Summary

Volautomatische centrifugale microfluïdische apparaat voor Ultragevoelige Protein Detection uit volbloed

Published: April 16, 2016
doi:

Summary

This protocol demonstrates how to achieve femto molar detection sensitivity of proteins in 10 µL of whole blood within 30 min. This can be achieved by using electrospun nanofibrous mats integrated in a lab-on-a-disc, which offers high surface area as well as effective mixing and washing for enhanced signal-to-noise ratio.

Abstract

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform for reduced sample volume and assay time as well as full automation are required for potential use in point-of-care-diagnostics. Recently, we have demonstrated ultrasensitive detection of serum proteins, C-reactive protein (CRP) and cardiac troponin I (cTnI), utilizing a lab-on-a-disc composed of TiO2 nanofibrous (NF) mats. It showed a large dynamic range with femto molar (fM) detection sensitivity, from a small volume of whole blood in 30 min. The device consists of several components for blood separation, metering, mixing, and washing that are automated for improved sensitivity from low sample volumes. Here, in the video demonstration, we show the experimental protocols and know-how for the fabrication of NFs as well as the disc, their integration and the operation in the following order: processes for preparing TiO2 NF mat; transfer-printing of TiO2 NF mat onto the disc; surface modification for immune-reactions, disc assembly and operation; on-disc detection and representative results for immunoassay. Use of this device enables multiplexed analysis with minimal consumption of samples and reagents. Given the advantages, the device should find use in a wide variety of applications, and prove beneficial in facilitating the analysis of low abundant proteins.

Introduction

Meerdere platforms voor ziektediagnose ontwikkeld gebaseerd op nanoschaal materialen zoals 1,2 nanodraden, nanodeeltjes 3, 4 nanobuisjes, 5 en nanovezels (NFS) 6-8. Deze nanomaterialen bieden uitstekende vooruitzichten bij het ontwerpen van nieuwe technologieën voor zeer gevoelige bioassays vanwege hun unieke fysisch-chemische eigenschappen. Zo hebben mesoporeuze zinkoxide nanovezels gebruikt voor de femto-molaire gevoelige detectie van borstkanker biomarkers. 9 Recentelijk nanomaterialen basis van titaandioxide (TiO 2) zijn onderzocht voor bioanalytische toepassingen 10 gezien hun chemische stabiliteit, 11 verwaarloosbaar eiwitdenaturatie , 12 en biocompatibiliteit. 13 Bovendien zijn de hydroxylgroepen op het oppervlak van TiO 2 vergemakkelijken chemische modificatie en de covalente hechting van biomoleculen. 14,15 gevormde TiO 2 thin films 16 of TiO 2 nanobuizen 17 zijn gebruikt om de detectiegevoeligheid van een doeleiwit bevorderen door de oppervlakte; echter, het fabricageproces nogal complex en vereist dure apparatuur. Anderzijds worden electrospun NFS ontvangen op door hun hoge oppervlaktegebied en eenvoudig en goedkoop fabricageproces, 18,19 toch de breekbare of losse kenmerk van de electrospun TiO 2 NF mat maakt het moeilijk te hanteren en geïntegreerd microfluïdische inrichtingen. 6,20 Daarom werden de TiO 2 NF matten zelden gebruikt in bioanalytische toepassingen, vooral diegenen die zware wasomstandigheden.

In deze studie, om deze beperkingen te overwinnen, wij hebben een nieuwe techniek ontwikkeld voor het overbrengen van de electrospun NF matten op het oppervlak van een target substraat met behulp van een dunne polydimethylsiloxaan (PDMS) kleeflaag. Furthermore, hebben we met succes toonde de integratie van electrospun TiO 2 NF matten op een centrifugale microfluïdische inrichting bestaande uit polycarbonaat (PC). Gebruik van dit apparaat een hooggevoelige volledig geautomatiseerde en geïntegreerde detectie van C-reactief proteïne (CRP) en cardiaal troponine I (cTnI) werd binnen 30 min van slechts 10 pl volbloed. 21 Door de gecombineerde voordelen van de eigenschappen van de NF en centrifugale platform, de test vertoonde een breed dynamisch bereik van zes orden van grootte van 1 pg / ml (~ 8 fM) tot 100 ng / ml (~ 12:08) met een onderste detectielimiet van 0,8 pg / ml (~ 6 fM) voor CRP en een dynamisch bereik van 10 pg / ml (~ 12:04) tot 100 ng / ml (~ 4 nM) met een detectiegrens van 37 pg / ml (~ 13:05) voor cTnI. De detectielimieten zijn ~ 300 en ~ 20-voudig lager in vergelijking met hun overeenkomstige conventionele ELISA resultaten. Deze techniek kan worden toegepast voor de detectie van elke doeleiwitten met geschikte antilichamen. Kortom, dit apparaat coULD dragen sterk in-vitro diagnostica en biochemische assays omdat het zeldzaam hoeveelheden doeleiwitten zelfs zeer kleine hoeveelheden biologische monsters te detecteren met grote gevoeligheid, bijvoorbeeld 10 pl volbloed. Hoewel we alleen aangetoond serumproteïnen detectie middels ELISA in deze studie kan de overdracht en integratietechnologie van electrospun NF met microfluïdische inrichtingen ruimer worden toegepast in andere biochemische reacties die een groot oppervlak voor hoge detectiegevoeligheid vereisen.

Protocol

LET OP: Bloed werd van gezonde individuen en werd opgevangen in een bloedafname. Schriftelijke toestemming werd verkregen van alle vrijwilligers. 1. Fabricage van TiO 2 NF Mat Bereiding van precursor oplossing 22 Los op 1,5 g titaantetraisopropoxide (TTIP) in een mengsel van ethanol (99,9%, 3 ml) en ijsazijn (3 ml) en meng de oplossing bij kamertemperatuur (25 ° C) gedurende 30 minuten op een magnetische roerder. <…

Representative Results

Met dit protocol, een volautomatische centrifugale microfluïdische inrichting voor eiwitdetectie uit vol bloed met hoge gevoeligheid bereid. De TiO 2 NF matten werden bereid door processen van elektrospinproces en calcineren. Om de NF van gewenste diameter, morfologie en dikte fabriceren, electospinning aandoeningen zoals debiet, spanning en spinnen tijd geoptimaliseerd. Wanneer de omstandigheden niet geoptimaliseerd, de kwaliteit van de gevormde NFs was slecht. Met name werd…

Discussion

De test op TiO 2 NF geïntegreerde schijf is een snelle, goedkope en gemakkelijke techniek voor de ultragevoelige detectie van lage overvloedige eiwitten in zeer lage hoeveelheid bloed. Deze techniek heeft het voordeel dat kleine monstervolumes (10 ui) en is vatbaar voor de analyse van meerdere monsters tegelijk. Dit verschaft een groot potentieel als multiplexing immuunanalysemedium. De inrichting heeft het voordeel dat het geen monstervoorbereiding stappen zoals plasmascheiding, die nodig zijn gebruikelijke…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door de National Research Foundation Korea (NRF) subsidies (2013R1A2A2A05004314, 2012R1A1A2043747), een subsidie ​​van de Koreaanse Health Technology R & D Project, ministerie van Volksgezondheid en Welzijn (A121994) en IBS-R020-D1 gefinancierd door de Koreaanse regering.

Materials

Si wafer LG SILTRON Polished Wafer, test grade Dia. (mm) = 150, orientation = <100>, dopant = boron, RES(Ohm-cm) = 1 – 30, thickness (μm) = 650 – 700
Polycarbonate (PC)  Daedong Plastic PCS#6900 Thickness (mm) = 1 and 5 
Titanium tetraisopropoxide, 98%, Sigma-Aldrich 205273
Polyvinylpyrrolidone, Mw = 1,300,000 Sigma-Aldrich 437190
Acetic acid Sigma-Aldrich 320099
Anhydrous ethanol Sigma-Aldrich 459836
Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane Sigma-Aldrich 448931
PDMS and curing agent Dow Corning SYLGARD 184
GPDES Gelest Inc SIG5832.0 
Ethanol J T Baker
FE-SEM FEI Nova NanoSEM
X-ray photoelectron spectroscopy ThermoFisher K-alpha
3D modeling machine M&I CNC Lab, Korea CNC milling machine
Wax-dispensing machine Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea Customized
Double-sided adhesive tape FLEXcon, USA DFM 200 clear 150 POLY H-9 V-95
Cutting plotter Graphtec Corporation, Japan Graphtec CE3000-60 MK2
Spin coater MIDAS SPIN-3000D
Furnace (calcination) R. D. WEBB COMPANY WEBB 99
Rheometer (Tack test) Thermo Scientific Haake MARS III – ORM Package
Oxygen plasma system FEMTO CUTE
Monoclonal mouse antihuman hsCRP Hytest Ltd., Finland 4C28 (clone # C5)
Monoclonal mouse anti-cTnI Hytest Ltd., Finland 4T21 (clone # 19C7)
HRP conjugated goat polyclonal anti-hsCRP Abcam plc., MA ab19175
HRP conjugated mouse monoclonal anti-cTnI Abcam plc., MA ab24460 (clone # 16A11)
hsCRP Abcam plc., MA ab111647
cTnI Fitzgerald, MA 30-AT43
Bovine Albumin Sigma-Aldrich A7906
PBS Amresco Inc E404
Blood collection tubes BD vacutainer 367844 K2 EDTA 7.2 mg plus blood
collection tubes
SuperSignal ELISA femto Invitrogen 37074
Modular multilabel plate reader Perkin Elmer Envision 2104
Disc operating machine Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea Customized
Photomultiplier tube (PMT) Hamamatsu Photonics H1189-210
AutoCAD AutoDesk Version 2012 Design software
SolidWorks 3D CAD software  SOLIDWORKS Corp. Version 2013 3D Design software,
Edgecam Vero software version 2009.01.06928 Code generating software
DeskCNC Carken Co. version 2.0.2.18 CNC milling machine software

References

  1. Zhang, Y., et al. Nanomaterials for Ultrasensitive Protein Detection. Adv. Mater. 25 (28), 3802-3819 (2013).
  2. Hu, W., Li, C. M. Nanomaterial-based advanced immunoassays. Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 3 (2), 119-133 (2011).
  3. Yang-Kyu, C., Chang-Hoon, K. Silicon Nanowire Biosensor for Cancer Markers. Biosensors and Cancer. , 164-183 (2012).
  4. Baltazar, R., Vistas, C. R., Ferreira, G. M. Biosensing Applications Using Nanoparticles. Nanocomposite Particles for Bio-Applications. , 265-282 (2011).
  5. Roy, P., Berger, S., Schmuki, P. TiO2 Nanotubes: Synthesis and Applications. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (13), 2904-2939 (2011).
  6. Yang, D., et al. Electrospun Nanofibrous Membranes: A Novel Solid Substrate for Microfluidic Immunoassays for HIV. Adv. Mater. 20 (24), 4770-4775 (2008).
  7. Chantasirichot, S., Ishihara, K. Electrospun phospholipid polymer substrate for enhanced performance in immunoassay system. Biosens. Bioelectron. 38 (1), 209-214 (2012).
  8. Zhang, N., et al. Electrospun TiO2 Nanofiber-Based Cell Capture Assay for Detecting Circulating Tumor Cells from Colorectal and Gastric Cancer Patients. Adv. Mater. 24 (20), 2756-2760 (2012).
  9. Ali, M. A., Mondal, K., Singh, C., Dhar Malhotra, B., Sharma, A. Anti-epidermal growth factor receptor conjugated mesoporous zinc oxide nanofibers for breast cancer diagnostics. Nanoscale. 7 (16), 7234-7245 (2015).
  10. Mondal, K., Ali, M. A., Agrawal, V. V., Malhotra, B. D., Sharma, A. Highly Sensitive Biofunctionalized Mesoporous Electrospun TiO2 Nanofiber Based Interface for Biosensing. ACS Appl. Mater. Interfaces. 6 (4), 2516-2527 (2014).
  11. Tu, W., Dong, Y., Lei, J., Ju, H. Low-Potential Photoelectrochemical Biosensing Using Porphyrin-Functionalized TiO2 Nanoparticles. Anal. Chem. 82 (20), 8711-8716 (2010).
  12. Liu, S., Chen, A. Coadsorption of Horseradish Peroxidase with Thionine on TiO2 Nanotubes for Biosensing. Langmuir. 21 (18), 8409-8413 (2005).
  13. Portan, D. V., Kroustalli, A. A., Deligianni, D. D., Papanicolaou, G. C. On the biocompatibility between TiO2 nanotubes layer and human osteoblasts. J.Biomed.Mater.Res. Part A. 100 (10), 2546-2553 (2012).
  14. Dettin, M., et al. Covalent surface modification of titanium oxide with different adhesive peptides: Surface characterization and osteoblast-like cell adhesion. J. Biomed. Mater. Res. Part A. 90 (1), 35-45 (2009).
  15. Kim, W. -. J., et al. Enhanced Protein Immobilization Efficiency on a TiO2 Surface Modified with a Hydroxyl Functional Group. Langmuir. 25 (19), 11692-11697 (2009).
  16. Son, K. J., Ahn, S. H., Kim, J. H., Koh, W. -. G. Graft Copolymer-Templated Mesoporous TiO2 Films Micropatterned with Poly(ethylene glycol) Hydrogel: Novel Platform for Highly Sensitive Protein Microarrays. ACS Appl. Mater. Interfaces. 3 (2), 573-581 (2011).
  17. Kar, P., Pandey, A., Greer, J. J., Shankar, K. Ultrahigh sensitivity assays for human cardiac troponin I using TiO2 nanotube arrays. Lab Chip. 12 (4), 821-828 (2012).
  18. Agarwal, S., Wendorff, J. H., Greiner, A. Use of electrospinning technique for biomedical applications. Polymer. 49 (26), 5603-5621 (2008).
  19. Ding, B., Wang, M., Wang, X., Yu, J., Sun, G. Electrospun nanomaterials for ultrasensitive sensors. Mater. Today. 13 (11), 16-27 (2010).
  20. Liu, Y., Yang, D., Yu, T., Jiang, X. Incorporation of electrospun nanofibrous PVDF membranes into a microfluidic chip assembled by PDMS and scotch tape for immunoassays. ELECTROPHORESIS. 30 (18), 3269-3275 (2009).
  21. Lee, W. S., Sunkara, V., Han, J. -. R., Park, Y. -. S., Cho, Y. -. K. Electrospun TiO2 nanofiber integrated lab-on-a-disc for ultrasensitive protein detection from whole blood. Lab Chip. 15 (2), 478-485 (2015).
  22. Li, D., Xia, Y. Fabrication of Titania Nanofibers by Electrospinning. Nano Lett. 3 (4), 555-560 (2003).
  23. Lombard, M. . SolidWorks 2013 BIBLE. , (2013).
  24. Tickoo, S. . EdgeCAM 11.0 for Manufacturers. , (2007).
  25. Zhu, R., et al. Improved adhesion of interconnected TiO2 nanofiber network on conductive substrate and its application in polymer photovoltaic devices. Appl. Phys. Lett. 93 (1), 013102 (2008).
  26. Song, M. Y., Ahn, Y. R., Jo, S. M., Kim, D. Y., Ahn, J. -. P. TiO2 single-crystalline nanorod electrode for quasi-solid-state dye-sensitized solar cells. Appl. Phys. Lett. 87 (11), 113113 (2005).
  27. Katsuhiro, O., et al. Electrospinning processed nanofibrous TiO2 membranes for photovoltaic applications. Nanotechnology. 17 (4), 1026-1031 (2006).

Play Video

Cite This Article
Park, Y., Sunkara, V., Kim, Y., Lee, W. S., Han, J., Cho, Y. Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood. J. Vis. Exp. (110), e54143, doi:10.3791/54143 (2016).

View Video