Abstract
Under rekonstruktiv bein operasjoner, er suprafysiologiske mengder av vekstfaktorer empirisk lastet på stillasene for å fremme vellykket bein fusion. Store doser av meget potente biologiske stoffer er nødvendig på grunn av vekstfaktor ustabilitet som et resultat av rask enzymatisk nedbrytning, så vel som bærer ineffektivitet i lokaliserende tilstrekkelige mengder av vekstfaktor ved implantatsteder. Derfor strategier som forlenger stabiliteten av vekstfaktorer så som BMP-2 / NELL-1, og kontrollere deres frigivelse kan faktisk redusere deres effektiv dose, og således redusere behovet for større doser under fremtidige benregenerering operasjoner. Dette i sin tur vil redusere bivirkninger og vekstfaktorer. Selv montert PEC er fabrikkert for å gi bedre kontroll med BMP-2 / NELL-en levering via heparin bindende og ytterligere forsterke vekstfaktor bioaktivitet ved å styrke in vivo stabilitet. Her viser vi enkelhet av PEC fabrikasjon som hjelpemidler i å levere denry av en rekke vekstfaktorer ved rekonstruktiv kirurgi bein.
Introduction
Forekomsten av pseudoarthrosis er blitt rapportert å være så høy som 10 til 45% i degenerativ spinal fusjon og revisjon spinal kirurgi 1. For å redusere frekvensen av pseudartrose under fremre fusjon og andre rekonstruktiv bein operasjoner, osteogene vekstfaktorer som BMP-2, Nell-1 1 og blodplater avledet vekstfaktor (PDGF) har blitt introdusert for å fremme de novo osteogenesis. Blant disse er BMP-2 et populært valg for spinal fusjon to. Selv om styrken av BMP-2 ved indusering og tilrettelegge ny bendannelse har blitt godt etablert 3; klinisk signifikante komplikasjoner som heterotop beindannelse, serom og hematomdannelse, betennelsesreaksjon, radikulitt, ryggvirvel kroppen osteolyse, og retrograd ejakulasjon fortsette å være saker av interesse på grunn av de suprafysiologiske beløp benyttet 4,5.
Derfor senke dosen av BMP-2 er fortsatt et relevant strategi vedfrister å minimalisere bivirkninger. Dessuten er effektive bæresystemer som kreves for å undertrykke den første serie utgivelsen av BMP-2 observert i moderne kollagen svamp bæresystemer og ytterligere forbedre langvarig og lokalisert levering av denne potente cytokin. Lag-på-lag selvbygging av alternerende kationiske og anioniske polyelektrolytter kan anvendes som en fleksibel fremgangsmåte for å bygge opp polyelektrolyttkomplekser på overflaten av stillas matriser eller implanterbare materialer 6. I denne forbindelse er heparin (kjent for å ha den høyeste negative ladningstetthet på alle biologiske faktorer) vært kjent for å begjærlig binde seg med en rekke vekstfaktorer via elektrostatiske og heparin-bindende domener. Faktisk har heparin er vist å forlenge halveringstiden og således forsterke bioaktiviteten av flere vekstfaktorer.
Basert på dette, vår gruppe tilpasset et lag-på-lag selv-montering protokollen for å dikte opp en heparin-baserte polyelektrolytkompleks (PEC) som belastninger og bevarer bioaktivitet av osteogene vekstfaktorer under immobilisering 7,8. Alginatet mikroperler Kjernen ble fremstilt ved tverrbinding av α-L-guluronate (G) rester av alginat med toverdig kation kalsium- eller strontiumioner. Alginatet kjerne er en bionedbrytbar matrise stillas; som etter implantering, er det resorberes i fusjons seng som gir plass for beninnvekst. Poly-L-lysin (PLL) eller protamin anvendes som kationiske laget for å sammenflettes med både stillaset matrise (i dette tilfellet, alginat mikrobæreren kjerne) og den negativt ladet heparin; mens de anioniske heparin laget virker til å stabilisere og lokalisere lastet vekstfaktorer. Trelags PEF har vist seg å øke vekstfaktor lastekapasitet i et svine-modell 9. Nylig har PEC bærere vist seg å kunne redusere den effektive dose av BMP-2 med minst 20 ganger hos rotte 10 og svinemodeller av spinal fusjon 8.
ntent "> Her rapporterer vi metoder for fabrikere PEC for økt vekstfaktor levering i spinal fusion og de andre rekonstruktiv bein operasjoner ved hjelp av BMP-2 som modell osteogene vekstfaktor.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Alginat Løsning Forberedelse
- Oppløs 200 mg natriumalginat (ubestrålt) eller 400 mg 8 Mrad bestrålt natriumalginat i 10 ml dobbeltdestillert vann og det hele rystes i en time for ikke-utstrålt alginat og 15 min for bestrålt alginat. Oppbevar alginatoppløsning ved 4 ° C over natten. Filtrer den alginatoppløsning med en steril 0,2 um sprøytefilter før alginat mikroperle fabrikasjon.
2. Alginat mikro Fabrication
- Desinfiser elektro perle generator og sprøytepumpe med 70% etanol og plassere dem i en klasse II biologisk sikkerhetskabinett (figur 1).
- Plassere et glass vask med en magnetisk rørestav inne vulsten generator.
- Innstill armen elektrode av vulsten generatoren 9 cm over vasken.
- Koble elektroden kabelen av vulsten generatoren til den riflede skruen 2 av armen elektrode, og hell 80 ml SrCl 2 løsning ibasseng.
- Belastning 5 ml 0,2 um filtrert alginat oppløsningen inn i sprøyten og gummirøret. Etter tilkobling av gummirøret til armen elektrode, skru på sprøytepumpen på 5 ml / time i 2 min for å drive ut luften inne i produksjonsrøret og levere den alginatoppløsning til spissen av munnstykket. Slå av sprøytepumpe.
- Deretter slår du på lamine og da, for å sprøytepumpen starte mikro generasjon. Innstill alginat strømningshastighet på 5 ml / time og spenningen ved 5,8 kV på laminerings. Kast mikroperlene som genereres i løpet av de første to minutter (eller innledende 0,5 ml alginat-oppløsning pumpet ut av sprøyten), som disse mikrokuler har en tendens til å være uregelmessig størrelse og form.
- Utlevering følgende mikroperler i 0,2 M strontiumklorid oppløsning. Slå av både sprøytepumpen og lamine (i den rekkefølgen) etter pumping pre-planlagte volum av alginat løsning. Gjenta dette for etterfølgende grupper av mikro fabrikasjon. Ved ferdigstillelse, slå avf sprøytepumpen først, etterfulgt av lamine.
- Oppbevar mikroperlene i 20 ml 0,2 M strontiumklorid oppløsning ved 4 ° C over natten for å fullføre tverrbinding og stabilisere gelen.
3. Størrelse Måling av Alginat mikroperler
- Samle 0,5 ml av alginat mikro med en plast pipette og plassere den på et objektglass. Vis mikroperlene under en optisk mikroskop på 10X forstørrelse. Ta ti bilder av mikro med et mikroskop CCD kamera. Lagre bildene med skala bar (500 mikrometer) i TIFF-format med oppløsning 2048 x 1536.
- Bruke lengde verktøy i ImageJ, måle størrelsen på mikroperler og skala bar (figur 2). Konverter mikroperler lengde fra pixel til mikrometer.
- Klikk på linjen verktøy og trekke en linje over midten av alginat perle.
- Klikk "Analyser" på menylinjen og velg "Mål". En pop-up vindu vil vises.
- Konverter diameteren av alginat vulsten til den faktiske lengden ved hjelp av formelen: lengde av alginat vulst / lengde av målestokken x 500 um. For eksempel 1.420 (diameter målt ved ImageJ) / 2,657 (skala bar lengde målt ved ImageJ) * 500 mikrometer = 267 mikrometer.
- Vurdere den gjennomsnittlige størrelse på 100 mikroperler (gjennomsnitt ± standardavvik) som representant størrelsen på hvert parti av mikroperler.
4. Sterilisering
- Samle mikroperler ved hjelp av en 100 mikrometer nylon sil og vaske perlene med dobbelt destillert vann.
- Ved hjelp av en slikkepott, overføre alle mikro laget fra 0,1 ml alginat løsning i et 2 ml mikrosentrifugerør og dekk med gasbind for å hindre uttørking.
- Til slutt, sterilisere mikroperlene ved autoklavering ved hjelp av væske-modus (115 ° C, 15 min), eller i overensstemmelse med sm.p.anufacturer spesifikasjoner. Tilsett 1,5 l destillert vann til kammeret for å hindre kulene fra tørking.
5. Protamine og Heparin Coating
- Inne i BSL-2 hette, inkuber sterile mikroperler med 1 ml 2 mg / ml protamin oppløsning (sterilisert ved bruk av et 0,2 um sprøytefilter) i 1 time ved romtemperatur.
- Etter inkubering mikroperlene i 1 time (trinn 5.1), samle 150 ul av protamin oppløsningen for mikro bicinchoninic syre (microBCA) test (seksjon 6).
- Vask protamin-belagt mikro to ganger med dobbeltdestillert vann. Spinn ned ved hjelp av en benk topp sentrifuger ved 200 xg i 3 min ved romtemperatur. Etter sentrifugering suge vannet ved hjelp av en sprøyte.
- Inkuber protamin belagte mikrokuler med 1 ml 0,5 mg / ml heparin-løsning (sterilisert ved bruk av et 0,2 um sprøytefilter) i 30 minutter for å skape polyelektrolytkompleks (PEC).
- Etter inkubasjon av protamin belagt mikro feller 30 min (trinn 5.4), samle 400 ul av heparin løsning for å avgjøre heparin innhold (kapittel 7).
- Etter inkubasjon vaske av ubundet heparin fra PEC ved å vaske to ganger med dobbelt destillert vann.
6. Protamine innhold
- Utfør microBCA test i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet, tilsett 150 ul protamin oppløsning (samlet før og etter inkubasjon med mikroperler) inn i en 96-brønners plate. Tilsett 150 ul microBCA arbeidsløsning.
- Bruke albumin-oppløsning (0, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20, 40 og 200 ug / ml) som kalibreringsstandarder.
- Inkuber blandingen i 60 minutter ved 60 ° C. Mål absorbansen med et spektrofotometer ved 562 nm.
- Bruke standardkurven for å bestemme konsentrasjonen av hver protamin ukjent prøve i henhold til produsentens instruksjoner.
- Bestem protamin innhold av mikroperlene ved å subtrahere den totale mengden av protamin ibeleggoppløsning (før inkubering med mikroperler) fra mengden av protamin som er igjen i beleggsløsningen (etter inkubasjon med mikroperler).
7. Heparin innhold
- Fremstille 10 ml arbeidsløsning ved å oppløse 4 mg toluidinblått og 20 mg natriumklorid i 0,01 N saltsyre.
- Tilsett 400 ul prøve (fra trinn 5.5) til arbeidsoppløsningen ved et forhold på 2: 3 og virvle i 30 sek.
- Legg 600 mL n-heksan (ekvivalent volum til arbeids reagensoppløsningen) og vortex blandingen for å ekstrahere toluidinblått heparin-komplekset.
- Sug av 200 ul av den vandige fase ved å sprøyte etter faseseparasjon.
- Måle mengden av un-ekstrahert toluidinblått som inneholdes i den vandige fasen ved hjelp av et spektrofotometer ved 631 nm.
- Fremstille heparin standardløsninger på 0-20 ug / ml.
- Plott 631 nm avlesning av hver heparin standard lignet med heparin-konsentrasjonen i ug / ml. Bruke standardkurven for å fastslå konsentrasjonen av heparin hver prøve.
8. Confocal Bilde av Layer-på-lag Structure
- Fremstill protamin, heparin og NELL-1 / BMP-2 fluoriserende analog CF-405 protamin (blå), CF 594 heparin (rød) og FITC-merket NELL-1 / FITC-merket (grønn) BMP-2 + heparin + protamin i henhold til produsentens Teknisk dataark.
- Coat 100 ug mikroperler med 300 ul av fluoriserende analog (belegg-metoden som beskrevet i 5.3 til 5.6) CF-405 protamin (blå) (2 mg / ml, 1 time inkubasjon), CF 594 heparin (rød) (0,5 mg / ml, 30 min) og FITC-merket NELL-1 / FITC-merket (grønn) BMP-2 (1,5 mg / ml, over natten). Vask mikroperlene to ganger med destillert vann for å fjerne det ubundne fluorescerende protamin, heparin og NELL-1 / BMP-2.
- Observere lag-for-lag struktur (figur 3) ved hjelp av et konfokalt mikroskop ved 10X forstørrelse. 7
9. BMP-2og NELL-1 Opptak og utløsning
- Last 13,3 ul av 1,5 mg / ml BMP-2 eller NELL-en oppløsning på 100 ug av PEF. Inkuber PEC ved 4 ° C under 30 opm ryster i 10 timer.
- Dyppe mikroperlene i 1 ml fosfat-buffret saltvann (PBS) ved 37 ° C med konstant risting (30 rpm).
- Samle 1 ml av supernatanten og erstatte den med 1 ml PBS etter 1, 3, 6, 10 og 14 dager.
- Evaluere opptak og slipper effektivitet av BMP-2 ved anvendelse av ELISA-metoden i henhold til produsentens protokoll. Evaluere opptak og slipper effektivitet i nell-1 ved anvendelse av karboksybenzoyl kinolin-2-karboksaldehyd (CBQCA) proteinanalysemetoden i henhold til produsentens protokoll.
- Bestem kumulativ utgivelsen på tiden (t):
Akkumulert utgivelsen på tiden (t) = Slipp på tiden (t) + Forrige utgivelse på tid (t-1). - Plott kumulative frigjøring av BMP-2 og NELL-en mot tiden.
10. In Vitro bioaktivitetav NELL-1
Merk: Bioaktiviteten i nell-en frigjøres fra PEF ble undersøkt ved å måle dens evne til å øke ekspresjonen av alkalisk fosfatase (ALP) i kanin benmarg stamceller (rBMSC).
- Seed 20.000 rBMSCs per brønn i en 24-brønners plate og tillate dem å vokse for en dag med 1 ml av Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) + 10% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C og 5% CO2.
- Etter 24 timer erstatte mediet med 1 ml av et osteogent medium (DMEM supplementert med 10% FBS, 2% penicillin streptomycin 50 ug / ml askorbinsyre, 10 mmol / l-beta-glycerofosfat, og 10 -8 mol / l deksametason ) i 7 dager ved 37 ° C og 5% CO2.
- Plasser 300 ug PEF-NELL-1 (fra trinn 8.2) og PEF innvendig celledyrkningsinnsatser (TC sett) for å holde PEC atskilt fra cellene (dette hindrer utvasking av PEF-mikroperler i løpet av osteogene medium endring). Place TC sette inn i 24 vel plspiste i 14 dager.
- Når hver tredje dag, aspirer 1 ml av osteogene medium ved å plassere en nål utenfor TC innsats, og erstatte med 1 ml frisk osteogene medium.
- Etter 7 og 14 dagers inkubering, bestemme ALP-aktivitet med en ALP analysesett i samsvar med settet produsentens protokoll.
- Lyse celler med analysebuffer inneholdende 0,1% TritonX-100 ved 4 ° C i 10 min. Skrap av levd cellene ved hjelp av en celle skrape. Inkuber cellesuspensjonen ved 4 ° C under omrøring i minst 60 min.
- Sentrifuger cellesuspensjonen ved 2500 xg ved 4 ° C i 10 min. Samle supernatanten for ALP analysen.
- Tilsett 50 ul fortynnet i serie alkalisk fosfatase standardløsning 200-0 ng / ml til brønnene i en 96-brønners plate. De endelige mengder av alkalisk fosfatase standard er 10, 5, 2,5, 1,2, 0,6, 0,3, 0,15, og 0 ng / brønn.
- Legg supernatanten fra trinn 10.5.2 (50 ul / brønn) og fortynnet med fortynning bUffer.
- Tilsett 50 ul p-nitrofenylfosfat (pNPP) substratløsning i hver brønn. Blanding av reagensene ved forsiktig risting platen i 30 sekunder. Inkuber blandingen i 30 min i mørket. Mål absorbansen ved 405 nm av plateleser.
- Beregn ALP aktivitet ved anvendelse av kalibreringskurven.
- Bestem proteininnhold ved hjelp av microBCA protein assay kit i henhold til produsentens instruksjoner. Normalisere ALP-aktivitet ved å dividere ALP aktivitet av proteininnhold.
11. celleviabilitet
- Inkuber 200 mg PEF-NELL-1 med 1 ml DMEM + 10% FBS ved 37 ° C i 24 timer for 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) analyse.
- Seed 2.000 rBMSCs per brønn (i 100 ul DMEM med 10% FBS) i en 96-brønners plate og inkuberes i 1 dag ved 37 ° C, 5% CO2.
- Bytt DMEM + 10% FBS med 100 ul PEC-NELL-1 / PEC ekstrakt og inkuberved 37 ° C, 5% CO2.
- Etter en dag eller 3 dagers inkubasjon, tilsett 10 ul av 5 mg / ml MTT-oppløsning og ytterligere inkubasjon ved 37 ° C, 5% CO2 i 4 timer i mørket.
- Tilsett 100 ul DMSO-oppløsning til hver brønn for å oppløse formazankrystaller.
- Bestem absorbansen ved 570 nm ved hjelp av en mikroplateleser.
- Beregn den relative vekstrate:
12. Emballasje inn Stillas og BMP-2 & NELL-1 Loading
- Pakke PEC inn i porene i et bioresorberbart medisinsk kvalitet Polykaprolakton - tri-kalsiumfosfat (mpCl-TCP) stillaset ved hjelp av en sterilisert spatel i en BSL-2 kammeret.
- Tilsett 1,5 mg / ml oppløsning av BMP-2 eller NELL-1 på mpCl-TCP stillas pakket med PEF og inkuber over natten ved 4 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I vår transportør, ble protamin valgt som en erstatning av poly-L-lysin som det har lignende kjemiske egenskaper, og det er FDA godkjent som en motgift av heparin. Optisk mikroskop Resultatene viste at de ikke-bestrålte mikroperler var sfærisk form med en diameter på 267 ± 14 um. (0,35 mm dyse, strømningshastighet på 5 ml / time og 5,8 kV). De fleste av de bestrålte mikroperlene er i dråpeform. Den måles på den runde del av de bestrålte mikroperler diameter var 212 ± 30 pm (0,35 mm dyse, strømningshastighet på 4 ml / time og 6 kV). (Figur 4).
Konfokale bilder av PEC mikro avdekke lag-for-lag belegg av CF-405-merket protamin (blå), CF594-merket heparin (rød) og FITC-BMP-2 / FITC-NELL-1 (grønn). Resultatene indikerer at PEC kan binde seg med positivt ladede BMP-2 og negativt ladet NELL-en via heparin binding domene (Figur 5). Dette tyder på at samspillet mellom PEC og osteogene vekstfaktorer ikke er betalt avhengig.
For å bevise at PEC kan opptak og avgivelse BMP-2, anvendte vi en ELISA-analyse for å bestemme mengden av BMP-2 som blir igjen etter inkubasjon og mengden av BMP-2 i PBS på dag 1, 3, 6, 10 og 14 . Men en lignende tilnærming fungerer ikke godt med NELL-1 protein, siden heparin blokkerer antistoffbindingssetet, noe som reduserer signal. Derfor ble CBQCA proteinanalysen benyttes til å bestemme differansen mellom PEF-NELL-1 og PEF. Fra den kumulative utgivelsen kurve, PEC ikke bare vise en høyere NELL-en opptakseffektivitet i forhold til BMP-2, men også slipper den mye tregere enn BMP-2 (NELL-1: 20% vs. BMP-2: 25%) (figur 6). Dette tyder på at PEC binde tettere med NELL-en enn BMP-2.
From den MTT-analysen, PEF-NELL-1 er ikke cytotoksisk (figur 7). Resultatet samsvarer med Alamar blå analyse resultat i en tidligere studie 7. Heparin nøytraliserer den positive ladningen av protamin som spiller en viktig rolle i å opprettholde det biologiske forenelighetsmiddel av PEF.
For å avgjøre om NELL-en utgivelse fra PEC påvirker langsiktig osteogene differensiering, uttrykket nivået av en osteogent markør, alkalisk fosfatase (ALP), ble undersøkt av en kolo analysen. NELL-1-frigivelse fra PEC øker ALP aktiviteten av kanin benmarg stamceller med 2,2 ganger på dag 14 sammenlignet med den anvendte PEF kontrollgruppen (figur 8). BMP-2 viser maksimal økning av ALP aktivitet (3,75 ganger) på dag 7. Begge PEC-BMP-2 og PEC-BMP-2 + ekstra BMP-2 viser nedgang aktivitet på dag 9.
ALP aktivitet med BMP-2 i mediet uten PEF er vist i
Figur 1: Elektro perle generator og sprøytepumpen satt opp i BSL-2 biosikkerhet kabinett (A) Dyse sikret på dyseholderen.. (B) Big bassenget for strontium-oppløsning. (C) elektrodekabelen. (D) Hose leverer alginat løsning. (E) Dyse holder og arm. (F) Elektroder forsyning than potensialforskjell for å regulere perlestørrelse. (G) magnetrører. (H) 5 ml sprøyte. (I) sprøytepumpe for å regulere strømningen alginat. (J) Agitator knappen for å kontrollere omrøringshastighet. (K) Spenning bryteren til å regulere spenningsforskjellen mellom 0-10 kV. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Måling alginat mikroperler med ImageJ programvare Etter åpning av bildefilen ved å klikke på Fil → Åpne, følger Trinn 1:. Klikk på linjen verktøyet og tegne en linje på alginat mikroperler. I trinn 2, klikker Analyser på menylinjen og et pop-up vindu vil vises. Gjenta trinn 1 og trinn 2 til alle mikro er meanes. I trinn 3, klikker du på linjen verktøyet, tegne en linje over målestokken og måle lengden på målestokken. Konverter mikroperler lengde til mikrometer ved hjelp av formelen:. Lengde på alginat / lengde Scale bar x 500 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 3: Skjematisk fremstilling av polyelektrolytkompleks Alginat kjerne (mørkegrønn) positiv ladning protamin lag (blek grønn), negativt ladet heparin lag (rød), osteogene vekstfaktor, f.eks, BMP-2 / NELL-1 på ytterste lag (blek blå). klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4:. Bright felt bilder av alginat mikroperler (A) Ikke-bestrålt. (B) 8M Rad bestrålt. Ikke-bestrålte alginat microbeads er sfærisk og 8M Rad bestrålt motstykke er dråpeformet. Forstørrelse 100X. (Scale bar = 500 mikrometer.) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 5: Confocal laser scanning mikroskopi bilder av alginat mikro inkubert med fluorescerende analoger av protamin, heparin, NELL-1 og BMP-2 (A) CF 405 Protamin (blå), (B) CF 594 Heparin (rød), (C ) FITC NELL-1 (grønn), og (D Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6:. Opptak og frigjøring av BMP-2 og NELL-1 (A) Opptak i nell-1 protein (sort) BMP-2 (rød), (B) Kumulativ frigivelse kurve av BMP-2 (rød) og NELL- 1 (svart) fra PEC transportør. Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
<br /> Fig. 7: Cytotoksisitet Assay (A) MTT-analysen av kanin benmarg stammer celle med protaminsulfat basert PEC NELL-en 200 mg / ml ekstrakt (sort), PEF-NELL-en 100 mg / ml ekstrakt (hvit) ved dag 1 og 3. (B) Alamar blå analyse av kanin benmarg stammer celle med PEC BMP-2 (blå), PEC (grønn) Forsøkene ble utført i tre eksemplarer og resultatene er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik. klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8: bioaktivitet analyse for BMP-2 og NELL-en utgivelse fra PEC bærer (A) ALP aktivitet kanin benmarg stamceller inkuberes med PEC-NELL-1 (svart), PEC (rød).. ALP-aktivitet ble målt som absorbans ved 405 nm. 2.2gangers økning i ALP aktivitet ble observert etter inkubering med PEC-NELL-1 på dag 14. (B) ALP aktivitet av kanin benmarg stamcelle inkubert med PEC-BMP-2 (rød) PEC-BMP-2 + tilsetning av BMP- 2 (grønn) og PEC (blå). Økning i ALP-aktivitet etter inkubering med PEC-BMP-2 og PEF-BMP-2 + tilsetning av BMP-2 ved dag 7, ALP aktivitet faller på dag 9. (C) ALP aktivitet av kanin benmarg stamcelle inkubert med PEC- BMP-2 (rød) BMP-2 (blå) og middels (grønn). Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9: Polykaprolakton Tri-kalsiumfosfat (PCL-TCP) stillaset pakket med PEC carrier (A) Polycaprola.ctone Tri-kalsiumfosfat (PCL-TCP) stillas (porestørrelse 1300 mikrometer) fullpakket med PEC transportør. (B) PCL-TCP stillaset. (C) Høy forstørrelse: PEC opprettholder sin form etter pakking. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen presenterer en metode for fremstilling av PEC gjennom lag-på-lag selv-sammenstillingen. Lag-på-lag struktur er anskueliggjort ved hjelp av fluorescerende analoger av protamin, heparin, BMP-2 og NELL-1 og konfokal mikroskopi. Opptak og frigjøringsforsøkene viser at heparin på PEC formidler osteogene vekstfaktor opptak og utslipp. Opptaket effektiviteten av PEC-metoden er: NELL-1: 86,7 ± 2,7%, BMP-2: 70,5 ± 3,1%. PEF bæreren har en bedre modulasjon av NELL-1 (20%) frigjøring sammenlignet med en ren overflate adsorpsjon bærer slik som kalsium apatitt partikler (40-80%) 11.
Foruten modulerende utgivelse, nøytraliserer heparin overdreven positiv ladning av polykationene som protamin å unngå uønsket cytotoksisitetstester relaterte spørsmål 12. Pecs ikke viser noen tegn til cytotoksisitet, som bestemmes av MTT analyse og Alamar blå analyse 7. Den ALP analysen viser PEC transportøren kan opprettholde Bioactivity av både NELL-1 og BMP-2. Selv utviklet for osteogene vekstfaktor BMP-2 terapi i spinal fusion operasjoner, kan PEC også ta opp andre vekstfaktorer med heparin bindende domener som NELL-1 og PDGF-BB. Sammenlignet med andre leveringsmetoder, slik som innkapsling av vekstfaktorer i polyglykolsyre-mikrokuler, gjør PEC ikke krever organiske oppløsningsmidler som har en tendens til å inaktivere vekstfaktorer 13.
En rekke faktorer i PEC fabrikasjon prosedyren kan påvirke bære ytelse. For det første påvirker mikroperlestørrelsen overflateareal / volumforhold. Høyere osteogene vekstfaktor lasting kan oppnås med mindre mikroperler. Dernest bør alginat konsentrasjonen være tilstrekkelig til å opprettholde stabiliteten av den mikrostruktur. Mikroperler stabilitet avhenger av alginat typen, kjedelengde (påvirket av gammastråling) og den divalente ion brukes (barium> strontium> kalsium). Mens 2% alginat oppløsning er tilstrekkelig til å produseresre PEC med stabile mikrostrukturer, er 4% alginat nødvendig etter 8 Mrad gammastråling for å kompensere for effekten av alginat kjeden forkorting under bestråling. For det tredje, er hastigheten av in vivo nedbrytning av alginat mikroperler sterkt påvirket av alginat kjedelengde. Basert på vår erfaring fra rotte og svin modeller, PEC fabrikkert ved hjelp av 8 Mrad bestrålt alginat viser rask (28 dager) og fullstendig nedbrytning av alginat kjernen (upubliserte data). Degradering av alginat kjernen gir rom avgjørende for beninnveksten. For det fjerde kan det inkubering over natten av BMP-2 og NELL-1 ved 4 ° C med konstant risting (f.eks, 30 rpm) forbedre opptak effektivitet. Endelig er det protamin beleggtykkelsen tidsavhengig. Siden utstrekningen av protamin-heparin interaksjon bestemmer frigjøringen av osteogene vekstfaktorer så som BMP-2 eller NELL-en, blir en time av protamin inkubasjon i bruk for å forbedre stabiliteten av den anvendte PEF struktur.
in vivo bioaktivitet. Gitt svært begrenset mengde av heparin som er involvert og kombinert med valget av motgift, dvs. protamin (et meget effektivt medikament i å nøytralisere de antikoagulerende aktivitet av heparin), forlenget blødningstid i decorticated ben er stort sett teoretisk og praktisk talt uten betydning.
Legge Pecs inn i PCL-TCP stillaset forbedrer lokalisering av perler på implantat nettsteder. Stillaser gi nødvendig mekanisk støtte som er avgjørende for fremre fusjon. I dagens studier, brukte vi PCL-TCP stillasene med 1300 mikrometer porer å lette riktig pakking (figur 9). Selv om den nåværende illustrasjonen viser PEC osteogene vekstfaktor levering med PCL-TCP stillaset, har vår gruppe også vurdert carrier ytelse med en Polyetherketonketon (PEKK) Bein kammer i en kanin studie med tilsvarende effekt.
I denne studien, kan mangelen på sammenligning med andre tidligere evaluert bærere av rhBMP-2 og NELL-1 representerer en begrensning.
I konklusjonen, gir det fremlagte prosedyren en nyttig operatør for å kontrollere utslipp av osteogene vekstfaktorer med heparin domener som BMP-2 og NELL-1. Den beskrevne strategien kombinerer mange fordeler: det er ikke begrenset til BMP-2 og gjeldende for andre vekstfaktorer med heparin bindende domener som NELL-1. Dosereduksjon på osteogen vekstfaktor kan redusere uønskede bivirkninger som serom, heterotrofe beindannelse og redusere de samlede kostnadene av behandlingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingen interessekonflikt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Life Science Acrodisc 25 mm Syring Filter with 0.2 µm Supor Membrane | PALL | PN4612 | Sterile protamine, heparin solution by ultrafiltration |
| 24 well plate | Cell Star | 662160 | |
| 96 well plate Nuclon Delta Surface | Thermo Fisher Scientific | 167008 | |
| (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide), MTT | Sigma Aldrich | M5655 | Measure cytotoxicity of PEC-NELL-1 |
| Acetone | Fisher Scientific | A/0600/17 | Precipitate CF-405 Labeled protamine |
| Alamar Blue | Invitrogen, Life Technologies | DAL 1025 | Measure cytotoxicity of PEC-BMP-2 |
| Alkaline Phosphatase Assay (ALP) assay kit | Anaspec | AS-72146 | |
| Ammonium Chloride | Merck | Art 1145 | Stop reagent in FITC labeling |
| Anhydrous Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Invitrogen, Life Technologies | D12345 | Solvent for fluorescent isothiocyanate I |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | Dissolve formazan | |
| Autoclave | Hirayama | HU-110 | Sterilize alginate beads by steam |
| Beta-glycerophosphate | Sigma Aldrich | G9422 | |
| BMP-2 (Infuse Bone Graft Large II Kit) | Medtronic Sofarmor Danek, Memphis TN, USA | 7510800 | Osteogenic Growth Factor, dialysis is needed to remove stabilizer component that interferes with FITC coupling |
| Carboxybenzoyl quinoline-2-Carboxaldehyde (CBQCA) | Thermo Fisher Scientific | A-6222 | To quantify NELL-1 protein |
| Cell Strainer (100 µm) | BD Science | 352360 | Hold PEC for ALP assay |
| Cell Scraper 290 mm Bladewide 20 mm | SPL Life Science | 90030 | Detach the cell from 24 well plate |
| CF 405S, Succinimidyl Ester | Sigma Aldrich | SCJ4600013 | Blue fluorescent dye for protamine labeling |
| CF 594, Hydrazide | Sigma Aldrich | SCJ4600031 | Deep red fluorescent dye for heparin labeling |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R | |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | Component of osteogenic growth medium |
| Dextran Desalting Columns | Pierce (Thermo Scientific) | 43230 | |
| DMEM | Gibco | 12320 | |
| BMP-2 Quantikine ELISA Kit | R&D System | DBP200 | Determine BMP-2 release |
| Fetal Bovine Serum FBS | Hyclone | SV30160.03 | |
| Fluoescein Isothiocyananate, Isomer I | Sigma Aldrich | F7250 | Green fluorescent dye for NELL-1 and BMP-2 labeling |
| ThinCert Cell Culture Inserts, For 24 Well plates, Sterile |
Greiner | 662630 | Prevents PEC wash out when changing osteogenic medium |
| Havard Appartus Syringe Pump (11 plus) | Havard Apparatus | 70-2208 | |
| n-Hexane (>99%) | Sigma Aldrich | 139386 | |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3149 | Binds with osteogenic growth factor with heparin binding domain |
| Hydrochloric acid (37%) | Merck | 100317 | Highly Corrosive |
| Incubator | Binder | C8150 | |
| MicroBCA Protein Assay kit | Thermoscientific | 23235 | |
| Microplate Reader | Tecan | Infinite M200 | For ALP and microBCA assays |
| Nisco cell encapsulator | Nisco Engineering Inc | Encapsulation unit VAR V1 | |
| Fluorescent Microscope | Olympus | IX71 | |
| mPCL-TCP Scaffold (Pore size is 1.3 mm) | Osteopore | PCL-TCP 0/90 | Hold PEC for in vivo study |
| Penicillin-Streptomycin 10,000 unit/ml, 100 ml | Hyclone Cell Culture | SV30010 | Antibiotic |
| 10x Phosphate Buffered Saline (PBS) | Vivantis | PB0344-1L | 10x Solution, Ultra Pure Grade |
| Poly-L-Lysine MW 15,000-30,000 | Sigma Aldrich | P2568 | Polycation |
| Protamine Sulfate salt, from Salmon | Sigma Aldrich | P4020 | Polycation |
| Shaker | Labnet | S2025 | |
| Snakeskin Dialysis Tubing 3,500 MWCO 22 mm x 35 feet | Thermo Fisher Scientific | 68035 | Remove unreacted FITC by dialysis |
| Sodium Chloride | Merck | 1.06404.1000 | |
| Sodium Hydroxide | Qrec | S5158 | |
| Sodium Bicarbonate | US Biological | S4000 | Buffer |
| Sodium carbonate | Sigma Aldrich | S7795-500G | Buffer |
| Strontium Chloride Hexahydrate | Sigma Aldrich | 255521 | Crosslinker for alginate |
| Spatula | 3dia | ||
| 5 ml syringe | Terumo | 140425R | Diameter of syringe affects the flow rate |
| 75 cm2 Cell Culture Flask Canted Neck | Corning | 730720 | |
| Toluidine Blue | Sigma Aldrich | 52040 | Heparin assay |
| Trypsin 1x | Hyclone Cell Culture | SH30042.01 | |
| Sodium alginate | Novamatrix (FMC Biopolymer, Princeton, NJ) | Pronova UPMVG | Core material of microbeads |
References
- Yuan, W., et al. NELL-1 based demineralized bone graft promotes rat spine fusion as compared to commercially available BMP-2 product. Orthop Sci. 18, 646-657 (2013).
- Anderson, C. L., Whitaker, M. C. Heterotopic ossification associated with recombinant human bone morphogenetic protein-2 (infuse) in posterolateral lumbar spine fusion: a case report. Spine. 37, 502-506 (2012).
- Glassman, S. D., et al. RhBMP-2 versus iliac crest bone graft for lumbar spine fusion: a randomized, controlled trial in patients over sixty years of age. Spine. 33, 2843-2849 (2008).
- Tannoury, C. A., An, H. S. Complications with the use of bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) in spine surgery. Spine J. 14, 552-559 (2014).
- Carragee, E. J., Hurwitz, E. L., Weiner, B. K. A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons learned. Spine J. 11, 471-491 (2011).
- Abbah, S. A., Lam, C. X., Hutmacher, D. W., Goh, J. C., Wong, H. K. Biological performance of a polycaprolactone-based scaffold used as fusion cage device in a large animal model of spinal reconstructive surgery. Biomaterials. 30, 5086-5093 (2009).
- Abbah, S. A., Liu, J., Lam, R. W., Goh, J. C., Wong, H. K. In vivo bioactivity of rhBMP-2 delivered with novel polyelectrolyte complexation shells assembled on an alginate microbead core template. J. Control. Release. 162, 364-372 (2012).
- Wang, M., et al. Polyelectrolyte Complex Carrier Enhances Therapeutic Efficiency and Safety Profile of Bone Morphogenetic Protein-2 in Porcine Lumbar Interbody Fusion Model. Spine. 40, 964-973 (2015).
- Abbah, S. A., Lam, W. M., Hu, T., Goh, J., Wong, H. K. Sequestration of rhBMP-2 into self-assembled polyelectrolyte complexes promotes anatomic localization of new bone in a porcine model of spinal reconstructive surgery. Tissue Eng. Part A. 20, 1679-1688 (2014).
- Hu, T., et al. Novel Protamine-Based Polyelectrolyte Carrier Enhances Low-Dose rhBMP-2 in Posterolateral Spinal Fusion. Spine. 40, 613-621 (2015).
- Hu, J., Hou, Y., Park, H., Lee, M. Beta-tricalcium phosphate particles as a controlled release carrier of osteogenic proteins for bone tissue engineering. J Biomed Mater Res A. 100, 1680-1686 (2012).
- Darrabie, M. D., Kendall, W. F., Opara, E. C.
- Li, X., Min, S., Zhao, X., Lu, Z., Jin, A. Optimization of entrapping conditions to improve the release of BMP-2 from PELA carriers by response surface methodology. Biomed Mater. 10, 015002 (2015).
