Abstract
在骨重建手术，生长因子超生理金额经验装上支架，以促进成功的骨融合。大剂量的高度有效的生物制剂的需要，由于生长因子的不稳定性如快速酶降解的结果，以及在植入物位点定位足够量的生长因子的载体的低效率。因此，该延长的生长因子的稳定性，如BMP-2 / NELL-1，并控制其释放策略实际上可以降低其有效剂量，从而减少了需要更大的剂量期间未来骨再生手术。反过来，这将减少副作用和生长因子的成本。自组装胸肌已经制造通过增强的体内稳定性通过肝素结合，并进一步使可能生长因子的生物活性提供的BMP-2 / NELL-1递送的更好的控制。在这里，我们说明了PEC制造这有助于在国内配送简单的过程中重建骨手术的各种生长因子RY。
Introduction
假的发病率已经报道高达10〜45％，在退化性脊柱融合和修订脊柱手术1。以减少脊柱融合和其他重建骨手术，骨生长因子如BMP-2，内尔-1 1和血小板衍生的生长因子（PDGF）已被引入，以促进从头成骨过程中假关节的速度。其中，BMP-2是脊柱融合2的热门选择。虽然BMP-2的诱导和促进新骨形成的效力已被很好地建立3;临床显著并发症，如异位骨形成，血清肿和血肿形成，炎症反应，神经根，椎体骨溶解和逆行射精继续关注的问题，由于使用的4,5超生理金额。
因此，降低的BMP-2的剂量保持在一个相关的策略引诱最小化的副作用。此外，需要有效的载体系统来抑制BMP-2在当代胶原海绵载波系统观察到的突释，并进一步加强这种有效的细胞因子的长期和本地化交货。交替阳离子和阴离子聚电解质的层-层自组装，可以用作建立脚手架基质或植入材料6的表面上的聚电解质复合物的可调谐方法。在这方面，肝素（对于具有所有生物剂的最高负电荷密度已知）已被识别为贪婪地通过静电和肝素结合结构域的多种生长因子结合。的确，肝素已经显示出延长的半衰期，从而使可能的多种生长因子的生物活性。
在此基础上，我们的组适于层 - 层自组装协议来制造基于肝素的聚电解质复合物（PEC），该负载和固定7,8中保留了成骨生长因子的生物活性。藻酸盐微球芯由交联的α-L-古洛糖醛酸盐（G），用二价阳离子钙或锶离子藻酸盐的残基制成。藻酸盐核心是可生物降解的支架基质;该植入后，它是在融合床提供余地骨向内生长吸收。聚-L-赖氨酸（PLL）或鱼精蛋白被用作阳离子层与两个支架矩阵（在这种情况下，藻微珠载体芯）和带负电的肝素隔行;而阴离子肝素层的功能，以稳定和定位加载生长因子。三重层的PEC已经显示出增加的生长因子负载能力在猪模型9。最近，PEC载体已显示出至少20倍的成功减少在大鼠10和脊骨融合8的猪模型的BMP-2的有效剂量。
ntent“>在这里，用BMP-2作为模型骨生长因子，我们报告脊柱融合增强生长因子交付和其他骨重建手术制造佩奇方法。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.海藻酸钠溶液制备
- 溶解200毫克藻酸钠（未照射），或者400毫克8兆拉德的在10ml双蒸水照射海藻酸钠振摇1小时的非辐射藻酸盐和辐照藻15分钟。过夜储存在4℃的藻酸盐溶液。滤波器海藻酸钠微珠制作之前无菌0.2微米的注射器过滤的藻酸盐溶液。
2.海藻酸钠微珠制作
- 消毒静电珠发生器和注射器泵用70％乙醇，并放置在一类二生物安全柜（ 图1）。
- 放置一个玻璃盆珠发生器内磁力搅拌棒。
- 设置珠发生器盆高于9厘米的臂电极。
- 珠发生器的电极电缆连接到手臂电极的滚花螺钉2，倒加入80ml SRCL 2溶液进盆地。
- 负载5毫升0.2微米过滤藻酸盐溶液到注射器和橡胶管。橡胶管连接到臂电极后，以5毫升/小时打开注射泵2分钟以排出管道内的空气，并提供藻酸盐溶液到喷嘴的前端。关掉注射器泵。
- 接下来，切换对封装，然后，将注射泵开始微珠生成。设定为5毫升/小时的藻流速和在5.8千伏的封装上的电压。丢弃前两分钟（或泵出注射器的初始0.5毫升藻酸盐溶液）期间产生的微珠，因为这些微珠趋于不规则尺寸和形状。
- 收集在0.2M的氯化锶溶液随后微珠。同时关闭抽藻酸盐溶液的预先计划体积后注射泵和封装器（按该顺序）。重复此微珠制作后续批次。项目建成后，转F中的注射泵第一，其次是封装。
- 在4℃下储存的微珠在20毫升的0.2M氯化锶溶液过夜以完成交联和稳定的凝胶。
3.海藻酸钠微球的尺寸测量
- 收集0.5海藻酸钠微珠毫升用塑料移液管，并放置在载玻片上。查看在光学显微镜下微珠在10倍的放大倍率。就拿微珠的十张图片，用显微镜CCD摄像头。在2048点¯x1536的分辨率保存在TIFF格式比例尺（500微米）的图像。
- 在ImageJ的使用长度工具，测量微珠和比例尺（ 图2）的大小。从像素转换微珠长度微米。
- 点击行工具和绘制穿过藻酸盐珠的中间线。
- 点击菜单栏上的“分析”，然后选择“测量”。会出现一个弹出窗口。
- 比例尺×500微米的胶珠/长度长度：通过使用公式转换藻酸盐珠的实际长度的直径。例如，1.420（直径ImageJ的测量）/ 2.657（由ImageJ的衡量标尺长度）×500微米= 267微米。
- 考虑100微珠的平均尺寸（平均值±标准偏差），为微珠每批代表尺寸。
4.消毒
- 收集使用100微米的尼龙过滤器微珠并用双蒸水洗涤珠。
- 使用刮刀，传送由0.1mL藻酸盐溶液进行的所有微珠入2ml微量离心管中，用纱布覆盖，以防止干燥。
- 最后，通过使用液体模式高压灭菌消毒的微珠（115℃，15分钟），或按照以manufacturer的规格。加1.5升蒸馏水到室，以防止干燥的珠子。
5.鱼精蛋白和肝素涂层
- 内的BSL-2罩，孵育1毫升的2毫克/毫升鱼精蛋白溶液在室温下1小时（用0.2μm注射器过滤灭菌的）无菌微珠。
- 孵化微珠1小时（步骤5.1）后，收集150微升的微型二喹啉甲酸（microBCA）测试（第6）鱼精蛋白的解决方案。
- 用双蒸水洗净，鱼精蛋白涂层微珠的两倍。降速使用台式离心机以200×g离心在室温下3分钟。离心后，吸用注射器水中。
- 孵育鱼精蛋白涂覆的微珠用1ml的0.5毫克/毫升肝素的溶液30分钟，以创建聚电解质复合物（PEC）（使用0.2微米的注射器过滤灭菌的）。
- 孵育涂鱼精蛋白微˚F后或30分钟（步骤5.4），收集400微升肝素溶液，以确定肝素含量（第7条）。
- 温育后，通过用双蒸水洗涤两次洗掉从胸肌未结合的肝素。
6.鱼精蛋白含量
- 根据制造商的说明进行microBCA测试。简要地说，添加150微升的鱼精蛋白溶液（收集前，用微珠孵育后）到96孔板中。添加150微升microBCA工作溶液。
- 使用白蛋白溶液（0,0.5，1，2，5，10，20，40和200微克/毫升）作为校准标准。
- 孵育在60℃下进行60分钟该混合物。测量用在562nm处用分光光度计的吸光度。
- 使用标准曲线来确定根据制造商的说明每个未知样品的鱼精蛋白的浓度。
- 通过在减去鱼精蛋白的总量确定的微珠的鱼精蛋白含量从精蛋白的残留在涂布液（用微珠孵育后）的量涂布液（用微珠孵育之前）。
7.肝素内容
- 通过将4毫克甲苯胺蓝和在0.01N盐酸20毫克氯化钠制备10毫升工作溶液。
- 添加400微升样品（来自步骤5.5），以工作溶液以2：3的比例为30秒和旋涡。
- 添加600μl的正己烷（等效体积的工作试剂溶液）并涡旋混合物以提取甲苯胺蓝肝素络合物。
- 抽吸将200μl的水相用注射器相分离之后。
- 测量使用分光光度计在631纳米包含在水相中的未提取的甲苯胺蓝的量。
- 准备0-20微克/毫升肝素标准的解决方案。
- 绘制每个标准肝素对肝素浓度的631 nm的读数微克/立方米湖使用标准曲线来确定各样品的肝素浓度。
8层 - 层结构的共焦成像
- 制造鱼精蛋白，肝素和NELL-1 / BMP-2的荧光类似物的CF-405精蛋白（蓝色），CF 594肝素（红色）和FITC标记NELL-1 / FITC标记根据（绿色），BMP-2 +肝素+精蛋白制造商的技术数据表。
- 外套100微克微珠用300μl荧光类似物（如在5.3-5.6中所述涂覆法）的CF-405精蛋白（蓝色）（2毫克/毫升，1小时温育），CF 594肝素（红色）（0.5毫克/毫升， 30分钟）和FITC标记NELL-1 / FITC标记（绿色）的BMP-2（1.5毫克/毫升，过夜）。用蒸馏水冲洗微珠两次，以消除未结合的荧光鱼精蛋白，肝素和NELL-1 / BMP-2。
- 通过在10倍的放大倍率使用共焦显微镜观察该层的分层结构（ 图3）。7
9. BMP-2的和NELL-1吸收和释放
- 装载13.3微升1.5毫克/毫升100微克PEC的BMP-2或NELL-1解决方案。在4℃下30 rpm振摇10小时孵育PEC。
- 在37℃下恒定振荡（30rpm下）沉浸在1ml磷酸盐缓冲盐水（PBS）的微珠。
- 收集1毫升上清液和后1,3，6,10和14天用1ml的PBS替换。
- 评估的摄取和使用根据制造商的协议ELISA方法释放的BMP-2的效率。评估的摄取和使用根据制造商的协议的羧基苯甲酰喹啉-2-甲醛（CBQCA）蛋白测定法释放NELL-1的效率。
- 在时间（t）确定累积释放：
在时间（t）=释放累积释放的时间（t）+前一版本在时间（t-1）。 - 绘制BMP-2和NELL-1的累积释放对时间。
10. 在体外生物活性NELL-1的
注：NELL-1 PEC释放的生物活性，通过测定其增加对兔骨髓干细胞（rBMSC）碱性磷酸酶（ALP）的表达能力进行评估。
- 种子每孔20,000个rBMSCs在24孔板中并允许它们在37℃和5％CO 2的胎牛血清（FBS），1毫升的Dulbecco氏改良Eagle氏培养基（DMEM）+ 10％的增长一天。
- 24小时后，更换用1ml成骨培养基（DMEM补充有10％胎牛血清，2％青霉素链霉素，50微克/毫升抗坏血酸，10毫摩尔/升的β-甘油磷酸的培养基中，10 -8 mol / L的地塞米松）7天，在37℃和5％的CO 2。
- 将300微克PEC-NELL-1（步骤8.2）和PEC细胞培养插入内（TC插入），以保持胸肌从细胞（这避免了成骨细胞培养基变化期间PEC微珠的冲洗）分开。地方TC插入24以及PL吃了14天。
- 每三天一次，吸将1ml成骨培养基中通过将针TC插入外，并用1ml新鲜成骨培养基的替换。
- 后7和14天的潜伏期，确定与在按照试剂盒生产商的方案的ALP测定试剂盒ALP活性。
- 裂解细胞用含有0.1％的TritonX-100，在4℃下进行10分钟的测定缓冲液。刮去使用细胞刮粘附细胞。在4℃下孵育细胞悬浮液在搅拌下至少60分钟。
- 离心细胞悬浮液以2500 xg离心在4℃下10分钟。收集的ALP测定上清。
- 加入50μl连续稀释碱性磷酸酶标溶液的从200到0纳克/毫升至96孔板的孔中。碱性磷酸酶标准最终量是10，5，2.5，1.2，0.6，0.3，0.15，和0纳克/孔。
- 从步骤10.5.2添加上清液（50μl/孔），并稀释与B类稀释uffer。
- 加入50μl的对硝基苯磷酸酯（物pNPP）底物溶液加入到每个孔中。通过轻轻晃动板30秒混合试剂。孵育在黑暗中30分钟该混合物。测量在通过板读数器405处的吸光度。
- 使用校准曲线计算碱性磷酸酶活性。
- 确定根据制造商的说明使用microBCA蛋白测定试剂盒蛋白质含量。由蛋白质含量除以碱性磷酸酶活性规范化碱性磷酸酶活性。
11.细胞活力
- 在37℃下孵育200毫克PEC-NELL-1用1ml的DMEM + 10％FBS的用于3-（4,5-二甲基吡啶-2-基）24小时-2,5-二苯基溴（MTT）检测。
- 种子2000 rBMSCs每孔（在100μl的DMEM含10％FBS）在96孔板中并孵育1天，在37℃，5％ 的 CO 2。
- 用100μlPEC-NELL-1 / PEC提取物代替DMEM + 10％FBS中孵育在37℃，5％ 的 CO 2。
- 后第1天或培养3天，添加10微升5mg / ml的MTT溶液，在37℃，5％的CO 2进一步孵育在黑暗中4小时。
- 加入100微升的DMSO溶液，以每孔以溶解甲晶体。
- 确定在使用酶标仪570nm处的吸光度。
- 计算相对增长率：
12.包装成支架和BMP-2 NELL-1加载
- 使用BSL-2室内的灭菌抹刀磷酸三钙（MPCL-TCP）脚手架 - 包装胸肌成生物可吸收的医用级聚己内酯的孔中。
- 添加1.5毫克/ BMP-2或NELL-1毫升溶液到填充有PEC的MPCL-TCP支架材料和孵育过夜，在4℃。
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Representative Results
在我们的载体，鱼精蛋白被选为聚-L-赖氨酸的替代，因为它有类似的化学性质，它是FDA批准作为肝素的解毒剂。光学显微镜结果表明，非照射微珠呈球状的形状，直径为267±14微米。 （0.35毫米喷嘴，流量为5ml /小时和5.8千伏率）。大部分照射微珠是泪滴形状。上照射微珠的轮部测得的直径为212±30微米（0.35毫米喷嘴，流速为4毫升/小时和6千伏率）。 （ 图4）。
在PEC微珠共聚焦图像揭示层 - 层的CF-405标记的鱼精蛋白（蓝色），CF594标记肝素（红色）和FITC-BMP-2 / FITC-NELL-1（绿色）的涂层。的结果表明，胸肌可以结合正电荷的BMP-2和通过肝素宾迪负NELL-1带电吴域（ 图5）。这表明，胸肌和成骨生长因子之间的相互作用不会充电依赖性。
证明该胸肌能够吸收和释放的BMP-2中，我们使用ELISA测定来确定的BMP-2的温育后残留的量和BMP-2的在PBS中在第1天，第3，第6，第10和14中的量然而，类似的方法并不很好地与NELL-1蛋白质的工作中，由于肝素阻断抗体结合位点，显著降低信号。因此，CBQCA蛋白测定来测定PEC-NELL-1和PEC之间的差异。从累积释放曲线，胸肌不仅表现出更高的NELL-1的吸收效率相比，BMP-2，但也释放它要比BMP-2的慢（NELL-1：20％对BMP-2：25％）（ 图6）。这表明，胸肌与NELL-1结合更紧密地比BMP-2。
神父嗡MTT测定，PEC-NELL-1没有细胞毒性（ 图7）。将结果与的Alamar蓝测定结果在先前的研究中7相匹配。肝素中和正电荷的精蛋白的其中在维持PEC的生物相容性中起重要作用。
确定来自PEC NELL-1释放是否影响长期成骨分化，成骨标志物的表达水平，碱性磷酸酶（ALP），通过比色测定的影响。从PEC NELL-1释放了2.2倍在第14天相比，在PEC对照组（ 图8）增大兔骨髓干细胞的ALP活性。 BMP-2示出了在第7天这两种PEC-BMP-2和PEC BMP-2 +额外的BMP-2显示出活性的第9天减少ALP活性的最大增加（3.75倍）。
ALP与BMP-2没有PEC媒体活动中显示
图1： 静电珠发生器和注射泵在BSL-2生物安全柜设置 （A）固定在喷嘴支架喷嘴。 （B）大流域为氯化锶的解决方案。 （C）电极电缆。 （D）软管提供藻酸盐溶液。 （E）喷嘴支架臂。 （F）电极供应T他电位差来调节珠的大小。 （G）磁力搅拌器。 （H）的5mL注射器。 （I）注射泵来调节流动海藻酸钠。 （J）搅拌器控制旋钮控制搅拌速度。 （K）电压控制旋钮调节0〜10千伏之间的电位差。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2： 测量与ImageJ的软件海藻酸钠微球通过单击文件→打开打开图像文件后，按照步骤 1：单击直线工具，借鉴海藻酸钠微珠一条线。第2步，单击菜单栏和弹出式窗口将出现在分析。重复步骤1和步骤2，直到所有微珠MEAsured。在步骤3，单击直线工具，画出整个比例尺一条线，测量比例尺的长度。通过公式转换微珠长度微米。比例尺的海藻酸钠/长度长度×500微米请点击此处查看该图的放大版本。
图3：最外层上聚电解质复合物的示意图海藻酸钠芯（深绿）正电荷鱼精蛋白层（浅绿色），负电荷肝素层（红色），骨生长因子， 例如 ，BMP-2 / NELL-1（淡蓝色）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 4： 海藻酸钠微球的亮场图像 （A）非照射。 （B）8M拉德照射。非辐照的海藻酸钠微球是球形和8M拉德照射对应的是泪滴形。放大100倍。 （比例尺= 500微米）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5：用鱼精蛋白，肝素的荧光类似物孵育，NELL-1和BMP-2的藻酸盐微球的共聚焦激光扫描显微镜图像 （A）的CF 405精蛋白（蓝色），（B）CF 594肝素（红色），（C ）FITC NELL-1（绿色），和（D 请点击此处查看该图的放大版本。
图6： 吸收和BMP-2和NELL-1的释放 （A）的NELL-1蛋白质（黑色）的摄取的BMP-2（红色），（B）的BMP-2（红色）和NELL-的累积释放曲线1从PEC载体（黑色）。结果以平均值±标准差。 请点击此处查看该图的放大版本。
<BR /> 图 7： 细胞毒性试验 （A）兔骨髓MTT法茎与鱼精蛋白基于PEC NELL-1 200毫克/毫升提取物（黑色），PEC-NELL-1 100毫克/毫升提取物（白）细胞1日和3（B）兔骨髓阿尔玛蓝测定茎用PEC BMP-2（蓝色）细胞，PEC（绿色）实验一式三份进行，结果以平均值±标准差。 请点击这里查看一个更大的版本这个数字。
图8：生物活性测定为BMP-2和PEC载体NELL-1释放 （A）和PEC-NELL-1（黑色），PEC（红色）培养兔骨髓干细胞碱性磷酸酶活性。 ALP活性在405nm测量吸光度。 2.2倍被温育后观察到的PEC-NELL-1在第14天（B）和PEC BMP-2（红色）PEC BMP-2 +加成BMP-孵育兔骨髓干细胞的ALP活性增加的ALP活性2（绿色）和PEC（蓝色）。增加ALP活性与PEC-BMP-2和PEC BMP-2 +加入BMP-2的在第7天温育后，ALP活性滴在9日（C）的 ALP兔骨髓干细胞的活性孵育PEC- BMP-2（红色）的BMP-2（蓝色）和中等（绿色）。结果以平均值±标准差。 请点击此处查看该图的放大版本。
图9： 聚己内酯磷酸三钙（PCL-TCP）支架挤满了PEC载体（A）Polycaprola。ctone三磷酸钙（PCL-TCP）支架（孔径1300微米）挤满了PEC载体。 （B）PCL-TCP支架。 （C）高倍率：PEC包装后保持其形状。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
该协议提出了通过层 - 层自组装制备的PEC的方法。的层 - 层结构，使用鱼精蛋白，肝素，BMP-2和NELL-1和共聚焦显微镜的荧光类似物可视化。吸收和释放试验表明，肝素对PEC介导成骨生长因子的吸收和释放。在PEC方法的摄取效率是：NELL-1：86.7±2.7％，BMP-2：70.5±3.1％。在PEC载体具有NELL-1（20％）释放的更好的调制相比，纯表面吸附载体如钙磷灰石颗粒（40-80％）11。
除了 调节释放，肝素中和过量的正电荷的聚阳离子，如鱼精蛋白，以避免不想要的细胞毒性相关的问题12。胸肌不显示细胞毒性的任何迹象，如通过MTT测定和的Alamar蓝测定7来确定。工党分析显示PEC载体可以保持BIOACTNELL-1和BMP-2二者的ivity。虽然成骨生长因子BMP-2治疗脊柱融合手术的发展，PEC还可以占用其他生长因子与肝素结合结构域，如NELL-1和PDGF-BB。相比其它递送方法，例如在聚乙醇酸微球的生长因子的封装，胸肌不需要倾向于失活生长因子13的有机溶剂。
一个数的PEC制造过程中的因素可能会影响运营商的表现。首先，微珠尺寸影响表面积/体积比。更高的成骨生长因子载荷可以用较小的微珠来实现。其次，藻酸盐浓度应足以保持微珠结构的稳定性。微珠稳定性取决于藻酸盐类，链长（受γ辐射）和所使用的二价离子（钡>锶>钙）。而2％藻酸盐溶液足以manufactu再有稳定微珠结构胸肌，需要4％藻以下8兆拉德γ辐射以补偿藻酸盐链缩短的照射期间的影响。第三，藻微珠体内降解速率强烈地受褐藻链长度的影响。基于我们从大鼠和猪模型的经验，PEC用8兆拉德照射藻示出了藻芯（未公布的数据）的快速（28天）和完全降解制成。海藻酸钠核心退化为骨质向内生长室至关重要。第四，BMP-2和NELL-1在4℃持续振荡（ 例如 ，每分钟30转）中过夜孵育可以提高吸收效率。最后，鱼精蛋白涂层厚度依赖于时间的。由于鱼精蛋白 - 肝素相互作用的程度上决定了成骨生长因子如BMP-2或NELL-1的释放，鱼精蛋白温育1小时，采用提高PEC结构的稳定性。
用于体内生物活性延长重要的。给予肝素参与和耦合用解毒剂的选择，在非常有限的量，即 ，鱼精蛋白，出血时间延长在去皮质骨（中和肝素的抗凝血活性高度有效的药物）是主要的理论和实践上无关紧要的。
加载胸肌到PCL-TCP支架在植入部位增强珠定位。支架提供必要的机械支撑是脊柱融合的关键。在本研究中，我们使用了1300微米的毛孔PCL-TCP支架，以方便适当的包装（ 图9）。虽然目前的插图显示与PCL-TCP脚手架PEC成骨生长因子交付，我们的团队也评价载体表现与聚醚（PEKK）骨髓腔与疗效相似一只兔子研究。
在这项研究中，缺乏与的rhBMP-2和NELL-1的其它先前评估的载体的比较可以代表一个限制。
总之，所提出的过程提供了控制的成骨生长因子的释放与肝素域，如BMP-2和NELL-1的有用的载体。所描述的策略结合许多优点：它不局限于BMP-2和适用于其它的生长因子与肝素结合结构域，如NELL-1。关于成骨生长因子减少剂量可以减少不希望的副作用，例如血清肿，异骨形成并降低治疗的总成本。
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Disclosures
我们没有任何利益冲突。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Life Science Acrodisc 25 mm Syring Filter with 0.2 µm Supor Membrane | PALL | PN4612 | Sterile protamine, heparin solution by ultrafiltration |
| 24 well plate | Cell Star | 662160 | |
| 96 well plate Nuclon Delta Surface | Thermo Fisher Scientific | 167008 | |
| (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide), MTT | Sigma Aldrich | M5655 | Measure cytotoxicity of PEC-NELL-1 |
| Acetone | Fisher Scientific | A/0600/17 | Precipitate CF-405 Labeled protamine |
| Alamar Blue | Invitrogen, Life Technologies | DAL 1025 | Measure cytotoxicity of PEC-BMP-2 |
| Alkaline Phosphatase Assay (ALP) assay kit | Anaspec | AS-72146 | |
| Ammonium Chloride | Merck | Art 1145 | Stop reagent in FITC labeling |
| Anhydrous Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Invitrogen, Life Technologies | D12345 | Solvent for fluorescent isothiocyanate I |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | Dissolve formazan | |
| Autoclave | Hirayama | HU-110 | Sterilize alginate beads by steam |
| Beta-glycerophosphate | Sigma Aldrich | G9422 | |
| BMP-2 (Infuse Bone Graft Large II Kit) | Medtronic Sofarmor Danek, Memphis TN, USA | 7510800 | Osteogenic Growth Factor, dialysis is needed to remove stabilizer component that interferes with FITC coupling |
| Carboxybenzoyl quinoline-2-Carboxaldehyde (CBQCA) | Thermo Fisher Scientific | A-6222 | To quantify NELL-1 protein |
| Cell Strainer (100 µm) | BD Science | 352360 | Hold PEC for ALP assay |
| Cell Scraper 290 mm Bladewide 20 mm | SPL Life Science | 90030 | Detach the cell from 24 well plate |
| CF 405S, Succinimidyl Ester | Sigma Aldrich | SCJ4600013 | Blue fluorescent dye for protamine labeling |
| CF 594, Hydrazide | Sigma Aldrich | SCJ4600031 | Deep red fluorescent dye for heparin labeling |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R | |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | Component of osteogenic growth medium |
| Dextran Desalting Columns | Pierce (Thermo Scientific) | 43230 | |
| DMEM | Gibco | 12320 | |
| BMP-2 Quantikine ELISA Kit | R&D System | DBP200 | Determine BMP-2 release |
| Fetal Bovine Serum FBS | Hyclone | SV30160.03 | |
| Fluoescein Isothiocyananate, Isomer I | Sigma Aldrich | F7250 | Green fluorescent dye for NELL-1 and BMP-2 labeling |
| ThinCert Cell Culture Inserts, For 24 Well plates, Sterile |
Greiner | 662630 | Prevents PEC wash out when changing osteogenic medium |
| Havard Appartus Syringe Pump (11 plus) | Havard Apparatus | 70-2208 | |
| n-Hexane (>99%) | Sigma Aldrich | 139386 | |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3149 | Binds with osteogenic growth factor with heparin binding domain |
| Hydrochloric acid (37%) | Merck | 100317 | Highly Corrosive |
| Incubator | Binder | C8150 | |
| MicroBCA Protein Assay kit | Thermoscientific | 23235 | |
| Microplate Reader | Tecan | Infinite M200 | For ALP and microBCA assays |
| Nisco cell encapsulator | Nisco Engineering Inc | Encapsulation unit VAR V1 | |
| Fluorescent Microscope | Olympus | IX71 | |
| mPCL-TCP Scaffold (Pore size is 1.3 mm) | Osteopore | PCL-TCP 0/90 | Hold PEC for in vivo study |
| Penicillin-Streptomycin 10,000 unit/ml, 100 ml | Hyclone Cell Culture | SV30010 | Antibiotic |
| 10x Phosphate Buffered Saline (PBS) | Vivantis | PB0344-1L | 10x Solution, Ultra Pure Grade |
| Poly-L-Lysine MW 15,000-30,000 | Sigma Aldrich | P2568 | Polycation |
| Protamine Sulfate salt, from Salmon | Sigma Aldrich | P4020 | Polycation |
| Shaker | Labnet | S2025 | |
| Snakeskin Dialysis Tubing 3,500 MWCO 22 mm x 35 feet | Thermo Fisher Scientific | 68035 | Remove unreacted FITC by dialysis |
| Sodium Chloride | Merck | 1.06404.1000 | |
| Sodium Hydroxide | Qrec | S5158 | |
| Sodium Bicarbonate | US Biological | S4000 | Buffer |
| Sodium carbonate | Sigma Aldrich | S7795-500G | Buffer |
| Strontium Chloride Hexahydrate | Sigma Aldrich | 255521 | Crosslinker for alginate |
| Spatula | 3dia | ||
| 5 ml syringe | Terumo | 140425R | Diameter of syringe affects the flow rate |
| 75 cm2 Cell Culture Flask Canted Neck | Corning | 730720 | |
| Toluidine Blue | Sigma Aldrich | 52040 | Heparin assay |
| Trypsin 1x | Hyclone Cell Culture | SH30042.01 | |
| Sodium alginate | Novamatrix (FMC Biopolymer, Princeton, NJ) | Pronova UPMVG | Core material of microbeads |
References
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