पूरी तरह से पूरे रक्त से ultrasensitive प्रोटीन का पता लगाने के लिए स्वचालित केन्द्रापसारक Microfluidic डिवाइस

Summary

This protocol demonstrates how to achieve femto molar detection sensitivity of proteins in 10 µL of whole blood within 30 min. This can be achieved by using electrospun nanofibrous mats integrated in a lab-on-a-disc, which offers high surface area as well as effective mixing and washing for enhanced signal-to-noise ratio.

Abstract

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform for reduced sample volume and assay time as well as full automation are required for potential use in point-of-care-diagnostics. Recently, we have demonstrated ultrasensitive detection of serum proteins, C-reactive protein (CRP) and cardiac troponin I (cTnI), utilizing a lab-on-a-disc composed of TiO₂ nanofibrous (NF) mats. It showed a large dynamic range with femto molar (fM) detection sensitivity, from a small volume of whole blood in 30 min. The device consists of several components for blood separation, metering, mixing, and washing that are automated for improved sensitivity from low sample volumes. Here, in the video demonstration, we show the experimental protocols and know-how for the fabrication of NFs as well as the disc, their integration and the operation in the following order: processes for preparing TiO₂ NF mat; transfer-printing of TiO₂ NF mat onto the disc; surface modification for immune-reactions, disc assembly and operation; on-disc detection and representative results for immunoassay. Use of this device enables multiplexed analysis with minimal consumption of samples and reagents. Given the advantages, the device should find use in a wide variety of applications, and prove beneficial in facilitating the analysis of low abundant proteins.

Introduction

रोग निदान के लिए कई प्लेटफार्मों ^1,2 ऐसे nanowires, ³ नैनोकणों, ⁴ नैनोट्यूब, ⁵ और nanofibers (एनएफएस) ^6-8 के रूप में nanoscale सामग्री के आधार पर विकसित किया गया है। इन nanomaterials उनके अद्वितीय भौतिक गुणों के कारण अत्यधिक संवेदनशील bioassays के लिए नई प्रौद्योगिकियों के डिजाइन में उत्कृष्ट संभावनाओं प्रदान करते हैं। उदाहरण के लिए, mesoporous जिंक आक्साइड nanofibers स्तन कैंसर बायोमार्कर की Femto-दाढ़ संवेदनशील पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है। हाल ही में ^9, टाइटेनियम डाइऑक्साइड के आधार पर ₍₂ Tio) Bioanalytical आवेदन पत्र ^{10 के} लिए लगाया गया है उनकी रासायनिक स्थिरता पर विचार nanomaterials, ¹¹ नगण्य प्रोटीन विकृतीकरण ¹² और biocompatibility। ¹³ इसके अलावा, ₂ Tio की सतह पर हाइड्रॉक्सिल समूहों रासायनिक संशोधन और biomolecules के सहसंयोजक लगाव की सुविधा। ^14,15 नमूनों ₂ Tio थीn फिल्मों ¹⁶ या ₂ Tio नैनोट्यूब ¹⁷ सतह क्षेत्र को बढ़ाने के द्वारा एक लक्ष्य प्रोटीन का पता लगाने संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए उपयोग किया गया है; हालांकि, निर्माण की प्रक्रिया जटिल है और महंगे उपकरणों की आवश्यकता है। दूसरी ओर, Electrospun एनएफएस सरल और कम लागत के निर्माण की प्रक्रिया के रूप में अपने उच्च सतह क्षेत्र की वजह से ध्यान प्राप्त कर रहे हैं के रूप में अच्छी तरह से, ^18,19 अभी तक, Electrospun ₂ Tio एनएफ चटाई की कमजोर या ढीला विशेषता इसे संभाल करने के लिए मुश्किल बना देता है और इसलिए microfluidic उपकरणों के साथ एकीकृत। ^6,20, ₂ Tio एनएफ मैट शायद ही कभी, रसायन अनुप्रयोगों में उपयोग किया गया विशेष रूप से कठोर धोने की स्थिति की आवश्यकता होती है उन।

इस अध्ययन में, इन सीमाओं को पार करने के लिए, हम एक नई तकनीक एक पतली polydimethylsiloxane (PDMS) चिपकने वाली परत का उपयोग करके किसी भी लक्ष्य सब्सट्रेट की सतह पर Electrospun एनएफ मैट स्थानांतरित करने के लिए विकसित किया है। furthermore, हम सफलतापूर्वक पॉली कार्बोनेट (पीसी) से बना एक केन्द्रापसारक microfluidic युक्ति पर Electrospun ₂ Tio एनएफ मैट के एकीकरण से पता चला है। इस उपकरण का उपयोग, सी-रिएक्टिव प्रोटीन का एक उच्च संवेदनशील, पूरी तरह से स्वचालित है, और एकीकृत पहचान (सीआरपी) के साथ ही हृदय ट्रोपोनिन मैं (cTnI) संयुक्त के कारण पूरे रक्त का केवल 10 μL से 30 मिनट के भीतर हासिल की थी। ²¹ एनएफएस और केन्द्रापसारक मंच के गुणों का लाभ, परख परिमाण के छह आदेश की एक व्यापक गतिशील रेंज 1 स्नातकोत्तर / एमएल (~ 8 एफएम) से 100 एनजी / एमएल (~ 0.8 बजे) का पता लगाने की एक निचली सीमा के साथ प्रदर्शन किया 0.8 स्नातकोत्तर / सीआरपी और 37 स्नातकोत्तर / एमएल (~ 1.5 बजे) की एक सीमा का पता लगाने के साथ 100 एनजी / एमएल (~ 4 एनएम) के लिए 10 स्नातकोत्तर / एमएल (~ 0.4 किमी निम्न के बजे) से एक गतिशील रेंज के लिए मिलीलीटर (~ 6 एफएम) के cTnI के लिए। ये पता लगाने सीमा ~ 300 और 20 गुना उनके इसी पारंपरिक एलिसा परिणामों की तुलना में कम है। इस तकनीक को किसी भी लक्ष्य प्रोटीन का पता लगाने के लिए लागू किया जा सकता उचित एंटीबॉडी के साथ। कुल मिलाकर, इस उपकरण सहULD में इन विट्रो निदान और जैव रासायनिक assays के लिए बहुत योगदान के बाद से यह जैविक नमूने की बहुत छोटी मात्रा से भी महान संवेदनशीलता के साथ लक्ष्य प्रोटीन की मात्रा में दुर्लभ पता लगा सकते हैं, जैसे, पूरे रक्त के 10 μl। हालांकि हम केवल इस अध्ययन में एलिसा का उपयोग कर सीरम प्रोटीन का पता लगाने का प्रदर्शन किया, हस्तांतरण और एकीकरण microfluidic उपकरणों के साथ Electrospun एनएफएस की तकनीक अधिक मोटे तौर पर अन्य जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं जो उच्च संवेदनशीलता का पता लगाने के लिए एक बड़े क्षेत्र की सतह की आवश्यकता होती है में लागू किया जा सकता है।

Protocol

नोट: रक्त स्वस्थ व्यक्तियों से तैयार किया गया था और एक रक्त संग्रह ट्यूब में एकत्र किया गया था। लिखित सूचित सहमति सभी स्वयंसेवकों से प्राप्त हुई थी। 1. 2 Tio एनएफ चटाई का निर्माण अग्…

Representative Results

इस प्रोटोकॉल, पूरे रक्त के साथ उच्च संवेदनशीलता से तैयार किया गया था प्रोटीन का पता लगाने के लिए एक पूरी तरह से स्वचालित केन्द्रापसारक microfluidic युक्ति का उपयोग करना। 2 Tio एनएफ मैट electrospinning और प?…

Discussion

₂ Tio एनएफ एकीकृत डिस्क पर परख कम प्रचुर मात्रा में रक्त की बहुत कम मात्रा में मौजूद प्रोटीन का पता लगाने के लिए एक ultrasensitive, तेजी से सस्ती और सुविधाजनक तकनीक है। इस तकनीक छोटा सा नमूना मात्रा (10 μl) का उपयोग ?…

Materials

Si wafer	LG SILTRON	Polished Wafer, test grade	Dia. (mm) = 150, orientation = <100>, dopant = boron, RES(Ohm-cm) = 1 – 30, thickness (μm) = 650 – 700
Polycarbonate (PC)	Daedong Plastic	PCS#6900	Thickness (mm) = 1 and 5
Titanium tetraisopropoxide, 98%,	Sigma-Aldrich	205273
Polyvinylpyrrolidone, Mw = 1,300,000	Sigma-Aldrich	437190
Acetic acid	Sigma-Aldrich	320099
Anhydrous ethanol	Sigma-Aldrich	459836
Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane	Sigma-Aldrich	448931
PDMS and curing agent	Dow Corning	SYLGARD 184
GPDES	Gelest Inc	SIG5832.0
Ethanol	J T Baker
FE-SEM	FEI	Nova NanoSEM
X-ray photoelectron spectroscopy	ThermoFisher	K-alpha
3D modeling machine	M&I CNC Lab, Korea		CNC milling machine
Wax-dispensing machine	Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea		Customized
Double-sided adhesive tape	FLEXcon, USA	DFM 200 clear 150 POLY H-9 V-95
Cutting plotter	Graphtec Corporation, Japan	Graphtec CE3000-60 MK2
Spin coater	MIDAS	SPIN-3000D
Furnace (calcination)	R. D. WEBB COMPANY	WEBB 99
Rheometer (Tack test)	Thermo Scientific	Haake MARS III – ORM Package
Oxygen plasma system	FEMTO	CUTE
Monoclonal mouse antihuman hsCRP	Hytest Ltd., Finland	4C28	(clone # C5)
Monoclonal mouse anti-cTnI	Hytest Ltd., Finland	4T21	(clone # 19C7)
HRP conjugated goat polyclonal anti-hsCRP	Abcam plc., MA	ab19175
HRP conjugated mouse monoclonal anti-cTnI	Abcam plc., MA	ab24460	(clone # 16A11)
hsCRP	Abcam plc., MA	ab111647
cTnI	Fitzgerald, MA	30-AT43
Bovine Albumin	Sigma-Aldrich	A7906
PBS	Amresco Inc	E404
Blood collection tubes	BD vacutainer	367844	K2 EDTA 7.2 mg plus blood collection tubes
SuperSignal ELISA femto	Invitrogen	37074
Modular multilabel plate reader	Perkin Elmer	Envision 2104
Disc operating machine	Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea		Customized
Photomultiplier tube (PMT)	Hamamatsu Photonics	H1189-210
AutoCAD	AutoDesk	Version 2012	Design software
SolidWorks 3D CAD software	SOLIDWORKS Corp.	Version 2013	3D Design software,
Edgecam	Vero software	version 2009.01.06928	Code generating software
DeskCNC	Carken Co.	version 2.0.2.18	CNC milling machine software