Hematopoietic स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं (HSPC) के विकास के दौरान विशेष (hemogenic) endothelial कोशिकाओं से निकाले जाते हैं, फिर भी थोड़ा प्रक्रिया है जिसके द्वारा कुछ endothelial कोशिकाओं को रक्त बनाने बनने के लिए निर्दिष्ट के बारे में जाना जाता है। हम एक प्रवाह cytometry आधारित पद्धति hemogenic endothelial कोशिकाओं और murine भ्रूण ऊतकों से HSPC के एक साथ अलगाव की इजाजत दी प्रदर्शित करता है।
भ्रूण संवहनी endothelium से hemogenic endothelial कोशिकाओं के विनिर्देश अलग ऊतकों के भीतर संक्षिप्त विकासात्मक अवधि के दौरान होता है, और murine अतिरिक्त भ्रूण जर्दी थैली, नाल, नाल वाहिकाओं, और भ्रूण महाधमनी-gonad-मेसोनेफ्रॉस से निश्चित HSPC के उद्भव के लिए आवश्यक है ( एजीएम) क्षेत्र। क्षणिक प्रकृति और इस सेल की आबादी के छोटे आकार सावधान मात्रा का ठहराव और प्रयोगात्मक अनुप्रयोगों के लिए अपनी प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य अलगाव तकनीकी रूप से कठिन बना देता है। हम जर्दी थैली और एजीएम में अपने चरम पीढ़ी समय के दौरान एक प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई hemogenic endothelial कोशिकाओं और HSPC के एक साथ अलगाव के लिए (FACS) आधारित प्रोटोकॉल की स्थापना की है। हम जर्दी थैली और माउस भ्रूण से एजीएम ऊतकों के विच्छेदन के लिए तरीकों का प्रदर्शन, और हम FACS के माध्यम से पहचान और पुनः प्राप्ति से पहले अधिक से अधिक सेल अस्तित्व के लिए अनुकूलित ऊतक पाचन विकार और एंटीबॉडी की स्थिति प्रस्तुत करते हैं। प्रतिनिधि FACS एनासेल भूखंडों कि hemogenic endothelial सेल और HSPC phenotypes की पहचान है, और एक प्रतिरूप स्तर पर उनके रक्त के गठन के संभावित मूल्यांकन के लिए एक methylcellulose आधारित परख का वर्णन दिखाए जाते हैं।
एक कार्यात्मक संचार प्रणाली रक्त वाहिकाओं और रक्त कोशिकाओं के समानांतर विकास की आवश्यकता है। खून विकास (आदिम hematopoiesis) के शुरुआती दौर में erythroblasts के मूल सख्ती 1 बहस रहता है। इसके विपरीत, रक्त कोशिका विकास (निश्चित hematopoiesis) के बाद के चरणों में, यह तेजी से स्पष्ट है कि बहु-वंश HSPC विशेष संवहनी endothelial कोशिकाओं है कि जर्दी थैली, नाल के भीतर रक्त के गठन के संभावित (hemogenic endothelial कोशिकाओं) के अधिग्रहण, और एजीएम से उठता बन गया है 2-5, साथ ही पीतक और नाल वाहिकाओं, भ्रूण अंतर्हृदकला 6, और सिर वाहिका 7 में। ये अलग ऊतकों के भीतर hemogenic endothelial कोशिकाओं के विनिर्देश विकास के विशिष्ट चरणों में होता है; उदाहरण के लिए, ~ E8.25 पर जर्दी थैली के भीतर और ~ E10 8-12 पर एजीएम के भीतर। बहरहाल, यहां तक कि इन विशिष्ट विकास खिड़कियों के दौरान, hemogenic एंडो की आबादी11,12 – (जर्दी थैली और एजीएम endothelial कोशिकाओं के 3% 1) thelial कोशिकाओं सभी endothelial कोशिकाओं का एक छोटा सा अंश का प्रतिनिधित्व करता है। hemogenic endothelial सेल "विशिष्टता 'की प्रक्रिया के रूप में अच्छी तरह से मानव, hematopoiesis के रूप में, murine के लिए महत्वपूर्ण है। Hematopoietic कोशिकाओं की जर्दी थैली वाहिकाओं के endothelium और मानव भ्रूण 13 में महाधमनी से कली को दिखाया गया है, और कई प्रयोगशालाओं दिखा दिया है कि मानव स्टेम कोशिकाओं से रक्त कोशिका के उत्पादन एक endothelial सेल मध्यवर्ती 14-16 की आवश्यकता है। इस प्रकार, murine hemogenic endothelial कोशिकाओं के phenotype को परिभाषित करने और आणविक घटनाओं है कि इस पशु मॉडल में उनके विकास के लिए नेतृत्व मानव स्टेम कोशिकाओं से hemogenic endothelial कोशिकाओं की पीढ़ी के लिए इन विट्रो प्रौद्योगिकियों की खोज की सुविधा चाहिए समझने। बदले में, बहु-वंश HSPC से विभेदित रक्त कोशिका प्रकार के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए एक दृष्टिकोण के अंतिम विकास – खुद को देरीमानव स्टेम कोशिकाओं से वेद एक physiologically प्रासंगिक hemogenic endothelial मध्यवर्ती सेल के माध्यम से – hematologic, Oncologic और पुनर्योजी चिकित्सा के लिए अविश्वसनीय चिकित्सीय क्षमता होगा। इस लक्ष्य की ओर, हम embryogenesis दौरान निश्चित HSPC उत्पादन का 11 और एजीएम 12, दो प्रमुख स्थलों थैली murine जर्दी भीतर hemogenic endothelial कोशिकाओं के phenotype परिभाषित किया है, एक प्रतिरूप स्तर पर। वयस्क अस्थि मज्जा 17, भ्रूण hemogenic endothelial कोशिकाओं और HSPC प्रदर्शनी Hoechst डाई तपका गुण भीतर HSPC और इसलिए तरह "पक्ष जनसंख्या" के भीतर एक FACS साजिश 5,11,12 (के रूप में 3 चित्र में दिखाया गया है) पर कोशिकाओं की (सपा) दिखाई देते हैं। इसके अलावा, हम भी पता चला है कि hemogenic endothelial कोशिकाओं दोनों endothelial के मार्करों व्यक्त करने और कोशिकाओं (Flk1 और cKit, क्रमशः) स्टेम, लेकिन hematopoietic वंश मार्कर, CD45 5,11,12 व्यक्त नहीं करते। इस प्रकार, hemogenic endothelial कोशिकाओं अध्यक्ष हो सकता हैified और FACS द्वारा पृथक रूप Flk1 + / cKit + / CD45- सपा कोशिकाओं, और हम पता चला है कि इन कोशिकाओं की जर्दी थैली और एजीएम कोशिकाओं 5,11,12 के Flk1- / cKit + / CD45 + सपा अंश के भीतर निहित HSPC को जन्म दे। Hemogenic endothelial कोशिकाओं और HSPC पहचान की जा सकती है और जर्दी थैली या एजीएम ऊतकों या तो हौसले euthanized भ्रूण से काटा से अलग, या पूर्व vivo भ्रूण संस्कृति में अप करने के लिए 48 घंटे (चित्रा 1 में दिखाया गया के रूप में) के लिए सुसंस्कृत भ्रूण से। पूर्व vivo संस्कृति चयनात्मक परमिट औषधीय एजेंटों के साथ व्यक्तिगत भ्रूण के पूर्व उपचार, और भी वांछित ट्रांसजीन (यानी, lentiviral पारगमन द्वारा) के क्षणिक अभिव्यक्ति के लिए अनुमति देता है। hemogenic endothelial कोशिकाओं और HSPC साथ साथ वर्णित विधि द्वारा की पहचान FACS आनुवंशिक छेड़छाड़ माउस मॉडल में निश्चित hematopoietic विकास का एक मात्रात्मक उपाय के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है; कोशिकाओं को भी रक्त एफओ सहित बाद में प्रयोगात्मक अनुप्रयोगों के लिए लिया जा सकता हैrming assays, अभिव्यक्ति विश्लेषण, और प्रत्यारोपण।
पशु विषयों: उपयोग करता है और नैतिक आधार
साहित्य की बढ़ती शरीर भ्रूण के विकास के निश्चित hematopoiesis चरण के दौरान HSPC गठन के लिए hemogenic endothelial कोशिकाओं के महत्वपूर्ण योगदान की स्थापना की है। फिर भी, शारीरिक स्थिति और संकेत है कि एक hemogenic भाग्य की दिशा में endothelial कोशिकाओं की एक उप-जनसंख्या के विनिर्देश को बढ़ावा देने के खराब समझ रहते हैं, और इसलिए अभी तक इन विट्रो सेटिंग में मजाक उड़ाया नहीं जा सकता है। दरअसल, तकनीक इस पत्र में वर्णित हमारी प्रयोगशाला और अन्य समूहों द्वारा उपयोग hematovascular विकास, ऐसा है कि पूर्व vivo hemogenic endothelial सेल विनिर्देश और HSPC उत्पादन के लिए एक दृष्टिकोण एक दिन विकसित किया जा सकता है की इस क्षेत्र की समझ में सुधार करने में वर्तमान में कर रहे हैं। ऐसे समय में जब तक, हालांकि, क्षेत्र (जंगली प्रकार से प्राथमिक ऊतकों और जीन पर निर्भर रहता हैtically संशोधित) माउस भ्रूण आगे के अध्ययन के लिए hemogenic endothelial कोशिकाओं और HSPC निर्दिष्ट प्राप्त करते हैं। Hemogenic endothelial कोशिकाओं और HSPC मज़बूती से पहचान की है और या तो E8.5 से अलग किया जा सकता है (10 – 12 विखंड जोड़े) जर्दी थैली या E10.5 (35 – 40 विखंड जोड़े) एजीएम 11,12। Hemogenic endothelial कोशिकाओं के सापेक्ष कमी के कारण (आम तौर पर 1 का प्रतिनिधित्व – कुल endothelial कोशिकाओं इन ऊतकों के भीतर 11,12 के 3%) एकाधिक से ऊतकों की पूलिंग (~ 8 – 10) एक भी नमूना में littermates जोरदार क्रम में करने के लिए सिफारिश की है बाद में प्रयोग के लिए पर्याप्त कोशिकाओं को प्राप्त करते हैं। सत्यापन कि hemogenic endothelial कोशिकाओं और HSPC सफलतापूर्वक पहचान की गई है और अलग-थलग स्थिति है कि hematopoietic भेदभाव प्रेरित तहत लिया गया कोशिकाओं की संस्कृति के द्वारा पूरा किया जा सकता है। इन शर्तों के तहत, hemogenic endothelial कोशिकाओं और HSPC बहु-वंश hematopoietic भेदभाव प्रदर्शन करेंगे, ery युक्त कालोनियों की उपस्थिति में जिसके परिणामस्वरूपthroid पूर्वज (BFU-ई), granulocyte और मैक्रोफेज पूर्वज (CFU जीएम), और granulocyte, एरिथ्रोसाइट, मैक्रोफेज, megakaryocyte पूर्वज कालोनियों (CFU-GEMM)।
तकनीकी क्षणिक और छोटे सेल आबादी है कि विशिष्ट विकास खिड़कियों के दौरान केवल उभरने के अध्ययन में निहित कठिनाइयों की वजह से क्षेत्र में अपनी प्रारंभिक अवस्था में है कि – वहाँ hematovascular विकास के क्षेत्र में कई अनुत्तरित सवाल बने हुए हैं। तकनीक ऊपर उल्लिखित hemogenic endothelial सेल से भी एकल कक्षों और अभिकर्मकों और उपकरण है कि आमतौर पर सबसे अधिक प्रयोगशालाओं में उपलब्ध हैं का उपयोग महत्वपूर्ण विकास समय बिंदुओं पर भ्रूण के ऊतकों में HSPC आबादी के अलगाव के लिए अनुमति देकर इन कठिनाइयों के कई उन्नति। हमारी प्रोटोकॉल भी वाईएस और एजीएम से गैर hemogenic endothelial सेल भिन्न, जो बाद के विश्लेषण में hemogenic endothelial सेल अंश के लिए स्वतंत्र विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, या के रूप में नियंत्रण के समानांतर अलगाव के लिए अनुमति देता है।
इस बहुरंगा FACS आधारित पद्धति का उपयोग कर hemogenic endothelial कोशिकाओं का अलगाव में एक प्रमुख मुद्दा उचित वर्णक्रम सह हैmpensation और एकल रंग फाटक के सटीक ड्राइंग। जैसे, यह पुरजोर सिफारिश की है कि सभी प्रयोगात्मक रन में बेदाग और एकल रंग नियंत्रण शामिल किया जाना है, और वे कहते हैं कि – निर्धारण मिलान नियंत्रण एंटीबॉडी के साथ इलाज के नमूने के साथ – शुरू में उचित मुआवजा वर्णक्रम के लिए और फाटकों के ड्राइंग स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। हालांकि, गैर विशिष्ट धुंधला इस प्रोटोकॉल, इस प्रकार बेदाग और एकल रंग नियंत्रण फाटकों की दिनचर्या सत्यापन के लिए पर्याप्त एक बार FACS सॉर्टर सेटिंग्स अनुकूलित किया गया है द्वारा कम है।
गलत खींचा सपा फाटकों दृष्टिकोण इस रिपोर्ट में वर्णित के साथ एक विशेष चिंता का विषय हैं। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि multipotent स्टेम कोशिकाओं Hoechst लाल 17 के तरजीही तपका दिखा रहे हैं, FACS द्वारा सपा में उनकी उपस्थिति के लिए शारीरिक आधार बनाने। हम जानते हैं कि hemogenic endothelial कोशिकाओं से पता चला है और HSPC इसी तरह सपा सेल अंश 5,11 के भीतर पाए जाते हैं। ऐसे में कैल्शियम चैनल के रूप में औषधhibitor Verapamil transmembrane बहुऔषध प्रतिरोध ट्रांसपोर्टरों की एक किस्म की रुकावट के माध्यम से सपा कोशिकाओं में इस Hoechst डाई तपका व्यवहार ब्लॉक। Hematopoietic स्टेम और पूर्वज कोशिकाओं में, यह मुख्य रूप से ABCG2 / BCRP1 ट्रांसपोर्टर 24 के माध्यम से होता है। आमतौर पर verapamil लाती> की सपा 50% रुकावट, हालांकि, Hoechst तपका के समग्र डिग्री और Verapamil द्वारा इसके बाद रुकावट देखा संभवतः कारण अंतर Hoechst के साथ कई बहुऔषध प्रतिरोधी ट्रांसपोर्टर प्रकार की अभिव्यक्ति को बदलने के लिए, विकास के समय से प्रभावित हो दिखाया गया है तपका क्षमता है, और Verapamil 5 के प्रति संवेदनशीलता। इस प्रकार, यह पुरजोर सिफारिश की है कि Verapamil इलाज Hoechst से सना हुआ नकारात्मक नियंत्रण standardly सुनिश्चित करने के लिए उचित सपा gating शामिल किया: अगर एक सपा गेट को ठीक से तैयार की है, सपा कोशिकाओं की संख्या में उल्लेखनीय कमी में Hoechst के साथ दाग नमूनों में पता लगाया जाना चाहिए Verapamil की उपस्थिति।
हम पहले से पता चला है कि हल कियाE9.5 murine जर्दी थैली से सपा कोशिकाओं को एक ~ 80 है – 90 गुना अधिक से अधिक methylcellulose आधारित hematopoietic संस्कृति में HSPC उत्पन्न करने के लिए जब E9.5 unfractionated की एक मिलान संख्या की तुलना में क्षमता, गैर Hoechst पूरे वाईएस ऊतक कोशिकाओं 5 दाग। सपा आगे लक्षण वर्णन से पता चला है कि जल्दी hematopoietic और E8.0 पर संवहनी विकास के दौरान murine जर्दी थैली में, वहाँ VE-cadherin और FLK-1 की सराहनीय अभिव्यक्ति है, लेकिन स्टेम (सी-किट) और hematopoietic मार्कर की कम अभिव्यक्ति है (CD45)। इस प्रकार, इस विकास timepoint, मौलिक (गैर hemogenic) चुनाव आयोग, FLK-1 + / CD31 + / CD45- गैर सपा कोशिकाओं प्रबल रूप में परिभाषित किया है। Endothelial मार्कर अभिव्यक्ति कम हो जाती है और CD45 और सी-किट अभिव्यक्ति बढ़ जाती है, एक बढ़ती हुई E9.5 और E11.5 5 के बीच इन विट्रो में HSPC उत्पन्न करने की क्षमता के साथ सहवर्ती के रूप में यह अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल पाली। यह पता चलता है वाईएस ऊतक के hematopoietic गतिविधि के भीतर सपा निहित है E9.5 और E11.5, और occurr के बीच सबसे अधिक स्पष्ट होता जा रहाendothelial विशेषताओं और hematopoietic क्षमता का क्रमिक अधिग्रहण के एक समय पर नुकसान के माध्यम से हैैं। जैसे, बहुऔषध प्रतिरोध ट्रांसपोर्टरों कि सपा phenotype को जन्म दे की अभिव्यक्ति hemogenic endothelium 5 के एक महत्वपूर्ण प्ररूपी मार्कर कर रहे हैं; वास्तव में, एजीएम से गैर सपा कोशिकाओं रक्त बनाने संभावित 12 प्रदर्शन नहीं करते। इस प्रकार, दोनों वाईएस और एजीएम में Hoechst धुंधला के माध्यम से सपा सफल अलगाव सुनिश्चित करता है कि कोशिकाओं को इस अंश के भीतर एक दिया ऊतक के hematopoietic स्टेम सेल डिब्बे, और कोशिकाओं के बाद एंटीबॉडी धुंधला से सुलझा लिया जाएगा hemogenic के भेदभाव की अनुमति देगा (FLK -1 + / सी किट + / CD45-) HSPC बनाम (Flk1- / C-किट + / CD45 +) आबादी 5,11,12। इसके अलावा, यह पहले से किया गया है कि संतोष व्यक्त भीतर जर्दी थैली और एजीएम ऊतकों की सपा CD41 + कोशिकाओं methylcellulose आधारित संस्कृति 11,12 में बहु-वंश कॉलोनी गठन करने में सक्षम हैं। हम Flk1 + C-किट + CD45- सपा सेल के रूप में hemogenic endothelial कोशिकाओं को परिभाषितCD45 hematopoietic वंश के एक नामित मार्कर के रूप में उपयोग कर के बजाय CD41 हमारे Flk1 और CD45 की है कि अभिव्यक्ति खोजने दिया द्वारा रों लगभग परस्पर अनन्य 5,11 है। (FLK-1) यह भीतर सपा दोनों endothelial है कि कोशिकाओं का एक शुद्ध अलगाव की अनुमति देता है और hematopoietic संक्रमण के लक्षण (सी-किट) endothelial के लिए आवश्यक स्टेम लेकिन जैसा कि इन में CD45 के अभाव के द्वारा निर्धारित किया जाता है, जो अभी तक इस बदलाव नहीं आया है, कोशिकाओं। यह HSPC आबादी के उप-विभाजन, के रूप में FLK-1- / C-किट + / CD45 + / सपा कोशिकाओं में परिभाषित किया गया, Csf1r + (ऊतक मैक्रोफेज) और Csf1r- (एचएससी) अंश में विचार करने के लिए उपयोगी हो सकता है के रूप में हाल ही में गोमेज़ और उनके सहयोगियों द्वारा रिपोर्ट 25, के रूप में यह सच HSPC का अधिक से अधिक संकल्प बनाम ऊतक मैक्रोफेज पूर्वज आबादी प्रदान करेगा, लेकिन इस hemogenic endothelial सेल अंश जिसका अलगाव हम Csf1r के बाद से रेखांकित किया है बृहतभक्षककोशिका पूर्वज 26 के एक मार्कर है की अखंडता को प्रभावित नहीं होना चाहिए।
Hemogenic endothelial कोशिकाओं दोनों वाईएस और एजीएम (जिसमें 1 – endothelial कोशिकाओं के 3%) में एक दुर्लभ उप-जनसंख्या हैं, और इसलिए उनके अध्ययन में एक बड़ी चुनौती बाद अनुप्रयोगों के लिए अपर्याप्त सेल उपज है। इस प्रोटोकॉल आमतौर पर केवल 10-20% के साथ भी इष्टतम परिस्थितियों में छँटाई का समय है, और एक ठेठ hemogenic endothelial सेल जमा ऊतकों से कई भ्रूण से प्राप्त प्रकार से व्यवहार्य शेष कोशिकाओं के 70-80% में यह परिणाम केवल कुछ सौ कोशिकाओं उपज हो सकती है के methylcellulose उत्पादन कालोनियों में एम्बेडेड कोशिकाओं लिया गया। हल सेल नंबर को अधिकतम करने के लिए, यह पुरजोर सिफारिश की है कि जांचकर्ताओं प्रक्रिया के हर कदम भर ऊतक और सेल व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए कदम उठाने के लिए: ऊतकों तेजी से विच्छेदित और जमा किया जाना चाहिए, और नमूने संभव बर्फ पर रखा जाना चाहिए, जब भी। नमूने नए सिरे से तैयार किया जाना चाहिए तुरंत FACS छँटाई करने से पहले, और संग्रह methylcellulose संस्कृति में उच्च सीरम सामग्री, या सीधे युक्त वर्णन के रूप में ट्यूबों में हलऊपर घ। अगर व्यवहार्यता समस्या जारी रहती है, संग्रह ट्यूब भी सीरम के साथ पूर्व लेपित किया जा सकता है आगे हल सेल अस्तित्व को बढ़ाने के लिए। hemogenic endothelial सेल उपज कम रहता है, वयस्क अस्थि मज्जा या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध fluorophore संयुग्मित मोती यहाँ बताया भ्रूण ऊतक व्युत्पन्न एकल रंग नियंत्रण के एवज में वर्णक्रम मुआवजे के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हल कोशिकाओं संस्कृति के लिए इरादा कर रहे हैं, तो hemogenic endothelial कोशिकाओं और HSPC टिशू कल्चर कुओं में सीधे हल किया जाना चाहिए। हल कोशिकाओं के डीएनए या आरएनए से संबंधित जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण, hemogenic और गैर-hemogenic endothelial कोशिकाओं और HSPC लिए इरादा कर रहे हैं संग्रह सेल नुकसान को कम करने के लिए नमूना lysis बफर युक्त ट्यूबों में सीधे हल किया जा सकता है।
उल्लिखित तकनीक में एक ही भ्रूण के ऊतकों से hemogenic और गैर-hemogenic endothelial कोशिकाओं के सफल (और एक साथ) अलगाव, साथ ही HSPC और परिपक्व रक्त कोशिका अंशों परमिट। यह दृष्टिकोण आगे संवर्धन में सक्षम बनाता हैमहत्वपूर्ण बदलाव होते हैं कि के रूप में endothelial कोशिकाओं को रक्त उत्पन्न की आणविक आधार के वाई। इन विकासात्मक अध्ययन से प्राप्त इनसाइट्स तो pluripotent से मानव hemogenic endothelial कोशिकाओं और HSPC संतान की पीढ़ी के अनुकूलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और संभवतः ऑटोलॉगस, प्रचलित hematopoietic विकारों के इलाज के लिए स्टेम कोशिकाओं।
The authors have nothing to disclose.
लेखकों घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि।
DAPT (N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester) | Sigma | D5942 | TOXIC irritant: Wear eye protection, mask, and gloves when handling. |
Absorbent bench underpad | Covidien | 7134 | |
#5 Straight Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
8.5cm straight scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
Isoflurane (Isothesia) | Henry Schein | 50033 | TOXIC inhalant: Use in fume hood. |
100x Penicillin Streptomycin Glutamine (10,000u/mL Penicillin, 10,000mg/mL Streptomycin, 29.2mg/mL L-glutamine) | Invitrogen | 10378016 | |
Type II Collagenase | Worthington | LS004174 | |
Falcon 70uM nylon cell strainer | Corning | CLS431751 | |
Anti-Mouse CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-81 | |
Anti-Mouse CD31 – PE | eBioscience | 12-0311-81 | |
Anti-Mouse Flk-1 PE-Cy7 | BD Pharmingen | 561259 | |
Hoechst 33342 (bisBenzimide H 33342 trihydrochloride) | Sigma | 14533 | TOXIC: irritant. Wear eye protection and gloves when handling. Prepare stock solution of 25mg/mL in distilled H2O, store aliquots at -20C until ready for use |
Verapamil Hydrochloride | Sigma | 1711202 | TOXIC: irritant. Wear eye protection, mask, and gloves when handling. Prepare stock solution of 5mM (100X) in 95% ethanol. Store at -20C until ready for use |
Falcon 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | |
MethoCult GF M3434 | Stem Cell Technologies | 3434 | Thaw and aliquot per manufacturer's instructions |
Modified Giemsa Stain | Sigma | GS500 | TOXIC: Contains Methanol – use in fume hood and wear gloves with handling. Dilute in distilled water to 0.02% solution. |
Cytospin Centrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | |
Clipped Funnel Starter Kit | Thermo Scientific | 3120110 | Includes cytofunnels, filter paper, cytoslides, and cytoclips for use with Cytospin centrifuge |
Anti-Mouse B-220 – FITC | BD Pharmingen | 553088 | |
Anti-Mouse Gr-1-FITC | eBioscience | 11-5931-85 | |
Anti-Mouse Ter-119-FITC | eBioscience | 11-5921-85 | |
Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | 10437-077 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (4.5g/L) | Life Technologies | 11965-092 | |
Hank's Buffered Salt Solution | Life Technologies | 14175-095 | |
Fibronectin-coated 24-well tissue culture plate | EMD Millipore | PIFB24P05 | |
IgG2A-PE | BD Pharmingen | 553930 | |
IgG2B-FITC | BD Pharmingen | 556923 |