Summary

Desenvolvimento de um modelo organotípicas multicelular tridimensional da Mucosa Intestinal Humano cultivadas sob microgravidade

Published: July 25, 2016
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Summary

As células que crescem num ambiente tridimensional (3-D) representam uma melhoria significativa sobre o cultivo de células em ambientes 2-D (por exemplo, frascos ou pratos). Aqui nós descrevemos o desenvolvimento de um modelo organot�ica 3-D multicelular da mucosa intestinal humana cultivadas sob microgravidade fornecida pela rotação da parede dos vasos biorreatores (RWV).

Abstract

Como as células que crescem em um ambiente tridimensional (3-D) têm o potencial para preencher muitas lacunas de cultivo celular em ambientes 2-D (ex., Frascos ou pratos). Na verdade, é amplamente reconhecido que as células crescidas em frascos ou pratos tendem a des-diferenciar-se e perder características especializadas dos tecidos a partir dos quais eles foram obtidos. Actualmente, existem essencialmente dois tipos de sistemas de cultura de 3-D, onde as células são semeadas em andaimes que imitam a matriz extracelular nativa (ECM): (a) modelos estáticos e modelos (b) utilizando biorreactores. O primeiro avanço foi a modelos estáticos em 3-D. modelos 3-D usando biorreatores como a parede do vaso rotativo (RWV) biorreatores são um desenvolvimento mais recente. O conceito original dos biorreatores RWV foi desenvolvido no Centro Espacial Johnson da NASA no início de 1990 e é acreditado para superar as limitações dos modelos estáticos, tais como o desenvolvimento de hipóxia, núcleos necróticos. Os biorreatores RWV pode contornar thé problema proporcionando dinâmica dos fluidos, que permitem a difusão eficiente de nutrientes e de oxigénio. Estes biorreatores consistem em uma base rotador que serve para apoiar e girar dois formatos diferentes de recipientes de cultura que diferem pelo seu tipo de fonte de aeração: (1) lenta ficar vasos laterais (STLVs) com um oxigenador de co-axial no centro, ou (2 ) Os navios de elevado coeficiente (HARVs) com oxigenação através de uma membrana de transferência de gás de borracha de silicone plana. Estes navios permitir a transferência de gás eficiente, evitando a formação de bolhas e consequente turbulência. Estas condições resultam em fluxo laminar e força de cisalhamento mínima que os modelos reduzida gravidade (microgravidade) no interior do recipiente de cultura. Aqui, descrevemos o desenvolvimento de um modelo organotípico 3-D multicelular da mucosa intestinal humana composta por uma linha de célula epitelial intestinal e linfócitos humanos primários, células endoteliais e fibroblastos cultivados sob microgravidade fornecida por o bioreactor RWV. </ P>

Introduction

O primeiro avanço na construção de um modelo 3-D foi relatado no início de 1980, quando os cientistas começaram a investigar diferentes tipos de andaime (por exemplo., Laminina, colágeno tipo I, colágeno IV e fibronectina) e cocktails de fatores de crescimento para melhorar célula-célula e interacções ECM de modelos 3-D "estáticos" 1-7. Desde então, o problema principal com estes modelos tem sido limitações na transferência de nutrientes e de oxigénio dentro das construções de médio e de tecido 8. Em contraste com as células no ambiente in vivo que recebe um fluxo constante de nutrientes e de oxigénio a partir de redes em torno dos vasos sanguíneos, a natureza estática destes modelos dificulta a distribuição eficaz deles para as células. Por exemplo, os agregados celulares gerados em modelos in vitro estáticos que excedem alguns milímetros de tamanho irá invariavelmente desenvolver hipóxicas, centros necróticos 9. Os biorreatores RWV pode contornar este problemafornecendo a dinâmica dos fluidos, que permitem a difusão eficiente de nutrientes e oxigénio 10-12. No entanto, até à data, os trabalhos utilizando biorreactores RWV têm sido limitados à inclusão de um ou dois tipos de células 13-17. Além disso, em vez de uma orientação espacial semelhante a tecidos nativos, as células formaram agregados celulares. A principal razão para estas limitações tem sido a falta de uma estrutura de suporte capaz de incorporar células de uma forma integrada. Os andaimes utilizados nos biorreatores RWV até à data consistem, com poucas exceções 16-18, principalmente de microesferas sintéticas, cilindros tubulares ou pequenas folhas 13-15,19-23. Estes são materiais rígidos e cuja composição de flexibilidade não pode ser manipulado, e para a qual as células são ligadas à sua superfície. Assim, é improvável que estes modelos irá proporcionar um sistema no qual a avaliar, de uma forma integrada, os vários componentes celulares, tais como células do estroma (por ex., F ibroblastos, células do sistema imunológico e endoteliais) que should ser disperso dentro do andaime para imitar de perto o tecido humano.

Aqui, descrevemos o desenvolvimento de um modelo organotípico 3-D multicelular da mucosa intestinal humana composta por uma linha de célula epitelial intestinal e linfócitos humanos primários, células endoteliais, fibroblastos e 24. Estas células foram cultivadas sob microgravidade fornecer pelo biorreator RWV 13,25-30. No nosso modelo 3-D, o ECM possui muitas propriedades distintas, tais como uma osmolalidade semelhante ao meio de cultura (por ex., Sistemas de retenção de difusão insignificante durante a cultura) e a capacidade de incorporar células e outras proteínas da matriz extracelular relevantes, bem como a rigidez adequada para ser utilizada em biorreactores de 24. Os sistemas biológicos são muito complexos, e ao longo dos últimos anos, tem havido uma mudança no foco da pesquisa da mucosa para o exame de interacções de células com o meio envolvente, em vez de estudá-los no isolation. Em particular, a importância das interacções célula-célula em influenciar a sobrevivência das células do intestino e a diferenciação está bem documentada 31-34. Especificamente, a comunicação entre as células epiteliais e os seus nicho tem uma profunda influência sobre a expansão de células epiteliais e diferenciação 35. Com efeito, é amplamente aceite que não só a célula-célula mas também as interacções célula-ECM são essenciais para a manutenção e diferenciação de células epiteliais em modelos de cultura de 3-D. Estudos anteriores demonstraram que as proteínas de ECM intestino, tais como colagénio I 24,36,37, laminina e fibronectina 38 39 são instrumentais em influenciar células epiteliais intestinais para adquirir orientação espacial semelhante à mucosa nativa. Assim, o desenvolvimento de novas tecnologias, como o nosso modelo 3-D 24, que pode imitar a diversidade é necessária fenotípica do intestino se pesquisadores pretendem recriar a arquitectura celular e estrutural complexoe função do microambiente intestinal. Esses modelos representam uma ferramenta importante no desenvolvimento e avaliação de novos medicamentos orais e vacinas candidatas.

Protocol

Declaração de ética: Todas as amostras de sangue foram coletadas de voluntários que participaram no número de protocolo HP-00040025-1. A Universidade de Maryland Institutional Review Board aprovou este protocolo e autorizou a coleta de amostras de sangue de voluntários saudáveis ​​para os estudos incluídos neste manuscrito. O objetivo deste estudo foi explicado aos voluntários, e todos os voluntários deram informados, assinaram termo de consentimento antes da coleta de sangue. Nota: Veja a Tabe…

Representative Results

Anteriormente temos manipulado um modelo organotípico 3-D multicelular da mucosa intestinal humana composta por uma linha de célula epitelial intestinal e linfócitos humanos primários, células endoteliais e fibroblastos cultivados sob condições de microgravidade 24 (Figura 1). Os fibroblastos e as células endoteliais foram embebidos numa matriz de colagénio I enriquecido com proteínas de membrana basal intestino adicional 45 (ist…

Discussion

Neste artigo, descreve-se o desenvolvimento de um modelo de bioengenharia da mucosa intestinal humana composta de múltiplos tipos de células incluindo linfócitos primários humanos, fibroblastos e células endoteliais, bem como linhas de células epiteliais intestinais 24. Neste modelo 3-D, as células são cultivadas numa matriz extracelular rica em colagénio em condições de microgravidade 24.

Como descrito anteriormente, as principais características deste mode…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported, in part, by NIAID, NIH, DHHS federal research grants R01 AI036525 and U19 AI082655 (CCHI) to MBS and by NIH grant DK048373 to AF. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institute of Allergy And Infectious Diseases or the National Institutes of Health.

Materials

Quad Rotator/Independent Rotating Wall Vessel (RWV) bioreactor  Synthecon RCCs-4DQ For up to 4 vessels. Models with more or less vessels are also available.
Disposable 50 ml-vessel Synthecon D-405 Box with 4 vessels
HCT-8 epithelial cells  ATCC CCL-244
CCD-18Co Fibroblasts  ATCC CRL-1459
Human Umbilical Vein Endothelial Cells ATCC CRL-1730 HUVEC
Fibroblast Growth Factor-Basic  Sigma F0291 bFGF
Stem Cell Factor  Sigma S7901 SCF
Hepatocyte Growth Factor  Sigma H1404 HGF
Endothelin 3 Sigma E9137
Laminin Sigma L2020 Isolated from mouse Engelbreth-Holm-Swarm tumor
Vascular Endothelial Growth Factor  Sigma V7259 VEGF
Leukemia Inhibitory Factor  Santa Cruz sc-4377 (LIF
Adenine Sigma A2786
Insulin Sigma I-6634
3,3',5-triiodo-L-thyronine  Sigma T-6397 T3
Cholera Toxin Sigma C-8052
Fibronectin BD 354008 Isolated from human plasma
apo-Transferrin Sigma T-1147
Heparin Sigma H3149
Heparan sulfate  proteoglycan Sigma H4777 Isolated from basement membrane of mouse  Engelbreth-Holm-Swarm tumor
Collagen IV Sigma C5533 Isolated from human placenta
Heat-inactivated fetal bovine serum  Invitrogen 10437-028
D-MEM, powder Invitrogen 12800-017
10% formalin–PBS  Fisher Scientific SF100-4
Bovine type I collagen  Invitrogen A1064401
Trypsin-EDTA  Fisher Scientific MT25-052-CI
Sodium pyruvate Invitrogen 11360-070
Gentamicin  Invitrogen 15750-060
Penicillin/streptomincin  Invitrogen 15140-122
L-Glutamine Invitrogen 25030-081
Hepes Invitrogen 15630-080
Ham's F-12 Invitrogen 11765-054
Basal Medium Eagle Invitrogen 21010-046 BME
RPMI-1640 Invitrogen 11875-093
Endothelial Basal Medium Lonza CC-3156 EBM-2
Endothelial cell growth supplement Millipore 02-102 ECGS

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Salerno-Goncalves, R., Fasano, A., Sztein, M. B. Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity. J. Vis. Exp. (113), e54148, doi:10.3791/54148 (2016).

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