एक तीन आयामी (3-डी) के माहौल में बढ़ कोशिकाओं 2-डी वातावरण (जैसे, बोतल या बर्तन) में सेल की खेती पर एक उल्लेखनीय सुधार प्रतिनिधित्व करते हैं। यहाँ हम घूर्णन-दीवार पोत (RWV) बायोरिएक्टर द्वारा प्रदान की microgravity के तहत सुसंस्कृत मानव आंत्र म्यूकोसा के एक बहुकोशिकीय 3-डी organotypic मॉडल के विकास का वर्णन है।
क्योंकि एक तीन आयामी (3-डी) के माहौल में बढ़ कोशिकाओं संभावित कई (जैसे।, बोतल या बर्तन) 2-डी वातावरण में सेल की खेती के अंतराल को पाटने के लिए किया है। वास्तव में, यह व्यापक रूप से मान्यता प्राप्त है कि बोतल या बर्तन में विकसित कोशिकाओं डे के अंतर और ऊतकों, जहां से वे प्राप्त किए गए की विशेष सुविधाओं खो देते हैं। (क) स्थिर मॉडल और (ख) मॉडल का उपयोग कर बायोरिएक्टर: वर्तमान में, वहाँ मुख्य रूप से मूल निवासी बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) नकल उतार जहां कोशिकाओं scaffolds में वरीयता प्राप्त कर रहे 3-डी संस्कृति सिस्टम के दो प्रकार के होते हैं। पहली सफलता स्थिर 3-डी मॉडल था। बायोरिएक्टर का उपयोग कर 3-डी मॉडल ऐसे घूर्णन-दीवार पोत के रूप में (RWV) बायोरिएक्टर में एक और अधिक हाल ही में विकास कर रहे हैं। RWV बायोरिएक्टर की मूल अवधारणा 1990 के दशक में नासा के जॉनसन स्पेस सेंटर में विकसित किया गया था और इस तरह hypoxic, परिगलित कोर के विकास के रूप में स्थिर मॉडल की सीमाओं को पार करने के लिए माना जाता है। RWV बायोरिएक्टर वें दरकिनार हो सकता हैद्रव गतिशीलता है कि पोषक तत्वों और ऑक्सीजन की कुशल प्रसार की अनुमति देने के लिए प्रदान करके समस्या है। ये बायोरिएक्टर एक रोटेटर आधार का समर्थन और कहा कि उनकी वातन स्रोत प्रकार से भिन्न संस्कृति वाहिकाओं के दो विभिन्न स्वरूपों को बारी बारी से करने के लिए कार्य करता है कि से मिलकर बनता है: (1) धीरे टर्निंग पार्श्व वेसल्स (STLVs) केंद्र में एक सह-अक्षीय oxygenator, या (2 ) उच्च पहलू अनुपात वेसल्स (HARVs) ऑक्सीजन के साथ एक फ्लैट, सिलिकॉन रबर गैस हस्तांतरण झिल्ली के माध्यम से। जबकि बुलबुला गठन और फलस्वरूप अशांति से बचने के इन जहाजों कुशल गैस हस्तांतरण की अनुमति है। इन शर्तों लामिना का प्रवाह और कम से कम कतरनी शक्ति है कि मॉडल संस्कृति पोत के अंदर कम हो गुरुत्व (microgravity) में परिणाम। यहाँ हम एक आंतों उपकला सेल लाइन और प्राथमिक मानव लिम्फोसाइट, endothelial कोशिकाओं और fibroblasts microgravity के तहत सुसंस्कृत RWV बायोरिएक्टर द्वारा प्रदान की रचना मानव आंत्र म्यूकोसा के एक बहुकोशिकीय 3-डी organotypic मॉडल के विकास का वर्णन है। </ P>
एक 3-डी मॉडल के निर्माण में पहली सफलता 1980 के दशक के शुरू में बताया गया था जब वैज्ञानिकों अलग (जैसे।, Laminin, कोलेजन प्रकार मैं, कोलेजन चतुर्थ, और fibronectin) पाड़ के प्रकार और वृद्धि कारकों के कॉकटेल में सुधार करने के लिए जांच शुरू कर दिया सेल करने वाली सेल और "स्थिर" 3-डी मॉडल 1-7 से ईसीएम बातचीत। तब से, इन मॉडलों के साथ मुख्य समस्या यह पोषक तत्वों के स्थानांतरण और ऑक्सीजन मध्यम और ऊतक निर्माणों 8 के भीतर में सीमाओं की गई है। इन विवो वातावरण है कि रक्त वाहिकाओं के नेटवर्क के आसपास से पोषक तत्वों की एक सतत प्रवाह और ऑक्सीजन प्राप्त करने में कोशिकाओं के विपरीत, इन मॉडलों के स्थिर प्रकृति की कोशिकाओं के लिए उनमें से प्रभावी वितरण hinders। उदाहरण के लिए, इन विट्रो स्थिर मॉडल में उत्पन्न सेल समुच्चय है कि आकार में कुछ मिलीमीटर से अधिक सदा ही hypoxic, परिगलित कोर 9 का विकास होगा। RWV बायोरिएक्टर इस समस्या को दरकिनार कर सकता हैद्रव गतिशीलता है कि पोषक तत्वों और ऑक्सीजन 10-12 के कुशल प्रसार की अनुमति देने के लिए प्रदान करके। हालांकि, आज तक, RWV बायोरिएक्टर का उपयोग कर काम एक या दो प्रकार की कोशिकाओं 13-17 के शामिल किए जाने के लिए सीमित कर दिया है। इसके अलावा, देशी ऊतकों के समान एक स्थानिक उन्मुखीकरण के बजाय, उन कोशिकाओं सेल समुच्चय का गठन किया। इन सीमाओं के लिए मुख्य कारण एक पाड़ एक एकीकृत फैशन में कोशिकाओं को शामिल करने में सक्षम की कमी की गई है। तिथि करने के लिए RWV बायोरिएक्टर में इस्तेमाल scaffolds मुख्य रूप से सिंथेटिक microbeads, ट्यूबलर सिलेंडरों या छोटे शीट 13-15,19-23 से कुछ अपवादों के साथ 16-18 मिलकर बनता है,। ये कड़ा माल जिसका संरचना और लचीलापन नहीं चालाकी से किया जा सकता है, और करने के लिए जो कोशिकाओं उनकी सतह से जुड़ी हैं। इस प्रकार, यह संभावना नहीं है कि इन मॉडलों, जिसमें मूल्यांकन करने के लिए एक प्रणाली प्रदान करेगा एक एकीकृत फैशन में, इस तरह के stromal कोशिकाओं के रूप में विभिन्न सेल घटकों (जैसे।, Fibroblasts, प्रतिरक्षा और endothelial कोशिकाओं) कि sHould पाड़ के भीतर फैलाया जा बारीकी से मानव ऊतक नकल करने के लिए।
यहाँ हम एक आंतों उपकला सेल लाइन और प्राथमिक मानव लिम्फोसाइट, endothelial कोशिकाओं से बना मानव आंत्र म्यूकोसा के एक बहुकोशिकीय 3-डी organotypic मॉडल के विकास का वर्णन है, और fibroblasts 24। इन कोशिकाओं को सुसंस्कृत microgravity तहत RWV बायोरिएक्टर 13,25-30 द्वारा प्रदान किया गया। हमारे 3-डी मॉडल में, ईसीएम ऐसी संस्कृति के माध्यम से इसी तरह के एक परासरणीयता (जैसे।, संस्कृति दौरान नगण्य diffusional मजबूरी) और क्षमता कोशिकाओं और अन्य प्रासंगिक बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन को शामिल करने के रूप में कई अलग-अलग गुण,, साथ ही पास उचित कठोरता बायोरिएक्टर 24 में इस्तेमाल किया जाएगा। जैविक सिस्टम बहुत जटिल हैं, और पिछले कुछ वर्षों में, वहाँ उन isolatio में अध्ययन करने के बजाय अपने आसपास के साथ सेल बातचीत की परीक्षा की ओर श्लैष्मिक अनुसंधान के ध्यान में एक बदलाव किया गया हैएन। विशेष रूप से, आंतों सेल अस्तित्व और भेदभाव को प्रभावित करने में सेल सेल बातचीत के महत्व को अच्छी तरह से 31-34 प्रलेखित है। विशेष रूप से, उपकला कोशिकाओं और उनके आला बीच संचार उपकला सेल विस्तार और भेदभाव 35 पर गहरा प्रभाव है। वास्तव में, यह व्यापक रूप से स्वीकार किया है कि न केवल सेल करने वाली सेल लेकिन यह भी सेल करने वाली ईसीएम बातचीत 3-डी संस्कृति मॉडल में रखरखाव और उपकला कोशिकाओं के भेदभाव के लिए महत्वपूर्ण हैं। पिछले अध्ययनों में इस तरह के कोलेजन मैं 24,36,37, 38 laminin और fibronectin 39 मूल निवासी म्यूकोसा के समान स्थानिक उन्मुखीकरण के अधिग्रहण की आंतों उपकला कोशिकाओं को प्रभावित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है के रूप में है कि पेट ईसीएम प्रोटीन का प्रदर्शन किया है। इस प्रकार, नई प्रौद्योगिकियों के विकास, हमारे 3-डी मॉडल 24 की तरह है, कि अगर शोधकर्ताओं जटिल सेलुलर और संरचनात्मक वास्तुकला विश्राम करने का इरादा नकल कर सकते हैं पेट के प्ररूपी विविधता की आवश्यकता हैऔर आंत microenvironment के समारोह। इन मॉडलों के विकास और नए मौखिक दवाओं और वैक्सीन उम्मीदवारों के मूल्यांकन में एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रतिनिधित्व करते हैं।
इस पांडुलिपि में, हम प्राथमिक मानव लिम्फोसाइट, fibroblasts, और endothelial कोशिकाओं, साथ ही आंतों उपकला सेल लाइनों 24 सहित कई गुना प्रकार की कोशिकाओं के शामिल मानव आंत्र म्यूकोसा के एक bioengineered मॉडल के विकास का वर्णन ह?…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported, in part, by NIAID, NIH, DHHS federal research grants R01 AI036525 and U19 AI082655 (CCHI) to MBS and by NIH grant DK048373 to AF. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institute of Allergy And Infectious Diseases or the National Institutes of Health.
Quad Rotator/Independent Rotating Wall Vessel (RWV) bioreactor | Synthecon | RCCs-4DQ | For up to 4 vessels. Models with more or less vessels are also available. |
Disposable 50 ml-vessel | Synthecon | D-405 | Box with 4 vessels |
HCT-8 epithelial cells | ATCC | CCL-244 | |
CCD-18Co Fibroblasts | ATCC | CRL-1459 | |
Human Umbilical Vein Endothelial Cells | ATCC | CRL-1730 | HUVEC |
Fibroblast Growth Factor-Basic | Sigma | F0291 | bFGF |
Stem Cell Factor | Sigma | S7901 | SCF |
Hepatocyte Growth Factor | Sigma | H1404 | HGF |
Endothelin 3 | Sigma | E9137 | |
Laminin | Sigma | L2020 | Isolated from mouse Engelbreth-Holm-Swarm tumor |
Vascular Endothelial Growth Factor | Sigma | V7259 | VEGF |
Leukemia Inhibitory Factor | Santa Cruz | sc-4377 | (LIF |
Adenine | Sigma | A2786 | |
Insulin | Sigma | I-6634 | |
3,3',5-triiodo-L-thyronine | Sigma | T-6397 | T3 |
Cholera Toxin | Sigma | C-8052 | |
Fibronectin | BD | 354008 | Isolated from human plasma |
apo-Transferrin | Sigma | T-1147 | |
Heparin | Sigma | H3149 | |
Heparan sulfate proteoglycan | Sigma | H4777 | Isolated from basement membrane of mouse Engelbreth-Holm-Swarm tumor |
Collagen IV | Sigma | C5533 | Isolated from human placenta |
Heat-inactivated fetal bovine serum | Invitrogen | 10437-028 | |
D-MEM, powder | Invitrogen | 12800-017 | |
10% formalin–PBS | Fisher Scientific | SF100-4 | |
Bovine type I collagen | Invitrogen | A1064401 | |
Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | MT25-052-CI | |
Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360-070 | |
Gentamicin | Invitrogen | 15750-060 | |
Penicillin/streptomincin | Invitrogen | 15140-122 | |
L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
Hepes | Invitrogen | 15630-080 | |
Ham's F-12 | Invitrogen | 11765-054 | |
Basal Medium Eagle | Invitrogen | 21010-046 | BME |
RPMI-1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
Endothelial Basal Medium | Lonza | CC-3156 | EBM-2 |
Endothelial cell growth supplement | Millipore | 02-102 | ECGS |