células-tronco e progenitoras hematopoiéticas (HSPC) derivam de células endoteliais especializadas (hegemônicos) durante o desenvolvimento, mas pouco se sabe sobre o processo pelo qual algumas células endoteliais especificar a tornar-se sangue formando. Nós demonstramos um método baseado citometria de fluxo que permite o isolamento de células endoteliais em simultâneo hegemônicos e HSPC de tecidos embrionários de murídeo.
A especificação de células endoteliais hegemônicos do endotélio vascular embrionária ocorre durante breves períodos de desenvolvimento dentro dos tecidos distintos, e é necessário para o surgimento de HSPC definitiva a partir do saco murino adicional embrionária gema, placenta, vasos umbilicais, ea aorta-gônadas-mesonephros embrionárias ( AGM) região. A natureza transitória e pequeno tamanho desta população de células torna o seu isolamento reprodutível para quantificação cuidadosa e aplicações experimentais tecnicamente difícil. Nós estabelecemos uma célula activada por fluorescência (FACS) protocolo baseado para o isolamento simultâneo de células endoteliais hegemônicos e HSPC durante os horários de pico de geração no saco vitelino e AGM. Nós demonstramos métodos para dissecção do saco vitelino e tecidos AGM de embriões de ratos, e nós apresentamos condições de digestão do tecido e de conjugação de anticorpos otimizados para a sobrevivência da célula máxima antes da identificação e recuperação via FACS. Representante FACS anaparcelas de lise são mostrados que identificar a célula endotelial hegemônicos e fenótipos HSPC, e descrevem um ensaio baseado em metilcelulose para avaliar o seu potencial de formação de sangue a um nível clonal.
Um sistema circulatório funcional exige o desenvolvimento paralelo de vasos sanguíneos e células do sangue. Nos primeiros estágios de desenvolvimento no sangue (hematopoiese primitiva), a origem de eritroblastos permanece vigorosamente debatidos 1. Em contraste, em fases posteriores do desenvolvimento de células do sangue (hematopoiese definitiva), tornou-se cada vez mais claro que a multi-linhagem HSPC surgir a partir de células especializadas vasculares endoteliais que adquirem formação de sangue (células endoteliais hegemônicos) potenciais dentro do saco vitelino, placenta, e AGM 2-5, assim como no vitelina e vasos umbilicais, o endocárdio embrionário 6, e 7 cabeça vasculatura. A especificação de células endoteliais hegemônicos dentro destes tecidos distintos ocorre em fases específicas do desenvolvimento; Por exemplo, dentro do saco vitelino em ~ E8.25 e dentro do AGM em ~ E10 8-12. No entanto, mesmo durante essas janelas específicas do desenvolvimento, a população de endo hegemônicoscélulas Thelial representa uma pequena fracção de todas as células endoteliais (1-3% do saco vitelino e células endoteliais AGM) 11,12. O processo de "especificação" hegemônicos célula endotelial é crítico para a murina, assim como humana, a hematopoiese. As células hematopoiéticas foram mostrados a brotar a partir do endotélio dos vasos do saco vitelino e da aorta em embriões humanos 13, e vários laboratórios têm demonstrado que a produção de células de sangue a partir de células estaminais pluripotentes humanas requer uma célula endotelial intermediário 14-16. Assim, a definição do fenótipo de células endoteliais hegemônicos murinos e compreensão dos eventos moleculares que levam ao seu desenvolvimento neste modelo animal deve facilitar a busca de tecnologias para a produção in vitro de células endoteliais hegemônicos de células estaminais pluripotentes humanas. Por sua vez, o eventual desenvolvimento de uma abordagem para a geração de grande escala de tipos de células diferenciadas a partir de HSPC sangue multi-linhagem –se derived a partir de células-tronco pluripotentes humanas através de uma célula endotelial hegemônicos fisiologicamente relevante intermediário – teria incrível potencial terapêutico para hematológicas, oncológicas e medicina regenerativa. Para atingir este objetivo, definimos o fenótipo de células endoteliais hegemônicos, em um nível clonal, dentro da gema de murino sac 11 e AGM 12, dois principais locais de produção HSPC definitiva durante a embriogênese. Como HSPC dentro da medula óssea adulta 17, células endoteliais hegemônicos embrionárias e HSPC exibem propriedades corante Hoechst efluxo e, portanto, aparece dentro da "população lado" (SP) de células de uma trama de FACS 5,11,12 (como mostrado na Figura 3). Além disso, também têm demonstrado que as células endoteliais expressam marcadores de hegemônicos tanto células endoteliais e (Flk1 e c-kit, respectivamente) do caule, mas não expressam o marcador de linhagem hematopoiética, CD45 5,11,12. Assim, as células endoteliais hegemônicos pode ser identficada e isolados por FACS como células Flk1 + / c-kit + / CD45- SP, e que têm demonstrado que estas células dão origem a HSPC contido dentro da / c-kit + / CD45 + SP Flk1- fracção de células do saco vitelino e AGM 5,11,12. Células endoteliais hegemônicos e HSPC pode ser identificado e isolado a partir do saco vitelino ou tecidos AGM colhidas a partir de qualquer embriões recentemente sacrificados, ou a partir de embriões em cultura durante até 48 horas em ex vivo, a cultura de embriões (como representado na Figura 1). Ex vivo cultura permite selectiva pré-tratamento de embriões individuais com agentes farmacológicos, e também permite a expressão transiente dos transgenes desejados (isto é, através de transdução lentiviral). identificação de FACS de células endoteliais e hegemônicos HSPC pelo método aqui descrito pode ser usado como uma medida quantitativa de desenvolvimento hematopoiético definitiva em modelos de ratos geneticamente manipulados; As células também podem ser recuperados para aplicações experimentais subsequentes, incluindo sangue-FOensaios rmando, análise de expressão, e transplante.
Os indivíduos com animais: Usos e Considerações éticas
Um crescente corpo de literatura estabeleceu a importante contribuição das células endoteliais hegemônicos a formação HSPC durante a fase de hematopoiese definitiva do desenvolvimento embrionário. No entanto, as condições fisiológicas e sinais que promovem a especificação de uma subpopulação de células endoteliais no sentido de um destino hegemônicos permanecem pouco compreendidos, e, por conseguinte, ainda não pode ser mimetizado num ambiente in vitro. Na verdade, as técnicas descritas neste documento estão atualmente em uso por nosso laboratório e outros grupos para melhorar a compreensão do campo do desenvolvimento hematovascular, de tal modo que uma abordagem para a especificação de células ex vivo hegemônicos endotelial e produção HSPC pode ser desenvolvido um dia. Até essa altura, no entanto, o campo permanece dependente de tecidos primários de tipo selvagem (e geneticamente modificados) embriões de camundongos para obter especificado células endoteliais hegemônicos e HSPC para um estudo mais aprofundado. Células endoteliais hegemônicos e HSPC podem ser identificados de forma confiável e isolados a partir de qualquer E8.5 (10 – 12 pares somite) saco vitelino ou E10.5 (35 – 40 pares somite) AGM 11,12. Devido à escassez relativa de células endoteliais hegemônicos (tipicamente representando 1-3% de células endoteliais total de 11,12 dentro destes tecidos) de agrupamento dos tecidos de múltipla (~ 8 – 10) ninhada em uma única amostra é fortemente recomendado, a fim de obter células suficientes para a experimentação subsequente. A verificação de que as células endoteliais e hegemônicos HSPC têm sido identificados e isolados com sucesso pode ser realizada por cultura de células recuperadas em condições que induzem a diferenciação hematopoiética. Sob estas condições, as células endoteliais e hegemônicos HSPC exibirão multi-linhagem diferenciação hematopoiética, resultando no aparecimento de colónias contendo eryprogenitores Throid (BFU-E), de granulócitos e macrófagos progenitores (CFU-GM) e granulócitos, eritrócitos, macrófagos, colônias megacari�itos progenitoras (CFU-GEMM).
Restam muitas perguntas sem resposta no domínio do desenvolvimento hematovascular – um campo que ainda está em sua infância, devido às dificuldades técnicas inerentes a estudar populações de células transitórios e pequenas que surgem apenas durante janelas específicas de desenvolvimento. As técnicas descritas acima melhorar muitas destas dificuldades, permitindo o isolamento de células, mesmo individuais da célula endotelial hegemônicos e populações HSPC em tecidos embrionários em momentos críticos do desenvolvimento, utilizando reagentes e equipamentos que estão normalmente disponíveis na maioria dos laboratórios. Nosso protocolo também permite o isolamento paralela de fracções de células endoteliais não-hegemônicos da YS e AGM, que podem ser utilizados para análises independentes, ou como controlos para a fracção de células endoteliais hegemônicos em análises subsequentes.
Um ponto-chave no isolamento das células endoteliais hegemônicos usando este método baseado em FACS multicolor é apropriado co espectralmpensation e desenho preciso de portões de uma só cor. Como tal, é fortemente recomendado que controles sem manchas e com uma única cor ser incluído em todas as corridas experimentais, e que – juntamente com amostras tratadas com anticorpos de controlo do mesmo isotipo – ser usado para estabelecer inicialmente compensação espectral adequada e desenho de portas. No entanto, a coloração não específica é mínima por este protocolo, assim, os controles não coradas e com uma única cor são suficientes para verificação de rotina dos portões uma vez configurações classificador FACS foram otimizados.
portões SP Inaccurately desenhadas são uma preocupação especial com a abordagem descrita neste relatório. Estudos anteriores demonstraram que as células estaminais multipotentes exibem efluxo preferencial da Hoechst vermelho 17, formando a base fisiológica para a sua aparição no SP por FACS. Mostrámos que as células endoteliais e hegemônicos HSPC são igualmente encontrados dentro da fracção de célula de SP 5,11. As drogas tais como o canal de cálcio emhibitor Verapamil bloquear este comportamento efluxo de corante Hoechst em células SP através do bloqueio de uma variedade de transportadores de resistência a múltiplas drogas transmembranar. Em células estaminais e progenitoras hematopoiéticas, isto ocorre principalmente via o transportador ABCG2 / BCRP1 24. Tipicamente verapamil induz> 50% de bloqueio do SP, no entanto, o grau global de Hoechst efluxo e seu bloqueio subsequente por Verapamil visto tem sido mostrado a ser afectado pelo tempo de desenvolvimento, presumivelmente devido à mudança de expressão de tipos de transportadores resistentes a múltiplas multidrogas com diferencial Hoechst capacidade de efluxo, e sensibilidade para Verapamil 5. Assim, é altamente recomendável que Verapamil-tratados Hoechst-manchado controle negativo ser standardly incluídos para garantir gating SP adequada: se um portão de SP está devidamente elaborado, uma notável redução no número de células SP devem ser detectados em amostras coradas com Hoechst em a presença de verapamil.
Temos demonstrado anteriormente que a classificadasCélulas SP a partir do saco de gema de E9.5 murino tem uma ~ 80 – 90 vezes maior capacidade para gerar HSPC em cultura hematopoiética à base de metilcelulose, quando comparado com um número correspondente de E9.5 não fraccionada, não-coradas Hoechst células do tecido YS todo 5. A caracterização adicional do SP tem mostrado que, no saco vitelino de murídeo durante hematopoéticas e o desenvolvimento vascular em E8.0, existe expressão significativa da VE-caderina e Flk-1, mas a baixa expressão da haste (c-kit) e marcadores hematopoiéticas (CD45). Assim, neste ponto de tempo do desenvolvimento primordial, (não-hegemônicos) CE, definida como Flk-1 + / CD31 + / CD45- células não SP predominam. Isso muda perfil de expressão como expressão do marcador endotelial diminui e CD45 e c-Kit expressão aumenta, concomitante com uma capacidade crescente para gerar HSPC in vitro entre E9.5 e E11.5 5. Isto sugere actividade hematopoiética de tecido YS está contido dentro do SP, a tornar-se mais aparente entre E9.5 e E11.5, e Ocorreming através de uma perda cronometrado de características endoteliais e aquisição gradual da capacidade hematopoiética. Como tal, a expressão dos transportadores de resistência a múltiplos fármacos que originam o fenótipo SP são um importante marcador fenotípico de endotélio hegemônicos 5; Na verdade, as células não-SP do AGM não exibem potencial 12 de formação do sangue. Assim, o isolamento bem sucedido do SP através de coloração Hoechst, tanto no YS e AGM assegura que as células serão classificadas a partir do compartimento hematopoiético de células estaminais de um dado tecido, e subsequente coloração com anticorpo de células dentro desta fracção permitirá discriminação da hegemônicos (Flk -1 + / c-kit + / CD45-) versus HSPC (Flk1- / c-kit + / CD45 +) populações 5,11,12. Além disso, tem sido observado anteriormente que CD41 + células dentro da SP do saco vitelino e dos tecidos AGM são capazes de formação de colónias de multi-linhagem em cultura com base metilcelulose 11,12. Definimos células endoteliais hegemônicos como Flk1 + c-Kit + células CD45- SPs usando CD45 como um marcador designado de linhagem hematopoiética, em vez de CD41 dada a nossa constatação de que a expressão de CD45 Flk1 e é virtualmente excluem mutuamente 5,11. Isto permite um isolamento pura de células dentro do SP que tem tanto endotelial (Flk-1) e da haste características (c-Kit) necessárias para endoteliais a transição hematopoiéticas, mas que ainda não tenham sido submetidos a esta alteração, tal como determinado pela ausência de CD45 nestas células. Seria útil considerar a sub-fraccionamento da população HSPC, definida como as células do Flk-1 / C-kit + / CD45 + / SP, em Csf1r + (macrófagos de tecido) e fracção Csf1r- (HSC) tal como foi recentemente relatado por Gomez e colegas 25, pois isso iria proporcionar uma maior resolução do verdadeiro HSPC contra populações de macrófagos de tecidos progenitoras, mas isso não deve afetar a integridade da fração de células endoteliais hegemônicos cujo isolamento temos delineado desde Csf1r é um marcador de células progenitoras de macrófagos 26.
Hemogcélulas endoteliais ENIC são uma subpopulação rara em ambos YS e AGM (compreendendo 1-3% de células endoteliais), e, portanto, um grande desafio em seu estudo é rendimento celular insuficiente para aplicações subseqüentes. Este protocolo resulta geralmente em 70-80% das células restantes viável no momento da triagem, e um tipo de célula típico hegemônicos endoteliais dos tecidos reunidos obtidos a partir de vários embriões pode render apenas algumas centenas de células, mesmo sob condições ideais, com apenas 10-20% células de colónias em metilcelulose incorporados produzir recuperado. Para maximizar o número de células ordenada, é altamente recomendável que os investigadores tomem medidas que assegurem tecidos e viabilidade celular durante todas as etapas do processo: tecidos devem ser rapidamente dissecado e combinados, e as amostras devem ser mantidas em gelo sempre que possível. As amostras devem ser preparadas imediatamente antes da separação por FACS, e classificados em tubos de colheita com conteúdo soro elevado, ou diretamente na cultura metilcelulose como descreverd acima. Se problemas de viabilidade persistirem, tubos de coleta também podem ser pré-revestidas com soro para aumentar ainda mais a sobrevivência das células de classificação. Se o rendimento de células endoteliais hegemônicos continua a ser baixa, da medula óssea adulta ou grânulos fluoróforos disponíveis comercialmente podem ser utilizados para a compensação espectral em vez de os controlos única cor derivada de tecidos embrionários aqui descritos. Se as células escolhidas são destinados para a cultura, as células endoteliais e hegemônicos HSPC devem ser classificados directamente em poços de cultura de tecidos. Se as células escolhidas são destinados para análise de ADN ou expressão de genes de ARN relacionado, as células endoteliais e não-hegemônicos hegemônicos e HSPC podem ser classificados directamente para tubos de colheita contendo tampão de lise da amostra para minimizar a perda de células.
A técnica descrita permite bem sucedida (e simultânea) isolamento de células endoteliais hegemônicos e não-hegemônicos, assim como fracções de HSPC e de células sanguíneas maduras a partir dos mesmos tecidos embrionários. Esta abordagem permite ainda parafuso prisioneiroy das bases moleculares das transições críticas que ocorrem como células endoteliais gerar sangue. Os conhecimentos obtidos a partir destes estudos de desenvolvimento pode, então, ser utilizados para optimizar a geração de células endoteliais humanas e hegemônicos HSPC progenitura de pluripotentes, e potencialmente autólogo, as células para o tratamento de desordens hematopoiéticas estaminais prevalentes.
The authors have nothing to disclose.
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
DAPT (N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester) | Sigma | D5942 | TOXIC irritant: Wear eye protection, mask, and gloves when handling. |
Absorbent bench underpad | Covidien | 7134 | |
#5 Straight Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
8.5cm straight scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
Isoflurane (Isothesia) | Henry Schein | 50033 | TOXIC inhalant: Use in fume hood. |
100x Penicillin Streptomycin Glutamine (10,000u/mL Penicillin, 10,000mg/mL Streptomycin, 29.2mg/mL L-glutamine) | Invitrogen | 10378016 | |
Type II Collagenase | Worthington | LS004174 | |
Falcon 70uM nylon cell strainer | Corning | CLS431751 | |
Anti-Mouse CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-81 | |
Anti-Mouse CD31 – PE | eBioscience | 12-0311-81 | |
Anti-Mouse Flk-1 PE-Cy7 | BD Pharmingen | 561259 | |
Hoechst 33342 (bisBenzimide H 33342 trihydrochloride) | Sigma | 14533 | TOXIC: irritant. Wear eye protection and gloves when handling. Prepare stock solution of 25mg/mL in distilled H2O, store aliquots at -20C until ready for use |
Verapamil Hydrochloride | Sigma | 1711202 | TOXIC: irritant. Wear eye protection, mask, and gloves when handling. Prepare stock solution of 5mM (100X) in 95% ethanol. Store at -20C until ready for use |
Falcon 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | |
MethoCult GF M3434 | Stem Cell Technologies | 3434 | Thaw and aliquot per manufacturer's instructions |
Modified Giemsa Stain | Sigma | GS500 | TOXIC: Contains Methanol – use in fume hood and wear gloves with handling. Dilute in distilled water to 0.02% solution. |
Cytospin Centrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | |
Clipped Funnel Starter Kit | Thermo Scientific | 3120110 | Includes cytofunnels, filter paper, cytoslides, and cytoclips for use with Cytospin centrifuge |
Anti-Mouse B-220 – FITC | BD Pharmingen | 553088 | |
Anti-Mouse Gr-1-FITC | eBioscience | 11-5931-85 | |
Anti-Mouse Ter-119-FITC | eBioscience | 11-5921-85 | |
Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | 10437-077 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (4.5g/L) | Life Technologies | 11965-092 | |
Hank's Buffered Salt Solution | Life Technologies | 14175-095 | |
Fibronectin-coated 24-well tissue culture plate | EMD Millipore | PIFB24P05 | |
IgG2A-PE | BD Pharmingen | 553930 | |
IgG2B-FITC | BD Pharmingen | 556923 |