This protocol demonstrates how to achieve femto molar detection sensitivity of proteins in 10 µL of whole blood within 30 min. This can be achieved by using electrospun nanofibrous mats integrated in a lab-on-a-disc, which offers high surface area as well as effective mixing and washing for enhanced signal-to-noise ratio.
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform for reduced sample volume and assay time as well as full automation are required for potential use in point-of-care-diagnostics. Recently, we have demonstrated ultrasensitive detection of serum proteins, C-reactive protein (CRP) and cardiac troponin I (cTnI), utilizing a lab-on-a-disc composed of TiO2 nanofibrous (NF) mats. It showed a large dynamic range with femto molar (fM) detection sensitivity, from a small volume of whole blood in 30 min. The device consists of several components for blood separation, metering, mixing, and washing that are automated for improved sensitivity from low sample volumes. Here, in the video demonstration, we show the experimental protocols and know-how for the fabrication of NFs as well as the disc, their integration and the operation in the following order: processes for preparing TiO2 NF mat; transfer-printing of TiO2 NF mat onto the disc; surface modification for immune-reactions, disc assembly and operation; on-disc detection and representative results for immunoassay. Use of this device enables multiplexed analysis with minimal consumption of samples and reagents. Given the advantages, the device should find use in a wide variety of applications, and prove beneficial in facilitating the analysis of low abundant proteins.
Meerdere platforms voor ziektediagnose ontwikkeld gebaseerd op nanoschaal materialen zoals 1,2 nanodraden, nanodeeltjes 3, 4 nanobuisjes, 5 en nanovezels (NFS) 6-8. Deze nanomaterialen bieden uitstekende vooruitzichten bij het ontwerpen van nieuwe technologieën voor zeer gevoelige bioassays vanwege hun unieke fysisch-chemische eigenschappen. Zo hebben mesoporeuze zinkoxide nanovezels gebruikt voor de femto-molaire gevoelige detectie van borstkanker biomarkers. 9 Recentelijk nanomaterialen basis van titaandioxide (TiO 2) zijn onderzocht voor bioanalytische toepassingen 10 gezien hun chemische stabiliteit, 11 verwaarloosbaar eiwitdenaturatie , 12 en biocompatibiliteit. 13 Bovendien zijn de hydroxylgroepen op het oppervlak van TiO 2 vergemakkelijken chemische modificatie en de covalente hechting van biomoleculen. 14,15 gevormde TiO 2 thin films 16 of TiO 2 nanobuizen 17 zijn gebruikt om de detectiegevoeligheid van een doeleiwit bevorderen door de oppervlakte; echter, het fabricageproces nogal complex en vereist dure apparatuur. Anderzijds worden electrospun NFS ontvangen op door hun hoge oppervlaktegebied en eenvoudig en goedkoop fabricageproces, 18,19 toch de breekbare of losse kenmerk van de electrospun TiO 2 NF mat maakt het moeilijk te hanteren en geïntegreerd microfluïdische inrichtingen. 6,20 Daarom werden de TiO 2 NF matten zelden gebruikt in bioanalytische toepassingen, vooral diegenen die zware wasomstandigheden.
In deze studie, om deze beperkingen te overwinnen, wij hebben een nieuwe techniek ontwikkeld voor het overbrengen van de electrospun NF matten op het oppervlak van een target substraat met behulp van een dunne polydimethylsiloxaan (PDMS) kleeflaag. Furthermore, hebben we met succes toonde de integratie van electrospun TiO 2 NF matten op een centrifugale microfluïdische inrichting bestaande uit polycarbonaat (PC). Gebruik van dit apparaat een hooggevoelige volledig geautomatiseerde en geïntegreerde detectie van C-reactief proteïne (CRP) en cardiaal troponine I (cTnI) werd binnen 30 min van slechts 10 pl volbloed. 21 Door de gecombineerde voordelen van de eigenschappen van de NF en centrifugale platform, de test vertoonde een breed dynamisch bereik van zes orden van grootte van 1 pg / ml (~ 8 fM) tot 100 ng / ml (~ 12:08) met een onderste detectielimiet van 0,8 pg / ml (~ 6 fM) voor CRP en een dynamisch bereik van 10 pg / ml (~ 12:04) tot 100 ng / ml (~ 4 nM) met een detectiegrens van 37 pg / ml (~ 13:05) voor cTnI. De detectielimieten zijn ~ 300 en ~ 20-voudig lager in vergelijking met hun overeenkomstige conventionele ELISA resultaten. Deze techniek kan worden toegepast voor de detectie van elke doeleiwitten met geschikte antilichamen. Kortom, dit apparaat coULD dragen sterk in-vitro diagnostica en biochemische assays omdat het zeldzaam hoeveelheden doeleiwitten zelfs zeer kleine hoeveelheden biologische monsters te detecteren met grote gevoeligheid, bijvoorbeeld 10 pl volbloed. Hoewel we alleen aangetoond serumproteïnen detectie middels ELISA in deze studie kan de overdracht en integratietechnologie van electrospun NF met microfluïdische inrichtingen ruimer worden toegepast in andere biochemische reacties die een groot oppervlak voor hoge detectiegevoeligheid vereisen.
De test op TiO 2 NF geïntegreerde schijf is een snelle, goedkope en gemakkelijke techniek voor de ultragevoelige detectie van lage overvloedige eiwitten in zeer lage hoeveelheid bloed. Deze techniek heeft het voordeel dat kleine monstervolumes (10 ui) en is vatbaar voor de analyse van meerdere monsters tegelijk. Dit verschaft een groot potentieel als multiplexing immuunanalysemedium. De inrichting heeft het voordeel dat het geen monstervoorbereiding stappen zoals plasmascheiding, die nodig zijn gebruikelijke…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door de National Research Foundation Korea (NRF) subsidies (2013R1A2A2A05004314, 2012R1A1A2043747), een subsidie van de Koreaanse Health Technology R & D Project, ministerie van Volksgezondheid en Welzijn (A121994) en IBS-R020-D1 gefinancierd door de Koreaanse regering.
Si wafer | LG SILTRON | Polished Wafer, test grade | Dia. (mm) = 150, orientation = <100>, dopant = boron, RES(Ohm-cm) = 1 – 30, thickness (μm) = 650 – 700 |
Polycarbonate (PC) | Daedong Plastic | PCS#6900 | Thickness (mm) = 1 and 5 |
Titanium tetraisopropoxide, 98%, | Sigma-Aldrich | 205273 | |
Polyvinylpyrrolidone, Mw = 1,300,000 | Sigma-Aldrich | 437190 | |
Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
Anhydrous ethanol | Sigma-Aldrich | 459836 | |
Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
PDMS and curing agent | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
GPDES | Gelest Inc | SIG5832.0 | |
Ethanol | J T Baker | ||
FE-SEM | FEI | Nova NanoSEM | |
X-ray photoelectron spectroscopy | ThermoFisher | K-alpha | |
3D modeling machine | M&I CNC Lab, Korea | CNC milling machine | |
Wax-dispensing machine | Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea | Customized | |
Double-sided adhesive tape | FLEXcon, USA | DFM 200 clear 150 POLY H-9 V-95 | |
Cutting plotter | Graphtec Corporation, Japan | Graphtec CE3000-60 MK2 | |
Spin coater | MIDAS | SPIN-3000D | |
Furnace (calcination) | R. D. WEBB COMPANY | WEBB 99 | |
Rheometer (Tack test) | Thermo Scientific | Haake MARS III – ORM Package | |
Oxygen plasma system | FEMTO | CUTE | |
Monoclonal mouse antihuman hsCRP | Hytest Ltd., Finland | 4C28 | (clone # C5) |
Monoclonal mouse anti-cTnI | Hytest Ltd., Finland | 4T21 | (clone # 19C7) |
HRP conjugated goat polyclonal anti-hsCRP | Abcam plc., MA | ab19175 | |
HRP conjugated mouse monoclonal anti-cTnI | Abcam plc., MA | ab24460 | (clone # 16A11) |
hsCRP | Abcam plc., MA | ab111647 | |
cTnI | Fitzgerald, MA | 30-AT43 | |
Bovine Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
PBS | Amresco Inc | E404 | |
Blood collection tubes | BD vacutainer | 367844 | K2 EDTA 7.2 mg plus blood collection tubes |
SuperSignal ELISA femto | Invitrogen | 37074 | |
Modular multilabel plate reader | Perkin Elmer | Envision 2104 | |
Disc operating machine | Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea | Customized | |
Photomultiplier tube (PMT) | Hamamatsu Photonics | H1189-210 | |
AutoCAD | AutoDesk | Version 2012 | Design software |
SolidWorks 3D CAD software | SOLIDWORKS Corp. | Version 2013 | 3D Design software, |
Edgecam | Vero software | version 2009.01.06928 | Code generating software |
DeskCNC | Carken Co. | version 2.0.2.18 | CNC milling machine software |