Vollautomatische Schleuder Mikrofluidik-Vorrichtung zur Ultrasensitive Proteindetektion aus Vollblut
Summary
This protocol demonstrates how to achieve femto molar detection sensitivity of proteins in 10 µL of whole blood within 30 min. This can be achieved by using electrospun nanofibrous mats integrated in a lab-on-a-disc, which offers high surface area as well as effective mixing and washing for enhanced signal-to-noise ratio.
Abstract
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform for reduced sample volume and assay time as well as full automation are required for potential use in point-of-care-diagnostics. Recently, we have demonstrated ultrasensitive detection of serum proteins, C-reactive protein (CRP) and cardiac troponin I (cTnI), utilizing a lab-on-a-disc composed of TiO2 nanofibrous (NF) mats. It showed a large dynamic range with femto molar (fM) detection sensitivity, from a small volume of whole blood in 30 min. The device consists of several components for blood separation, metering, mixing, and washing that are automated for improved sensitivity from low sample volumes. Here, in the video demonstration, we show the experimental protocols and know-how for the fabrication of NFs as well as the disc, their integration and the operation in the following order: processes for preparing TiO2 NF mat; transfer-printing of TiO2 NF mat onto the disc; surface modification for immune-reactions, disc assembly and operation; on-disc detection and representative results for immunoassay. Use of this device enables multiplexed analysis with minimal consumption of samples and reagents. Given the advantages, the device should find use in a wide variety of applications, and prove beneficial in facilitating the analysis of low abundant proteins.
Introduction
Mehrere Plattformen für die Diagnose von Krankheiten wurden auf Basis von nanoskaligen Materialien 1,2 wie Nanodrähte entwickelt, 3 – Nanopartikel, 4 – Nanoröhrchen, 5 und Nanofasern (NFS) 6-8. Diese Nanomaterialien bieten hervorragende Perspektiven bei der Gestaltung neuer Technologien für die hochsensiblen Biotests aufgrund ihrer einzigartigen physikalisch-chemischen Eigenschaften. Zum Beispiel haben mesoporösen Zinkoxid – Nanofasern für die Femto-molar empfindlichen Nachweis von Brustkrebs Biomarkern verwendet worden. 9 Kürzlich Basis Nanomaterialien auf Titandioxid (TiO 2) wurden für bioanalytische Anwendungen 10 unter Berücksichtigung ihrer chemischen Stabilität, 11 vernachlässigbar Proteindenaturierung untersucht , 12 und Biokompatibilität. 13 Außerdem erleichtern die Hydroxylgruppen auf der Oberfläche der TiO 2 chemische Modifikation und die kovalente Anlagerung von Biomolekülen. 14,15 Patterned TiO 2 thin Filme 16 oder TiO 2 -Nanoröhren 17 die Detektionsempfindlichkeit eines Zielproteins zu verbessern , verwendet worden sind , durch den Oberflächenbereich zu erhöhen; jedoch ist das Herstellungsverfahren ziemlich komplex und erfordert eine teure Ausrüstung. Auf der anderen Seite, elektro NFs Aufmerksamkeit wegen ihrer hohen Oberfläche erhalten sowie einfache und kostengünstige Herstellungsverfahren; 18,19 noch die zerbrechliche oder lose Charakteristik des elektro TiO 2 NF Matte macht es schwierig zu handhaben und Integration mit mikrofluidischen Systemen. 6,20 Daher wurden die TiO 2 NF Matten selten in bioanalytischen Anwendungen eingesetzt, insbesondere solche , erfordern harte Waschbedingungen.
In dieser Studie wurden diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir durch die Verwendung eines dünnen Polydimethylsiloxan (PDMS) Haftschicht, eine neue Technologie für die Übertragung der NF elektroMatten auf die Oberfläche eines beliebigen Zielsubstrat entwickelt. Furthermore haben wir erfolgreich zeigte die Integration der elektro TiO 2 NF Matten auf eine zentrifugale Mikrofluidikvorrichtung aus Polycarbonat (PC) hergestellt. Mit diesem Gerät wird eine hochempfindliche, vollautomatische und integrierte Detektion von C-reaktivem Protein (CRP) sowie kardialem Troponin I (cTnI) wurde aus 10 & mgr; l Vollblut innerhalb von 30 min erreicht. 21 aufgrund der kombinierten Vorteile der Eigenschaften des NFS- und die zentrifugale Plattform der Assay einen breiten dynamischen Bereich von sechs Größenordnungen von 1 pg / ml (~ 8 fM) bis 100 ng / ml (~ 12.08) mit einer unteren Nachweisgrenze zeigten von 0,8 pg / ml (~ 6 fM) für CRP und einem dynamischen Bereich von 10 pg / ml (~ 12.04) bis 100 ng / ml (~ 4 nM) mit einer Nachweisgrenze von 37 pg / ml (~ 01.05) für cTnI. Diese Nachweisgrenzen sind ~ 300 und ~ 20-fach niedriger im Vergleich zu ihren entsprechenden herkömmlichen ELISA-Ergebnisse. Diese Technik könnte zum Nachweis von irgendwelchen Zielproteine verwendet werden, mit entsprechenden Antikörpern. Insgesamt ist dieses Gerät could tragen wesentlich zur in-vitro – Diagnostik und biochemische Tests , da sie auch von sehr geringen Mengen an biologischen Proben selten Mengen von Zielproteinen mit großer Sensibilität erkennen kann, beispielsweise 10 & mgr; l Vollblut. Obwohl wir nur die Serumproteinnachweis mittels ELISA in dieser Studie gezeigt, die Übertragung und Integration Technologie der elektro NFs mit mikrofluidischen Vorrichtungen breiter in anderen biochemischen Reaktionen angewendet werden kann, die eine große Oberfläche für eine hohe Detektionsempfindlichkeit erfordern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der Assay auf TiO 2 NF integrierten Platte eine schnelle, kostengünstige und praktische Technik für die ultrasensitiver Detektion niedriger reichlich vorhandene Proteine in sehr geringen Blutvolumen. Diese Technik hat den Vorteil der Verwendung von kleinen Probenvolumina (10 ul) und ist für die Analyse von mehreren Proben gleichzeitig zugänglich. Dies stellt ein großes Potential als Multiplexing-Immunoassay-Gerät. Die Vorrichtung hat den zusätzlichen Vorteil, dass es nicht Probevorbehandlungsschr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der National Research Foundation of Korea (NRF) Zuschüsse unterstützt (2013R1A2A2A05004314, 2012R1A1A2043747), einen Zuschuss von der koreanischen Health Technology R & D-Projekt, das Ministerium für Gesundheit und Soziales (A121994) und IBS-R020-D1 von der koreanischen Regierung finanziert.
Materials
| Si wafer | LG SILTRON | Polished Wafer, test grade | Dia. (mm) = 150, orientation = <100>, dopant = boron, RES(Ohm-cm) = 1 – 30, thickness (μm) = 650 – 700 |
| Polycarbonate (PC) | Daedong Plastic | PCS#6900 | Thickness (mm) = 1 and 5 |
| Titanium tetraisopropoxide, 98%, | Sigma-Aldrich | 205273 | |
| Polyvinylpyrrolidone, Mw = 1,300,000 | Sigma-Aldrich | 437190 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| Anhydrous ethanol | Sigma-Aldrich | 459836 | |
| Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
| PDMS and curing agent | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
| GPDES | Gelest Inc | SIG5832.0 | |
| Ethanol | J T Baker | ||
| FE-SEM | FEI | Nova NanoSEM | |
| X-ray photoelectron spectroscopy | ThermoFisher | K-alpha | |
| 3D modeling machine | M&I CNC Lab, Korea | CNC milling machine | |
| Wax-dispensing machine | Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea | Customized | |
| Double-sided adhesive tape | FLEXcon, USA | DFM 200 clear 150 POLY H-9 V-95 | |
| Cutting plotter | Graphtec Corporation, Japan | Graphtec CE3000-60 MK2 | |
| Spin coater | MIDAS | SPIN-3000D | |
| Furnace (calcination) | R. D. WEBB COMPANY | WEBB 99 | |
| Rheometer (Tack test) | Thermo Scientific | Haake MARS III – ORM Package | |
| Oxygen plasma system | FEMTO | CUTE | |
| Monoclonal mouse antihuman hsCRP | Hytest Ltd., Finland | 4C28 | (clone # C5) |
| Monoclonal mouse anti-cTnI | Hytest Ltd., Finland | 4T21 | (clone # 19C7) |
| HRP conjugated goat polyclonal anti-hsCRP | Abcam plc., MA | ab19175 | |
| HRP conjugated mouse monoclonal anti-cTnI | Abcam plc., MA | ab24460 | (clone # 16A11) |
| hsCRP | Abcam plc., MA | ab111647 | |
| cTnI | Fitzgerald, MA | 30-AT43 | |
| Bovine Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| PBS | Amresco Inc | E404 | |
| Blood collection tubes | BD vacutainer | 367844 | K2 EDTA 7.2 mg plus blood collection tubes |
| SuperSignal ELISA femto | Invitrogen | 37074 | |
| Modular multilabel plate reader | Perkin Elmer | Envision 2104 | |
| Disc operating machine | Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea | Customized | |
| Photomultiplier tube (PMT) | Hamamatsu Photonics | H1189-210 | |
| AutoCAD | AutoDesk | Version 2012 | Design software |
| SolidWorks 3D CAD software | SOLIDWORKS Corp. | Version 2013 | 3D Design software, |
| Edgecam | Vero software | version 2009.01.06928 | Code generating software |
| DeskCNC | Carken Co. | version 2.0.2.18 | CNC milling machine software |
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