전혈에서 고감도 단백질 검출을위한 완전 자동화 된 원심 미세 유체 장치
Summary
This protocol demonstrates how to achieve femto molar detection sensitivity of proteins in 10 µL of whole blood within 30 min. This can be achieved by using electrospun nanofibrous mats integrated in a lab-on-a-disc, which offers high surface area as well as effective mixing and washing for enhanced signal-to-noise ratio.
Abstract
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform for reduced sample volume and assay time as well as full automation are required for potential use in point-of-care-diagnostics. Recently, we have demonstrated ultrasensitive detection of serum proteins, C-reactive protein (CRP) and cardiac troponin I (cTnI), utilizing a lab-on-a-disc composed of TiO2 nanofibrous (NF) mats. It showed a large dynamic range with femto molar (fM) detection sensitivity, from a small volume of whole blood in 30 min. The device consists of several components for blood separation, metering, mixing, and washing that are automated for improved sensitivity from low sample volumes. Here, in the video demonstration, we show the experimental protocols and know-how for the fabrication of NFs as well as the disc, their integration and the operation in the following order: processes for preparing TiO2 NF mat; transfer-printing of TiO2 NF mat onto the disc; surface modification for immune-reactions, disc assembly and operation; on-disc detection and representative results for immunoassay. Use of this device enables multiplexed analysis with minimal consumption of samples and reagents. Given the advantages, the device should find use in a wide variety of applications, and prove beneficial in facilitating the analysis of low abundant proteins.
Introduction
질병 진단을위한 여러 플랫폼 1,2- 예컨대 나노 와이어, 나노 입자 (3), (4) 나노 튜브 (5)와 나노 파이버 (NFS) 6-8과 같은 나노 재료에 기초하여 개발되었다. 이 나노 물질은 독특한 물리 화학적 특성으로 인해 매우 민감한 생물 검정을위한 새로운 기술의 디자인 적으로도 뛰어난 전망을 제공합니다. 예를 들어, 메조 포러스 산화 아연 나노 유방암 바이오 마커의 펨토 몰 민감한 검출을 위해 사용되었다. 구 최근 화학적 안정성을 고려하여 생체 시료 애플리케이션 10 탐구되었다 티탄 (TiO2), 이산화에 기초하여 나노 물질을 11 무시할 단백질 변성 12 및 또한 생체 적합성.도 13은 이산화 티탄의 표면에 수산기 화학적 변형 및 생체 분자의 공유 결합을 용이하게한다. 14,15 무늬 이산화 티탄 생N 막 16 이산화 티탄 (17) 표면적이 증가하여 표적 단백질의 검출 감도를 향상시키는 데에 이용 된 나노 튜브; 그러나, 제조 공정이 다소 복잡하고 값 비싼 장비를 필요로한다. 한편, 전기 방사 NFS가 간단하고 저렴한 제조 공정뿐만 아니라 그들의 높은 표면적 주목 받고; 18,19 아직 상기 전기 방사 이산화 티탄 NF 매트 취약한 느슨한 특성 다루기가 어렵고 미세 유체 장치와 통합 할 수 있습니다. 6,20을 따라서, 이산화 티탄 NF 매트는 거의, 생체 시료 응용 프로그램에서 거친 세척 조건을 필요로 특히 활용되지 않았다.
본 연구에서는 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 얇은 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 접착제 층을 이용하여 임의의 피 처리 기판의 표면에 매트 NF는 전기 방사를 전송하는 새로운 기술을 개발 하였다. 작고에hermore, 우리는 성공적으로 폴리 카보네이트 (PC)로 이루어진 원심 미세 유체 소자로 전기 방사 티오 NF는 매트 (2)의 적분을 보여왔다. 이 장치를 사용하여, C 반응성 단백질의 민감한 높은 완전 자동화 된, 통합 검색 (CRP)뿐만 아니라 심장 트로포 닌 I (cTnI는)는 전체 혈액의 10 μL에서 30 분 이내에 달성 하였다. (21)로 인해 결합에 는 NFS와 원심 플랫폼의 특성의 장점은 분석은 검출 하한 100 ng를 / ㎖ (0.8 ~ PM) 1 pg / ml 인 (~ 8 FM)에서 크기의 여섯 주문의 넓은 동적 범위를 전시 CRP (37) PG / ㎖ (~ 오후 1시 5분)의 검출 한계 100ng의 / ㎖ (~ 4 ㎚) 10 pg / ml 인 (0.4 ~ PM)의 동적 범위의 0.8 pg / ml이다 (~ 6 FM)의 cTnI는합니다. 이러한 검출 한계는 300 ~되고, 20 배, 대응하는 종래의 ELISA 결과와 비교하여 낮은. 이 기술은 적절한 항체 모든 표적 단백질의 검출에 적용될 수있다. 전반적으로,이 장치 공동예를 들면, 전혈을 10 μl를 그것은 생물학적 샘플의 극소량에서조차 좋은 감도로 표적 단백질의 드문 양을 검출 할 수 있기 때문에 ULD은 체외 진단 및 생화학 적 분석에 크게 기여한다. 우리는이 연구에서 ELISA를 사용하여 혈청 단백질 검출을 증명하지만, 미세 유체 소자와 전기 방사의 NFS 전사 통합 기술은 더 광범위하게 높은 검출 감도를위한 큰 표면적을 필요로하는 다른 생화학 적 반응에 적용될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이산화 티탄 NF 통합 된 디스크에 대한 분석은 혈액의 매우 낮은 볼륨에 존재하는 낮은 풍부한 단백질의 고감도 검출을위한 신속하고 저렴하고 편리한 기술이다. 이 기술은 적은 양의 샘플 (10 μL)를 사용하는 장점을 가지며, 동시에 다수의 샘플 분석을위한 의무이다. 이것은 다중 면역 장치로서 큰 잠재력을 제공한다. 상기 장치는 통상적 인 ELISA를에 필요한 혈장 분리, 같은 시료의 전처리…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 한국 연구 재단 (NRF) 보조금 (2013R1A2A2A05004314, 2012R1A1A2043747), 한국 정부에 의해 투자 한국의 의료 기술 R & D 프로젝트, 보건 복지부 (A121994)와 IBS-R020-D1의 정부에서 보조금에 의해 지원되었다.
Materials
| Si wafer | LG SILTRON | Polished Wafer, test grade | Dia. (mm) = 150, orientation = <100>, dopant = boron, RES(Ohm-cm) = 1 – 30, thickness (μm) = 650 – 700 |
| Polycarbonate (PC) | Daedong Plastic | PCS#6900 | Thickness (mm) = 1 and 5 |
| Titanium tetraisopropoxide, 98%, | Sigma-Aldrich | 205273 | |
| Polyvinylpyrrolidone, Mw = 1,300,000 | Sigma-Aldrich | 437190 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| Anhydrous ethanol | Sigma-Aldrich | 459836 | |
| Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
| PDMS and curing agent | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
| GPDES | Gelest Inc | SIG5832.0 | |
| Ethanol | J T Baker | ||
| FE-SEM | FEI | Nova NanoSEM | |
| X-ray photoelectron spectroscopy | ThermoFisher | K-alpha | |
| 3D modeling machine | M&I CNC Lab, Korea | CNC milling machine | |
| Wax-dispensing machine | Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea | Customized | |
| Double-sided adhesive tape | FLEXcon, USA | DFM 200 clear 150 POLY H-9 V-95 | |
| Cutting plotter | Graphtec Corporation, Japan | Graphtec CE3000-60 MK2 | |
| Spin coater | MIDAS | SPIN-3000D | |
| Furnace (calcination) | R. D. WEBB COMPANY | WEBB 99 | |
| Rheometer (Tack test) | Thermo Scientific | Haake MARS III – ORM Package | |
| Oxygen plasma system | FEMTO | CUTE | |
| Monoclonal mouse antihuman hsCRP | Hytest Ltd., Finland | 4C28 | (clone # C5) |
| Monoclonal mouse anti-cTnI | Hytest Ltd., Finland | 4T21 | (clone # 19C7) |
| HRP conjugated goat polyclonal anti-hsCRP | Abcam plc., MA | ab19175 | |
| HRP conjugated mouse monoclonal anti-cTnI | Abcam plc., MA | ab24460 | (clone # 16A11) |
| hsCRP | Abcam plc., MA | ab111647 | |
| cTnI | Fitzgerald, MA | 30-AT43 | |
| Bovine Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| PBS | Amresco Inc | E404 | |
| Blood collection tubes | BD vacutainer | 367844 | K2 EDTA 7.2 mg plus blood collection tubes |
| SuperSignal ELISA femto | Invitrogen | 37074 | |
| Modular multilabel plate reader | Perkin Elmer | Envision 2104 | |
| Disc operating machine | Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea | Customized | |
| Photomultiplier tube (PMT) | Hamamatsu Photonics | H1189-210 | |
| AutoCAD | AutoDesk | Version 2012 | Design software |
| SolidWorks 3D CAD software | SOLIDWORKS Corp. | Version 2013 | 3D Design software, |
| Edgecam | Vero software | version 2009.01.06928 | Code generating software |
| DeskCNC | Carken Co. | version 2.0.2.18 | CNC milling machine software |
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