Utvikling av en Flercellede Tredimensjonal organotypiske Model of Human tarmslimhinnen Grown Under Microgravity

Summary

Celler som vokser i en tredimensjonal (3-D) miljø representerer en markert forbedring i forhold til celledyrking i 2-D-miljøer (f.eks flasker eller retter). Her beskriver vi utviklingen av en flercellet 3-D organotypiske modell av det menneskelige tarmslimhinnen dyrket under mikrogravitasjons tilgjengelig ved å dreie-vegg-fartøy (RWV) bioreaktorer.

Abstract

Fordi celler som vokser i en tredimensjonal (3-D) miljø har potensial til å bygge bro mange hull for celledyrking i 2-D-miljøer (f.eks., Kolber eller retter). Faktisk er det allment anerkjent at celler dyrket i kolber eller retter en tendens til å de-differensiere og mister spesialiserte funksjoner av vev fra der de ble hentet. For tiden er det i hovedsak to typer 3D-kultur systemer hvor cellene seeded inn stillaser etterligne de innfødte ekstracellulære matriks (ECM): (a) statiske modeller og (b) modeller som bruker bioreaktorer. Den første gjennombruddet var de statiske 3-D modeller. 3-D modeller som bruker bioreaktorer som roterende-vegg-fartøy (RWV) bioreaktorer er en nyere utvikling. Den opprinnelige konseptet av RWV bioreaktorer ble utviklet ved NASAs Johnson Space Center i begynnelsen av 1990 og antas å overvinne begrensninger av statiske modeller som for eksempel utvikling av hypoksiske, nekrotiske kjerner. De RWV bioreaktorer kan omgå ther problem ved å tilveiebringe fluiddynamikk som tillater effektiv diffusjon av næringsstoffer og oksygen. Disse bioreaktorer består av en rotator base som tjener til å støtte og rotere to forskjellige formater av kultur fartøy som avviker fra deres lufting kildetype: (1) Slow Turning Lateral Vessels (STLVs) med en koaksial oksygenator i sentrum, eller (2 ) Høy sideforhold Vessels (Harvs) med oksygenering via en flat, silikongummi gass overføring membran. Disse fartøyene tillate effektiv gassoverføring samtidig unngå bobledannelse og påfølgende turbulens. Disse betingelsene resulterer i laminær strømning og minimale skjærkraft som modellerer redusert gravitasjon (mikrogravitasjon) på innsiden av kulturen fartøyet. Her beskriver vi utviklingen av en flercellet 3-D organotypiske modell av tarmslimhinnen hos mennesker bestående av en intestinal epitelcellelinje og primære humane lymfocytter, endotelceller og fibroblaster dyrket under mikrogravitasjon levert av RWV bioreaktoren. </ P>

Introduction

Den første gjennombrudd i byggingen av en 3-D-modell ble rapportert i begynnelsen av 1980-tallet da forskere begynt å undersøke forskjellige typer av stillaset (f.eks., Laminin, kollagen type I, kollagen IV, og fibronektin) og cocktail av vekstfaktorer for å forbedre celle-til-celle og ECM interaksjoner av "statisk" 3-D modeller ^1-7. Siden den gang har det største problemet med disse modellene vært begrensninger i overføring av næringsstoffer og oksygen i løpet av de mellomstore og vev konstruerer ^8. I motsetning til celler in in vivo miljø som mottar en jevn strøm av næringsstoffer og oksygen fra omgivende nettverk av blodårer, den statiske natur av disse modellene hindrer effektiv fordeling av dem til cellene. For eksempel vil celleaggregater som genereres i in vitro-modeller statiske som overstiger noen få millimeter i størrelse alltid utvikle hypoksiske, nekrotiske kjerner ^9. De RWV bioreaktorer kan omgå dette problemetved å tilveiebringe fluiddynamikk som tillater effektiv diffusjon av næringsstoffer og oksygen ^10-12. Men til dags dato, arbeid med RWV bioreaktorer har vært begrenset til inkludering av en eller to celletyper ^13-17. Dessuten, i stedet for en romlig orientering som ligner naturlige vev, de celler som dannes celleaggregater. Hovedårsaken til disse begrensningene har vært mangelen på et stillas i stand til å innlemme celler i en integrert måte. Stillasene som brukes i RWV bioreaktorer til dags dato består, med få unntak ^16-18, hovedsakelig av syntetisk mikroperler, rørformede sylindre eller små ark ^13-15,19-23. Disse er stive materialer hvis sammensetning og fleksibilitet kan ikke manipuleres, og til hvilke celler som er festet til sin overflate. Således er det usannsynlig at disse modellene vil tilveiebringe et system for å evaluere, på en integrert måte, de forskjellige cellekomponenter slik som stromale celler (f.eks. Fibroblaster,, immun og endoteliale celler) at should bli spredt innenfor stillas til tett etterligne menneskelig vev.

Her beskriver vi utviklingen av en flercellet 3-D organotypiske modell av tarmslimhinnen hos mennesker bestående av en intestinal epitelcellelinje og primære humane lymfocytter, endotelceller og fibroblaster ^24. Disse cellene ble dyrket i henhold til mikrogravitasjon gir av RWV bioreaktor ^13,25-30. I vår 3-D-modell, besitter ECM mange forskjellige egenskaper, for eksempel en osmolalitet lignende til kulturmediet (f.eks., Neglisjerbare diffusjonelle begrensninger i løpet av kultur), og evnen til å innlemme celler og andre relevante ekstracellulære matriksproteiner, samt passende stivhet til å brukes i bioreaktorer ^24. Biologiske systemer er svært komplekse, og i løpet av de siste årene har det vært et skifte i fokus for slimhinne forskning mot undersøkelse av celle interaksjoner med omgivelsene heller enn å studere dem i isolation. Spesielt er betydningen av celle-celle interaksjoner i å påvirke tarmcelleoverlevelse og differensiering godt dokumentert ^31-34. Nærmere bestemt har kommunikasjonen mellom epitelceller og deres nisje en stor innflytelse på den epiteliale celle ekspansjon og differensiering ^35. Faktisk er det allment akseptert at ikke bare celle-til-celle, men også celle-til-ECM interaksjoner er kritisk for vedlikehold og differensiering av epitelceller i 3-D kultur modeller. Tidligere studier har vist at tarmen ECM-proteiner som kollagen I ^24,36,37, laminin og fibronektin ^{38 39} er medvirkende til å påvirke intestinale epitelceller for å erverve romlig orientering som ligner den native mucosa. Således har utviklingen av nye teknologier, som vår 3-D-modell ^24, som kan etterligne den fenotypiske mangfoldet av tarmen er nødvendig hvis forskere har til hensikt å gjenskape den komplekse cellulære og strukturell arkitekturog funksjon i tarmen mikromiljøet. Disse modellene representerer et viktig verktøy i utvikling og evaluering av nye orale legemidler og vaksinekandidater.

Protocol

Etikk uttalelse: Alle blodprøver ble samlet inn fra frivillige som deltok i protokollnummer HP-00040025-1. The University of Maryland Institutional Review Board godkjent denne protokollen og autorisert innsamling av blodprøver fra friske frivillige for studiene som inngår i dette manuskriptet. Hensikten med denne studien ble forklart til frivillige, og alle frivillige ga informert, undertegnet samtykke før blodprøvetaking. Merk: Se tabell 1 for medium supplement forberedelse. Se tabell …

Representative Results

Vi har tidligere utviklet en flercellet 3-D organotypiske modell av tarmslimhinnen hos mennesker bestående av en intestinal epitelcellelinje og primære humane lymfocytter, endotelceller og fibroblaster dyrket under betingelser mikrogravitasjon 24 (figur 1). Fibroblaster og endotelceller ble innleiret i en kollagen I matrix beriket med ytterligere gut basalmembran-proteiner 45 (f.eks., Laminin, kollagen IV, fibronektin og heparinsulf…

Discussion

I dette manuskriptet, beskriver vi utviklingen av en bioengineered modell av det menneskelige tarmslimhinnen består av multiple celletyper, inkludert primære, humane lymfocytter, fibroblaster og endotelceller, samt intestinale epitel-cellelinjer ^24. I denne 3-D-modell, blir cellene dyrket i et kollagenrikt ekstracellulær matriks i henhold til mikrogravitasjon betingelser ^24.

Som beskrevet tidligere, de viktigste trekk ved denne modellen er: (i) evnen…

Materials

Quad Rotator/Independent Rotating Wall Vessel (RWV) bioreactor	Synthecon	RCCs-4DQ	For up to 4 vessels. Models with more or less vessels are also available.
Disposable 50 ml-vessel	Synthecon	D-405	Box with 4 vessels
HCT-8 epithelial cells	ATCC	CCL-244
CCD-18Co Fibroblasts	ATCC	CRL-1459
Human Umbilical Vein Endothelial Cells	ATCC	CRL-1730	HUVEC
Fibroblast Growth Factor-Basic	Sigma	F0291	bFGF
Stem Cell Factor	Sigma	S7901	SCF
Hepatocyte Growth Factor	Sigma	H1404	HGF
Endothelin 3	Sigma	E9137
Laminin	Sigma	L2020	Isolated from mouse Engelbreth-Holm-Swarm tumor
Vascular Endothelial Growth Factor	Sigma	V7259	VEGF
Leukemia Inhibitory Factor	Santa Cruz	sc-4377	(LIF
Adenine	Sigma	A2786
Insulin	Sigma	I-6634
3,3',5-triiodo-L-thyronine	Sigma	T-6397	T3
Cholera Toxin	Sigma	C-8052
Fibronectin	BD	354008	Isolated from human plasma
apo-Transferrin	Sigma	T-1147
Heparin	Sigma	H3149
Heparan sulfate  proteoglycan	Sigma	H4777	Isolated from basement membrane of mouse  Engelbreth-Holm-Swarm tumor
Collagen IV	Sigma	C5533	Isolated from human placenta
Heat-inactivated fetal bovine serum	Invitrogen	10437-028
D-MEM, powder	Invitrogen	12800-017
10% formalin–PBS	Fisher Scientific	SF100-4
Bovine type I collagen	Invitrogen	A1064401
Trypsin-EDTA	Fisher Scientific	MT25-052-CI
Sodium pyruvate	Invitrogen	11360-070
Gentamicin	Invitrogen	15750-060
Penicillin/streptomincin	Invitrogen	15140-122
L-Glutamine	Invitrogen	25030-081
Hepes	Invitrogen	15630-080
Ham's F-12	Invitrogen	11765-054
Basal Medium Eagle	Invitrogen	21010-046	BME
RPMI-1640	Invitrogen	11875-093
Endothelial Basal Medium	Lonza	CC-3156	EBM-2
Endothelial cell growth supplement	Millipore	02-102	ECGS