Las células que crecen en un entorno tridimensional (3-D) representan una mejora marcada sobre el cultivo de células en entornos 2-D (por ejemplo, frascos o platos). Aquí se describe el desarrollo de un modelo organotípico 3-D multicelular de la mucosa intestinal humana cultivadas en microgravedad proporcionada por la rotación de la pared de los vasos biorreactores (RWV).
Dado que las células que crecen en un entorno tridimensional (3-D) tienen el potencial de salvar muchas lagunas de cultivo celular en ambientes 2-D (por ejemplo., Frascos o platos). De hecho, se reconoce ampliamente que las células cultivadas en frascos o platos tienden a DE-diferenciarse y perder características especializadas de los tejidos de los que se derivaron. Actualmente, existen principalmente dos tipos de sistemas de cultivo de 3-D, donde las células se sembraron en andamios que imitan la matriz nativa extracelular (ECM): (a) modelos estáticos y modelos (b) utilizando biorreactores. El primer gran avance fueron los modelos estáticos en 3-D. modelos en 3-D utilizando biorreactores como la pared de los vasos giratorio (RWV) biorreactores son un desarrollo más reciente. El concepto original de los biorreactores RWV fue desarrollado en el Centro Espacial Johnson de la NASA en la década de 1990 y se cree que superar las limitaciones de los modelos estáticos, tales como el desarrollo de hipoxia, núcleos necróticos. Los biorreactores RWV podrían eludir THes problema proporcionando la dinámica de fluidos que permiten la difusión eficiente de los nutrientes y el oxígeno. Estos biorreactores constan de una base rotador que sirve para soportar y rotar dos formatos diferentes de recipientes de cultivo que se diferencian por su tipo de fuente de aireación: (1) Slow giro Los buques laterales (STLVs) con un oxigenador de co-axial en el centro, o (2 ) Los buques de alta Relación de aspecto (HARVs) con la oxigenación a través de una membrana de transferencia de gas de caucho de silicona plana. Estos recipientes permiten la transferencia de gas eficiente, evitando la formación de burbujas y la consiguiente turbulencia. Estas condiciones resultan en el flujo laminar y la fuerza de corte mínima que los modelos de gravedad reducida (microgravedad) en el interior del recipiente de cultivo. Aquí se describe el desarrollo de un modelo organotípico 3-D multicelular de la mucosa intestinal humana compuesta de una línea de células epiteliales intestinal y linfocitos humanos primarios, células endoteliales y fibroblastos cultivadas en microgravedad proporcionada por el biorreactor RWV. </ P>
El primer gran avance en la construcción de un modelo 3-D se informó a principios de la década de 1980 cuando los científicos empezaron a investigar los diferentes tipos de andamio (por ejemplo., Laminina, colágeno tipo I, colágeno IV y fibronectina) y cócteles de factores de crecimiento para mejorar célula a célula y ECM interacciones de modelos en 3-D "estáticos" 1-7. Desde entonces, el principal problema de estos modelos ha sido limitaciones en la transferencia de nutrientes y oxígeno dentro de las construcciones medianas y tejidos 8. En contraste con las células en el entorno in vivo que recibe un flujo constante de nutrientes y el oxígeno de los alrededores de las redes de los vasos sanguíneos, la naturaleza estática de estos modelos dificulta la distribución efectiva de ellos a las células. Por ejemplo, los agregados de células generadas en modelos estáticos in vitro que superan unos pocos milímetros de tamaño invariablemente desarrollar hipoxia, 9 núcleos necróticos. Los biorreactores RWV podrían eludir este problemaproporcionando la dinámica de fluidos que permiten la difusión eficiente de los nutrientes y 10-12 oxígeno. Sin embargo, hasta la fecha, el trabajo usando biorreactores RWV se han limitado a la inclusión de uno o dos tipos de células 13-17. Además, en lugar de una orientación espacial similar a tejidos nativos, las células forman agregados celulares. La razón principal de estas limitaciones ha sido la falta de un andamio capaz de incorporar las células de una manera integrada. Los andamios utilizados en los biorreactores RWV hasta la fecha consisten, con pocas excepciones, 16-18, sobre todo de microperlas sintéticas, cilindros tubulares o pequeñas hojas 13-15,19-23. Estos son materiales rígidos cuya composición y de flexibilidad no puede ser manipulado, y para el cual las células están unidas a su superficie. Por lo tanto, es poco probable que estos modelos proporcionar un sistema en el que evaluar, de una manera integrada, los diversos componentes celulares tales como las células del estroma (por ejemplo., Fibroblastos, células inmunes y endoteliales) que should dispersarse dentro del andamiaje para imitar el tejido humano.
Aquí se describe el desarrollo de un modelo organotípico 3-D multicelular de la mucosa intestinal humana compuesta de una línea de células epiteliales intestinal y linfocitos humanos primarios, células endoteliales, fibroblastos y 24. Estas células se cultivaron en condiciones de microgravedad proporcionar por el biorreactor RWV 13,25-30. En nuestro modelo de 3-D, el ECM posee muchas propiedades distintas, tales como una osmolalidad similar al medio de cultivo (por ejemplo., Las restricciones de difusión despreciables durante el cultivo) y la capacidad de incorporar las células y otras proteínas de la matriz extracelular pertinentes, así como la rigidez apropiado para ser utilizado en los biorreactores de 24. Los sistemas biológicos son muy complejas, y en los últimos años, ha habido un cambio en el foco de la investigación de la mucosa hacia el examen de las interacciones de las células con su entorno en lugar de estudiar en isolationorte. En particular, la importancia de las interacciones célula-célula para influir en la supervivencia celular y la diferenciación intestinal está bien documentada 31-34. En concreto, la comunicación entre las células epiteliales y su nicho tiene una profunda influencia en la expansión de las células epiteliales y la diferenciación 35. De hecho, es ampliamente aceptado que no sólo de célula a célula, pero también las interacciones célula-ECM son críticos para el mantenimiento y la diferenciación de las células epiteliales en modelos de cultivo de 3-D. Estudios previos han demostrado que las proteínas ECM intestino tales como el colágeno I 24,36,37, laminina y fibronectina 38 39 son instrumentales para influir en las células epiteliales intestinales para adquirir la orientación espacial similar a la mucosa nativo. Por lo tanto, el desarrollo de nuevas tecnologías, como nuestro modelo en 3-D 24, que puede imitar es necesaria la diversidad fenotípica del intestino si los investigadores tienen la intención de recrear la arquitectura celular y estructural complejay la función del microambiente intestino. Estos modelos representan una herramienta importante en el desarrollo y evaluación de nuevos fármacos orales y candidatos vacunales.
En este manuscrito, se describe el desarrollo de un modelo de bioingeniería de la mucosa intestinal humana compuesta de tipos de células incluyendo linfocitos múltiplos primarios humanos, fibroblastos y células endoteliales, así como líneas de células epiteliales intestinales 24. En este modelo 3-D, las células se cultivaron dentro de una matriz extracelular rica en colágeno en condiciones de microgravedad 24.
Como se ha descrito anteriormente, las característ…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported, in part, by NIAID, NIH, DHHS federal research grants R01 AI036525 and U19 AI082655 (CCHI) to MBS and by NIH grant DK048373 to AF. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institute of Allergy And Infectious Diseases or the National Institutes of Health.
Quad Rotator/Independent Rotating Wall Vessel (RWV) bioreactor | Synthecon | RCCs-4DQ | For up to 4 vessels. Models with more or less vessels are also available. |
Disposable 50 ml-vessel | Synthecon | D-405 | Box with 4 vessels |
HCT-8 epithelial cells | ATCC | CCL-244 | |
CCD-18Co Fibroblasts | ATCC | CRL-1459 | |
Human Umbilical Vein Endothelial Cells | ATCC | CRL-1730 | HUVEC |
Fibroblast Growth Factor-Basic | Sigma | F0291 | bFGF |
Stem Cell Factor | Sigma | S7901 | SCF |
Hepatocyte Growth Factor | Sigma | H1404 | HGF |
Endothelin 3 | Sigma | E9137 | |
Laminin | Sigma | L2020 | Isolated from mouse Engelbreth-Holm-Swarm tumor |
Vascular Endothelial Growth Factor | Sigma | V7259 | VEGF |
Leukemia Inhibitory Factor | Santa Cruz | sc-4377 | (LIF |
Adenine | Sigma | A2786 | |
Insulin | Sigma | I-6634 | |
3,3',5-triiodo-L-thyronine | Sigma | T-6397 | T3 |
Cholera Toxin | Sigma | C-8052 | |
Fibronectin | BD | 354008 | Isolated from human plasma |
apo-Transferrin | Sigma | T-1147 | |
Heparin | Sigma | H3149 | |
Heparan sulfate proteoglycan | Sigma | H4777 | Isolated from basement membrane of mouse Engelbreth-Holm-Swarm tumor |
Collagen IV | Sigma | C5533 | Isolated from human placenta |
Heat-inactivated fetal bovine serum | Invitrogen | 10437-028 | |
D-MEM, powder | Invitrogen | 12800-017 | |
10% formalin–PBS | Fisher Scientific | SF100-4 | |
Bovine type I collagen | Invitrogen | A1064401 | |
Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | MT25-052-CI | |
Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360-070 | |
Gentamicin | Invitrogen | 15750-060 | |
Penicillin/streptomincin | Invitrogen | 15140-122 | |
L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
Hepes | Invitrogen | 15630-080 | |
Ham's F-12 | Invitrogen | 11765-054 | |
Basal Medium Eagle | Invitrogen | 21010-046 | BME |
RPMI-1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
Endothelial Basal Medium | Lonza | CC-3156 | EBM-2 |
Endothelial cell growth supplement | Millipore | 02-102 | ECGS |