for Ig L chains. J Immunol. 140 (4), 1194-1197 (1988).
- Vollmers, H. P., Dammrich, J., Hensel, F. Differential expression of apoptosis receptors on diffuse and intestinal type stomach carcinoma. Cancer. 79 (3), 433-440 (1997).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Stummeyer, K., Dickmanns, A., Muhlenhoff, M. Crystal structure of the polysialic acid-degrading endosialidase of bacteriophage K1F. Nat. Struct. Mol. Biol. 12 (1), 90-96 (2005).
- Vollmers, H. P., Dammrich, J., Ribbert, H. Apoptosis of stomach carcinoma cells induced by a human monoclonal antibody. Cancer. 76 (4), 550-558 (1995).
- Werneburg, S., Muhlenhoff, M., Stangel, M. Polysialic acid on SynCAM 1 in NG2 cells and on neuropilin-2 in microglia is confined to intracellular pools that are rapidly depleted upon stimulation. Glia. 63 (7), 1240-1255 (2015).
- Brandlein, S., Rauschert, N., Rasche, L. The human IgM antibody SAM-6 induces tumor-specific apoptosis with oxidized low-density lipoprotein. Mol Cancer Ther. 6 (1), 326-333 (2007).
- Vollmers, H. P., Hensel, F., Hermann, R. Tumor-specific apoptosis induced by the human monoclonal antibody SC-1: a new therapeutical approach for stomach cancer. Oncol Rep. 5 (1), 35-40 (1998).
- Vollmers, H. P., O'Connor, R., Muller, J. SC-1, a functional human monoclonal antibody against autologous stomach carcinoma cells. Cancer Res. 49 (9), 2471-2476 (1989).
- Vollmers, H. P., Zimmermann, U., Krenn, V. Adjuvant therapy for gastric adenocarcinoma with the apoptosis-inducing human monoclonal antibody SC-1: first clinical and histopathological results. Oncol Rep. 5 (3), 549-552 (1998).
- Nakano, K., Yasuda, K., Shibuya, H. ANNALS EXPRESS: Transient human anti-mouse antibody generated with immune enhancement in a carbohydrate antigen 19-9 immunoassay after surgical resection of recurrent cancer. Ann Clin Biochem. , (2016).
- Pettingill, P., Kramer, H. B., Coebergh, J. A. Antibodies to GABAA receptor alpha1 and gamma2 subunits: clinical and serologic characterization. Neurology. 84 (12), 1233-1241 (2015).
- Morel, N., Simon, S., Frobert, Y. Selective and efficient immunoprecipitation of the disease-associated form of the prion protein can be mediated by nonspecific interactions between monoclonal antibodies and scrapie-associated fibrils. J Biol Chem. 279 (29), 30143-30149 (2004).
- Lobo, P. I., Schlegal, K. H., Vengal, J. Naturally occurring IgM anti-leukocyte autoantibodies inhibit T-cell activation and chemotaxis. J Clin Immunol. 30, Suppl 1. S31-S36 (2010).
- Lobo, P. I., Schlegel, K. H., Spencer, C. E. Naturally occurring IgM anti-leukocyte autoantibodies (IgM-ALA) inhibit T cell activation and chemotaxis. J Immunol. 180 (3), 1780-1791 (2008).
- Wikstrand, C. J., Fredman, P., Svennerholm, L. Detection of glioma-associated gangliosides GM2, GD2, GD3, 3'-isoLM1 3',6'-isoLD1 in central nervous system tumors in vitro and in vivo using epitope-defined monoclonal antibodies. Prog Brain Res. 101, 213-223 (1994).
- Hamilton, W. B., Helling, F., Lloyd, K. O. Ganglioside expression on human malignant melanoma assessed by quantitative immune thin-layer chromatography. Int J Cancer. 53 (4), 566-573 (1993).
- Galuska, S. P., Oltmann-Norden, I., Geyer, H. Polysialic acid profiles of mice expressing variant allelic combinations of the polysialyltransferases ST8SiaII and ST8SiaIV. J Biol Chem. 281 (42), 31605-31615 (2006).
