Desenvolvimento de um modelo organotípicas multicelular tridimensional da Mucosa Intestinal Humano cultivadas sob microgravidade

Summary

As células que crescem num ambiente tridimensional (3-D) representam uma melhoria significativa sobre o cultivo de células em ambientes 2-D (por exemplo, frascos ou pratos). Aqui nós descrevemos o desenvolvimento de um modelo organot�ica 3-D multicelular da mucosa intestinal humana cultivadas sob microgravidade fornecida pela rotação da parede dos vasos biorreatores (RWV).

Abstract

Como as células que crescem em um ambiente tridimensional (3-D) têm o potencial para preencher muitas lacunas de cultivo celular em ambientes 2-D (ex., Frascos ou pratos). Na verdade, é amplamente reconhecido que as células crescidas em frascos ou pratos tendem a des-diferenciar-se e perder características especializadas dos tecidos a partir dos quais eles foram obtidos. Actualmente, existem essencialmente dois tipos de sistemas de cultura de 3-D, onde as células são semeadas em andaimes que imitam a matriz extracelular nativa (ECM): (a) modelos estáticos e modelos (b) utilizando biorreactores. O primeiro avanço foi a modelos estáticos em 3-D. modelos 3-D usando biorreatores como a parede do vaso rotativo (RWV) biorreatores são um desenvolvimento mais recente. O conceito original dos biorreatores RWV foi desenvolvido no Centro Espacial Johnson da NASA no início de 1990 e é acreditado para superar as limitações dos modelos estáticos, tais como o desenvolvimento de hipóxia, núcleos necróticos. Os biorreatores RWV pode contornar thé problema proporcionando dinâmica dos fluidos, que permitem a difusão eficiente de nutrientes e de oxigénio. Estes biorreatores consistem em uma base rotador que serve para apoiar e girar dois formatos diferentes de recipientes de cultura que diferem pelo seu tipo de fonte de aeração: (1) lenta ficar vasos laterais (STLVs) com um oxigenador de co-axial no centro, ou (2 ) Os navios de elevado coeficiente (HARVs) com oxigenação através de uma membrana de transferência de gás de borracha de silicone plana. Estes navios permitir a transferência de gás eficiente, evitando a formação de bolhas e consequente turbulência. Estas condições resultam em fluxo laminar e força de cisalhamento mínima que os modelos reduzida gravidade (microgravidade) no interior do recipiente de cultura. Aqui, descrevemos o desenvolvimento de um modelo organotípico 3-D multicelular da mucosa intestinal humana composta por uma linha de célula epitelial intestinal e linfócitos humanos primários, células endoteliais e fibroblastos cultivados sob microgravidade fornecida por o bioreactor RWV. </ P>

Introduction

O primeiro avanço na construção de um modelo 3-D foi relatado no início de 1980, quando os cientistas começaram a investigar diferentes tipos de andaime (por exemplo., Laminina, colágeno tipo I, colágeno IV e fibronectina) e cocktails de fatores de crescimento para melhorar célula-célula e interacções ECM de modelos 3-D "estáticos" ^1-7. Desde então, o problema principal com estes modelos tem sido limitações na transferência de nutrientes e de oxigénio dentro das construções de médio e de tecido ^8. Em contraste com as células no ambiente in vivo que recebe um fluxo constante de nutrientes e de oxigénio a partir de redes em torno dos vasos sanguíneos, a natureza estática destes modelos dificulta a distribuição eficaz deles para as células. Por exemplo, os agregados celulares gerados em modelos in vitro estáticos que excedem alguns milímetros de tamanho irá invariavelmente desenvolver hipóxicas, centros necróticos ^9. Os biorreatores RWV pode contornar este problemafornecendo a dinâmica dos fluidos, que permitem a difusão eficiente de nutrientes e oxigénio ^10-12. No entanto, até à data, os trabalhos utilizando biorreactores RWV têm sido limitados à inclusão de um ou dois tipos de células ^13-17. Além disso, em vez de uma orientação espacial semelhante a tecidos nativos, as células formaram agregados celulares. A principal razão para estas limitações tem sido a falta de uma estrutura de suporte capaz de incorporar células de uma forma integrada. Os andaimes utilizados nos biorreatores RWV até à data consistem, com poucas exceções ^16-18, principalmente de microesferas sintéticas, cilindros tubulares ou pequenas folhas ^13-15,19-23. Estes são materiais rígidos e cuja composição de flexibilidade não pode ser manipulado, e para a qual as células são ligadas à sua superfície. Assim, é improvável que estes modelos irá proporcionar um sistema no qual a avaliar, de uma forma integrada, os vários componentes celulares, tais como células do estroma (por ex., F ibroblastos, células do sistema imunológico e endoteliais) que should ser disperso dentro do andaime para imitar de perto o tecido humano.

Aqui, descrevemos o desenvolvimento de um modelo organotípico 3-D multicelular da mucosa intestinal humana composta por uma linha de célula epitelial intestinal e linfócitos humanos primários, células endoteliais, fibroblastos e ^24. Estas células foram cultivadas sob microgravidade fornecer pelo biorreator RWV ^13,25-30. No nosso modelo 3-D, o ECM possui muitas propriedades distintas, tais como uma osmolalidade semelhante ao meio de cultura (por ex., Sistemas de retenção de difusão insignificante durante a cultura) e a capacidade de incorporar células e outras proteínas da matriz extracelular relevantes, bem como a rigidez adequada para ser utilizada em biorreactores de ^24. Os sistemas biológicos são muito complexos, e ao longo dos últimos anos, tem havido uma mudança no foco da pesquisa da mucosa para o exame de interacções de células com o meio envolvente, em vez de estudá-los no isolation. Em particular, a importância das interacções célula-célula em influenciar a sobrevivência das células do intestino e a diferenciação está bem documentada ^31-34. Especificamente, a comunicação entre as células epiteliais e os seus nicho tem uma profunda influência sobre a expansão de células epiteliais e diferenciação ^35. Com efeito, é amplamente aceite que não só a célula-célula mas também as interacções célula-ECM são essenciais para a manutenção e diferenciação de células epiteliais em modelos de cultura de 3-D. Estudos anteriores demonstraram que as proteínas de ECM intestino, tais como colagénio I ^24,36,37, laminina e fibronectina ^{38 39} são instrumentais em influenciar células epiteliais intestinais para adquirir orientação espacial semelhante à mucosa nativa. Assim, o desenvolvimento de novas tecnologias, como o nosso modelo 3-D ^24, que pode imitar a diversidade é necessária fenotípica do intestino se pesquisadores pretendem recriar a arquitectura celular e estrutural complexoe função do microambiente intestinal. Esses modelos representam uma ferramenta importante no desenvolvimento e avaliação de novos medicamentos orais e vacinas candidatas.

Protocol

Declaração de ética: Todas as amostras de sangue foram coletadas de voluntários que participaram no número de protocolo HP-00040025-1. A Universidade de Maryland Institutional Review Board aprovou este protocolo e autorizou a coleta de amostras de sangue de voluntários saudáveis ​​para os estudos incluídos neste manuscrito. O objetivo deste estudo foi explicado aos voluntários, e todos os voluntários deram informados, assinaram termo de consentimento antes da coleta de sangue. Nota: Veja a Tabe…

Representative Results

Anteriormente temos manipulado um modelo organotípico 3-D multicelular da mucosa intestinal humana composta por uma linha de célula epitelial intestinal e linfócitos humanos primários, células endoteliais e fibroblastos cultivados sob condições de microgravidade 24 (Figura 1). Os fibroblastos e as células endoteliais foram embebidos numa matriz de colagénio I enriquecido com proteínas de membrana basal intestino adicional 45 (ist…

Discussion

Neste artigo, descreve-se o desenvolvimento de um modelo de bioengenharia da mucosa intestinal humana composta de múltiplos tipos de células incluindo linfócitos primários humanos, fibroblastos e células endoteliais, bem como linhas de células epiteliais intestinais ^24. Neste modelo 3-D, as células são cultivadas numa matriz extracelular rica em colagénio em condições de microgravidade ^24.

Como descrito anteriormente, as principais características deste mode…

Materials

Quad Rotator/Independent Rotating Wall Vessel (RWV) bioreactor	Synthecon	RCCs-4DQ	For up to 4 vessels. Models with more or less vessels are also available.
Disposable 50 ml-vessel	Synthecon	D-405	Box with 4 vessels
HCT-8 epithelial cells	ATCC	CCL-244
CCD-18Co Fibroblasts	ATCC	CRL-1459
Human Umbilical Vein Endothelial Cells	ATCC	CRL-1730	HUVEC
Fibroblast Growth Factor-Basic	Sigma	F0291	bFGF
Stem Cell Factor	Sigma	S7901	SCF
Hepatocyte Growth Factor	Sigma	H1404	HGF
Endothelin 3	Sigma	E9137
Laminin	Sigma	L2020	Isolated from mouse Engelbreth-Holm-Swarm tumor
Vascular Endothelial Growth Factor	Sigma	V7259	VEGF
Leukemia Inhibitory Factor	Santa Cruz	sc-4377	(LIF
Adenine	Sigma	A2786
Insulin	Sigma	I-6634
3,3',5-triiodo-L-thyronine	Sigma	T-6397	T3
Cholera Toxin	Sigma	C-8052
Fibronectin	BD	354008	Isolated from human plasma
apo-Transferrin	Sigma	T-1147
Heparin	Sigma	H3149
Heparan sulfate  proteoglycan	Sigma	H4777	Isolated from basement membrane of mouse  Engelbreth-Holm-Swarm tumor
Collagen IV	Sigma	C5533	Isolated from human placenta
Heat-inactivated fetal bovine serum	Invitrogen	10437-028
D-MEM, powder	Invitrogen	12800-017
10% formalin–PBS	Fisher Scientific	SF100-4
Bovine type I collagen	Invitrogen	A1064401
Trypsin-EDTA	Fisher Scientific	MT25-052-CI
Sodium pyruvate	Invitrogen	11360-070
Gentamicin	Invitrogen	15750-060
Penicillin/streptomincin	Invitrogen	15140-122
L-Glutamine	Invitrogen	25030-081
Hepes	Invitrogen	15630-080
Ham's F-12	Invitrogen	11765-054
Basal Medium Eagle	Invitrogen	21010-046	BME
RPMI-1640	Invitrogen	11875-093
Endothelial Basal Medium	Lonza	CC-3156	EBM-2
Endothelial cell growth supplement	Millipore	02-102	ECGS