Introduction
Antistoffer av IgM-isotypen demonstrere stort terapeutisk potensiale for behandling av forskjellige sykdommer, inkludert kreft og CNS-lidelser 1-7. Den Vollmers 'gruppe identifisert en rekke antistoffer i kreftpasienter for potensiell bruk som tumor-spesifikke biomarkører eller aktive behandlingsformer som er i stand til å drepe ondartede celler ved å fremkalle apoptotiske trasé 4,8,9. Interessant, alle identifiserte antistoffer med terapeutiske potensialet er av IgM-isotype og hører til gruppen av "naturlige antistoffer" (Nabs).
Tilsvarende identifisert Rodriguez gruppe mus og humane antistoffer som stimulerer remyelinering i kronisk demyelinerte ryggmargslesjoner i modeller for multippel sklerose (MS). Identisk med antistoffer med anti-kreft effekt, alle remyelinering fremmende antistoffer er Nabs og av IgM-isotypen 1,6,7,10. De nøyaktige antigener for de identifiserte IGMS er fortsatt graved inkludert den menneskelige remyelinisering fremmende antistoff rHIgM22, for tiden i fase I kliniske studier for MS-pasienter 11. Til tross for gjentatte forsøk fra eksperter innen lipid og karbohydrat forskning både i den akademiske omgivelser og i samarbeid med industrien 11, forsøker å identifisere rHIgM22 s antigen har ikke vært vellykket. Svikt av standard teknikker som brukes til å identifisere antigener av IgG-antistoffer til å arbeide med IgM-antistoffer identifiserer et kritisk behov for å raffinere metoder som er spesifikke for disse antistoffene at mest sannsynlig mål karbohydrat eller lipid-antigener.
Fokus for dette manuskriptet er den menneskelige regenerativ antistoff HIgM12 og de eksperimentelle prosedyrer som brukes til å identifisere sitt antigen. Antistoff HIgM12 ble identifisert fra pasienter med Walden makroglobulinemi, stimulerer neurittutvekst in vitro 12-14 og mål polysialic syre (PSA) festet til nevrale celleadhesjonsmolekyl (PSA-NCAM) 15,16. HIgM12 forlenger levetiden i en musemodell for ALS 17 og forbedrer funksjonelle resultatet i Theiler sin muse encefalomyelitt virus (TMEV) -infected mus. Spesielt stimulerer HIgM12 spontan horisontal og vertikal motorisk aktivitet i kronisk demyelinerte mus og øker antall små og mellomstore diameter ryggmarg axoner åtte uker etter en enkelt, lav dose av intraperitoneal injisert antistoff 18.
Det nevrale celleadhesjonsmolekyl (NCAM) er et glykoprotein av immunoglobulin (lg) superfamilien som uttrykkes på celleoverflaten av nerveceller, gliaceller, skjelettmuskel, og naturlig dreperceller 19-25. De tre store NCAM isoformene betegnes NCAM180, NCAM140, og NCAM120, er alternative spleise varianter av en primær transkripsjon som bare varierer i sin cytoplasmaområde. Innenfor CNS, er NCAM hoved polysialylated molekylet (> 95%) med lange, negativt ladede sialinsyre-homopolymerer. Polysialic encid med n> 10 er betegnet PSA men kortere oligomeric strukturer eksisterer som også er biologisk relevant. Andre polysialylated proteiner uttrykt i CNS er SynCAM1 26, Neuropilin-2 (NRP-2) 27,28 og en natriumkanal subenhet 25 (for oversikt se 29).
Metodene som beskrives her tillate antigen identifikasjon for mennesker og mus immunglobuliner som inneholder spesifikke kappa (Vκ) lette kjeder (VκI, VκIII eller VκIV lette kjeder for humane antistoffer og VκI lette kjeder for mus antistoffer) uavhengig av antistoffets isotype (f.eks IgG, IgM , IgA, IgD eller IgE). Denne begrensningen er basert på bruk av protein L agarose for immunoutfellinger med antistoffer av IgM-isotypen. Alternative strategier kan omfatte mannose-bindende lektiner og sekundære IgG anti-IgM-antistoffer covalent bundet til agarosekuler, noe som kan utvide anvendbarheten av denne metode til flere IgM antistoff økesLuding de med lambda (λ) lette kjeder (se diskusjon). Prosenter av serum IgM Vκ lette kjedene i forhold til IgM λ lette kjedene avledet fra friske individer er 1,5: 1 30.
Basert på den kromatografiske metoden som er benyttet her for å separere, berike, og immunologisk oppdage visse molekyler 31, er alle antigener som kreves for å inkludere i det minste en liten protein domene. Antistoffets spesifikke binding epitop kan være innenfor eller utenfor det protein domenet (for eksempel i glykoproteiner, lipoproteiner). Innledende biokjemiske trinnene som brukes for å identifisere spesifikt antigen for HIgM12, respektive å innskrenke listen over mulige kandidater, er de mest avgjørende skritt i denne metoden. Celletype spesifikke forberedelser og celle morfologi baserte karakteristikkene er beskrevet for gliacellene, men denne metoden kan ekstrapoleres til å betjene andre celletyper innenfor eller utenfor CNS.
Det er et presserendebehov for å utvikle nye eller endrede teknikker som kan anvendes for det økende antall av IgM-antistoffer med terapeutisk potensial for forskjellige menneskelige lidelser særlig i de tilfeller (de fleste IgM-antigener) hvor antistoff-mål er karbohydrat eller lipid-strukturer.
Protocol
Animal protokoller og prosedyrer ble utført i samsvar med National Institutes of Health retningslinjer og godkjent av Mayo Clinic institusjonelle dyr omsorg og bruk komiteer (Mayo IACUC protokollen nummer # A51912).
1. Generell CNS Tissue Forberedelse
- Generer NCAM mangel (KO) mus på C57 / BL6 bakgrunn (vennlig levert av Dr. Lynn Landmesser, Case Western Reserve University, Cleveland, Ohio), heterozygote NCAM mus og villtype (WT) kullsøsken (C57 / BL6) ved å krysse heterozygoter. Genotyping av NCAM KO mus ble beskrevet tidligere 32-34, og vil ikke bli forklart i ytterligere detalj.
Merk: Trinn 01.02 til 01.06 er valgfritt.
- Før kirurgi, administrere en pentobarbital løsning (lager: 25 mg / ml; 50/100 mL av pentobarbital for tidlig postnatal respektive voksne stadier) via intraperitoneal injeksjon (27 gauge nål og 1 mlsprøyte).
- Vent i 2 minutter, eller inntil dyret har oppnådd en kirurgisk plan av anestesi. Administrere ytterligere bedøvelse etter behov i løpet av hver operasjon for å opprettholde en kirurgisk plan av anestesi. Bruk tå pinch-respons metode for å bestemme dybden av anestesi. Dyr må ikke svarer før du fortsetter.
- Lag en 0,5 - 1 cm lateral snitt gjennom integument og bukveggen like under brystkassen. Del forsiktig leveren fra membranen. Lag et lite snitt i mellomgulvet ved hjelp av en buet, sløv saks. Fortsett membranen innsnitt langs hele lengden av brystkassen for å eksponere pleuralhulrommet.
- Plasser buet, sløv saks langs den ene siden av brystkassen, nøye fortrenge lungene, og et snitt gjennom brystkassen opp til kragebeinet. Lag en tilsvarende kutt på motsatt side. Løfte sternum bort, trim nøye alle vev koble det til hjertet.
- Lag et snitt til dyret'S høyre atrium ved hjelp av iris saks til å lage så stor en stikkontakt som mulig. Injiseres sakte 10 ml fosfatbufret saltvann (PBS) inn i dyrets venstre ventrikkel (lyserød; strømningshastighet: 1 ml / min) ved anvendelse av en 10 ml sprøyte utstyrt med en 27-gauge nål. Ikke øk trykket / PBS flyt under perfusjon å unngå vev ødeleggelse.
- Halshogge neonatal mus ved hjelp av kirurgisk saks.
- Fjern hjernen ved å gripe øyehulene med en tang og ved å sette inn en liten saks inn i ryggmargen. Skjær skallen mot fronten i ørehøyde. Vipp av skallen og forsiktig plassere hjernen til en 60 mm petriskål fylt med 10 ml iskald dissekere medium på is (tabell 1). Plasser hver hjerne i et 1,5 ml mikrosentrifugerør og umiddelbart lagre på tørris (-79 ºC).
- Incise lillehjernen og hjernestammen fra frosne hjerner med en ren barberblad på is. Arbeid raskt for å unngå å tine vevet.
- veiefrosset cerebrum, satt i et 15 ml rør på is og tilsett iskald lyseringsbuffer (se tabell 1) til en sluttkonsentrasjon på 150 ug hjernevev per ul lyseringsbuffer. Gjenta for gjenværende cerebra. Hold hjernen på is til alle tider for trinn 1.9 - 1.11.
- Homogen hjerner i lysebuffer ved triturering gjennom en 1 ml pipette (10 ganger) etterfulgt av triturering gjennom en 5 ml sprøyte utstyrt med en 27-gauge nål (10 ganger). Inkuber hjernelysatene for ytterligere 30 minutter på isen for å tillate fullstendig vev lyse.
- Fjerne detergent-uoppløselig materiale og hjerne lipider gjennom seriesentrifugering (fire runder ved 19 000 xg i 10 min ved 4 ° C). Forkast (hvit) myelin og celleavfall inneholdende pellet, men beholde supernatanten etter hvert sentrifugeringstrinn. Delmengde hjernelysatene og oppbevares ved -80 ºC.
2. immunoutfellinger med humane IGMS (HIgM12 og isotypekontrollantistoff IgM) som en "Pull-down" Agent fra Cerebral Lysates av WT og NCAM KO mus
- Protein L Agarose Bead Forberedelse 9,35,36
- Forbered 200 ml IP buffer inkludert BSA (se tabell 1). Fremstille ytterligere 200 ml av den samme IP-buffer uten BSA.
- Per immunopresipiteringsreaksjon overføre 100 ul Protein L Agarose oppslemning ved anvendelse av en 200 ul pipette i et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Har ikke vortex protein L agarose perler! Tilsett 1 ml med IP-buffer (se tabell 1) til hvert rør. Bland Protein L agarose og IP buffer manuelt gjennom inversjon (fem ganger).
- Vask protein L agaroseperler fire ganger ved sentrifugering i en Borstemmaskin sentrifuge (1000 xg, 2 min, 25 ºC). Ta av supernatant ved hjelp av en 200 mL pipette uten å forstyrre agarose pellet. Gjenta vaske trinn 2.1.2 til 2.1.3 tre ganger til.
- Stabilisere protein L agarose i 1 ml ferskt lagt IP buffer på en berg natten ved 4 ºC.
- Antistoff-antigen-Agarose L Complex Dannelse og antigendeteksjon i Western avsetninger
- Inkuber 30 mg lysert hjernevev (~ 200 ul lysat) i 1 ml iskald IP-buffer med 20 ug av IgM-antistoff (HIgM12) i et 1,5 ml mikrosentrifugerør over natten på en valse ved 4 ° C.
- Spinne ned protein L-agarose-kuler (fra trinn 2.1.4) i en bord- sentrifuge i 2 minutter ved 1000 xg, 4 ° C. Kast supernatanten ved hjelp av en 200 mL pipette uten å forstyrre agarose pellet. Tilsett avkjølt antistoff-hjerne-lysat-løsning (fra trinn 2.2.1) til proteinet L-agarose ved hjelp av en 1 ml pipette.
- Inkuber antistoff-antigen-protein L-agarose-suspensjonen i 2 timer på en valse ved 4 ° C. Vask den antistoff-antigen-komplekset bundet til agarose L gjennom sentrifugering ved 1000 x g i 2 min, 4 ° C. forkaste nøye supernatanten uten å forstyrre pelleten og tilsett 1 ml iskald IP-buffer inneholdende 0,2% BSA.
- Gjenta vasketrinn en gang ved hjelp av iskald IP buffer som inneholder 0,2% BSA og ytterligere to ganger med iskald IP buffer uten BSA.
- Spinne ned antistoff-antigen-komplekset bundet til agarose L ved 1000 x g i 2 min, 4 ° C. Kast supernatanten helt først ved å bruke en 200 ul pipette inntil ~ 50 ul av oppløsning er igjen på toppen av proteinet L agarose pellet etterfulgt av en 10 ul pipette. Hold prøver på is.
- Legg 40 mL av IP elueringsbuffer (se tabell 1) per 1,5 ml mikrosentrifugerør, finger flick rør 6 ganger og varme i 5 min ved 95 ºC. Sett prøvene på is i 2 min og spinne ned i 30 sek på 13 000 xg, 4 ºC.
- Overfør supernatanten ved bruk av en 10 ul pipette (~ 35 mL totalt) inn i en frisk 1,5 ml mikrosentrifugerør uten å forstyrre pelleten. Bekrefte fraværet av protein L agarosekuler ved å skylle ned en liten mengde av eluert prøven ved den indre rørvegg.
Merk: "Granular"protein L agarose perler er godt synlig hvis det finnes. - Hvis protein L agarosekuler er til stede, spinne ned prøven for ytterligere 30 sekunder ved 13 000 xg, og supernatanten overføres til rent rør. Gjenta steg til det ikke agarose perler kan påvises.
- Belastning 10 - 20 ul av eluerte prøver per brønn på SDS-polyakrylamid-gel i en Tris / glycin / SDS-buffer-systemet (se tabell 1).
Merk: Bruk 7,5% eller 4-20% gradient geler med 50 pl lastevolum per brønn for påvisning av PSA-NCAM eller NCAM isoformer (gel dimensjoner (B x L x tykkelse: 8,6 x 6,7 x 0,1 cm). - Kjør gels for ~ 1 time ved 100 V (1,74 V / cm 2) på stasjonære maskiner. Ekstra kjøling er ikke nødvendig for dette trinnet 37,38.
- Overføring av proteiner til PVDF (polyvinylidenfluorid) membran (porestørrelse 0,45 um) i 2,5 timer i kjølerom ved 100 V (1,74 V / cm 2) ved hjelp av kald overføringsbuffer (5 - 10 ° C) (se tabell 1).
- Block membraner wed 10% (vekt / volum) tørr melkepulver i PBS-T i 1 time ved 25 ° C på en orbital-rystemaskin Borstemmaskin, vaske membranene to ganger i 10 minutter med PBS-T og sonde over natten med primært antistoff i 5% BSA i PBS- T på en orbital shaker i kjølerommet.
- Den neste morgen vaske membranene en gang kort med overskudd av PBS-T ved 25 ° C (inkludere lokk og beholder) etterfulgt av 3 vaskinger med PBS-T i 10 min hver på en orbital-rystemaskin (80 rpm) (alle vasketrinn blir utført ved 25 ºC).
- Legg sekundært antistoff (pepperrotperoksidase (HRP) -konjugert anti-humant anti-IgM-antistoff (for HIgM12) (fortynning 1: 30000) i 5% tørrmelk i PBS-T i 1 time ved 25 ° C på en orbital-rystemaskin (70 rpm ).
- Vask membraner omfattende en gang kort med overskudd av PBS-T ved 25 ° C (inkludere lokk og beholder) etterfulgt av 3 vaskinger med PBS-T i 10 min hver på en orbital-rystemaskin (80 rpm) (alle vasketrinn er utført ved 25 ° C) .
- Bland 1 ml avkjølt forbedret chemiluminescence HRP-substrat komponent A (forbedret luminol-reagens) med 1 ml av komponent B (oksideringsreagens) (pr mini-blot) ved 25 ° C.
- Bruk plast pinsett til å overføre membraner på kjøkkenpapir for å fjerne overflødig væske (holde dem på de aller kanter). Tørre beholdere med tørkepapir og satt membraner tilbake i beholdere (en for hver membran). Umiddelbart tilsett 2 ml av den ferdigblandede forbedret kjemiluminescens HRP-substrat (forbindelse A + B) (trinn 2.2.16.) For hver membran og inkuberes i 2 minutter ved 25 ° C på en orbital-rystemaskin (90 rpm). Sørg for at membranene blir jevnt fuktet med chemiluminescence reagens.
- Transfer membraner i en gjennomsiktig plast ermet og overflødig væske og luftbobler fjernes med tørkepapir. Sett membraner i plast ermet i en film kassett og til slutt tape plasthylsen inn i kassetten. Lukk kassett.
- Ta ut kassetten, film, tidtaker og saks i mørkerommet. Avskåret øverst i høyre hjørne fra hver film for orienteringsformål utsette (ulike) filmer for ulike tidsperioder (10 sek, 1 min, 10 min) og utvikle film i en film utvikler.
3. Endoneuraminidase-NF Fordøyelse av PSA Vedlagt NCAM 39
- Digest lysert hjernevev fra postnatal dag (P) 7 WT mus og P7 NCAM KO-mus (fremstilt fra trinn 1.12) i 2 timer på is ved hjelp av endoneuraminidase-NF (endo-NF) som vist i tabell 2. 39.
- Tilsett 5 ul av 4 x Laemmli-prøvebuffer til hvert rør (1 - 6) fra trinn 3.1 (tabell 2).
- Laste prøver på en 4-20% gradient SDS-polyakrylamid gel og gjenta trinn 2.2.10 til 2.2.19. Probe membraner med HIgM12 (1 pg / ml), kommersielt tilgjengelig anti-PSA-mAb (klon 2-2B) (1 pg / ml) og β-aktin-antistoff (lasting kontroll) (1 pg / ml) i 5% BSA i PBS -T.
4. Utarbeidelse av Rat og mus CNS kulturer
- Syrevask 25 mm dekkglass i en M HCl ved 50 - 60 ºC for 4-16 timer i et avtrekksskap ved hjelp av en glassbeholder. Agitere Dekk tidvis gjennom forsiktige virvelbevegelser.
- Vask dekkglass i stor utstrekning i destillert vann (3x). Sørg for å vaske ut syre mellom stablede dekk.
- Skyll Dekk i 100% etanol og tørke dem på Parafilm i en cellekultur hette. Én dag før bruk, varme dekkglass i 24 timer i en glassbeholder med lokk ved 100 ° C i en ovn.
- Sette dekkglass i 6-brønners skål, og belegge med 3 ml 40 ug / ml poly-D-lysin i sterilt vann i 1 time ved 37 ° C.
- Vask to ganger med sterilt vann, tørke helt under cellekultur panseret og gjelder UV-lys i 20 min.
- Coat 60 mm cellekulturskåler eller 75 cm 2 vevskulturflasker med treml eller 10 ml, respektivt, på 40 ug / ml poly-D-lysin i sterilt vann i 1 time ved 37 ° C.
- Vask to ganger med vann, tørkes fullstendig under cellekultur hette og anvende UV-lys i 20 min.
- Anesthetize neonatale rotter i IACUC godkjente gnager dødshjelp kammer med CO 2 gassforsyning (fullt automatisert). Bruk tå pinch-respons metode for å bestemme dyrets manglende respons. Halshogge neonatal Sprague Dawley rotte (P0P1) (6 - 10 unger om gangen).
- Fjern hjernen ved å gripe øyehulene med en tang og ved å sette inn en liten saks inn i ryggmargen. Skjær skallen mot fronten i ørehøyde. Skrelle tilbake skallen og forsiktig plassere hjernen inn i en 60 mm petriskål fylt med 10 ml iskald dissekere medium på is (se tabell 1).
- Gjenta for resten av rotteunger (6 - 10 unger). Hold vev på is i trinn 4.3.2 - 4.3.7. Del hjernen langs midtlinjen i to hjernehemisfærene og deretter kuttet av olfactory pærer, basalgangliene under hjernebarken og hippocampus med Dumont tang. Plasser den isolerte cerebral cortex i en ren petriskål inneholdende dissekere medium på is.
- Ta en cortex. Fjern hjernehinnene med pinsett med gode tips i henhold til en disseksjon mikroskop.
- Gjenta med de resterende cortices. Legg alle meninges-free ekser i en ren petriskål på is.
- Kombiner kortikale halvkuler fra alle unger i en 60 mm petriskål og bruke en steril barberblad til terninger hjernevevet i 1 mm hakket stykker.
- Overfør kvernet hjernevevet ved hjelp av en 10 ml pipette inn i en steril, ubelagt 500 ml glasskolbe og tilsett 10 ml iskald dissekere medium per rotte hjernen. Virvle kolben under tilsetning av 1 ml av trypsin-løsning i HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) (5 mg / ml trypsin) i 9 ml HBSS per rotte hjernen. Tilsett 2% Av det totale volumet i DNase-løsning (1 mg / ml) og 2% av det totale volumet i MgSO4-løsning (3,82% MgSO4 i HBSS (w / v)) til hjernevevet suspensjonen og virvle forsiktig.
- Trypsineres vev under forsiktig rysting på en rotasjonsrister i 30 minutter ved 37 ° C. Sørg for at vev stykker er flytende i dette trinnet, og ikke sedimentere til bunnen. Øke rotasjonshastigheten om nødvendig.
- Legg bovint serum (FBS) føtalt til en sluttkonsentrasjon på 10% (v / v) og bland ved å svinge kolben 10 ganger i 10 sek. Kjøl ned vev suspensjon i isvann i 15 min. Swirl kolbe forsiktig fem ganger hvert sekund min.
- overføre forsiktig vevet suspensjonen inn i sterile 50 ml rør ved bruk av 25 ml eller 50 ml pipetter og sentrifuger i 5 minutter ved 200 x g, 4 ° C.
- Fjern supernatant og resuspender forsiktig spaltet CNS-vev i 15 ml iskald dissekere medium supplert med 5 ml føtalt bovint serum, 0,4 ml MgSO4-løsning (3,82%MgSO4 i HBSS) og 1,6 ml DNase I (1 mg / ml).
- Split vev suspensjon likt i to sterile 15 ml rør (~ 10 ml hver gang) og langsomt triturate anvendelse av en 10 ml pipette (10 ganger) inntil suspensjonen blir grumsete / melkeaktig. Hold suspendert celler på is mens den neste tube behandlingen. Vent i 3 minutter før gjenværende fordøyd CNS vev sediment på bunnen av røret. Overføring supernatant for å rense 50 ml rør uten å forstyrre pelleten fraksjon.
- Eventuelt kan passere turbide supernatantene gjennom en 40-mikron cellefilter og kombinere den resulterende enkeltcelle-suspensjon i sterile 50 ml rør på is.
- Spin celle slurry i 5 min ved 200 xg, 4 ºC.
- fjern supernatanten ved bruk av en 10 ml pipette forsiktig til ~ 2 ml dissekere medium blir igjen på toppen av cellepelleten.
- Finger flick cellepelleter i 50 ml rør (~ 10 ganger). Langsomt tilsett 5 ml varm vekstmedium (se tabell 1) til cellesuspensjonen under forsiktighånd virvlende røret.
- Eventuelt gjentar DNase trinn 4.3.12 i ytterligere 10 minutter på is med frisk DNase I-løsning og MgSO4-oppløsning i tilfelle av synlige vev klynger eller DNA klumper. Swirl tube manuelt 5 ganger hvert sekund min.
- Plate 50.000 celler per 25 mm dekkglass i en dam av 400 ul vekstmedium i en 6-brønners skål og la cellene feste i 30 min i en cellekultur inkubator (5% CO 2, 37 ºC).
- For sammenflytende (innen 24-48 timer etter plating) 60 mm cellekulturskåler og 75 cm 2 vevsdyrkingskolber, plate 500.000 celler (60 mm parabol) eller 2 millioner celler (75 cm 2 kolber).
- Tilsett 2 ml (per brønn, 25 mm dekkglass i 6-brønners skål), 3 ml (60 mm skåler) eller 10 ml (75 cm2 kolber) av varm vekstmedium til hver brønn. Inkuber cellene over natten og endre medium helt til neste morgen. Deretter endrer medium annenhver dag (dag 3, dag 5, dag 7, etc.).
Neite: Rotte blandet gliaceller kulturer er klar til bruk for immunocytochemistry eller biokjemi 24-48 timer etter plating.
- Identisk med disseksjon av neonatal rottehjerner beskrevet i avsnitt 4.3.1 til 4.3.6, halshogge P0 neonatale WT og NCAM KO mus med C57 / BL6 bakgrunn, fjerne hjernen og sette dem i iskaldt dissekere medium (se tabell 1). Hold vev på is til alle tider.
- Del hjernen langs midtlinjen i to hjernehemisfærene og deretter kuttet av olfactory pærer, basalgangliene under hjernebarken og hippocampus med Dumont tang. Plasser den isolerte cerebral cortex i en ren petriskål som inneholdt HBSS på is.
- Ta en cortex. Fjern hjernehinnene med pinsett med gode tips i henhold til en disseksjon mikroskop. Gjenta med de resterende cortices. Legg alle meninges-free ekser i en ren petriskål på is.
- Overfør cortical hemispheres med en ml pipette fra hver mus i separate, sterile 15 ml rør. Tilsett 1,2 ml iskald dissekere medium til hver hjerne og mekanisk forstyrre hjernevevet ved pipettering det 2 ganger opp og ned ved hjelp av en 1 ml pipette.
- Tilsett 150 ul papain-oppløsning (10 mg / ml i PBS), 100 ul DNase I-løsning (1 mg / ml i HBSS) og 50 ul MgSO4 (3,82% i HBSS) til hver hjerne og bland ved å knipse finger.
- Inkuber hjernen suspensjonen i 30 minutter ved 37 ° C i et vannbad og bland hjernesuspensjoner hvert andre minutt etter finger Flikking. Tilsett 1 ml per rør FBS, bland og avkjøles vevet suspensjonen i 10 min på is.
- Spinne ned hjernevevet i 4 minutter ved 200 x g, 4 ° C og resuspendere vevet pelleten i 1 ml iskald dissekere buffer supplert med 70 ul av DNase I-løsning (1 mg / ml i HBSS) og 30 ul MgSO4 løsning (3,82% i HBSS).
- Triturer hjernevevet ved hjelp av en FBS-belagt 1 ml pipette(~ 5 ganger) inntil supernatanten blir grumset. Pass supernatanten gjennom en 40-micron celle sil og overføre til et rent rør på is.
- Pellet blandede gliaceller ved sentrifugering i 5 min ved 200 x g, 4 ° C. Aspirer supernatanten inntil ~ 100 ul av medium blir igjen på toppen av cellepelleten. Resuspender cellepelleten av finger bla (~ 5 ganger) og tilsett 1 ml varm mus vekstmedium (se tabell 1).
- Eventuelt kan oppløse synlige cellegrupper og lyserte celler / utfelles DNA ved forsiktig pipettering cellesuspensjonen opp og ned (fem ganger).
- Plate muse blandede gliacellene på PDL-belagte dekkglass eller 60 mm retter som beskrevet i trinn 4.3.19 - 4.3.21. Vask cellene neste morgen med varm mus vekstmedium og deretter annenhver dag. Mouse blandet gliaceller er klar til bruk for immunocytochemistry 48-72 timer etter plating.
- Kultur rotte blandetgliaceller i 75 cm2 vevsdyrkingskolber i vekstmedium (se tabell 1) i 10 dager. Rist av mikrogliaceller cellegrupper fra blandede glial kulturer på et rotasjonsristeapparat i en cellekulturinkubator (5% CO2, 37 ° C) ved 140 opm i 1 time.
- Ta av microglia holdig supernatant fra blandet gliaceller kulturer, passerer det gjennom en 40-micron celle sil og holde cellesuspensjonen i sterile 50 ml rør.
Merk: mikrogliaceller kulturer er vanligvis> 95% rent etter dette trinnet med få forurensende OPCS og svært få astrocytter. - Eventuelt erstatte vekstmedium på blandede gliaceller kulturer for fremtidige mikrogliaceller shake-offs. Vanligvis utfører flere mikrogliaceller shake-offs (en gang per uke) fra blandede gliaceller kulturer.
- Eventuelt, for å få høyere renhet 95% platen 10 ml av mikroglia-inneholdende supernatant (trinn 4.5.2) per 100 mm petriskåler og inkuberes i en cellekulturinkubator i 30 minutter ved 37 ° C. bare microglia vil legge til petriskåler, mens astrocytter og OPCs forbli i supernatanten.
- Rist petriskåler med og mot klokken (fem ganger hver) i cellekultur panseret. Sug av cellekulturmediet fullstendig og erstatte med 10 ml vekstmedium. Dannede microglia kulturer er> 98% ren.
- Kultur microglia for opp til 7 dager i DMEM supplert med 1% FBS og 1% penicillin / streptomycin.
- For å oppnå høyt anrikede kulturer OPC ryst mikrogliale celler først fra 10 dager gamle blandede glial kulturer dyrket i 75 cm2 kolber på en rotasjonsrister i en cellekulturinkubator (5% CO2, 37 ° C) ved 140 opm i 1 time. Kast microglia bare holdig supernatant eller bruke for microglia spesifikke eksperimenter (se trinn 5.5).
- Bytt microglial holdig supernatant med 10 ml vekstmedium og riste av blandede glia kulturer foren annen 18 timer på en rotasjonsrystemaskin ved 200 opm (5% CO2, 37 ° C).
- Samle microglia- og OPC-holdig supernatant fra blandede gliaceller kulturer og passerer gjennom en 40-micron celle sil. Samle cellesuspensjonen i sterile 50 ml rør.
- Eventuelt erstatte vekstmedium på blandede gliaceller kulturer for fremtidige OPC shake-offs.
Merk: OPCs fortsetter å spre på astrocytic næringslag og kan rystes-off en andre og tredje gang (en gang per uke), om enn med lavere avkastning. - Plate 10 ml av microglia- og OPC-inneholdende supernatant inn i 100 mm petriskåler og inkuberes i cellekulturinkubator i 30 minutter ved 37 ° C. Microglia vil feste til petriskåler, mens OPCs og astrocytter forbli i supernatanten.
- Rist petriskåler med og mot klokken (5 ganger hver) i en cellekultur hette. Ta ut noen få petriskåler i en tid fra cellekultur inkubator (microglia vil starte løsner fra Petri retter når ristet kraftig i kjøligere medium).
- Samle og kombinerer OPC-supernatant i 50 ml rør. Eventuelt legge kulturmedium til petriskåler til bruk i microglia spesifikke eksperimenter.
- Eventuelt, for ytterligere å øke renheten av OPC kulturer gjenta trinn 5.6.5 og 5.6.6 en gang med frisk Petriskåler for å redusere omfanget av mikroglia i OPC preparater.
- Spinne ned anriket OPC-inneholdende væsken i sentrifuge i 5 min ved 250 x g, 4 ° C. Forsiktig aspirer supernatanten uten å forstyrre cellepelleten. La 3 ml av supernatanten på toppen av pelleten og begynne resuspendering OPCS etter finger Flikking (10 ganger).
- Forsiktig triturate OPC cellegrupper ved å bruke en 10 ml pipette (5 - 10 ganger).
- Telle celler og plate 50.000 OPCs per 25 mm dekkglass (PDL-belagt) i en dam av 400 ul vekstmedium i en seks-brønns fatet og la cellene feste i 30 min i en cellekultur inkubator (5% CO 2, 376, C). Tilsett 2 ml varm spredning medium (se tabell 1) til hver brønn. For PDL-belagte 60 mm cellekulturskåler, plate 1 - 1,5 millioner OPCs i 3 ml spredning medium.
- Nøye erstatte FBS holdig spredning medium med fersk spredning medium tre timer etter plating de OPCs (sørg OPCs festet skikkelig og ikke løsner under middels endring). Utveksling medium annenhver dag.
Merk: Rat OPC kulturer utarbeidet etter denne protokollen er vanligvis 90% rent med microglia som de store forurensende celletype, etterfulgt av astrocytter.
5. Immunocytochemistry Bruke HIgM12 i Primær gliaceller
- Triple-label immunfluorescens bruker HIgM12, anti-PSA mAb, og Cell type spesifikke markører i Primær gliaceller fra WT og NCAM KO mus
- Under live-celle forhold, etiketten 60% konfluent mus blandet gliaceller kulturer fra WT og NCAM KO mus dyrket på PDL-belagte25 mm dekkglass med HIgM12 (10 ug / ml) og anti-PSA-mAb (klon 2-2B) (10 ug / ml) i PBS supplert med 10% FBS ved 4 ° C i 30 minutter.
- Vask cellene tre ganger i 20 sekunder hver med iskald PBS supplert med 10% FBS og feste med 4% paraformaldehyd i PBS, pH 7,4 i 15 min ved 25 ° C.
- Vask fikserte celler to ganger 1 min hver gang med PBS supplert med 10% FBS og permeabilisere cellene med 0,1% Triton-X100 i PBS, pH 7,4 i 2 min ved 25 ° C. Vask cellene to ganger 1 min og etikett med glial markører GFAP (astrocytter) eller IBA-en (microglia) (1 mikrogram / ml) i PBS supplert med 10% FBS natten ved 4 ºC i kjølerommet.
- Fortsett med standard immunofluorescence forhold, inkludert DAPI holdig monteringsmedium 31.
Merk: Bruk av fluorescensmerkede Fab 2 fragmenter som sekundære antistoffer for mennesker (HIgM12) og mus (anti-PSA mAb, klone 2 - 2B) IGMS anbefales sterkt. - ta fluorescent bilder på 60X eller 100X forstørrelse. Bruk de samme instrumentinnstillingene for alle bilder og behandle bilder identisk.
- Immunfluorescens Merking av ENDO-NF-behandlede WT gliaceller bruker HIgM12 som et primært antistoff
- Kultur WT mus blandet gliaceller dyrket i 3 dager i Neurobasal En supplert med 10% FBS og B27 supplement (01:50) på PDL-belagte 25 mm dekkglass. Legg ENDO-NF (30 ug / ml) til 1 ml kulturmedium og inkuberes over natten i en cellekulturinkubator (37 ° C, 5% CO2).
- Etikett celler lever kaldt med HIgM12 og innvendig astrocytic markør GFAP etter fiksering og permeabiliseringen som beskrevet i trinn 5.1.1 til 5.1.5. Ta fluorescerende bilder på 60X eller 100X forstørrelse. Bruk de samme instrumentinnstillinger for alle bilder og behandle likt.
Representative Results
Denne delen viser eksempler på resultater som kan oppnås ved å studere menneske IgM-spesifikke PSA-antigener i CNS. Bruken av humane IgM-antistoffer som inneholder spesifikke Vκ lette kjeder i biokjemiske innstillinger og med fluorescerende immunocytokjemi er vist.
HIgM12 Immunoutfellingene sin antigen fra cerebrale hjernelysatene og fungerer som et påvisningsmiddel (primær antistoff) i Western blot. Hverken isotype kontrollantistoff eller agarose L perler immunoutfelle en tilsvarende antigen, noe som viser spesifisiteten av trekke ned (figur 1). Western blot bruker CNS lysatene fra WT og NCAM KO mus demonstrere spesifisitet HIgM12-binding til PSA-holdige NCAM (figur 2A). Enzymatisk nedbrytning av CNS-vev fra WT mus ved hjelp av ENDO-NF identifiserer PSA festet til NCAM som det spesifikke bindende epitop for HIgM12 (figur 2B). Ved bruk av metoden som er beskrevet heri, er IBA-1-positive rotte mikrogliaceller kulturer av høy renhet oppnås (figur 3). Kommersielt tilgjengelige anti-PSA-antistoff (klone 2-2B) ikke merke celleoverflaten eller interne PSA bassenger i faste og permeabilized IBA-1-positive mikrogliaceller celler ved fluorescerende mikroskopi. I samsvar med tidligere utgitt litteratur, som rapporterer ingen celle-overflate uttrykk for PSA-NCAM i microglia 16,41 HIgM12 ikke merke celleoverflateantigener i rene rotte microglia. Interessant, HIgM12 merking av faste og permeabilized microglia resulterer i en intracellulær, perinukleær mønster som ikke er begrenset til spesifikke organeller (figur 3). Resultatene er i kontrast til de som ble oppnådd ved bruk av et anti-PSA-IgG-antistoff (klon 735) 26 som er rettet mot PSA-SynCAM i mikroglia ved nivået for Golgi-41.
I motsetning til mikroglia, HIgM12og A2B5 mål-celleoverflateantigener i sterkt anriket rotte OPC-kulturer i henhold til levende celle betingelser (figur 4). OPC kulturer inneholde ~ 5% forurensende mikrogliale celler. Figur 5 illustrerer en praktisk talt identisk celleoverflate fargemønster mellom HIgM12 og anti-PSA-mAb (klon 2-2B) i GFAP-positive astrocytter (figur 5A). Immunofluorescent merking av ENDO-NF-fordøyd WT astrocytter i forhold til buffer kontrollbehandlede WT astrocytter hjelp HIgM12 viser tilstedeværelse av astrocytic PSA (figur 5B). Tilstedeværelsen av PSA-positive astrocytter in vivo har fortsatt ikke bekreftet.
Figur 1: HIgM12 fungerer som en "pull-down" Agent i immunoutfellinger immunoutfellinger fra total hjerne lysat av tre måneder gamle mus bruker HIgM12, menneskelig isotypekontrollantistoff HIGM.126 eller agarose L perler eneste som "trekker ned" agenter. Eluerte proteiner ble kjørt i Western blot med membraner autosøk mot HIgM12. Molekylvekter av eluerte proteiner fra HIgM12-belagte perler var i området fra 160 til 200 kDa i tillegg til den IGMS tunge kjede (~ 65-73 kDa). Dette tallet har blitt forandret fra J. Neurochem. 15. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: HIgM12 Målsettinger den Polysialic Acid (PSA) delen på NCAM. A. Brain homogenates fra P7, P13, P16 og P27 NCAM totalt KO mus og heterozygote kull kontroller ble kjørt i Western blot med membraner autosøk mot HIgM12, Ptil og β-actin som lasting kontroll.
Figur 3: Absence of Ptil på Rat Microglia speiles av en mangel på HIgM12 Merking Rat microglia ble dyrket i 48 timer på poly-D-lysin belagt dekkglass og enten merket live på isen med HIgM12 eller etter fiksering med HIgM12 eller anti. -PSA mAb (klone 2-2B). Celler ble triple merket med microglia markør IBA-en (grønn), HIgM12 / PSA (rød) og DAPI (blå). Bildene viser mangel på microglial celleoverflatebinding ved hjelp av HIgM12 (øverste rad) og mangel på anti-PSA-binding (klon 2-2B) til celleoverflaten og indre lagre i primær rotte mikroglia (nederste rad). Basert på bipolar morfologi og fravær av IBA-1-farging, ble den lille PSA-positiv celle (nederste rad) foreslått å være en OPC. I faste celler, HIgM12 farging resulterte i en punctated, perinukleær mønster som ikke var begrenset til spesifikke organeller og ble ansett som ikke-spesifikk binding (midterste rad). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: HIgM12 Targets Cell Surface PSA-NCAM på Rat OPCs Rat OPCs og microglia var Cultu.rød for 4 dager i spredning medium på poly-D-lysin belagt dekkglass og tre merkede live på isen med HIgM12 eller A2B5 (grønn), intern makrofag / monocytt markør CD68 (klon ED-1) (rød) og DAPI (blå) . Bildene viser cellepopulasjoner majorly positivt for OPC markør A2B5 (øverste rad) og HIgM12 (nedre rad) med noen CD68-positive microglia (~ 5%). Fasekontrast og DAPI bilder ble lagt for å avsløre celle integritet og celle tall for hver populasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: HIgM12 og anti-PSA mAb co-merke en astrocytic undergruppe i Mouse Mixed Glia. A. Muse blandede gliaceller fra WT og NCAM totalt KO dyr inneholder astrocytter oligodendrocyte-avstamning celler og mikrogramlia ble dyrket i 3 dager og merket live på isen med HIgM12 (grønn), anti-PSA mAb (klone 2-2B) (rød) og senere for astrocytic markør GFAP (lilla) og DAPI (blå). HIgM12 og anti-PSA avslører et virtuelt identisk fargemønster på GFAP-positive WT astrocytter men mangel binding til kultur astrocytter fra NCAM KO mus. Dette tallet har blitt forandret fra J. Neurochem. 15. B. Blandede gliaceller ble dyrket identisk som beskrevet under A. og behandlet over natten med endoneuraminidase-NF (vennlig levert av Dr. Martina Muehlenhoff) eller PBS kontroll. Celler ble merket live på isen med HIgM12 (grønn) og deretter farget for intern markører GFAP (rød) og DAPI (blå). HIgM12 rettet mot celleoverflateantigener på PBS-kontroll behandlet blandede gliaceller kulturer, men ikke endoneuraminidase-NF behandlet blandet gliaceller. Dette tallet har blitt forandret fra JNSCI 16. Pllette Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Alle bildene ble tatt ved 60x forstørrelse med de samme instrumentinnstillinger og behandles likt.
Tabell 1:. Buffer og Solution Oppskrifter Klikk her for å laste ned denne tabellen.
| CNS vev | ENDO-NF / PBS | lyseringsbuffer | totalt volum | |
| 1. WT mus | 67 mikrogram (0,45 mL) | 2 mL (12 mikrogram) ENDO-NF | 7.55 mL | 10 ul |
| 2. WT mus | 67 mikrogram (0,45 mL) | 2 ul PBS | 7.55 mL | 10 ul |
| 3. WT mus | 67 mikrogram (0,45 mL) | ingen PBS eller ENDO-NF | 9,55 mL | 10 ul |
| 4. NCAM KO mus | 67 mikrogram (0,45 mL) | 2 mL (12 mikrogram) ENDO-NF | 7.55 mL | 10 ul |
| 5. NCAM KO mus | 67 mikrogram (0,45 mL) | 2 ul PBS | 7.55 mL | 10 ul |
| 6. NCAM KO mus | 67 mikrogram (0,45 mL) | ingen PBS eller ENDO-NF | 9,55 mL | 10 ul |
Tabell 2: ENDO-NF fordøyelse av CNS-vev fra P7 WT og NCAM KO mus.
Discussion
Humane naturlige IgM-autoantistoffer er tiltalende kandidater for immunterapi og har vist terapeutisk potensiale for behandling av forskjellige sykdommer, inkludert kreft og CNS-lidelser 1-7. Fortrinnsvis vil disse antistoffene ikke utløse en immunrespons i hvilken dannelsen av nøytraliserende antistoffer i vesentlig grad reduserer den effektive terapeutiske dose og effekt. Viktigere, har alle antistoffer med terapeutisk potensial vært av IgM isotype og hører til NAB repertoar 3-5,8,9,37,40,42-45. Et stort hinder for den potensielle kliniske anvendelsen av IgM-antistoffer er identifikasjonen av deres antigener, som er fastslått i mange tilfeller. Standard teknikker ansatt for IgG antistoffer er ofte ikke aktuelt å identifisere en IgM er antigen.
Denne protokollen beskriver identifiseringen av PSA-NCAM som antigen for den regenerative humant IgM-antistoff HIgM12, effektive i dyremodellerav MS og ALS 15-18. Den metodikk som brukes er hovedsakelig anvendelig for alle humane antistoffer med spesifikk Vκ lette kjeder VκI, VκIII og VκIV og muse-antistoffer med VκI lette kjeder, uten hensyn til antistoffets isotype.
Den mest kritiske trinn i denne protokollen er bruken av IgM-antistoffer i affinitetskromatografiske anvendelser. Nærmere bestemt er fremgangsrike antistoff nødvendig for å virke som rullegardinstoffer i immunoutfellinger for å isolere eller til å anrike et antigen ut av komplekse vevs- eller cellekultur-lysater. Anrikede fraksjoner antigen kan sammenlignes med immunoutfellinger fra isotypekontrollantistoffer og deretter analysert for forskjeller ved massespektrometri. Ett viktig krav eller begrensning av dette trinnet er nærværet av den korrekte antistoff Vκ lettkjede og vert (human, mus) for å muliggjøre antistoffbinding til protein L agarose. Bruk av mannan-bindende protein bundet til agarose (også called mannose-bindende lektin) i stedet for L-proteinet agarose er et potensielt alternativ til å immunoutfelle IGMS uten særlige Vκ lette kjeder. Imidlertid, som det fremgår av Arnold et al. 35, antigen-bundet IgM-antistoffer binder ikke til mannan-bindende protein, som målet glykan synes å være utilgjengelige når IgM har bundet til dets antigen. Basert på disse funnene mannose-bindende protein kan ikke brukes som en bindende matrise for å immunoutfelle antigen belastede IgM molekyler med molekylvekt 35. Andre mulige alternativer kan være bruk av sekundære agarose-bundet anti-IgM IgG-antistoffer 46,47 eller bruk av overflateaktiverte magnetiske kuler 48. IgG antistoffer rettet mot IGMS kan være kjemisk tverrbundet til agarose A eller G-agarose for å redusere omfanget av eluerte antistoffet sammen med antigenet av interesse. En riktig sammenligning mellom ulike varianter av IgM immunopresipitering med hensyn til vellykket identifiserte antigener ier vanskelig fordi de fleste immunoutfellinger ble utført for å isolere eller utarme IGMS uten ytterligere interesse for sine antigener. I tillegg ble det ved hjelp av immunoutfellinger IGMS i hovedsak brukt for å bekrefte en allerede kjent eller forventet enkelt antigen med antistoff eksponering til rensede antigener 49. En ulempe ved agarose-koplet IgG rettet mot human IGMS er et meget lavt utbytte (10 - 15%) av immunopresipitert serum-IgM-molekyler sammenlignet med utgangsmaterialet 50. I motsetning til dette ble det overflateaktiverte magnetiske kuler med hell brukes til antistoffer av forskjellige isotyper, inkludert IgM for å immunoutfelle skrapesyke-assosiert fibriller 48. Denne metoden er ikke begrenset til spesifikke kappa (Vκ) eller lambda (λ) kjeder eller en spesiell vert, og kan i det vesentlige utvide spekteret av IgM-antistoffer som brukes i immunoutfellinger.
Et annet viktig skritt i protokollen er antistoffets evne til å fungere som en Detecting antistoff (primær antistoff) i Western blot eller andre screening plattformer. Vellykket antistoffer må målrette deres antigenet med tilstrekkelig høy affinitet til å tillate antigen binding i nærvær av ikke-ioniske eller muligens ioniske vaskemidler. Høy affinitet antistoffer er vanlig blant affinitets-maturated IgG-antistoffer, men mindre vanlig blant antistoffer av IgM-isotypen, som er en av årsakene til at det er relativt få kommersielt tilgjengelige IgM-antistoffer som detektering av midler i biokjemiske innstillinger. Høyaffinitets binding av antistoffer som er en forutsetning for immunoutfellinger av molekylære antigener og for Western blotting. Senking vaskemiddel konsentrasjoner eller fullstendig fravær av vaskemidler i IP buffere og oppløsnings buffere tillater antigen målretting av lav affinitet antistoffer via sin Fab-domene. I motsetning til dette er antistoffets evne til å målrette protein L-agarose via sin Fc-del ikke i vesentlig grad påvirkes blant isotype kontroll over en rekke forskjellige detergent konsenrasjoner. Imidlertid lav konsentrasjon vaskemiddel i lyseringsbuffer og IP-buffer hindrer cellemembranen avbrudd og isolering av spesifikke molekyler. Tilsvarende vil en lav konsentrasjon vaskemiddel i Western-blot vaske- buffere (for eksempel PBS-T) tillater antigen binding av lav-affinitets antistoffer, men på samme tid øker ikke-spesifikk binding, og er derfor ikke et alternativ.
Tilstedeværelsen av et antigen-protein kjerne er en forutsetning for denne metoden. Proteiner med posttranslational modifikasjoner (f.eks glykoproteiner, lipoproteiner) og umodifiserte proteiner, men ikke eneste lipider eller karbohydrater, kan påvises i Western blot. Det er ikke mulig å immunoutfelle lipider (f.eks sfingolipider) fra vevs- eller cellelysatene i nærvær eller fravær av detergenter. De fysiokjemiske egenskapene til vaskemidler og lipider er for like til å tillate selektiv lipid-antistoff-interaksjoner, mens på samme tid vaskemidler er vesentlig å forstyrremembraner for å tillate selektiv isolasjon av spesifikke molekyler. Til vår beste kjennskap, immunoutfellinger utelukkende består av karbohydrater, i fravær av et protein kjerne, har ikke tidligere blitt rapportert. Dette blir spesielt relevant fordi IgM-antistoffer ofte målrette karbohydrater og glykolipider, som ikke nødvendigvis er bundet til et protein enhet. Andre kromatografiske teknikker er nødvendig for separasjon og immunologiske identifisering av lipider og karbohydrater i fravær av et protein kjerne. For eksempel kan tynnsjiktskromatografi (TLC) av cellulære lipider med etterfølgende antistoffdeteksjon på TLC-platen (immuno-TLC) implementeres 51,52.
Andre anti-PSA-antistoffer er blitt beskrevet i tidligere studier og resultater, sammenlignet med HIgM12, så vel som den kommersielt tilgjengelige anti-PSA-IgM (klon 2-2B). Den mest brukte antistoff i feltet av PSA er et IgG-antistoff (klon 735) som er tilgjengelig som mus monoclonal eller kanin polyklonale antistoff 53. Denne anti-PSA IgG antistoff oppdager PSA på SynCAM og NCAM på ulike CNS celletyper, inkludert mikrogliaceller celler 41. I motsetning til den anti-PSA-IgG-antistoff, humane IgM-antistoffer HIgM12, HIgM42 og anti-PSA-muse-IgM (klon 2-2B) er ute av stand til å målrette PSA på SynCAM (men på NCAM) ved forskjellige embryonale og tidlige postnatale stadier i mus , mens ikke-polysialylated SynCAM er lett synlig 15. IgM antistoffer som brukes er heller ikke i stand til å oppdage Ptil på mikrogliaceller celler (figur 3 + 4). En mulig forklaring på forskjellene observert mellom antistoff-isotyper kan være lave PSA-SynCAM nivåer sammenlignet med nivåer av PSA-NCAM kombinert med potensielt lavere affinitet binding av IgM-antistoffer sammenlignet med anti-PSA-IgG. For å teste denne hypotesen, utførte vi immunoutfellinger i NCAM KO dyr på fosterstadiet E17 med store mengder SynCAM stede og brukes HIgM12 som en "pull-down agent" <sup> 15. I E17 WT kull styrer HIgM12 immunopresipitert PSA-NCAM i en grad som viste tilsvarende intensiteter av "trukket ned" PSA-NCAM forhold til IGMS tungkjede som detektert ved densitometri i påfølgende Western blot ved hjelp eluert antigener. Dette resultatet foreslått minst en tilstrekkelig affinitet HIgM12 til målet Ptil. I motsetning til WT kull styrer HIgM12 ikke oppdage PSA festet til SynCAM i NCAM KO dyr. Identiske resultater ble oppnådd i immunoutfellinger ved hjelp av humane anti-PSA IgM HIgM42. HIgM12 og HIgM42, samt mus anti-PSA IgM (klone 2-2B) var ikke i stand til å målrette Ptil på SynCAM i vestlige blotter fra WT og NCAM KO dyr på embryonale og postnatal utviklingsstadier. Gitt den lave mengden av HIgM12 kreves (0,1 ug / ml) for spesifikt å påvise PSA festet til NCAM i Western blot ved hjelp av små mengder av CNS vev (0,1 ug CNS vev per brønn) 15 synes det å være lite sannsynlig at lave affiniteter alene eransvarlig for fullstendig mangel på PSA-SynCAM deteksjon av HIgM12 i tre forskjellige metoder.
Vi konkluderer med at det er betydelige forskjeller mellom anti-PSA IgM antistoffer og ofte publisert anti-PSA IgG antistoff (klon 735). Det er ikke klart hvorfor kommersielt tilgjengelige anti-PSA IgM-antistoffer ikke ble brukt oftere i det siste for å bekrefte resultatene oppnådd med antiPSA IgG antistoff 735. Dette er spesielt interessant fordi HIgM12 allerede har dokumentert effekt i forskjellige sykdomsmodeller. Mens andre anti-PSA IgM-antistoffer kan ha lignende terapeutiske effekter er det fortsatt uklart om anti-PSA IgG antistoff (klon 735) har en lignende terapeutisk utfall i modeller av MS og ALS.
I korte trekk, ble metodene som er beskrevet her brukes primært for å identifisere antigenet av de regenerative humant antistoff HIgM12 å støtte potensielle kliniske forsøk for MS og eventuelt andre nevrodegenerative sykdommer. Identifiseringen av maurigens for antistoffer med biologisk aktivitet er like viktig skritt for å forstå deres virkningsmekanisme. Dette blir særlig relevant i sammenheng med en rekke monoklonale antistoffer tiden blir testet for sikkerhet og effekt i menneskelige forsøk. Mens antall klinisk testet IgM antistoffer til dags dato er liten, nylige fremskritt i hybridoma teknologi sammen med et økende antall studier fremhever det terapeutiske potensialet i dette antistoffet klassen 1-10,37,40,42-45 oppfordrer til utvikling av nye eller modifiserte metoder anvendelig for å identifisere ikke-protein-IgM-antigener.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Institutes of Health (R01 GM092993, R01 NS048357 og R21 NS073684), National Science Foundation (KARRIERE Award), Minnesota Partnership Award for bioteknologi og medisinsk Genomics, National Multiple Sclerosis Society (CA1060A) og Mayo Clinic Senter for klinisk og translasjonell Science (CCaTS). Forfatterne erkjenner støtte fra Applebaum, Hilton, Peterson og Sanford Foundations, månen og Marilyn Park Styreverv Fondet og McNeilus familien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Fisher Scientific | MT-10-013-CVRF | High glucose, with glutamine, with sodium pyruvate, 500 ml |
| DMEM/F-12, HEPES | Life Technologies | 11330-032 | 500 ml, L-glutamine, sodium pyruvate, high glucose |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | 10,000 U/ml, 100 ml |
| N-2 Supplement (100x) | Life Technologies | 17502-048 | 5 ml |
| B-27 Supplement (50x) | Life Technologies | 17504-044 | serum free, 10 ml |
| Fetal Bovine Serum - Optima | Atlanta Biologicals | S12450 | 500 ml |
| Sterile water for irrigation | Baxter Healthcare | #2F7114 | USP-1,000 ml, 12/CA |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7886-50MG | D-Lys-(D-Lys)n-D-Lys · xHBr, Molecular Weight 30,000-70,000 g/mol, 50 mg |
| bovine serum albumin fraction V | Sigma | A-3294-100G | heat shock fraction, protease free, pH 7, purity 98%, 100 g |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G5767-500G | C6H12O6, Molecular Weight: 180.16 g/mol, ACS reagent, 500 g |
| Trypsin from bovine pancreas | Sigma | T9935-100mg | essentially salt-free, lyophilized powder, 9,000 BAEE units/mg protein |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D5025-150KU | Type IV, lyophilized powder, 2,000 Kunitz units/mg protein |
| Recombinant Rat FGF basic Protein | R&D systems | 3339-FB-025 | BSA as a carrier protein, 25 µg, lyophilized, > 95%, 16.2 kDa |
| Recombinant Rat PDGF-AA Protein | R&D systems | 1055-AA-50 | carrier free, 50 µg, lyophilized, > 97%, E. coli-derived, 12.5 kDa |
| Neurobasal-A | Life Technologies | 10888-022 | 500 ml, No Glutamine, No Aspartic Acid, No Glutamic Acid |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148-1KG | crystalline, 1 kg, reagent grade, Molecular Weight 30.03 g/mol (as monomer) |
| Tris[hydroxymethyl]aminomethane (Tris bas | Biorad | #1610719 | 1 kg, 99.8% pure, powder |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Biorad | #1610302 | 1 kg, powder |
| Glycine | Fisher Scientific | BP-381-5 | C2H5NO2, Molecular weight: 75.07 g/mol, White crystalline Powder, 5 kg |
| Sodium chloride | Sigma | S7653-5KG | NaCl, Molecular Weight: 58.44 g/mol, 5 kg |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S0751-500G | NaH2PO4, Molecular Weight: 119.98 g/mol, 500 g |
| Phosphate-buffered Solution 1x (PBS) | Cellgro | MT-21-040-CV | Without Calcium and Magnesium, 6 x 500 ml |
| Falcon 60 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning Life Sciences | #353002 | 60 mm Cell Culture Dish, TC-treated polystyrene, 20/pack, sterile |
| Falcon 60 mm x 15 mm Petri dish | Corning Life Sciences | #351007 | Not TC-Treated Bacteriological Petri Dish, 20/Pack |
| 6 well cell culture plates | Corning Costar | CLS3516 | 6 well, flat bottom (Individually wrapped), gamma-irradiated, growth area 9.5 c |
| 75 cm² tissue culture flask | Corning Life Sciences | 430720U | 75 cm² U-Shaped Canted Neck Cell Culture Flask with Plug Seal Cap |
| Pierce™ Protein L Plus Agarose | ThermoFisher Scientific | #20520 | 2 ml, crosslinked 6% beaded agarose (CL-6B), binding capacity: 10 to 20 mg IgG |
| 4 - 20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Biorad | 456-1094 | 10-well, 50 µl, for use with Mini-PROTEAN electrophoresis cells |
| Immobilon-P Membrane | Millipore | IPVH00010 | PVDF, 0.45 µm, 26.5 cm x 3.75 m roll |
| Anti-Polysialic Acid-NCAM Antibody, clone | Millipore | MAB5324 | 50 microliters, Host: mouse, monoclonal IgM |
| 4x Laemmli Sample Buffer | Biorad | #1610747 | 10 ml, 4x premixed protein sample buffer |
| 2-mercaptoethanol | Biorad | #1610710 | 25 ml, 98 % pure, 14.2 M |
| Endoneuraminidase-N (Endo-N) | ABC Scientific | ABC0020 | 50 microliters, 200 µg/ml, 3,500 U/mg |
| 25 mm glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-102 | Circles No. 1; Thickness: 0.13 to 0.17 mm; Size: 25 mm |
| HEPES buffer solution | ThermoFisher Scientific | 15630-080 | 100 ml, 1 M |
| Hanks' Balanced Salt Solution 1x (HBSS) | Cellgro | MT-21-022-CV | 500 ml, without Calcium, Magnesium, Phenol Red |
| Papain | Worthington Biochemical Cooperation | LS003119 | lyophilized powder, 100 mg |
| Magnesiumsulfate | Sigma | M-2643-500G | powder, 500 g |
| L-Glutamine | Gibco | #25030-081 | 100 ml, 200 mM |
References
- Asakura, K., Miller, D. J., Pease, L. R. Targeting of IgMkappa antibodies to oligodendrocytes promotes CNS remyelination. J Neurosci. 18 (19), 7700-7708 (1998).
- Bieber, A. J., Warrington, A., Asakura, K. Human antibodies accelerate the rate of remyelination following lysolecithin-induced demyelination in mice. Glia. 37 (3), 241-249 (2002).
- Vollmers, H. P., Brandlein, S.
- Vollmers, H. P., Brandlein, S.
- Vollmers, P. H., Brandlein, S. Natural monoclonal antibodies and cancer. Recent Pat Anticancer Drug Discov. 3 (2), 84-87 (2008).
- Warrington, A. E., Asakura, K., Bieber, A. J. Human monoclonal antibodies reactive to oligodendrocytes promote remyelination in a model of multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci. 97 (12), 6820-6825 (2000).
- Warrington, A. E., Bieber, A. J., Ciric, B. A recombinant human IgM promotes myelin repair after a single, very low dose. J Neurosci Res. 85 (5), 967-976 (2007).
- Brandlein, S., Pohle, T., Ruoff, N. Natural IgM antibodies and immunosurveillance mechanisms against epithelial cancer cells in humans. Cancer Res. 63 (22), 7995-8005 (2003).
- Pohle, T., Brandlein, S., Ruoff, N. Lipoptosis: tumor-specific cell death by antibody-induced intracellular lipid accumulation. Cancer Res. 64 (11), 3900-3906 (2004).
- Miller, D. J., Sanborn, K. S., Katzmann, J. A. Monoclonal autoantibodies promote central nervous system repair in an animal model of multiple sclerosis. J Neuro. 14 (10), 6230-6238 (1994).
- Acorda Therapeutics Inc. An Intravenous Infusion Study of rHIgM22 in Patients With Multiple Sclerosis (Clinical Trials Identifier - NCT01803867). , Available from: http://1.usa.gov/1N2gsHJ (2015).
- Warrington, A. E., Bieber, A. J., Van Keulen, V. Neuron-binding human monoclonal antibodies support central nervous system neurite extension. J Neuropathol Exp Neurol. 63 (5), 461-473 (2004).
- Xu, X., Warrington, A. E., Wright, B. R. A human IgM signals axon outgrowth: coupling lipid raft to microtubules. J Neurochem. 119 (1), 100-112 (2011).
- Xu, X., Wittenberg, N. J., Jordan, L. R. A patterned recombinant human IgM guides neurite outgrowth of CNS neurons. Sci Rep. 3, 2267 (2013).
- Watzlawik, J. O., Kahoud, R. J., Ng, S. Polysialic acid as an antigen for monoclonal antibody HIgM12 to treat multiple sclerosis and other neurodegenerative disorders. J Neurochem. 134 (5), 865-878 (2015).
- Watzlawik, J. O., Painter, M. M., Wootla, B. A human anti-polysialic acid antibody as a potential treatment to improve function in multiple sclerosis patients. J Nat Sci. 1 (8), (2015).
- Xu, X., Denic, A., Jordan, L. R. A natural human IgM that binds to gangliosides is therapeutic in murine models of amyotrophic lateral sclerosis. Dis Model Mech. 8 (8), 831-842 (2015).
- Denic, A., Macura, S. I., Warrington, A. E. A single dose of neuron-binding human monoclonal antibody improves spontaneous activity in a murine model of demyelination. PLoS One. 6 (10), e26001 (2011).
- Lanier, L. L., Chang, C., Azuma, M. Molecular and functional analysis of human natural killer cell-associated neural cell adhesion molecule (N-CAM/CD56). J Immunol. 146 (12), 4421-4426 (1991).
- Moore, S. E., Thompson, J., Kirkness, V. Skeletal muscle neural cell adhesion molecule (N-CAM): changes in protein and mRNA species during myogenesis of muscle cell lines. J Cell Biol. 105 (3), 1377-1386 (1987).
- Pollerberg, E. G., Sadoul, R., Goridis, C. Selective expression of the 180-kD component of the neural cell adhesion molecule N-CAM during development. J Cell Biol. 101 (5 Pt 1), 1921-1929 (1985).
- Seilheimer, B., Persohn, E., Schachner, M. Neural cell adhesion molecule expression is regulated by Schwann cell-neuron interactions in culture. J Cell Biol. 108 (5), 1909-1915 (1989).
- Trotter, J., Bitter-Suermann, D., Schachner, M. Differentiation-regulated loss of the polysialylated embryonic form and expression of the different polypeptides of the neural cell adhesion molecule by cultured oligodendrocytes and myelin. J Neuro Res. 22 (4), 369-383 (1989).
- Yazaki, T., Asou, H., Arimoto, K. Decrease of NCAM expression and astrocyte-neurone interaction in long-term cultured astrocytes. Neuroreport. 6 (8), 1085-1088 (1995).
- Zuber, C., Lackie, P. M., Catterall, W. A. Polysialic acid is associated with sodium channels and the neural cell adhesion molecule N-CAM in adult rat brain. J Biol Chem. 267 (14), 9965-9971 (1992).
- Galuska, S. P., Rollenhagen, M., Kaup, M. Synaptic cell adhesion molecule SynCAM 1 is a target for polysialylation in postnatal mouse brain. Proc Natl Acad Sci. 107 (22), 10250-10255 (2010).
- Curreli, S., Arany, Z., Gerardy-Schahn, R. Polysialylated neuropilin-2 is expressed on the surface of human dendritic cells and modulates dendritic cell-T lymphocyte interactions. J Biol Chem. 282 (42), 30346-30356 (2007).
- Rollenhagen, M., Buettner, F. F., Reismann, M. Polysialic acid on neuropilin-2 is exclusively synthesized by the polysialyltransferase ST8SiaIV and attached to mucin-type o-glycans located between the b2 and c domain. J Biol Chem. 288 (32), 22880-22892 (2013).
- Schnaar, R. L., Gerardy-Schahn, R., Hildebrandt, H. Sialic acids in the brain: gangliosides and polysialic acid in nervous system development, stability, disease, and regeneration. Physiol Rev. 94 (2), 461-518 (2014).
- Abe, M., Goto, T., Kosaka, M. Differences in kappa to lambda (kappa:lambda) ratios of serum and urinary free light chains. Clin Exp Immunol. 111 (2), 457-462 (1998).
- Bhattacharyya, D., Hammond, A. T., Glick, B. S.
- Cremer, H., Lange, R., Christoph, A. Inactivation of the N-CAM gene in mice results in size reduction of the olfactory bulb and deficits in spatial learning. Nature. 367 (6462), 455-459 (1994).
- Polo-Parada, L., Bose, C. M., Plattner, F. Distinct roles of different neural cell adhesion molecule (NCAM) isoforms in synaptic maturation revealed by analysis of NCAM 180 kDa isoform-deficient mice. J Neurosci. 24 (8), 1852-1864 (2004).
- Tomasiewicz, H., Ono, K., Yee, D. Genetic deletion of a neural cell adhesion molecule variant (N-CAM-180) produces distinct defects in the central nervous system. Neuron. 11 (6), 1163-1174 (1993).
- Arnold, J. N., Wormald, M. R., Suter, D. M. Human serum IgM glycosylation: identification of glycoforms that can bind to mannan-binding lectin. J Biol Chem. 280 (32), 29080-29087 (2005).
- Bjorck, L., Protein, L. A novel bacterial cell wall protein with affinity for Ig L chains. J Immunol. 140 (4), 1194-1197 (1988).
- Vollmers, H. P., Dammrich, J., Hensel, F. Differential expression of apoptosis receptors on diffuse and intestinal type stomach carcinoma. Cancer. 79 (3), 433-440 (1997).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Stummeyer, K., Dickmanns, A., Muhlenhoff, M. Crystal structure of the polysialic acid-degrading endosialidase of bacteriophage K1F. Nat. Struct. Mol. Biol. 12 (1), 90-96 (2005).
- Vollmers, H. P., Dammrich, J., Ribbert, H. Apoptosis of stomach carcinoma cells induced by a human monoclonal antibody. Cancer. 76 (4), 550-558 (1995).
- Werneburg, S., Muhlenhoff, M., Stangel, M. Polysialic acid on SynCAM 1 in NG2 cells and on neuropilin-2 in microglia is confined to intracellular pools that are rapidly depleted upon stimulation. Glia. 63 (7), 1240-1255 (2015).
- Brandlein, S., Rauschert, N., Rasche, L. The human IgM antibody SAM-6 induces tumor-specific apoptosis with oxidized low-density lipoprotein. Mol Cancer Ther. 6 (1), 326-333 (2007).
- Vollmers, H. P., Hensel, F., Hermann, R. Tumor-specific apoptosis induced by the human monoclonal antibody SC-1: a new therapeutical approach for stomach cancer. Oncol Rep. 5 (1), 35-40 (1998).
- Vollmers, H. P., O'Connor, R., Muller, J. SC-1, a functional human monoclonal antibody against autologous stomach carcinoma cells. Cancer Res. 49 (9), 2471-2476 (1989).
- Vollmers, H. P., Zimmermann, U., Krenn, V. Adjuvant therapy for gastric adenocarcinoma with the apoptosis-inducing human monoclonal antibody SC-1: first clinical and histopathological results. Oncol Rep. 5 (3), 549-552 (1998).
- Nakano, K., Yasuda, K., Shibuya, H. ANNALS EXPRESS: Transient human anti-mouse antibody generated with immune enhancement in a carbohydrate antigen 19-9 immunoassay after surgical resection of recurrent cancer. Ann Clin Biochem. , (2016).
- Pettingill, P., Kramer, H. B., Coebergh, J. A. Antibodies to GABAA receptor alpha1 and gamma2 subunits: clinical and serologic characterization. Neurology. 84 (12), 1233-1241 (2015).
- Morel, N., Simon, S., Frobert, Y. Selective and efficient immunoprecipitation of the disease-associated form of the prion protein can be mediated by nonspecific interactions between monoclonal antibodies and scrapie-associated fibrils. J Biol Chem. 279 (29), 30143-30149 (2004).
- Lobo, P. I., Schlegal, K. H., Vengal, J. Naturally occurring IgM anti-leukocyte autoantibodies inhibit T-cell activation and chemotaxis. J Clin Immunol. 30, Suppl 1. S31-S36 (2010).
- Lobo, P. I., Schlegel, K. H., Spencer, C. E. Naturally occurring IgM anti-leukocyte autoantibodies (IgM-ALA) inhibit T cell activation and chemotaxis. J Immunol. 180 (3), 1780-1791 (2008).
- Wikstrand, C. J., Fredman, P., Svennerholm, L. Detection of glioma-associated gangliosides GM2, GD2, GD3, 3'-isoLM1 3',6'-isoLD1 in central nervous system tumors in vitro and in vivo using epitope-defined monoclonal antibodies. Prog Brain Res. 101, 213-223 (1994).
- Hamilton, W. B., Helling, F., Lloyd, K. O. Ganglioside expression on human malignant melanoma assessed by quantitative immune thin-layer chromatography. Int J Cancer. 53 (4), 566-573 (1993).
- Galuska, S. P., Oltmann-Norden, I., Geyer, H. Polysialic acid profiles of mice expressing variant allelic combinations of the polysialyltransferases ST8SiaII and ST8SiaIV. J Biol Chem. 281 (42), 31605-31615 (2006).
