This protocol demonstrates how to achieve femto molar detection sensitivity of proteins in 10 µL of whole blood within 30 min. This can be achieved by using electrospun nanofibrous mats integrated in a lab-on-a-disc, which offers high surface area as well as effective mixing and washing for enhanced signal-to-noise ratio.
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform for reduced sample volume and assay time as well as full automation are required for potential use in point-of-care-diagnostics. Recently, we have demonstrated ultrasensitive detection of serum proteins, C-reactive protein (CRP) and cardiac troponin I (cTnI), utilizing a lab-on-a-disc composed of TiO2 nanofibrous (NF) mats. It showed a large dynamic range with femto molar (fM) detection sensitivity, from a small volume of whole blood in 30 min. The device consists of several components for blood separation, metering, mixing, and washing that are automated for improved sensitivity from low sample volumes. Here, in the video demonstration, we show the experimental protocols and know-how for the fabrication of NFs as well as the disc, their integration and the operation in the following order: processes for preparing TiO2 NF mat; transfer-printing of TiO2 NF mat onto the disc; surface modification for immune-reactions, disc assembly and operation; on-disc detection and representative results for immunoassay. Use of this device enables multiplexed analysis with minimal consumption of samples and reagents. Given the advantages, the device should find use in a wide variety of applications, and prove beneficial in facilitating the analysis of low abundant proteins.
מספר פלטפורמות לאבחון המחלה פותחו על בסיס חומרים ננומטריים 1,2 כגון ננו-חוטים, 3 חלקיקים, 4 צינורות, 5 ו nanofibers (NFS) 6-8. ננו אלה מציעים סיכויים מצוינים בעיצוב של טכנולוגיות חדשות עבור bioassays רגיש מאוד בשל המאפיינים physicochemical הייחודיים שלהם. לדוגמא, nanofibers תחמוצת אבץ mesoporous שמש לצורך זיהוי פמטו-הטוחנת הרגיש של סמנים לסרטן השד. 9 לאחרונה, ננו מבוסס על תחמוצת טיטניום (Tio 2) נחקר עבור יישומי bioanalytical 10 בהתחשב היציבות הכימית שלהם, 11 denaturation חלבון זניח , 12 ו biocompatibility. 13 בנוסף, קבוצות הידרוקסיל על פני השטח של Tio 2 להקל שינוי כימי ואת הקובץ המצורף קוולנטי של מולקולות ביולוגיות. 14,15 2 Patterned TIO תיn סרטים 16 או Tio 2 צינורות 17 כבר נוצלו כדי לשפר את רגישות הזיהוי של חלבון המטרה על ידי הגדלת שטח הפנים; עם זאת, תהליך הייצור הוא מורכב למדי ודורש ציוד יקר. מצד השני, NFS electrospun מקבל תשומת לב בגלל שטח הפנים הגבוה שלהם, כמו גם תהליך ייצור פשוט בעלות נמוך; 18,19 עדיין, המאפיין השביר או רופף של מזרן NF electrospun Tio 2 המקשה לטפל לשלב עם מכשירי microfluidic. 6,20 לכן, מחצלות Tio 2 NF נוצלו לעתים רחוקות ביישומי bioanalytical, במיוחד אלה הדורשים תנאי כביסה קשים.
במחקר זה, כדי להתגבר על המגבלות האלה, פיתחנו טכנולוגיה חדשה להעברת electrospun NF מחצלות על פני השטח של כל המצע היעד על ידי ניצול שכבת דבק דקה polydimethylsiloxane (PDMS). Furthermore, יש לנו בהצלחה הראה שילוב של טיו electrospun 2 NF מחצלות על גבי מכשיר microfluidic צנטריפוגלי פוליקרבונט (PC). שימוש במכשיר זה, זיהוי גבוה רגיש, אוטומטי לחלוטין, ומשולב של C-reactive protein (CRP) כמו גם טרופונין הלבבי אני (cTnI) הושג תוך 30 דקות מן רק 10 μL של דם מלא. 21 בשל בשילוב יתרונות של המאפיינים של NFS ואת פלטפורמת צנטריפוגלי, assay הציג טווח דינמי רחב של שישה סדרי הגודל מ 1 pg / ml (~ 8 FM) עד 100 ng / ml (~ 0.8 pM) עם גבול תחתון של זיהוי של 0.8 pg / ml (~ 6 FM) עבור CRP ומגוון דינמי מ -10 pg / ml (~ 0.4 pM) עד 100 ng / ml (~ 4 ננומטר) עם גבול הגילוי של 37 pg / ml (~ 1.5 pM) עבור cTnI. מגבלות זיהוי אלה ~ 300 ו ~ 20-לקפל תחתון בהשוואה לתוצאות ELISA הקונבנציונליות המתאימות. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת לצורך זיהוי של כל חלבוני יעד, עם נוגדנים מתאימים. בסך הכל, שיתוף המכשיר הזהULD לתרום רבות חוץ גופית אבחון מבחני ביוכימיים כי הוא מסוגל לגלות כמויות נדירות של חלבונים היעד ברגישות רבה גם מכמויות קטנות מאוד של דגימות ביולוגיות, לדוגמה, 10 μl של דם מלא. למרות שאנחנו רק הוכחנו את זיהוי סרום חלבון באמצעות ELISA במחקר זה, טכנולוגית ההעברה והאינטגרציה של electrospun NFS עם מכשירי microfluidic יכולה להיות מיושמת באופן נרחב יותר בתגובות ביוכימיות אחרות הדורשים שטח פנים גדול עבור רגישות זיהוי גבוהה.
את assay על דיסק משולב Tio 2 NF הוא טכניקה מהירה, זולה ונוחה לאיתור הרגיש של חלבונים נמוכים בשפע נוכחים נפח נמוך מאוד של דם. טכניקה זו יש את היתרון של שימוש כרכים מדגם קטן (10 μl) ו ניתנת לניתוח של דגימות מרובות בו זמנית. זה מספק פוטנציאל גדול כהתקן immunoassay ריבוב. המכשיר כול…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי National Research Foundation של קוריאה (NRF) מענקים (2013R1A2A2A05004314, 2012R1A1A2043747), מענק מטעם R בריאות הטכנולוגיה הקוריאני & D פרויקט, משרד הבריאות והרווחה (A121994) ו IBS-R020-D1 הממומן על ידי ממשלת קוריאה.
Si wafer | LG SILTRON | Polished Wafer, test grade | Dia. (mm) = 150, orientation = <100>, dopant = boron, RES(Ohm-cm) = 1 – 30, thickness (μm) = 650 – 700 |
Polycarbonate (PC) | Daedong Plastic | PCS#6900 | Thickness (mm) = 1 and 5 |
Titanium tetraisopropoxide, 98%, | Sigma-Aldrich | 205273 | |
Polyvinylpyrrolidone, Mw = 1,300,000 | Sigma-Aldrich | 437190 | |
Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
Anhydrous ethanol | Sigma-Aldrich | 459836 | |
Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
PDMS and curing agent | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
GPDES | Gelest Inc | SIG5832.0 | |
Ethanol | J T Baker | ||
FE-SEM | FEI | Nova NanoSEM | |
X-ray photoelectron spectroscopy | ThermoFisher | K-alpha | |
3D modeling machine | M&I CNC Lab, Korea | CNC milling machine | |
Wax-dispensing machine | Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea | Customized | |
Double-sided adhesive tape | FLEXcon, USA | DFM 200 clear 150 POLY H-9 V-95 | |
Cutting plotter | Graphtec Corporation, Japan | Graphtec CE3000-60 MK2 | |
Spin coater | MIDAS | SPIN-3000D | |
Furnace (calcination) | R. D. WEBB COMPANY | WEBB 99 | |
Rheometer (Tack test) | Thermo Scientific | Haake MARS III – ORM Package | |
Oxygen plasma system | FEMTO | CUTE | |
Monoclonal mouse antihuman hsCRP | Hytest Ltd., Finland | 4C28 | (clone # C5) |
Monoclonal mouse anti-cTnI | Hytest Ltd., Finland | 4T21 | (clone # 19C7) |
HRP conjugated goat polyclonal anti-hsCRP | Abcam plc., MA | ab19175 | |
HRP conjugated mouse monoclonal anti-cTnI | Abcam plc., MA | ab24460 | (clone # 16A11) |
hsCRP | Abcam plc., MA | ab111647 | |
cTnI | Fitzgerald, MA | 30-AT43 | |
Bovine Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
PBS | Amresco Inc | E404 | |
Blood collection tubes | BD vacutainer | 367844 | K2 EDTA 7.2 mg plus blood collection tubes |
SuperSignal ELISA femto | Invitrogen | 37074 | |
Modular multilabel plate reader | Perkin Elmer | Envision 2104 | |
Disc operating machine | Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea | Customized | |
Photomultiplier tube (PMT) | Hamamatsu Photonics | H1189-210 | |
AutoCAD | AutoDesk | Version 2012 | Design software |
SolidWorks 3D CAD software | SOLIDWORKS Corp. | Version 2013 | 3D Design software, |
Edgecam | Vero software | version 2009.01.06928 | Code generating software |
DeskCNC | Carken Co. | version 2.0.2.18 | CNC milling machine software |