Abstract
Polydimethylsiloxane (PDMS) הוא חומר בניין הרווח להפוך התקני microfluidic בשל קלות דפוס המליט שלה, כמו גם השקיפות שלה. בשל רכות של החומר PDMS, לעומת זאת, היא מאתגרת להשתמש PDMS לבניית nanochannels. הערוצים נוטים לקרוס בקלות במהלך מליטת פלזמה. במאמר זה, אנו מציגים שיטת הרכבה עצמית מונחה אידוי של חלקיקים קולואידים סיליקה ליצור צומת ננו-נוזליים עם תת-50 ננומטר נקבוביים בין שני microchannels. גודל הנקבוביות, כמו גם את תשלום השטח של צומת ננו-נוזלי הוא מתכונן פשוט על ידי שינוי חרוז סיליקה colloidal functionalization גודל המשטח החיצוני של המכשיר microfluidic התאספו בבקבוקון לפני תהליך ההרכבה העצמית. באמצעות ההרכבה העצמית של חלקיקים עם גודל חרוז של 300 ננומטר, 500 ננומטר, ו -900 ננומטר, ניתן היה לפברק קרום נקבובי עם גודל נקבובי של ~ 45 ננומטר, ~ 75 ננומטר ~ 135 ננומטר, בהתאמה. תחת חשמליפוטנציאל אל, יזם קרום nanoporous זה קיטוב ריכוז יון (ICP) מתנהג כמו קרום קטיון סלקטיבית להתרכז DNA על ידי ~ 1,700 פעמים בתוך 15 דקות. תהליך nanofabrication הלא ליתוגרפיות זה פותח הזדמנות חדשה לבנות צומת ננו-נוזלי מתכונן לחקר תהליכי הובלה ננומטריים של יונים ומולקולות בתוך שבב microfluidic PDMS.
Introduction
Nanofluidics הוא תחום מחקר המתפתח של TAS μ (מערכות ניתוח סה"כ מיקרו) ללמוד תהליכים ביולוגיים או תופעות מעבר של יונים ומולקולות בקנה מידה באורך של 10 1 - 10 2 ננומטר. עם כניסתו של כלי ננו-נוזלי כגון nanochannels, תהליכי הובלה של מולקולות ויונים ניתן לנטר בדייקנות חסרת תקדים מניפולציות, במידת הצורך, תוך ניצול התכונות הזמינות רק בקנה מידה אורך זה להפרדה וזיהוי. 1,2 אחד אלה תכונות ננו מאפיין היא יחס גבוה של פני שטח כדי תשלום בתפזורת (או מספר Dukhin) ב nanochannels שיכול לגרום לחוסר איזון תשלום וליזום קיטוב ריכוז יון (ICP) בין nanochannel ו microchannel. 3
פלטפורמת מכשיר נפוצה לחקר תופעות ננו-נוזלי מורכבת ממערכת של שני microchannel המחוברים באמצעות מערך של nanochannels כצומת. 4-6 7 עם זאת, ייצור המכשיר סיליקון דורש מסכות יקרות כמות ניכרת של עיבוד במתקן cleanroom. 8- 10 בשל הנוחות של ייצור המכשיר באמצעות דפוס מליטה פלזמה, polydimethylsiloxane (PDMS) כבר מקובל כחומר בנייה עבור מיקרופלואידיקה וזה יהיה חומר אידיאלי עבור nanofluidics גם כן. עם זאת, מודולוס של יאנג הנמוך שלה סביב 360-870 KPA, הופך את ערוץ PDMS מתקפל בקלות במהלך מליטה פלזמה. יחס היבט המינימום של nanochannel (רוחב עומק) צריך להיות פחות מ -10: 1 כלומר הייצור של מכשירי PDMS באמצעות photolithography הסטנדרטי יהפוך מאתגר מאוד אם עומק nanochannel צריך להיות מתחת ל -100 ננומטר, הדורש רוחב ערוץ פחות מאשר המגבלה הנוכחית של photolithography בסביבות 1 מיקרומטר. כדי להתגבר על מגבלה זו, נעשו ניסיונות ליצור nanochannels ב PDMS בשיטות הלא lithographical כגון מתיחה ליזום סדקים עם עומק ממוצע של 78 11 ננומטר או ליצירת קמטים לאחר הטיפול פלזמה. 12 קורסת ערוץ PDMS עם לחץ מכני מותר גובה nanochannel נמוך כמו 60 ננומטר. 13
למרות שיטות שאינן ליתוגרפיות המצאתית ביותר נתנו nanochannels בניין מתחת ל -100 ננומטר ובעמקות את יכולת שליטת הממדים של ייצור nanochannel עדיין מהווה מכשול בדרך הסכמה רחבה של PDMS כחומר בנייה עבור התקני ננו-נוזליים. בעיה נוספת קריטית של nanochannels, אם בסיליקון או PDMS, הוא functionalization משטח במקרה שיש צורך לשנות את המטען משטח על קיר ערוץ המניפולציה של יונים או מולקולות. לאחר הרכבה מכשירה באמצעות מליטה, את nanochannels קשה מאודלהגיע עבור functionalization השטח בשל התחבורה דיפוזיה-מוגבל. ליצירת ערוץ ננו עם נאמנות גבוהה ממדי functionalization משטח הקליל, שיטת ההרכבה העצמית של חלקיקים קולואידים המושרים על ידי אידוי 14-16 במכשירי microfluidic יכולה להיות אחת הגישות המבטיחות. מלבד יכולת השליטה של גודל נקבובי ורכוש שטח, יש אפילו אפשרות לכוון את הגודל הנקבובי in-situ בעת שימוש חלקיקים קולואידים מצופים polyelectrolytes ידי שליטה על הטמפרטורה, 17 pH, 18,19 וכוח יוני. 18 בגלל אלה יתרונות, שיטת ההרכבה העצמית של חלקיקים קולואידים כבר מצא יישומים עבור electrochromatography, 20 חיישנים ביולוגיים, 21 חלבון ריכוז 22 והפרדת חלבונים ו- DNA מיקרופלואידיקה. 14,23 במחקר זה, אנו פרוסים שיטת ההרכבה העצמית זה לבנות מכשיר preconcentration אלקטרוקינטיות בPDMS הדורש צומת ננו-נוזלי בין שני microchannels. 24 מנגנון היסוד מאחורי הריכוז אלקטרוקינטיות מבוסס על קיטוב ריכוז יון (ICP). 25 תיאור מפורט של צעדי ייצור והרכבה נכלל בפרוטוקול הבא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת התרחיפים החרוזים Colloidal סיליקה
- הכנת 300 ננומטר ו 500 השעיות חרוז סיליקה ננומטר
- וורטקס ההשעיה המניות חרוז סיליקה (10% w / v במים) למשך 30 שניות. כדי לקבל השעיה הומוגנית. פיפטה סך של 600 ההשעיה המניות μl לתוך צינור 1.5 מ"ל ו צנטריפוגות אותו 2,600 XG דקות 1.
- החליפו את supernatant עם 400 μl של חיץ פוספט נתרן 1 מ"מ (PB, pH 7.0).
- להשעות את החרוזים סיליקה לתוך לריכוז סופי של 15% בתמיסה פוספט נתרן 1 מ"מ 7.0 pH באמצעות vortexing.
- חרוזים carboxyl סיליקה Surface functionalize 500 ננומטר עם פולי (allylamine הידרוכלוריד, PAH), ועם פולי (sulfonate סטירן נתרן, PSS) polyelectrolytes
- להשעות 0.1 גרם של 500 חרוזים סיליקה ננומטר עם הקבוצה carboxyl עם 10 מ"ל 1 M NaCl (pH 7.0) עבור 1% (w / v) ההשעיה חרוז.
- כן 0.4% PAH (MW 65K) ב 1 M NACl על ידי המסת 300 μl של פתרון המניות (20% w / v במים) ב 15 מ"ל של 1 M NaCl. הכן 0.9% PSS (70K MW) ב 1 פתרון M NaCl ידי המסת PSS 0.18 גרם ב 20 מ"ל 1 פתרון M NaCl. וורטקס הוא פתרונות דקות 1. לפזר את polyelectrolytes לחלוטין.
- הוסף 200 μl של פתרון PAH ל -9.8 מ"ל של חרוזים carboxyl סיליקה 1% בתוך שפופרת 15 מ"ל להפקיד רובד polyelectrolyte בעלי מטען חשמלי חיובי על חרוזים סיליקה עם קבוצת carboxyl פונקציונלי. וורטקס ההשעיה חרוז דקות 1. דגירה זה על הכתף צינור במשך 60 דקות. ב RT.
- צנטריפוגה ההשעיה החרוזה XG ב 1801 דקות 1. לשטוף פעמים PAH חמש מאוגד עם מים די 10 מ"ל. אחרי כל צנטריפוגה והסרה של supernatant, החרוזים היו צפופים בתחתית של התחתית. לשבש את גוש חרוז ידי pipetting נמרצת עם 2 מ"ל מים DI לפני הוספת 8 מ"ל מים DI כך חרוזים ניתן מחדש על תנאי לשטוף לפני הצעד צנטריפוגה הבא.
- לעקוב אחראת השלבים 1.2.3 ו 1.2.4 לציפוי PSS להפקיד רובד טעון שלילי על החרוזים. Re- להשעות את החרוזים 9.8 מיליליטר של 1 M NaCl לפני בתצהיר PSS לאחר הסרת supernatant המים די משלב הכביסה 5 th של 1.2.4.
- השתמש באותו שלב pipetting נמרצת באמצעות 2 מ"ל של 1 M NaCl כדי לשבור את גוש חרוז בתחתית הצינור 15 מ"ל ולאחר מכן להוסיף 8 מ"ל של 1 M NaCl. הוסף 200 μl של פתרון PSS ל -9.8 מיליליטר של חרוזי סיליקה שהופקדו בשכבת PAH יחידה. לאחר vortexing דקות 1. ו דגירה של 60 דקות. על הכתף צינור, לחזור 5 צעדים כביסה עם מים די.
- מדוד את פוטנציאל זטה של החרוזים לפני ואחרי כל ציפוי polyelectrolyte באמצעות מערכת פיזור אור דינאמי על פי הפרוטוקול של היצרן כדי לוודא את ההליך בתצהיר polyelectrolyte שבוצע כהלכה (ראה טבלה 1).
- חזור על חמישה צעדי שטיפה במי DI בעקבות שכבת PSS היחידהבתצהיר מחדש להשעות את החרוזים 650 μl של חיץ פוספט נתרן 1 מ"מ עם 0.05% Tween 20 (15% w / v) לפני השימוש במכשיר microfluidic כדי לשפר flowability שלה.
- בצע את ההליך המתואר לעיל מן 1.2.5 כדי 1.2.6 עבור 500 חרוזים ננומטר סיליקה עם הקבוצה הפונקציונלית אמין להפקיד שכבה יחידה של PSS.
ייצור 2. של שבב microfluidic PDMS
- Microfabrication של המאסטר סיליקון
- לפברק המאסטר סיליקון ליציקה PDMS באמצעות טכניקות microfabrication כדלקמן.
- ספין מעיל photoresist דק 1 מיקרומטר ב -4,000 סל"ד על פרוסות סיליקון. תבנית השכבה באמצעות ליתוגרפיה הקרנה (זמן חשיפה 170 msec.) לחרוט 700 עמוק ננומטר ו -2 מיקרומטר הרחב nanochannels מישוריים (מתנהגת כמו nanotraps עבור חרוזי סיליקה) עם תחריט יון תגובתי.
- השתמש פרמטרי התחריט הבאים כדי להשיג את שיעור לחרוט של 3.5 ננומטר / ים: 3 CHF (45 SCCM), 4 CF (15 SCCM), Ar (100 SCCM), לחץ 100 mTorr, כוח RF 200 W.
- ספין מעיל שכבת photoresist עבה השני 1 מיקרומטר ב -2,000 סל"ד ולבצע יישור אל nanotraps בדוגמת בעבר. תבנית את microchannels תוך קשר ליתוגרפיה ידי תחריט יון תגובתי עמוק (DRIE) של סיליקון. השתמש DRIE פרמטרים 26 בטבלה 2.
- לפברק המאסטר סיליקון ליציקה PDMS באמצעות טכניקות microfabrication כדלקמן.
- המצאה של עובש PDMS
- Silanize המאסטר סיליקון עם trichlorosilane (50 μl) בבית N / O ואקום הצנצנת.
זהירות: Tricholorosilane הוא חומר רעיל ומאכל. תמיד להשתמש בו במנדף כימי עם אמצעי הגנה אישי נאות. - מערבבים את בסיס לסוכן ריפוי ב -10: 1 PDMS יחס ויצוק על המאסטר סיליקון silanized ולרפא אותו על 70 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות בתנור הסעה.
- הסר את לוח PDMS מן האדון סיליקון עם קשר סכין פלזמה זה על פרוסות סיליקון ריקות באמצעות שואב פלזמה לאחר plטיפול אסמא בתוך שואב פלזמה דקות 1. צרף קלטות בשולי לסמן קו חלוק של PDMS הבא ליהוק צעד.
- Silanize עובש PDMS בצנצנת ואקום עם trichlorosilane (50 μl) O / N.
- עופרת PDMS (בסיס: סוכן ריפוי 10: 1 יחס) על תבנית silanized PDMS ולרפא אותו על 70 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות בתנור הסעה.
- Silanize המאסטר סיליקון עם trichlorosilane (50 μl) בבית N / O ואקום הצנצנת.
- המצאה של המכשיר PDMS
- קלף את לוח PDMS נרפא מהתבנית PDMS לאורך קו החלוקה מסומן עם הקלטת.
- חורים מאגר פאנץ עם ביופסיה 1.5 מ"מ, נקי עם קלטת, יש לשטוף עם אלכוהול איזופרופיל (IPA) ויבש עם חנקן.
- אג"ח פלזמת מכשיר PDMS בשקופית זכוכית מיקרוסקופ 25 מ"מ x 75 מ"מ אחרי טיפול פלזמה שואבת פלזמת דקות 1.
- Ultrasonicate ההשעיה חרוז במשך 60 דקות. באמבטיה קולית לפני המילוי. פיפטה השעיה חרוזה 10 μl (300 סיליקה הלא פונקציונלית ננומטר להיותמודעות, או 500 חרוזים ננומטר סיליקה carboxyl עם שכבות PAH-PSS, או 500 חרוזים אמין ננומטר סיליקה בשכבה PSS) לתוך פתחי הכניסה 4 ו -6 כל (ראה איור 1 א ', ב) מיד לאחר מליטה פלזמה של השבב PDMS על מצע זכוכית. הקש בעדינות על השבב PDMS עם קצה פיפטה כדי לשפר את האריזה חרוז.
- לאחר מילוי ערוצי משלוח חרוז, לכסות את כל פתחי הכניסה למעט 1 ו -9 עם קלטת. אוויר יבש המכשיר במשך 3 שעות ולאחסן ב +4 מעלות צלזיוס לפני השימוש. איור 2 נותן צעד-אחר-צעד סכמטי של תהליך ההרכבה העצמית קולואידים.
ניסוי 3. ריכוז אלקטרוקינטיות של DNA
- מלאו את מאגרי 3, 7 עם פתרון חיץ (10 μl של 1 מ"מ PB) ומאגר 5 עם דגימת DNA (10 μl של 10 ננומטר ב 1 מ"מ PB) ולהחיל לחץ שלילי עדין עם קצה פיפטה הפוכה על מאגרי 2 , 8 ו -10 כדי למלא את הערוצים עם הפתרונים ללא בועות (ראו
- הוסף 10 μl של 1 מ"מ PB למאגרים 2 ו -8 ו -10 μl של ה- DNA 10 ננומטר למאגר 10 כדי לאזן את הלחץ ולחכות 5 דקות. כדי להגיע לשיווי משקל.
- הכנס את חוטי Pt לתוך מאגרים 3, 5, 7, 10.
- החל המתח על פני צומת ננו-נוזלי באמצעות מחלק מתח מחובר מד מקור וחוטי Pt. ראשית מרחי 30 V על מאגרי 5, 10 ו GND על מאגרי 3, 7.
- להקטין את המתח ל -25 V על מאגר 10 לאחר ~ 30 שניות.
- השתמש תריס מכאני עם פתח תקופתי בכל 5 שניות כדי למזער photobleaching של המדגם בעת הקלטת אותות הקרינה מן ה- DNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שבב concentrator אלקטרוקינטיות ב PDMS המכיל צומת ננו-נוזלי עצמית התאספו בין שני microchannels מוצג באיור 1 א). הערוץ באמצע המכשיר מתמלא פתרון דגימת DNA, לצדם שני ערוצי פתרון חיץ בכל צד דרך ערוץ משלוח חרוז רחב 50 מיקרומטר (איור 1B). ההשעיה colloidal סיליקה הוא טס לתוך התעלה משלוח חרוז מיד לאחר מליטה פלזמה ליצור צומת ננו-נוזלי בין המדגם בערוץ פתרון חיץ. מערך nanotrap המורכב 700 ננומטר עמוק 2 מיקרומטר nanochannels הרחב משמש כדי ללכוד את חלקיקי קולואידים. התמונה הסרוקה שלה שהושגה עם מאבחן משטח ללא מגע מוצגת באיור 1C). הממברנות החרוזים קולואידים לאחר האידוי מוצגים 1D איור). את SEM ב 1E איור) מציג את מלכודת חרוזי סיליקהped על מערך מישוריים nanotrap הפרדת ערוץ מדגם מערוץ משלוח חרוז. האריזה החרוזה סיליקה 300 ננומטר תערוכות הורה מאוד אריזת משושה עם כמה פגמים קלים שעלולות לגרום וריאציה בהתנהגות הריכוז (האיור 1F). העיצוב של שבב concentrator PDMS עם ממדיו ניתן למצוא כאן וגם הקבצים המשלימים.
איור 1. רכז Microfluidic ב PDMS עם תת-50 משולבת ננומטר צומת nanoporous. (א) תמונה של מכשיר concentrator PDMS. (ב) סכמטי של המכשיר מיקרו-ננו-נוזלי עם ערוץ משלוח חרוז בין ערוץ פתרון מדגם חיץ. המתח מוחל על פני ממברנות חרוזים בין הערוץ מדגם ואת ch פתרון החיץannels. (C) פרופיל Surface של המערך nanotrap ב PDMS עם רוחב של 2 מיקרומטר ו לעומק של 700 ננומטר. (ד) מיקרוסקופ של המכשיר עם הרכבת חלקיקי colloidal בתוך ערוץ המשלוח חרוז לאחר אידוי. (ה) מיקרוסקופ אלקטרונים סורק של חלקיקים קולואידים סיליקה עצמית התאספו 300 ננומטר עם מערכים nanotrap בין המדגם לבין חיץ ערוץ. 300 חרוזי ננומטר לכודים בכניסה של nanotraps בשל שטח מתח. (F) Hexagonally ארוז 300 חרוזים סיליקה ננומטר בתוך microchannel משלוח חרוז לאחר אידוי. (מעובד מתוך Ref. 25 באישור האגודה המלכותית לכימיה) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
סכמטי של השלבים microfabrication עבור concentrato PDMS מכשיר r מוצג באיור 2. כדי להפוך התקן PDMS, ליהוק PDMS כפול נדרש. תהליך מילוי החרוז הזה concentrator PDMS מוצג באיור 3. הפרטים על microfabrication ואת תהליך המילוי ניתן למצוא בפרוטוקול. הפוטנציאל זטא של חרוזים סיליקה בלי ועם ציפוי polyelectrolyte מוצג בטבלה 1.
איור 2. סכמטי של תהליך ייצור עבור האדון סיליקון, המאסטר PDMS וההתקן concentrator PDMS. אחרי שני צעדים photolithographic ותחריט, המאסטר סיליקון הוא יצוק עם PDMS. לאחר-דפוס כפול, מכשיר PDMS מורכב באמצעות מליטת פלזמה מלאת השעיה חרוזה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
: לשמור-together.within-page = "1"> 
האיור 3. שלב-אחר-שלב סכמטי להרכבה עצמית של חרוזי סיליקה colloidal. 10 μl של ההשעיה החרוזה היה pipetted אל ערוצי משלוח חרוז מייד לאחר טיפול פלזמה. ברגע ערוץ משלוח החרוז היה מלא, אבל כל שני פתחי כניסה 1 ו -9 היו מכוסים בסרט ואוויר המכשירים היבש עבור 3 שעות לפני השימוש. (לשכפל מ Ref. 25 באישור האגודה המלכותית לכימיה) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| חלקיקי קולואיד (500 ננומטר) | פוטנציאל זטה (mV) |
| סיליקה | -2.04 |
| אמין סיליקה | 19.6 |
| carboxyl סיליקה | -19.73 |
| ג סיליקהarboxyl, PAH מצופה | 31.8 |
| carboxyl סיליקה, PAH, PSS מצופה | -28.5 |
| אמין סיליקה, PSS מצופה | -31.2 |
פוטנציאל בטבלה 1. זטה של חרוזים סיליקה של 25 מעלות צלזיוס. 0.1% (w / v) פתרונות קולואידים שימשו המדידות (n = 3).
תמונות SEM נלקחו מערוץ האריזה החרוזה לאחר הייבוש החוצה להראות גודל הנקבוביות הנע בין 60 ננומטר, 91 ננומטר ו -170 ננומטר, כפי שמוצגת באיור 4. הגודל הנקבובי מתאים כ 20% של גודל החרוז, 300 ננומטר, 500 ננומטר ו -900 ננומטר, בהתאמה (15% מקוטר החרוז הוא הגודל הנקבובי התיאורטי).
איור 4. SEM תמונות של עצמית התאספו 300 ננומטר (א), 500 ננומטר (B) ו -900 ננומטר אריזת חרוז קולואידים סיליקה (C). מכשירי PDMS היו מלוכדות הפיכות שקופיות זכוכית וחרוזים טסים לתוך התעלה באמצעות לחץ שלילי. לאחר אוויר ייבוש המכשירים O / N, מכשירי PDMS היו משוכים של הזכוכית בזהירות צלמו. גודל נקבובי זה נאמד להיות 60 ± 2, 91 ± 5 ו -170 ± 7 ננומטר עבור 300 ננומטר, 500 ננומטר ו -900 ננומטר חרוזים בהתאמה (n = 9). הגודל הנקבובי אלה היו קרובים לגודל התיאורטי, ~ 15% מקוטר החרוז. (מעובד מתוך Ref. 25 באישור האגודה המלכותית לכימיה) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
כאשר מיישם מתח של 30 V דרך הממברנה החרוז 300 ננומטר, אזור דלדול יון נצפה ליד הממברנה קולואידים בתוך microchannel מלאניאון DNA שכותרתו (איור 5 א ', ב). כאשר הורידו המתח ל -25 V בצד השמאל, את מולקולות ה- DNA יש שנצברו בצורה של תוסף והריכוז שלה גדל עקב זרימת electroosmotic מונעת על ידי פרש מתח של 30 V- 25 V מעבר לתעלת המדגם (איור 5 ג , ד).
איור 5. micrographs זמן לשגות להראות את ההיווצרות של אזור מחסור יון ליד הצמתים קולואידים ננו-הנוזליות בערוץ המלא DNA (בריכוז ההתחלתי של 10 ננומטר). אזור דלדול יון יזם בזמן t = 10 s ו תקע ה- DNA מרוכז שנוצר היה ב V2 = 30 V ו- V1 = 25 V מעבר לתעלת המדגם בעוד ערוצי החיץ קורקעו. הקווים המקווקווים שימשו כדי להדגיש את הקירות ערוצים. גורם ריכוז של קפלי 1,700 ~ הושג תוך 15 דקות. uלשיר קרום קולואידים 300 ננומטר. (לשכפל מ Ref. 25 באישור האגודה המלכותית לכימיה) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
הממברנות סיליקה עם גודל חרוז של 300 ננומטר ו 500 ננומטר הראה הגורם הריכוז הגבוה ביותר ב ~ 1,700 פעמים עבור סיי 5 מתויג DNA (TAG CAT CAT CAA CCG ATG CCA CTA C) בתוך 15 דקות. (איור 6 א, ב). הממברנות החרוזים סיליקה מצופה polyelectrolyte ביאה לגידול 200 1,000 של פי ריכוז ה- DNA לאחר 15 דקות. (איור 6 ג, ד).
איור 6. עוצמת קרינה של DNA כפונקציה של זמן (א) 300 חרוזי ננומטר סיליקה (ב) 500 ננומטר חרוזי סיליקהד (ג) 500 חרוזים אמינים סיליקה PSS מצופה ננומטר (D) 500 ננומטר PAH / PSS מצופה חרוזי סיליקה carboxyl. הקווים המקווקווים מייצגים את רמת עוצמת אות הקרינה עבור 10 ננומטר (A, B, C, D), 17 מיקרומטר (A, B), 2 מיקרומטר (C) ו -10 מיקרומטר DNA (D). התוצאות היו מנורמלות נגד קרינת רקע. (לשכפל מ Ref. 25 באישור האגודה המלכותית לכימיה) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| זמן תהליך | מצב Etch | מצב פסיבציה |
| זמן תהליך | 6 ים | 4.5 s |
| מוצף | 0.5 s | 0 s |
| גנרטור משטח סריקה | 80 W | 60 W |
| גנרטור סליל | 600 W | 600 W |
| גַז | SF 6 70 SCCM | C 4 F 8 35 SCCM |
| שיעור Etch | 1.47 מיקרומטר / min | |
טבלה 2. פרמטרים DRIE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בעקבות ערכת עיצוב מכשיר הנפוצה ללמוד nanofluidics, אנו מפוברקים צומת ננו-נוזלי בין שני ערוצי microfluidic באמצעות חלקיקי ההרכבה העצמית של קולואידים מונחה אידוי במקום lithographically patterning מערך של nanochannels. כאשר זורם חלקיקים קולואידים לתוך התעלה משלוח חרוז, מערך של nanotraps עם עומק של 700 ננומטר ברוחב של 2 מיקרומטר משני צידי תעלת הלידה חרוז ברוחב כולל של 100 מיקרומטר מנעו ההשעיה חרוז לזרום לתוך חיץ מדגם ערוץ בשל מתח הפנים בבית nanotraps. ומשנלכדים, חלקיקים קולואידים ארז בערוץ משלוח חרוז במהירות ויצרו צומת nanoporous בין המדגם לבין חיץ ערוץ.
חשוב לטעון את ההשעיה חרוז מייד לאחר מליט פלזמה כך שכוח הנימים שמניע את ההשעיה החרוזה סיליקה עד לכניסה של המשקע reservoirs בערוץ משלוח חרוז הידרופילי זמנית. כדי למנוע בועת אוויר חוסמת את הזרימה במאגר הכניסה, מומלץ מאוד להגיע לתחתית של המאגר עם קצה פיפטה ולאחר מכן שחרר את ההשעיה חרוז לתוך המאגר. במקרה של חרוזים פונקציונלי משטח עם polyelectrolytes, flowability שלהם הופחת לעומת דרסטי על חרוזי סיליקה ללא functionalization שטח נטה לצבור יותר בקלות לדבוק פני הערוץ בתהליך המילוי. על מנת למנוע סתימת הערוץ עם חרוזי polyelectrolyte מצופה, הוספנו פעילי שטח, 0.05% Tween 20, על השעיית החרוז. במקרה היה עדיין בעית הסתימה במהלך מילוי, נקישות עדינות על שבב PDMS עם קצה פיפטה עזרו בדרך כלל כדי לפתור אותה.
כמו כן, חשוב כי ההשעיה החרוזה לא התייבשה לחלוטין לאחר האידוי מאז שזה יהיה קשה INFiltrate הממברנה חרוז עם פתרון חיץ פוספט נתרן שוב. לכן, לאחר 3 שעות של אידוי חלקי, כל in- שקעים של מכשיר PDMS הוקלטו והמשיך ב 4 מעלות צלזיוס במשך אחסון לפני שימוש כך אריזת החרוז נשארת לחה. במהלך ניסויי preconcentration, החרוז העצמי התאסף שמר על היציבות המבנית שלה על פי רוב. עם זאת, ב כמה מקרים, צפינו פריק של החרוזים שהצביעו על אריזה פגומה של חרוזי microchannels. חרוזי סיליקה עצמיות התאסף החל בקוטר של 900 ננומטר עד 300 ננומטר לאחר ההרכבה העצמית ניתן לראות באיור 4. הגודל הנקבובי התיאורטי של האריזה החרוזה היה ~ 45 ננומטר, כ ~ 15% של החלקיקים קולואידים קוֹטֶר. יכולנו לאשר את הגודל הנקבובי באמצעות ניתוח SEM ונמדד גודל נקבובי כ 20% מקוטר החרוז לאחר האריזה.
באמצעות ננומטר 300 העצמי התאסף ו -500 ממברנות חלקיקי colloidal ננומטר כמו יון-סלקטיבית נהצומת noporous, נוכל ליזום אזור מחסור יון ב 30 V ולהתרכז 10 ננומטר Cy5 מתויג DNA (TAG CAT CAT CAA CCG ATG CCA CTA C) במאגר סודיום פוספט 1 מ"מ (איור 5). על ידי ברציפות זורם דגימת DNA לעבר אזור דלדול יון עם זרימת electroosmotic בכל V הבדל במתח 2 -V 1 = 5 V, נוכל להגדיל את ריכוז ה- DNA הראשוני על ידי ~ 1,700 קפלים תוך 15 דקות. (איור 6 א, ב). 500 חרוזי ננומטר מותר ריכוז ה- DNA חזקים יותר מ -300 חרוזים ננומטר, כפי שמוצג באיור 6 ב). מאז הריכוז אלקטרוקינטיות מבוסס על איזון כוח בין כוח electroosmotic וכוחות electrophoretic הקויים מאוד, הגורם הריכוז הסופי נקבע על ידי המידה שבה איזון הכח הזה יכול להישמר במהלך ריכוז אלקטרוקינטיות. 27
יתרון משמעותי נוסף של פריסת חלקיקים קולואידים לבניית צומת ננו-נוזלי הוא הקלות שבה surfac שלהניתן לבצע functionalization דואר. במקום ליצור nanochannel דרך המליטה ראשונה ולאחר מכן ביצוע functionalization שטח על זה, אנחנו יכולים לצוץ פשוט functionalize החלקיקים קולואידים בבקבוקון מחוץ המכשיר הראשון ולאחר מכן לזרום אותם לתוך התעלה להרכבה עצמית. בהתבסס על גישה זו, נוכל ליזום ICP באמצעות חלקיקים אמין סיליקה 500 ננומטר מצופה בשכבה אחת של PSS ו -500 חלקיקים carboxyl סיליקה ננומטר מצופה בשכבת PAH ו PSS (איור 6 C ו- D), במתח נמוך (8 V ו -10 V, בהתאמה) מאשר חלקיקים קולואידים ללא functionalization פני השטח (30 V). תוצאה זו מלמדת כי functionalization השטח של החלקיקים קולואידים לפני ההרכבה העצמית היה יעיל להגדיל את החיוב לפני השטח של חלקיקי קולואידים וגרם ICP הגבוה. עם זאת, במונחים של הגורם המגביר שהושג, צומת ננו-הנוזלית של החרוזים פונקציונלי המשטח הייתה פחות יעילה מאשר סי אי-הפונקציונליתחרוזי Lica. אמין / PSS-מצופה חרוזים מופעל פקטור של ~ 200, בעוד carboxyl / PAH / PSS קרום חרוז הראה עלייה של 1,000 במשפחה אחרי 15 דקות. (איור 6 ד). תוצאה זו יכולה להיות מוסברת על ידי שעבוד פנים גבוה של nanopores פונקציונלי המשטח שהוביל אורך מוגבר של אזור מחסור היון דוחף את ריכוז תקע מדגם רחוק מן הקרום החרוז ולכן, כדי ריכוז יציב פחות. אנו מאמינים שקיצור הרוחב הכולל של הממברנה חרוז nanoporous מ כרגע 1 מ"מ (בסעיף המאגר המקבילי קרום חרוז לערוץ מדגם) יכול להקל סוגיית חוסר היציבות הזה. על פי המחקר הקודם שלנו, את רוחב צומת nanoporous קובע את כמות חולפת הזרם היוני דרכו. 28 ככל שעולה רוחב, עולה הזרם היוני ומאז קטיונים יותר יכול להעביר דרך הממברנה, מגדילה אורך אזילה התקע ריכוז עוד נדחף משם מצומת nanoporous. Therefore, ההצטברות מתרחשת באופן פחות סגור תקע הדגימה נעשה פחות יציב. מבחינה אמפירית, צומת nanoporous צריך להיות ~ 100-400 מיקרומטר רוחב. תכונה נוספת לשפר הייתה עובי מספיק של קיר PDMS של 15 מיקרומטר בין הערוץ מדגם ואת המסירה החרוזה. בסעיף דק זה PDMS הביאה מליטה מספיק שאפשר זרם יוני בין חיץ הערוץ מדגם. לכן, במקביל בסעיף קרום חרוז כולו לערוץ המדגם (1 מ"מ רוחב) היה מתנהג כמו צומת nanoporous, אף על פי שרק 100 מיקרומטר של החרוז נועדו קרום צומת nanoporous פי הרוחב הכולל של מערך nanotrap. עובי הקיר PDMS צריך להיות לפחות 25 מיקרומטר ומעלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי NIH R21 EB008177-01A2 וניו יורק אוניברסיטת אבו דאבי (NYUAD) מחקר שיפור הקרן 2013. אנו מביעים את תודתנו הצוות הטכני של MIT MTL על תמיכתם במהלך microfabrication וג'יימס ווסטון ניקולאס Giakoumidis של NYUAD עבור שלהם תמיכה ב מצלם SEM ובניית מחלק מתח, בהתאמה. ייצור המכשיר PDMS נערך במתקן הליבה microfabrication של NYUAD. לבסוף, ברצוננו להודות רבקה Pittam ממרכז NYUAD עבור מלגות דיגיטליות לצילומי וידאו ועריכה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly(Styrenesulfonic Acid) Sodium Salt | Polysciences | 08772 | |
| Poly(allylamine) Solution | Sigma Aldrich | 479144-5G | |
| Silica Microsphere - 300 nm | Polysciences | 24321 | |
| Silica Microsphere - 500 nm | Polysciences | 24323 | |
| Silica Microsphere Carboxyl Functional - 500 nm | Polysciences | 24753 | |
| Silica Microsphere Amine Functional - 500 nm | Polysciences | 24756 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer kit | Dow Corning | ||
| Trichlorosilane | Sigma Aldrich | 175552 | |
| Ultrasonic Cleaner | Branson | 3510 | |
| Tube Rotator | VWR | 10136-084 | |
| Vortex Mixer | WiseMix | VM-10 | |
| Microcentrifuge | VWR | Micro 1207 | |
| Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-001-HP | |
| PDMS Mixer | Thinky | ARE-250 | |
| Oven | Thermo Scientific | PR305220M | |
| Epi-fluorescence Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| CCD Camera | Andor | Clara | |
| Platinum Electrodes | Alfa Aesar | 43014 | |
| Source Meter | Keithley | 2400 | |
| Digital Multimeter | Extech | 410 | |
| Microscopy Glass Slides | Thermo Scientific | 2951-001 | |
| Tween 20 | Merck Millipore | 822184 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 7646-14-5 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | 71505 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S3264 | |
| DNA | IDT | CAA CCG ATG CCA CAT CAT TAG CTA C | |
| B-Phycoerythrin | Life Technologies | P-800 | |
| Dynamic light scattering system for Zeta Potential Measurement | Malvern | Zetasizer Nano S | |
| Photoresist | Shipley | SPR700-1.0 | |
| Projection lithography | Nikon | NSR2005i9 | |
| Reactive Ion Etcher | Applied Materials | AME P5000 | |
| ICP deep reactive ion etcher | STS | STS-6" | |
| Contact lithography | Electronic Visions | EV620 | |
| Photoresist Coater Developer | SSI | SSI 150 | |
| Non-contact surface profiler | Wyko | NT 9800 |
References
- Mawatari, K., Kazoe, Y., Shimizu, H., Pihosh, Y., Kitamori, T. Extended-Nanofluidics: Fundamental Technologies, Unique Liquid Properties, and Application in Chemical and Bio Analysis Methods and Devices. Anal Chem. 86, 4068-4077 (2014).
- Tsukahara, T., Mawatari, K., Kitamori, T. Integrated extended-nano chemical systems on a chip. Chem Soc Rev. 39, 1000-1013 (2010).
- Mani, A., Zangle, T. A., Santiago, J. G. On the Propagation of Concentration Polarization from Microchannel-Nanochannel Interfaces Part I: Analytical Model and Characteristic Analysis. Langmuir. 25, 3898-3908 (2009).
- Aizel, K., et al. Enrichment of nanoparticles and bacteria using electroless and manual actuation modes of a bypass nanofluidic device. Lab Chip. 13, 4476-4485 (2013).
- Wang, Y. C., Stevens, A. L., Han, J. Million-fold preconcentration of proteins and peptides by nanofluidic filter. Anal Chem. 77, 4293-4299 (2005).
- Karnik, R., et al. Electrostatic control of ions and molecules in nanofluidic transistors. Nano letters. 5, 943-948 (2005).
- Mao, P., Han, J. Y. Fabrication and characterization of 20 nm planar nanofluidic channels by glass-glass and glass-silicon bonding. Lab Chip. 5, 837-844 (2005).
- Mao, P., Han, J. Massively-parallel ultra-high-aspect-ratio nanochannels as mesoporous membranes. Lab Chip. 9, 586-591 (2009).
- Balducci, A., Mao, P., Han, J. Y., Doyle, P. S. Double-stranded DNA diffusion in slitlike nanochannels. Macromolecules. 39, 6273-6281 (2006).
- Yamada, M., Mao, P., Fu, J. P., Han, J. Y. Rapid Quantification of Disease-Marker Proteins Using Continuous-Flow Immunoseparation in a Nanosieve Fluidic Device. Anal Chem. 81, 7067-7074 (2009).
- Huh, D., et al. Tuneable elastomeric nanochannels for nanofluidic manipulation. Nat Mater. 6, 424-428 (2007).
- Chung, S., Lee, J. H., Moon, M. W., Han, J., Kamm, R. D. Non-lithographic wrinkle nanochannels for protein preconcentration. Adv Mater. 20, 3011-3016 (2008).
- Park, S. M., Huh, Y. S., Craighead, H. G., Erickson, D. A method for nanofluidic device prototyping using elastomeric collapse. Proc Natl Acad Sci. 106, 15549-15554 (2009).
- Zeng, Y., Harrison, D. J. Self-assembled colloidal arrays as three-dimensional nanofluidic sieves for separation of biomolecules on microchips. Anal Chem. 79, 2289-2295 (2007).
- Malekpourkoupaei, A., Kostiuk, L. W., Harrison, D. J. Fabrication of Binary Opal Lattices in Microfluidic Devices. Chem Mat. 25, 3808-3815 (2013).
- Merlin, A., Salmon, J. -B., Leng, J.
- Schepelina, O., Zharov, I. PNIPAAM-modified nanoporous colloidal films with positive and negative temperature gating. Langmuir. 23, 12704-12709 (2007).
- Schepelina, O., Zharov, I. Poly(2-(dimethylamino)ethyl methacrylate)-Modified Nanoporous Colloidal Films with pH and Ion Response. Langmuir. 24, 14188-14194 (2008).
- Smith, J. J., Zharov, I. Ion transport in sulfonated nanoporous colloidal films. Langmuir. 24, 2650-2654 (2008).
- Gaspar, A., Hernandez, L., Stevens, S., Gomez, F. A. Electrochromatography in microchips packed with conventional reversed-phase silica particles. Electrophoresis. 29, 1638-1642 (2008).
- Lee, S. Y., et al. High-Fidelity Optofluidic On-Chip Sensors Using Well-Defined Gold Nanowell Crystals. Anal Chem. 83, 9174-9180 (2011).
- Hu, Y. L., et al. Interconnected ordered nanoporous networks of colloidal crystals integrated on a microfluidic chip for highly efficient protein concentration. Electrophoresis. 32, 3424-3430 (2011).
- Zhang, D. -W., et al. Microfabrication-free fused silica nanofluidic interface for on chip electrokinetic stacking of DNA. Microfluid Nanofluid. 14, 69-76 (2013).
- Syed, A., Mangano, L., Mao, P., Han, J., Song, Y. A. Creating sub-50 nm nanofluidic junctions in a PDMS microchip via self-assembly process of colloidal silica beads for electrokinetic concentration of biomolecules. Lab Chip. 14, 4455-4460 (2014).
- Kim, S. J., Song, Y. A., Han, J. Nanofluidic concentration devices for biomolecules utilizing ion concentration polarization: theory, fabrication, and applications. Chem Soc Rev. 39, 912-922 (2010).
- Fu, J. P., Mao, P., Han, J. Y. Continuous-flow bioseparation using microfabricated anisotropic nanofluidic sieving structures. Nat Protoc. 4, 1681-1698 (2009).
- Plecis, A., Nanteuil, C., Haghiri-Gosnet, A. M., Chen, Y.
- Ko, S. H., et al. Nanofluidic preconcentration device in a straight microchannel using ion concentration polarization. Lab Chip. 12, 4472-4482 (2012).
