Abstract
Во время реконструктивных операций костей, супрафизиологические количество факторов роста эмпирически загружены на строительные леса, чтобы способствовать успешному слиянию кости. Большие дозы сильнодействующих биологических агентов необходимы из-за нестабильности фактора роста в результате быстрого ферментативного разложения, а также носителей неэффективностью локализацией достаточное количество фактора роста на участки имплантации. Следовательно, стратегии, которые продлевают стабильность факторов роста, таких как BMP-2 / НЕЛЛ-1, а также контролировать их высвобождение может реально снизить эффективную дозу и, таким образом, уменьшить потребность в больших дозах во время будущих операций регенерации костной ткани. Это, в свою очередь, приведет к снижению побочных эффектов и затрат на фактор роста. Самоассоциированные УИКи были изготовлены для обеспечения лучшего контроля БМП-2 / НЕЛЛ-1 доставку через гепаринсвязывающий и еще один фактор роста биоактивности потенцировать за счет повышения естественных условиях стабильности. Здесь мы проиллюстрируем простоту изготовления ФЭП, который помогает в deliveRy из множества факторов роста во время реконструктивных операций костей.
Introduction
Частота ложных суставов , как сообщается, может достигать от 10 до 45% при дегенеративных спондилодез и пересмотров операции на позвоночнике 1. Для снижения скорости псевдоартрозов во время спондилодеза и других реконструктивных операциях костей, остеогенных факторы роста , такие как BMP-2, Нелл-1 1 и тромбоцитарный фактор роста (PDGF) были введены в целях содействия De Novo остеогенез. Среди них, БМП-2 является популярным выбором для спондилодеза 2. Хотя эффективность БМП-2 в стимулировании и облегчении образования новой кости хорошо установлено 3; клинически значимые осложнения , такие как гетеротопной формирования костной ткани, серома и образования гематомы, воспалительной реакции, радикулите, позвоночной остеолиза тела, и ретроградной эякуляции продолжают оставаться вопросы, вызывающие озабоченность в связи с супрафизиологического суммами , используемыми 4,5.
Таким образом, снижая дозу BMP-2 остается соответствующую стратегию наманит, чтобы минимизировать побочные эффекты. Кроме того, эффективные системы носителей необходимы для подавления первоначального выпуска разрыва БМП-2 наблюдается в современной коллагеновые губки систем-носителей и дальнейшего повышения длительной и локализованной доставки этого мощного цитокина. Слой за слоем , самосборка чередующихся катионного и анионного полиэлектролитов могут быть использованы в качестве перестраиваемого метода для формирования до полиэлектролитных комплексов на поверхности матриц строительных лесах или имплантируемых материалов 6. В этом отношении, гепарин (известный, имеющие самую высокую отрицательную плотность заряда всех биологических агентов) был признан запоем связываться с различными факторами роста за счет электростатических и гепарин связывающих доменов. Действительно, гепарин, как было показано, чтобы продлить период полураспада и, таким образом, потенцируют биоактивности нескольких факторов роста.
Исходя из этого, наша группа адаптировали слой за слоем протокола самосборки для изготовления гепарином на основе полиэлектролита комплекс (PEC), что грузы и сохраняет биоактивности остеогенных факторов роста во время иммобилизации 7,8. Ядро альгинат Microbead был изготовлен сшивающий -L-guluronate (G) остатки альгината с ионами двухвалентных катионов кальция или стронций. Ядро альгинат представляет собой биоразлагаемый матрица строительных лесов; который после имплантации, она рассасывается в гибридном кровати, обеспечивая пространство для костистых врастания. Поли-L-лизин (ФАПЧ) или протамин используется в качестве катионного слоя переплетаются с обеих матрицы подмостей (в данном случае, ядро альгинат Microbead носитель) и отрицательно заряженного гепарина; в то время как функции анионные гепарин слой, чтобы стабилизировать и локализовать нагруженных факторы роста. Тройной слой PEC было показано увеличение мощности нагрузки фактора роста в модели свиньи 9. В последнее время , носители PEC было показано , что успешно уменьшить эффективную дозу BMP-2 , по крайней мере , в 20 раз в 10 крыс и свиней моделей спондилодез 8.
ntent "> Здесь мы сообщаем методы изготовления УИКов для расширенной доставки фактора роста в спондилодез и других реконструктивных операций с использованием костей БМП-2 в качестве фактора роста остеогенной модели.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Приготовление раствора альгината
- Растворите 200 мг альгината натрия (не облученный) или 400 мг 8 мрад облучают альгинат натрия в 10 мл дважды дистиллированной воде и встряхивают в течение 1 часа для не-излучаемая альгината и 15 мин для облученного альгината. Хранить раствор альгината при 4 ° С в течение ночи. Фильтр альгината раствора со стерильным фильтром шприца 0,2 мкм до изготовления альгината микрогранулами.
2. альгинат Microbead Fabrication
- Лечить электростатического генератора шарик и шприцевой насос с 70% -ным этанолом и помещают их в классе II биологической безопасности (рисунок 1).
- Поместите стеклянный резервуар с магнитной мешалкой внутри генератора шарик.
- Установите кронштейн электрода генератора шарик 9 см выше бассейна.
- Подключите кабель электрода генератора борта к накатанной головкой 2 рычага электрода, и залить 80 мл раствора SrCl 2 вбассейна.
- Нагрузка 5 мл 0,2 мкм фильтрованного раствора альгината в шприц и резиновую трубку. После подключения резиновой трубки к рычагу электрода, включите насос шприца в 5 мл / ч в течение 2 мин, чтобы изгнать воздух внутри трубки и доставить альгинат решение кончике сопла. Выключите шприцевой насос.
- Затем включите инкапсуляторе, а затем, шприц насос начать Microbead поколение. Установите скорость потока альгината при 5 мл / ч и напряжение на 5,8 кВ на инкапсуляторе. Откажитесь микрошариков, сгенерированные в течение первых двух минут (или начальное 0,5 мл раствора альгината, откачиваемой из шприца), так как эти микросферы, как правило, неравномерно размер и форму.
- Сбор последующих микрогранулы в растворе хлорида 0,2 М стронций. Выключите и шприцевой насос и инкапсулятор (в таком порядке) после откачки Запланированный объем альгината раствора. Повторите эту процедуру для последующих партий изготовления микрогранулами. После завершения поворотуе шприцевой насос первой, а затем инкапсуляторе.
- Хранить микрошариков в 20 мл раствора хлорида 0,2 М стронций при температуре 4 ° С в течение ночи, чтобы закончить сшивание и стабилизировать гель.
3. Измерение размера альгината микрошариков
- Сбор 0,5 мл альгинатных микрогранул с пластиковой пипеткой и поместите его на предметное стекло. Просмотр микрошариков под оптическим микроскопом при 10-кратным увеличением. Возьмите десять изображений микрошариков с помощью микроскопа ПЗС-камерой. Сохранение изображений со шкалой бар (500 мкм) в формате TIFF с разрешением 2048 х 1536.
- Использование инструментов длины в ImageJ, измерить размер микрошариков и масштабной линейки (Рисунок 2). Преобразование длины микрогранулы от пикселя к микрометра.
- Нажмите на инструменты линии и нарисуйте линию через середину альгината шарик.
- Нажмите кнопку "Анализ" в строке меню и выберите "Мера". Появится всплывающее окно.
- Преобразование диаметра альгината борта к фактической длине, используя формулу: длина альгинат шарик / длина шкалы бар х 500 мкм. Например, 1,420 (диаметр, измеренный с помощью ImageJ) / 2,657 (шкала длина шины измеряется ImageJ) * 500 мкм = 267 мкм.
- Рассмотрим средний размер 100 микрошариков (среднее значение ± стандартное отклонение) в качестве репрезентативного размера каждой партии микрогранул.
4. Стерилизация
- Соберите микрогранулы с использованием 100 мкм нейлоновый фильтр и мыть шарики с дважды дистиллированной водой.
- С помощью шпателя, передать все микрошарики, сделанные из 0,1 мл раствора альгината в микроцентрифужных пробирку 2 мл и накрыть марлей, чтобы предотвратить высыхание.
- И, наконец, стерилизуют автоклавированием микрогранулы с использованием жидкого режима (115 ° С, 15 мин), или в соответствии с мХарактеристики anufacturer в. Добавить 1,5 л дистиллированной воды в камеру, чтобы предотвратить бусы из сушки.
5. Протамина и гепарин покрытие
- Внутри BSL-2 капот, инкубировать стерильные микрогранулы с 1 мл 2 мг / мл протамина раствора (стерилизованный с помощью шприца 0,2 мкм фильтр) в течение 1 ч при комнатной температуре.
- После инкубации микрошарики в течение 1 ч (шаг 5,1), собирают 150 мкл протамина раствора для микро бицинхониновой кислоты (microBCA) испытания (раздел 6).
- Вымойте Протамина покрытием микрошарики дважды дистиллированной водой. Спин вниз с помощью лабораторной центрифуге при 200g в течение 3 мин при комнатной температуре. После центрифугирования, аспирация воды с помощью шприца.
- Выдержите протамин покрытием микрогранулы с 1 мл 0,5 мг / мл раствора гепарина (стерилизованы с помощью шприца 0,2 мкм фильтр) в течение 30 мин для создания полиэлектролитного комплекса (PEC).
- После инкубирования протамин- покрытием микрогранул Fили 30 мин (шаг 5,4), собирают 400 мкл раствора гепарина для определения содержания гепарин (раздел 7).
- После инкубации, смыть несвязанного гепарин из УИКов дважды промывку с использованием дважды дистиллированной водой.
6. Протамина Содержание
- Выполните проверку microBCA в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, добавьте 150 мкл раствора протамина (собранные до и после инкубации с микрошариков) в 96-луночный планшет. Добавьте 150 мкл рабочего раствора microBCA.
- Используйте раствор альбумина (0, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20, 40 и 200 мкг / мл) в качестве калибровочных стандартов.
- Выдержите смесь в течение 60 мин при 60 ° C. Измеряют поглощение с помощью спектрофотометра при 562 нм.
- Используйте стандартную кривую для определения концентрации протамина каждого неизвестного образца в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Определяют содержание протамина микрошариков вычитанием общего количества протамина вРаствор для нанесения покрытия (до инкубации с микрогранул) от количества протамина, оставшегося в растворе для нанесения покрытия (после инкубации с микрогранул).
7. Гепарин Содержание
- Приготовьте 10 мл рабочего раствора путем растворения 4 мг толуидиновым синим и 20 мг хлорида натрия в 0,01 н соляной кислоты.
- Добавить 400 мкл образца (со стадии 5.5) в рабочий раствор в соотношении 2: 3 и вихре в течение 30 сек.
- Добавьте 600 мкл н-гексана (эквивалентный объем раствора до рабочего реактива) и вихрь смеси для извлечения толуидиновым синим гепарин комплекс.
- Отберите 200 мкл водной фазы с помощью шприца после разделения фаз.
- Измерить количество неизвлеченная толуидиновым синим, содержащегося в водной фазе с использованием спектрофотометра при 631 нм.
- Подготовка стандартных растворов гепарин 0-20 мкг / мл.
- Участок чтения 631 нм каждого стандарта гепарин против концентрации гепарина в мкг / мл. С помощью стандартной кривой, чтобы определить концентрацию гепарин каждого образца.
8. конфокальной Изображение послойный Структура
- Изготовить протамин, гепарин и НЕЛЛ-1 / БМП-2 флуоресцентный аналог CF-405 протамин (синий), CF 594 гепарин (красный) и FITC помечены НЕЛЛ-1 / меченное ФИТЦ (зеленый) BMP-2 + гепарин + протамин в соответствии с производителем технический паспорт.
- Шерсть 100 мкг микрогранулы 300 мкл флуоресцентного аналога (способ нанесения покрытия, как описано в 5.3-5.6) CF-405 протамин (синий) (2 мг / мл, 1 ч инкубации), CF-594 гепарин (красный) (0,5 мг / мл, 30 мин) и меченное ФИТЦ НЕЛЛ-1 / меченное ФИТЦ (зеленый) ВМР-2 (1,5 мг / мл, в течение ночи). Промыть микрогранулы дважды дистиллированной водой для удаления несвязанного флуоресцентного протамина, гепарин и НЕЛЛ-1 / БМП-2.
- Обратите внимание на слой за слоем структуры (рисунок 3) с помощью конфокальной микроскопии при 10 - кратным увеличением. 7
9. БМП-2и НЕЛЛ-1 Усвоение и выпуска
- Нагрузка 13,3 мкл 1,5 мг / мл ВМР-2 или НЕЛЛ-1 раствора на 100 мкг ФЭП. Выдержите PEC при 4 ° С при 30 оборотах в минуту встряхивания в течение 10 ч.
- Погружают микрогранулы в 1 мл фосфатно-буферного раствора (PBS) при 37 ° С при постоянном встряхивании (30 оборотов в минуту).
- Сбор 1 мл надосадочной жидкости и заменить его на 1 мл PBS, после того, как 1, 3, 6, 10 и 14 дней.
- Оценить поглощение и выпустить эффективность БМП-2 с использованием метода ELISA в соответствии с протоколом производителя. Оценка поглощения и выпуска эффективности Нелл-1 с использованием карбоксибензоил хинолин-2-карбоксальдегид (CBQCA) метод анализа белка в соответствии с протоколом производителя.
- Определить высвобождение накопленного в момент времени (T):
Совокупный выпуск в момент времени (Т) = Release в момент времени (T) + Предыдущий релиз в момент времени (т-1). - Участок кумулятивный выпуск БМП-2 и Нелл-1 в зависимости от времени.
10. экстракорпорального биоактивностьнел-1
Примечание: Биоактивность НЕЛЛ-1 выпущенный из ФЭП оценивали путем измерения его способности увеличивать экспрессию щелочной фосфатазы (ALP) в кролика стволовых клеток костного мозга (rBMSC).
- Семенной 20000 rBMSCs на лунку в 24-луночный планшет и дать им возможность расти в течение одного дня с 1 мл Дульбекко модифицированной среде Игла (DMEM) + 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) , при температуре 37 ° С и 5% CO 2.
- Через 24 часа заменить среду с 1 мл остеогенной среды Игла (DMEM , дополненной 10% FBS, 2% пенициллина стрептомицин, 50 мкг / мл аскорбиновой кислоты, 10 ммоль / л бета-глицерофосфат, и 10 -8 моль / л дексаметазона ) в течение 7 дней при температуре 37 ° С и 5% CO 2.
- Поместите 300 мкг PEC-Нелл-1 (с шага 8.2) и ПЭК внутри клеточных культур вставок (TC вставки), чтобы держать отдельно от УИК клеток (это исключает вымывание PEC микрогранул во время остеогенной среды меняются). Место TC вставки в 24 хорошо плели в течение 14 дней.
- Раз в три дня, аспирата 1 мл остеогенной среды путем размещения иглы вне ТС вставки и заменить 1 мл свежей остеогенной среды.
- Через 7 и 14 дней инкубации, определения активности ALP с комплектом ALP анализа в соответствии с протоколом производителя комплекта.
- Лизируйте клетки с буфером для анализа, содержащего 0,1% Тритон Х-100 при температуре 4 ° С в течение 10 мин. Соскребите прилипших клеток с использованием клеток скребком. Инкубируйте клеточной суспензии при 4 ° С при перемешивании в течение, по крайней мере 60 мин.
- Центрифуга клеточной суспензии при 2500 мкг при 4 ° С в течение 10 мин. Соберите супернатант для анализа ALP.
- Добавляют 50 мкл серийно разведенного щелочного раствора стандарта фосфатазы от 200 до 0 нг / мл в лунки 96-луночного планшета. Окончательные количества щелочной фосфатазы стандарта 10, 5, 2,5, 1,2, 0,6, 0,3, 0,15, и 0 нг / лунку.
- Добавьте супернатант от стадии 10.5.2 (50 мкл / лунку) и разбавьте разбавления бuffer.
- Добавляют 50 мкл р - нитрофенил фосфата раствора (PNPP) субстрата в каждую лунку. Перемешайте реагенты, осторожно встряхивая планшет в течение 30 сек. Выдержите смесь в течение 30 мин в темноте. Измеряют поглощение при 405 нм с помощью планшет-ридере.
- Вычислить ALP активность с использованием калибровочной кривой.
- Определение содержания белка с использованием набора для анализа белка microBCA в соответствии с инструкциями изготовителя. Нормализация ALP активность путем деления ALP активности по содержанию белка.
11. Жизнеспособность клеток
- Инкубируют 200 мг PEC-Нелл-1 с 1 мл DMEM + 10% FBS при 37 ° С в течение 24 ч для 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолийбромид (МТТ) анализ.
- Seed 2000 rBMSCs на лунку (в 100 мкл среды DMEM с 10% FBS) в 96 - луночный планшет и инкубируют в течение 1 дня при температуре 37 ° С, 5% СО 2.
- Заменить DMEM + 10% FBS с 100 мкл экстракта РЕС-НЕЛЛ-1 / PEC и инкубироватьпри 37 ° С, 5% СО 2.
- Через 1 день или 3 дней инкубации, добавляют 10 мкл 5 мг / мл раствора MTT и дополнительно инкубировали при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 в течение 4 часов в темноте.
- Добавьте 100 мкл раствора ДМСО в каждую лунку для растворения кристаллов формазана.
- Определить оптическую плотность при 570 нм с использованием микропланшет-ридера.
- Вычислить относительную скорость роста:
12. Упаковка в строительные леса и БМП-2 и Нелл-1 Загрузка
- Пакет УИК в поры саморассасывающийся медицинского сорта поликапролактон - фосфат трифосфат кальция (mPCL-TCP) с использованием каркасного стерилизованный лопаточку внутри BSL-2 камеры.
- Добавить 1,5 мг / мл раствора ВМР-2 или Нелл-1 на mPCL-TCP помост, заполненную ПЭК и инкубировать в течение ночи при 4 ° С.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В нашем носителе, протамин был выбран в качестве замены поли-L-лизина, так как он имеет сходные химические свойства, и он FDA одобрил как антидот гепарина. Оптические микроскопы Результаты показали, что необлученных микросферы имеют сферическую форму с диаметром 267 ± 14 мкм. (0,35 мм сопла, скорости потока 5 мл / ч и 5,8 кВ). Большинство облучаемых микрошариков имеют каплевидной формы. Диаметр измеряется на круглой части облучаемых микрошариков была 212 ± 30 мкм (0,35 мм форсунка, со скоростью 4 мл / ч и 6 кВ потока данных). (Рисунок 4).
Конфокальной образы микрошариков PEC раскрывают слой за слоем покрытия CF-405 с маркировкой протамина (синий), CF594-меченый гепарин (красный) и FITC-BMP-2 / FITC-Нелл-1 (зеленый). Эти результаты указывают на то, что УИК может связываться с положительно заряженным ВМР-2 и отрицательно заряженные НЕЛЛ-1 с помощью гепариновой биндиНесколько доменов нг (Рисунок 5). Это говорит о том, что взаимодействие между УИКи и остеогенных факторов роста не зависит от зарядки.
Для того, чтобы доказать, что УИКи может поглощать и выпускать BMP-2, мы использовали анализ ELISA для определения количества ВМР-2, остающийся после инкубации и количество BMP-2 в PBS на день 1, 3, 6, 10 и 14 . Однако, подобный подход не очень хорошо работает с белком НЕЛЛ-1, так как гепарин блокирует сайт связывания антител, что значительно снижает сигнал. Таким образом, анализ протеина CBQCA был использован для определения разницы между PEC-Нелл-1 и ПЭК. Из кривой совокупного выпуска, УИКи не только показывают более высокую НЕЛЛ-1 эффективность поглощения по сравнению с BMP-2 , но и выпустить его гораздо медленнее , чем BMP-2 (Nell-1: 20% по сравнению с БМП-2: 25%) (рис 6). Это говорит о том, что УИКи более тесно связываться с Нелл-1, чем БМП-2.
Frом МТТ - анализе, PEC-НЕЛЛ-1 не цитотоксическим (рисунок 7). Результат совпадает с результатом анализа Аламар голубого цвета в предыдущем исследовании 7. Гепарин нейтрализует положительный заряд протамин, который играет важную роль в поддержании биосовместимость ПЭК.
Для того, чтобы определить, влияет ли НЕЛЛ-1 выпуск от ФЭП долгосрочного остеогенной дифференцировки, уровень экспрессии остеогенной маркера, щелочной фосфатазы (ALP), исследовали с помощью колориметрического анализа. НЕЛЛ-1 выпуск от ПЭК повышает ALP активность кролика стволовых клеток костного мозга на 2,2 раза в 14 -й день по сравнению с контрольной группой , PEC (рисунок 8). BMP-2 показывает максимальное увеличение активности ALP (3,75 раза) в день 7. И PEC-БМП-2 и БМП-PEC-2 + дополнительные БМП-2 показывают снижение активности на 9-й день.
ALP активность с BMP-2 в среде без PEC показан на
Рисунок 1: Генератор шарика электростатический и шприцевой насос установлен в шкафу BSL-2 биологической безопасности (A) Насадка под залог держателя форсунки.. (B) Большой бассейн для приготовления раствора хлорида стронция. (С) Электродный кабель. (D) Шланг обеспечивает альгинат решение. (E) Держатель сопла и рычаг. (F) Электроды питания тон разность потенциалов, чтобы регулировать размер шарика. (G) , магнитная мешалка. (Н) 5 мл шприц. (I) шприцевой насос для регулирования потока альгината. Ручка управления (J) мешалка для контроля скорости перемешивания. Ручка управления (K) для регулирования напряжения разность потенциалов между 0-10 кВ. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Измерение альгината микрогранулы с ImageJ программного обеспечения После открытия файла изображения, выбрав Файл → Открыть, выполните Шаг 1:. Выберите инструмент линии и нарисуйте линию на альгинатных микрогранул. На шаге 2, нажмите кнопку Анализ на панели меню и всплывающее окно появится. Повторять шаги 1 и 2, пока все микрогранулы MEAренные. На шаге 3, выберите инструмент линии, нарисуйте линию через масштабную линейку и измерить длину шкалы. Преобразование длины микрогранул в мкм по формуле:. Длина альгината / длина масштабной линейки х 500 мкм Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3:. Схематическое представление полиэлектролитного комплекса альгинат сердечника (темно - зеленый) положительный заряд протамин слой (светло - зеленый), отрицательный заряд гепарин слой (красный), остеогенной фактор роста, например, ВМР-2 / НЕЛЛ-1 на наружном слое (бледные синий). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 4: Светлое поле изображения альгинатных микрогранул (А) Необлученный. (В) 8М Rad облучают. Необлученных альгинатные микросферы имеют сферическую форму и 8M Rad облучают аналог имеет форму слезинки. Увеличение 100X. (Шкала бар = 500 мкм.) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 5: конфокальной лазерной сканирующей микроскопии изображений альгинатных микрогранул , инкубированных с люминесцентными аналогами протамин, гепарин, НЕЛЛ-1 и БМП-2 (А) , CF - 405 протамина (синий), (B) , CF - 594 Гепарин (красный), (С ) FITC НЕЛЛ-1 (зеленый) и (D Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 6: Усвоение и выпуск БМП-2 и Нелл-1 (А) Усвоение НЕЛЛ-1 белка (черный) BMP-2 (красный), (B) Совокупный выпуск кривой BMP-2 (красный) и NELL- 1 (черный) от PEC носителя. Результаты представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
<бр /> Рис . 7: цитотоксичности (A) МТТ кролика костного мозга стеблями клеток с протамина на основе ПЭК НЕЛЛ-1 200 мг / мл экстракта (черный), PEC-НЕЛЛ-1 100 мг / мл экстракта (белый) в День 1 и 3. (в) Аламар Синий анализ кролика костного мозга стеблями клетки с PEC BMP-2 (синий), PEC (зеленый) Эксперименты проводились в трех экземплярах , и результаты представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы просмотреть увеличенная версия этой фигуры.
Рисунок 8: биоактивности Анализ на БМП-2 и НЕЛЛ-1 освобождение от PEC носителя (А) ALP активность кролика костного мозга стволовых клетки инкубировали с PEC-Нелл-1 (черный), PEC (красный).. Активность ЩФ измеряли в виде оптической плотности при 405 нм. 2.2кратное увеличение ALP активности наблюдалось после инкубации с PEC-Нелл-1 на 14 -й день (B) ALP активности кролика костного мозга стволовых клетки инкубировали с PEC-BMP-2 (красный) PEC-BMP-2 + добавление BMP- 2 (зеленый) и PEC (синий). Увеличение ALP активности после инкубации с PEC-BMP-2 и PEC-BMP-2 + добавление БМП-2 на 7 -й день, ALP активность падает на День 9. (C) ALP активность кролика костного мозга стволовых клетки инкубировали с PEC- БМП-2 (красный) BMP-2 (синий) и средний (зеленый). Результаты представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 9: фосфат Поликапролактон Tri-кальция (PCL-TCP) эшафот упакованы с PEC носителя (А) Polycaprola.CTONE трифосфат кальция (PCL-TCP) леска (размер пор 1300 мкм), заполненную PEC носителем. (B) PCL-TCP эшафот. (C) Высокое увеличение: ПЭК сохраняет свою форму после упаковки. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол представляет собой способ получения избирательных участков через слой за слоем самосборки. Структура послойный визуализируется с использованием флуоресцентных аналогов протамин, гепарин, BMP-2 и НЕЛЛ-1 и конфокальной микроскопии. Усвоение и высвобождают тесты показывают, что гепарин на избирательном участке посредничает остеогенной поглощение фактора роста и высвобождения. Эффективность поглощения метода РЕС: НЕЛЛ-1: 86,7 ± 2,7%, ВМР-2: 70,5 ± 3,1%. Носитель ПЭК имеет лучшую модуляцию высвобождения Нелл-1 (20%) по сравнению с чистой поверхностной адсорбции носителем , таким как частицы апатита кальция (40-80%) 11.
Кроме того , модулировать высвобождение, гепарин нейтрализует чрезмерный положительный заряд поликатионов , таких как протамин , чтобы избежать нежелательных проблем , связанных с цитотоксичности 12. Печ не показывают каких - либо признаков цитотоксичности, как определено с помощью анализа МТТ и аламаровый Синей анализа 7. Анализ показывает ALP носитель PEC может поддерживать Bioactivity обоих Нелл-1 и БМП-2. Несмотря на то, разработанный для остеогенной фактора роста BMP-2 терапии при операции на позвоночнике слияния, PEC также могут занять другие факторы роста с гепарином связывающих доменов, таких как Нелл-1 и PDGF-BB. По сравнению с другими способами доставки , таких как инкапсуляция факторов роста в микросферы полигликолевой кислоты, УИКи не требуют органических растворителей , которые имеют тенденцию инактивировать факторы роста 13.
Ряд факторов в процедуре изготовления ФЭП может повлиять на производительность носителя. Во-первых, размер Microbead влияет на соотношение площади поверхности / объем. Более высокая остеогенной фактор роста нагрузка может быть достигнута с меньшими микрогранул. Во-вторых, концентрация альгината должна быть достаточной, чтобы поддерживать стабильность структуры микрогранулами. Microbead стабильность зависит от типа альгината, длина цепи (зависит от гамма-облучения) и двухвалентного иона бария, используемого (> стронций> кальция). В то время как 2% альгината раствора достаточно для производства фирмыповторно УИКов со стабильными Microbead структурами, 4% альгината требуется после 8 мрад гамма-облучение для компенсации эффектов альгината цепи укорочения в процессе облучения. В- третьих, скорость деградации в естественных условиях альгинатных микрогранул сильно зависит от длины цепи альгината. Основываясь на нашем опыте от крыс и свиней моделей, ПЭК, изготовленных с использованием 8 Мрад облучают альгинат показывает быстрое (28 дней) и полную деградацию альгината ядра (неопубликованные данные). Деградация альгината сердечника обеспечивает простор существенным для костистых врастания. В- четвертых, инкубирования в течение ночи ВМР-2 и Нелл-1 при температуре 4 ° С при постоянном встряхивании (например, 30 оборотов в минуту) может улучшить поглощение эффективность. И, наконец, толщина протамин покрытия зависит от времени. Так как степень взаимодействия протамин-гепарин определяет высвобождение остеогенных факторов роста, таких как BMP-2 или Нелл-1, 1 ч инкубации протамина принята для того чтобы улучшить стабильность структуры ФЭП.
в естественных условиях биоактивности. С учетом весьма ограниченного количества гепарина , участвующих и в сочетании с выбором противоядия, то есть, протамин (высокоэффективный препарат для нейтрализации анти-коагулянта деятельности гепарина), длительное время кровотечения в лущеные кости в значительной степени теоретическим и практически несущественным.
Загрузка в УИК эшафот PCL-TCP увеличивает локализацию шариков на участках имплантата. Каркасы обеспечивают необходимую механическую поддержку, которая имеет решающее значение для спондилодеза. В настоящем исследовании мы использовали PCL-TCP каркасы с 1300 мкм порами , чтобы облегчить надлежащую упаковку (рисунок 9). Хотя в настоящее время иллюстрация показывает PEC остеогенной доставки фактора роста с эшафота PCL-TCP, наша группа также оценивали производительность носителя с полиэфиркетонкетон (РЕКК) Кости камеры в одном исследовании кролика с одинаковой эффективностью.
В этом исследовании, отсутствие сравнения с другими ранее оцененных носителей rhBMP-2 и Нелл-1 может представлять собой ограничение.
В заключение, представленная процедура представляет собой полезный носитель для контроля высвобождения остеогенных факторов роста с гепарином областях, таких как BMP-2 и Нелл-1. Описанная стратегия сочетает в себе множество преимуществ: она не ограничивается BMP-2 и применимо к другим факторам роста с гепаринсвязывающий доменами, такими как Нелл-1. Снижение дозы на остеогенной фактора роста может уменьшить нежелательные побочные эффекты, такие как серома, формирование гетеротрофной кости и снизить общую стоимость лечения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У нас нет конфликта интересов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Life Science Acrodisc 25 mm Syring Filter with 0.2 µm Supor Membrane | PALL | PN4612 | Sterile protamine, heparin solution by ultrafiltration |
| 24 well plate | Cell Star | 662160 | |
| 96 well plate Nuclon Delta Surface | Thermo Fisher Scientific | 167008 | |
| (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide), MTT | Sigma Aldrich | M5655 | Measure cytotoxicity of PEC-NELL-1 |
| Acetone | Fisher Scientific | A/0600/17 | Precipitate CF-405 Labeled protamine |
| Alamar Blue | Invitrogen, Life Technologies | DAL 1025 | Measure cytotoxicity of PEC-BMP-2 |
| Alkaline Phosphatase Assay (ALP) assay kit | Anaspec | AS-72146 | |
| Ammonium Chloride | Merck | Art 1145 | Stop reagent in FITC labeling |
| Anhydrous Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Invitrogen, Life Technologies | D12345 | Solvent for fluorescent isothiocyanate I |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | Dissolve formazan | |
| Autoclave | Hirayama | HU-110 | Sterilize alginate beads by steam |
| Beta-glycerophosphate | Sigma Aldrich | G9422 | |
| BMP-2 (Infuse Bone Graft Large II Kit) | Medtronic Sofarmor Danek, Memphis TN, USA | 7510800 | Osteogenic Growth Factor, dialysis is needed to remove stabilizer component that interferes with FITC coupling |
| Carboxybenzoyl quinoline-2-Carboxaldehyde (CBQCA) | Thermo Fisher Scientific | A-6222 | To quantify NELL-1 protein |
| Cell Strainer (100 µm) | BD Science | 352360 | Hold PEC for ALP assay |
| Cell Scraper 290 mm Bladewide 20 mm | SPL Life Science | 90030 | Detach the cell from 24 well plate |
| CF 405S, Succinimidyl Ester | Sigma Aldrich | SCJ4600013 | Blue fluorescent dye for protamine labeling |
| CF 594, Hydrazide | Sigma Aldrich | SCJ4600031 | Deep red fluorescent dye for heparin labeling |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R | |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | Component of osteogenic growth medium |
| Dextran Desalting Columns | Pierce (Thermo Scientific) | 43230 | |
| DMEM | Gibco | 12320 | |
| BMP-2 Quantikine ELISA Kit | R&D System | DBP200 | Determine BMP-2 release |
| Fetal Bovine Serum FBS | Hyclone | SV30160.03 | |
| Fluoescein Isothiocyananate, Isomer I | Sigma Aldrich | F7250 | Green fluorescent dye for NELL-1 and BMP-2 labeling |
| ThinCert Cell Culture Inserts, For 24 Well plates, Sterile |
Greiner | 662630 | Prevents PEC wash out when changing osteogenic medium |
| Havard Appartus Syringe Pump (11 plus) | Havard Apparatus | 70-2208 | |
| n-Hexane (>99%) | Sigma Aldrich | 139386 | |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3149 | Binds with osteogenic growth factor with heparin binding domain |
| Hydrochloric acid (37%) | Merck | 100317 | Highly Corrosive |
| Incubator | Binder | C8150 | |
| MicroBCA Protein Assay kit | Thermoscientific | 23235 | |
| Microplate Reader | Tecan | Infinite M200 | For ALP and microBCA assays |
| Nisco cell encapsulator | Nisco Engineering Inc | Encapsulation unit VAR V1 | |
| Fluorescent Microscope | Olympus | IX71 | |
| mPCL-TCP Scaffold (Pore size is 1.3 mm) | Osteopore | PCL-TCP 0/90 | Hold PEC for in vivo study |
| Penicillin-Streptomycin 10,000 unit/ml, 100 ml | Hyclone Cell Culture | SV30010 | Antibiotic |
| 10x Phosphate Buffered Saline (PBS) | Vivantis | PB0344-1L | 10x Solution, Ultra Pure Grade |
| Poly-L-Lysine MW 15,000-30,000 | Sigma Aldrich | P2568 | Polycation |
| Protamine Sulfate salt, from Salmon | Sigma Aldrich | P4020 | Polycation |
| Shaker | Labnet | S2025 | |
| Snakeskin Dialysis Tubing 3,500 MWCO 22 mm x 35 feet | Thermo Fisher Scientific | 68035 | Remove unreacted FITC by dialysis |
| Sodium Chloride | Merck | 1.06404.1000 | |
| Sodium Hydroxide | Qrec | S5158 | |
| Sodium Bicarbonate | US Biological | S4000 | Buffer |
| Sodium carbonate | Sigma Aldrich | S7795-500G | Buffer |
| Strontium Chloride Hexahydrate | Sigma Aldrich | 255521 | Crosslinker for alginate |
| Spatula | 3dia | ||
| 5 ml syringe | Terumo | 140425R | Diameter of syringe affects the flow rate |
| 75 cm2 Cell Culture Flask Canted Neck | Corning | 730720 | |
| Toluidine Blue | Sigma Aldrich | 52040 | Heparin assay |
| Trypsin 1x | Hyclone Cell Culture | SH30042.01 | |
| Sodium alginate | Novamatrix (FMC Biopolymer, Princeton, NJ) | Pronova UPMVG | Core material of microbeads |
References
- Yuan, W., et al. NELL-1 based demineralized bone graft promotes rat spine fusion as compared to commercially available BMP-2 product. Orthop Sci. 18, 646-657 (2013).
- Anderson, C. L., Whitaker, M. C. Heterotopic ossification associated with recombinant human bone morphogenetic protein-2 (infuse) in posterolateral lumbar spine fusion: a case report. Spine. 37, 502-506 (2012).
- Glassman, S. D., et al. RhBMP-2 versus iliac crest bone graft for lumbar spine fusion: a randomized, controlled trial in patients over sixty years of age. Spine. 33, 2843-2849 (2008).
- Tannoury, C. A., An, H. S. Complications with the use of bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) in spine surgery. Spine J. 14, 552-559 (2014).
- Carragee, E. J., Hurwitz, E. L., Weiner, B. K. A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons learned. Spine J. 11, 471-491 (2011).
- Abbah, S. A., Lam, C. X., Hutmacher, D. W., Goh, J. C., Wong, H. K. Biological performance of a polycaprolactone-based scaffold used as fusion cage device in a large animal model of spinal reconstructive surgery. Biomaterials. 30, 5086-5093 (2009).
- Abbah, S. A., Liu, J., Lam, R. W., Goh, J. C., Wong, H. K. In vivo bioactivity of rhBMP-2 delivered with novel polyelectrolyte complexation shells assembled on an alginate microbead core template. J. Control. Release. 162, 364-372 (2012).
- Wang, M., et al. Polyelectrolyte Complex Carrier Enhances Therapeutic Efficiency and Safety Profile of Bone Morphogenetic Protein-2 in Porcine Lumbar Interbody Fusion Model. Spine. 40, 964-973 (2015).
- Abbah, S. A., Lam, W. M., Hu, T., Goh, J., Wong, H. K. Sequestration of rhBMP-2 into self-assembled polyelectrolyte complexes promotes anatomic localization of new bone in a porcine model of spinal reconstructive surgery. Tissue Eng. Part A. 20, 1679-1688 (2014).
- Hu, T., et al. Novel Protamine-Based Polyelectrolyte Carrier Enhances Low-Dose rhBMP-2 in Posterolateral Spinal Fusion. Spine. 40, 613-621 (2015).
- Hu, J., Hou, Y., Park, H., Lee, M. Beta-tricalcium phosphate particles as a controlled release carrier of osteogenic proteins for bone tissue engineering. J Biomed Mater Res A. 100, 1680-1686 (2012).
- Darrabie, M. D., Kendall, W. F., Opara, E. C.
- Li, X., Min, S., Zhao, X., Lu, Z., Jin, A. Optimization of entrapping conditions to improve the release of BMP-2 from PELA carriers by response surface methodology. Biomed Mater. 10, 015002 (2015).
