Totalmente automatizada de dispositivos de microfluidos para centrífuga Ultrasensible detección de proteínas a partir de sangre entera
Summary
This protocol demonstrates how to achieve femto molar detection sensitivity of proteins in 10 µL of whole blood within 30 min. This can be achieved by using electrospun nanofibrous mats integrated in a lab-on-a-disc, which offers high surface area as well as effective mixing and washing for enhanced signal-to-noise ratio.
Abstract
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform for reduced sample volume and assay time as well as full automation are required for potential use in point-of-care-diagnostics. Recently, we have demonstrated ultrasensitive detection of serum proteins, C-reactive protein (CRP) and cardiac troponin I (cTnI), utilizing a lab-on-a-disc composed of TiO2 nanofibrous (NF) mats. It showed a large dynamic range with femto molar (fM) detection sensitivity, from a small volume of whole blood in 30 min. The device consists of several components for blood separation, metering, mixing, and washing that are automated for improved sensitivity from low sample volumes. Here, in the video demonstration, we show the experimental protocols and know-how for the fabrication of NFs as well as the disc, their integration and the operation in the following order: processes for preparing TiO2 NF mat; transfer-printing of TiO2 NF mat onto the disc; surface modification for immune-reactions, disc assembly and operation; on-disc detection and representative results for immunoassay. Use of this device enables multiplexed analysis with minimal consumption of samples and reagents. Given the advantages, the device should find use in a wide variety of applications, and prove beneficial in facilitating the analysis of low abundant proteins.
Introduction
Varias plataformas para el diagnóstico de la enfermedad se han desarrollado sobre la base de materiales a nanoescala 1,2 tales como nanocables, 3 nanopartículas, nanotubos de 4, 5 y nanofibras (NFS) 6-8. Estos nanomateriales ofrecen excelentes perspectivas en el diseño de nuevas tecnologías para bioensayos altamente sensibles debido a sus propiedades físico-químicas únicas. Por ejemplo, las nanofibras de óxido de zinc mesoporoso se han utilizado para la detección sensible femto-molar de biomarcadores de cáncer de mama. 9 Recientemente, los nanomateriales a base de dióxido de titanio (TiO 2) han sido exploradas para aplicaciones bioanalíticos 10 teniendo en cuenta su estabilidad química, 11 desnaturalización de la proteína insignificante , 12 y biocompatibilidad. 13 Además, los grupos hidroxilo en la superficie de TiO 2 facilitar la modificación química y la unión covalente de biomoléculas. 14,15 modelado TiO 2 thin películas 16 o TiO 2 nanotubos 17 se han utilizado para mejorar la sensibilidad de detección de una proteína diana por aumento de la superficie; sin embargo, el proceso de fabricación es bastante complejo y requiere un equipo caro. Por otra parte, las federaciones nacionales electrospun están recibiendo atención debido a su gran área de superficie, así como proceso sencillo y fabricación de bajo costo; 18,19 sin embargo, la característica frágiles o suelto de la electrospun TiO2 NF tapete hace que sea difícil de manejar y integrar con los dispositivos de microfluidos. 6,20 por lo tanto, las esteras de TiO2 NF rara vez se utilizan en aplicaciones de bioanálisis, particularmente aquellos que requieren condiciones de lavado agresivos.
En este estudio, para superar estas limitaciones, hemos desarrollado una nueva tecnología para la transferencia de la electrospun NF esteras sobre la superficie de cualquier sustrato diana mediante la utilización de una capa de adhesivo de polidimetilsiloxano delgada (PDMS). Furthermore, hemos demostrado con éxito la integración de electrospun TiO 2 NF esteras en un dispositivo de microfluidos centrífuga de policarbonato (PC). El uso de este dispositivo, una detección de alta sensibilidad, totalmente automatizado e integrado de la proteína C-reactiva (CRP), así como la troponina I cardíaca (cTnI) se logró en 30 min a partir de solamente 10 l de sangre entera. 21 Debido a la combinación ventajas de las propiedades de los NF y la plataforma centrífuga, el ensayo exhibieron una amplia gama dinámica de seis órdenes de magnitud de 1 pg / ml (~ 8 fM) a 100 ng / ml (~ 0,8 pM) con un límite inferior de detección de 0,8 pg / ml (~ 6 fM) para la PCR y un rango dinámico de 10 pg / ml (~ 0,4 pM) a 100 ng / ml (~ 4 nM) con un límite de detección de 37 pg / ml (~ 1,5 pM) de cTnI. Estos límites de detección son ~ 300 y ~ 20 veces menor en comparación con sus correspondientes resultados de ELISA convencionales. Esta técnica se podría aplicar para la detección de cualquier proteína objetivo, con los anticuerpos apropiados. En general, este dispositivo de coULD contribuyen en gran medida en el diagnóstico in vitro y ensayos bioquímicos ya que puede detectar cantidades raras de proteínas diana con gran sensibilidad incluso de cantidades muy pequeñas de muestras biológicas, por ejemplo, 10 l de sangre entera. A pesar de que sólo demostró la detección de proteínas de suero usando ELISA en este estudio, la tecnología de transferencia e integración de electrospun NFS con dispositivos de microfluidos podría aplicarse más ampliamente en otras reacciones bioquímicas que requieren una gran área superficial para la alta sensibilidad de detección.
Protocol
Representative Results
Discussion
El ensayo en TiO 2 NF disco integrado es una técnica rápida, de bajo costo y conveniente para la detección ultrasensible de proteínas de baja abundancia presentes en muy bajo volumen de sangre. Esta técnica tiene la ventaja de usar pequeños volúmenes de muestra (10 l) y es susceptible para el análisis de múltiples muestras simultáneamente. Esto proporciona un gran potencial como un dispositivo de multiplexación inmunoensayo. El dispositivo tiene la ventaja de que no requiere etapas de pretratamient…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) subvenciones (2013R1A2A2A05004314, 2012R1A1A2043747), una subvención de la tecnología de la salud R coreana + D Proyecto, Ministerio de Salud y Bienestar Social (A121994) y el SII-R020-D1 financiado por el Gobierno de Corea.
Materials
| Si wafer | LG SILTRON | Polished Wafer, test grade | Dia. (mm) = 150, orientation = <100>, dopant = boron, RES(Ohm-cm) = 1 – 30, thickness (μm) = 650 – 700 |
| Polycarbonate (PC) | Daedong Plastic | PCS#6900 | Thickness (mm) = 1 and 5 |
| Titanium tetraisopropoxide, 98%, | Sigma-Aldrich | 205273 | |
| Polyvinylpyrrolidone, Mw = 1,300,000 | Sigma-Aldrich | 437190 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| Anhydrous ethanol | Sigma-Aldrich | 459836 | |
| Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
| PDMS and curing agent | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
| GPDES | Gelest Inc | SIG5832.0 | |
| Ethanol | J T Baker | ||
| FE-SEM | FEI | Nova NanoSEM | |
| X-ray photoelectron spectroscopy | ThermoFisher | K-alpha | |
| 3D modeling machine | M&I CNC Lab, Korea | CNC milling machine | |
| Wax-dispensing machine | Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea | Customized | |
| Double-sided adhesive tape | FLEXcon, USA | DFM 200 clear 150 POLY H-9 V-95 | |
| Cutting plotter | Graphtec Corporation, Japan | Graphtec CE3000-60 MK2 | |
| Spin coater | MIDAS | SPIN-3000D | |
| Furnace (calcination) | R. D. WEBB COMPANY | WEBB 99 | |
| Rheometer (Tack test) | Thermo Scientific | Haake MARS III – ORM Package | |
| Oxygen plasma system | FEMTO | CUTE | |
| Monoclonal mouse antihuman hsCRP | Hytest Ltd., Finland | 4C28 | (clone # C5) |
| Monoclonal mouse anti-cTnI | Hytest Ltd., Finland | 4T21 | (clone # 19C7) |
| HRP conjugated goat polyclonal anti-hsCRP | Abcam plc., MA | ab19175 | |
| HRP conjugated mouse monoclonal anti-cTnI | Abcam plc., MA | ab24460 | (clone # 16A11) |
| hsCRP | Abcam plc., MA | ab111647 | |
| cTnI | Fitzgerald, MA | 30-AT43 | |
| Bovine Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| PBS | Amresco Inc | E404 | |
| Blood collection tubes | BD vacutainer | 367844 | K2 EDTA 7.2 mg plus blood collection tubes |
| SuperSignal ELISA femto | Invitrogen | 37074 | |
| Modular multilabel plate reader | Perkin Elmer | Envision 2104 | |
| Disc operating machine | Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea | Customized | |
| Photomultiplier tube (PMT) | Hamamatsu Photonics | H1189-210 | |
| AutoCAD | AutoDesk | Version 2012 | Design software |
| SolidWorks 3D CAD software | SOLIDWORKS Corp. | Version 2013 | 3D Design software, |
| Edgecam | Vero software | version 2009.01.06928 | Code generating software |
| DeskCNC | Carken Co. | version 2.0.2.18 | CNC milling machine software |
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