خلايا تنمو في (3-D) بيئة ثلاثية الأبعاد تمثل تحسنا ملحوظا خلال زراعة الخلايا في بيئات 2-D (على سبيل المثال، قوارير أو أطباق). نحن هنا وصف تطوير نموذج عضوي النمط 3-D متعددة الخلايا في الغشاء المخاطي في الأمعاء البشرية المستزرعة في ظل انعدام الجاذبية التي تقدمها الدورية جدار الأوعية الدموية (RWV) المفاعلات الحيوية.
لأن الخلايا التي تنمو في (3-D) بيئة ثلاثية الأبعاد لديها القدرة على سد العديد من الثغرات في زراعة الخلايا في بيئات 2-D (على سبيل المثال، قوارير أو أطباق). في الواقع، من المسلم به على نطاق واسع أن الخلايا المزروعة في قوارير أو أطباق تميل إلى التقليل من التمييز وفقدان الميزات المتخصصة التابعة للأنسجة التي تشتق منها. حاليا، هناك أساسا نوعان من نظم الاستزراع 3-D حيث هي المصنفة الخلايا في السقالات محاكاة المصفوفة خارج الخلية الأم (ECM): (أ) نماذج ثابتة ونماذج (ب) باستخدام المفاعلات الحيوية. كان الانطلاقة الأولى للساكنة نماذج 3-D. نماذج 3-D باستخدام المفاعلات الحيوية مثل الدورية جدار الأوعية الدموية (RWV) المفاعلات الحيوية هي تطور أكثر حداثة. تم تطوير المفهوم الأصلي للالمفاعلات الحيوية RWV في مركز جونسون للفضاء التابع لناسا في 1990s في وقت مبكر، ويعتقد أن التغلب على القيود المفروضة على نماذج ثابتة مثل تطوير ميتة، النوى الميتة. في المفاعلات الحيوية RWV قد تحايل عشرهو المشكلة عن طريق توفير ديناميات السوائل التي تسمح للنشر كفاءة من المواد المغذية والأكسجين. هذه المفاعلات الحيوية تتكون من قاعدة المدورة التي تعمل على دعم وتدوير شكلين مختلفين من السفن الثقافة التي تختلف من حيث النوع مصدر التهوية: (1) بطء تحول السفن الجانبي (STLVs) مع مكساج المشارك المحوري في المركز، أو (2 ) سفن ارتفاع نسبة الارتفاع (HARVs) مع الأوكسجين عبر، سيليكون المطاط غشاء نقل الغاز مسطح. هذه السفن تسمح نقل الغاز كفاءة مع تجنب تشكيل فقاعة ويترتب على ذلك الاضطراب. هذه الظروف تؤدي إلى تدفق الصفحي والحد الأدنى من قوة القص أن النماذج خفض الثقل (الجاذبية الصغرى) داخل سفينة الثقافة. نحن هنا وصف تطوير نموذج عضوي النمط 3-D متعددة الخلايا في الغشاء المخاطي المعوي البشري يتكون من خط الأمعاء الظهارية الخلايا والخلايا الليمفاوية الإنسان الأساسية، والخلايا البطانية والخلايا الليفية مثقف تحت الجاذبية الصغرى التي تقدمها مفاعل حيوي RWV. </ P>
وذكرت تقارير ان الانطلاقة الأولى في بناء نموذج 3-D في وقت مبكر من 1980s عندما بدأ العلماء للتحقيق في أنواع مختلفة من سقالة (على سبيل المثال، laminin، نوع الكولاجين الأول، الكولاجين الرابع، والفيبرونكتين) والكوكتيلات من عوامل النمو لتحسين خلية الى خلية والتفاعلات ECM من "ثابت" نماذج 3-D 1-7. ومنذ ذلك الحين، كانت المشكلة الرئيسية مع هذه النماذج القيود في نقل المواد المغذية والأكسجين داخل المتوسطة والأنسجة يبني 8. وعلى النقيض من الخلايا في البيئة في الجسم الحي الذي يتلقى تدفق مستمر من المواد المغذية والأكسجين من المحيط شبكات الأوعية الدموية، وطبيعة ثابتة من هذه النماذج تعيق التوزيع الفعال منهم إلى الخلايا. على سبيل المثال، سوف المجاميع خلية ولدت في في المختبر النماذج الثابتة التي تتجاوز بضعة ملليمترات في حجم تتطور دائما ميتة، النوى الميتة 9. في المفاعلات الحيوية RWV قد تحايل على هذه المشكلةمن خلال توفير ديناميات السوائل التي تسمح للنشر أكفأ من المغذيات والأكسجين 10-12. ومع ذلك، حتى الآن، العمل باستخدام المفاعلات الحيوية RWV اقتصرت على إدراج واحد أو اثنين من أنواع الخلايا 13-17. وعلاوة على ذلك، بدلا من التوجه المكاني مماثلة لأنسجة الأم، تلك الخلايا شكلت المجاميع الخلية. وكان السبب الرئيسي لهذه القيود عدم وجود سقالة قادرة على دمج الخلايا بطريقة متكاملة. السقالات المستخدمة في المفاعلات الحيوية RWV حتى الآن تتكون، مع استثناءات قليلة 16-18، وذلك أساسا من ميكروبيدات الاصطناعية، واسطوانات أنبوبي أو ورقة صغيرة 13-15،19-23. هذه هي مواد شديدة تركيبتها والمرونة لا يمكن التلاعب بها، والتي تعلق الخلايا إلى سطحها. وبالتالي، فإنه من غير المحتمل أن هذه النماذج سيوفر النظام الذي لتقييم وبطريقة متكاملة، ومختلف مكونات الخلية مثل خلايا انسجة (على سبيل المثال، الخلايا الليفية، الخلايا المناعية والبطانية) أن لياليأن تفرق hould معها داخل سقالة لتقليد بشكل وثيق الأنسجة البشرية.
نحن هنا وصف تطوير نموذج عضوي النمط 3-D متعددة الخلايا في الغشاء المخاطي المعوي البشري يتكون من خط الأمعاء الظهارية الخلايا والخلايا الليمفاوية الإنسان الأساسية، والخلايا البطانية، والخلايا الليفية 24. وكانت هذه الخلايا المستزرعة تحت الجاذبية الصغرى تقدم من قبل مفاعل حيوي RWV 13،25-30. في نموذجنا 3-D، إدارة المحتوى في المؤسسة تمتلك العديد من الخصائص المتميزة، مثل الأسمولية مماثلة إلى مستنبت (على سبيل المثال، القيود الأنتشارى تذكر خلال ثقافة)، والقدرة على دمج الخلايا وغيرها من البروتينات المصفوفة خارج الخلية ذات الصلة، فضلا عن صلابة مناسبة لاستخدامها في المفاعلات الحيوية 24. النظم البيولوجية معقدة جدا، وعلى مدى السنوات القليلة الماضية، كان هناك تحول في التركيز على البحوث المخاطية نحو دراسة التفاعلات الخلية مع محيطهم بدلا من دراستها في isolatioن. على وجه الخصوص، على أهمية التفاعلات خلية خلية في التأثير على بقاء الخلية المعوية والتمايز موثق جيدا 31-34. على وجه التحديد، والاتصالات بين الخلايا الظهارية ومكانها المناسب له تأثير عميق على توسيع الخلايا الظهارية والتمايز 35. في الواقع، ومن المسلم به على نطاق واسع ليس فقط من خلية إلى خلية لكن أيضا التفاعلات الخلية الى ECM حاسمة لصيانة وتمايز الخلايا الظهارية في نماذج الثقافة 3-D. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن البروتينات الأمعاء ECM مثل الكولاجين أنا 24،36،37، laminin 38 و 39 الفيبرونكتين دور فعال في التأثير على الخلايا الظهارية في الأمعاء للحصول على التوجه المكاني على غرار الغشاء المخاطي الأصلي. وهكذا، وتطوير التكنولوجيات الجديدة، مثل لدينا نموذج 3-D 24، التي يمكن أن تحاكي مطلوب تنوع المظهري للامعاء إذا تنوي الباحثين لإعادة العمارة الخلوية والهيكلية المعقدةوظيفة المكروية القناة الهضمية. وتمثل هذه النماذج أداة هامة في تطوير وتقييم الأدوية عن طريق الفم الجديدة واللقاحات المرشحة.
في هذا المخطوط، وصفنا تطوير نموذج الهندسة البيولوجية من الغشاء المخاطي المعوي البشري يتكون من أنواع الخلايا مضاعفات بما في ذلك الخلايا الليمفاوية الإنسان الأساسية، الخلايا الليفية، والخلايا البطانية، وكذلك الأمعاء خطوط الخلايا الظهارية 24. في هذا النموذج 3-D،…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported, in part, by NIAID, NIH, DHHS federal research grants R01 AI036525 and U19 AI082655 (CCHI) to MBS and by NIH grant DK048373 to AF. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institute of Allergy And Infectious Diseases or the National Institutes of Health.
Quad Rotator/Independent Rotating Wall Vessel (RWV) bioreactor | Synthecon | RCCs-4DQ | For up to 4 vessels. Models with more or less vessels are also available. |
Disposable 50 ml-vessel | Synthecon | D-405 | Box with 4 vessels |
HCT-8 epithelial cells | ATCC | CCL-244 | |
CCD-18Co Fibroblasts | ATCC | CRL-1459 | |
Human Umbilical Vein Endothelial Cells | ATCC | CRL-1730 | HUVEC |
Fibroblast Growth Factor-Basic | Sigma | F0291 | bFGF |
Stem Cell Factor | Sigma | S7901 | SCF |
Hepatocyte Growth Factor | Sigma | H1404 | HGF |
Endothelin 3 | Sigma | E9137 | |
Laminin | Sigma | L2020 | Isolated from mouse Engelbreth-Holm-Swarm tumor |
Vascular Endothelial Growth Factor | Sigma | V7259 | VEGF |
Leukemia Inhibitory Factor | Santa Cruz | sc-4377 | (LIF |
Adenine | Sigma | A2786 | |
Insulin | Sigma | I-6634 | |
3,3',5-triiodo-L-thyronine | Sigma | T-6397 | T3 |
Cholera Toxin | Sigma | C-8052 | |
Fibronectin | BD | 354008 | Isolated from human plasma |
apo-Transferrin | Sigma | T-1147 | |
Heparin | Sigma | H3149 | |
Heparan sulfate proteoglycan | Sigma | H4777 | Isolated from basement membrane of mouse Engelbreth-Holm-Swarm tumor |
Collagen IV | Sigma | C5533 | Isolated from human placenta |
Heat-inactivated fetal bovine serum | Invitrogen | 10437-028 | |
D-MEM, powder | Invitrogen | 12800-017 | |
10% formalin–PBS | Fisher Scientific | SF100-4 | |
Bovine type I collagen | Invitrogen | A1064401 | |
Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | MT25-052-CI | |
Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360-070 | |
Gentamicin | Invitrogen | 15750-060 | |
Penicillin/streptomincin | Invitrogen | 15140-122 | |
L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
Hepes | Invitrogen | 15630-080 | |
Ham's F-12 | Invitrogen | 11765-054 | |
Basal Medium Eagle | Invitrogen | 21010-046 | BME |
RPMI-1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
Endothelial Basal Medium | Lonza | CC-3156 | EBM-2 |
Endothelial cell growth supplement | Millipore | 02-102 | ECGS |