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Biology

अवलोकन और टेलोमेर की मात्रा और दोहराव दृश्यों का उपयोग प्रतिदीप्ति Published: August 4, 2016 doi: 10.3791/54224

Introduction

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Telomere न्यायपालिका फ्यूजन और गिरावट से गुणसूत्र सिरों सुरक्षा करता है। स्तनधारी telomere जी अमीर hexameric दोहराता है, TTAGGG, और shelterin परिसरों से बना है। निमेटोड के टेलोमेर दोहराने अनुक्रम स्तनधारी (TTAGGC) के समान ही है। अधिकांश eukaryotes उनकी गुणसूत्र छोर तक टेलोमेर दोहराता जोड़ने की टेलोमिरेज का उपयोग। हालांकि, 10 - कैंसर की कोशिकाओं का 15% टेलोमिरेज स्वतंत्र तंत्र, telomeres (ALT) 3 के वैकल्पिक लंबी रूप में जाना जाता का उपयोग। इससे पहले, हम सूचना दी कि टेलोमेर दोहराता है और उसके संबंधित दृश्यों, TALT के रूप में नाम, टेलोमिरेज उत्परिवर्ती लाइनों है कि महत्वपूर्ण बाँझपन 2 बच के telomeres में परिलक्षित किया गया।

टेलोमेर की लंबाई मात्रात्मक पीसीआर द्वारा या दक्षिणी धब्बा है, जो कुल telomeres 4,5,6,7 की औसत लंबाई प्रदान करता है के द्वारा मापा गया था। पूरे जीनोम अनुक्रमण डेटा में टेलोमेर दोहराने की गणना पढ़ें भी कुल टेलोमेर सामग्री 8 का सूचक है। हालांकि पापgle टेलोमेर की लंबाई विश्लेषण (STELA) प्रदान के लिए एक एकल टेलोमेर की लंबाई, यह telomeres 9 के स्थानिक जानकारी प्रदान नहीं कर सकते हैं सकता है। पॉट 1 :: mCherry संवाददाता प्रोटीन विवो में telomeres के स्थानिक जानकारी प्रदान करता है, यह डबल असहाय टेलोमेयर की लंबाई का प्रतिनिधित्व नहीं कर सकते हैं, के रूप में बर्तन-1 एक एकल कतरा टेलोमेर बाध्यकारी प्रोटीन 10 है।

ऊपर उल्लिखित तरीकों दोहराव दृश्यों की औसत से जानकारी प्रदान करते हैं, सीटू संकरण (मछली) में प्रतिदीप्ति एक गुणसूत्र पैमाने पर राशि और ब्याज की अलग-अलग दृश्यों के स्थानिक पैटर्न का पालन करने के लिए अनुमति देता है। डीएनए की शुद्धि के बजाय, ऊतकों या कोशिकाओं मछली में मूल निवासी स्थानिक जानकारी की रक्षा करने के लिए तय कर रहे हैं। इस प्रकार, मछली ऐसे टेलोमेर दोहराता के रूप में व्यक्तिगत दोहराने दृश्यों, के अवलोकन के लिए एक मात्रात्मक और गुणात्मक दोनों उपकरण है।

इस प्रोटोकॉल दोनों Telo के एक साथ पता लगाने के लिए एक कारगर तरीका प्रदान करता हैमात्र और अन्य दोहराता पहले से वर्णित विधि 11,12 से सुधार के आधार पर सी। एलिगेंस लार्वा या वयस्कों अत्यधिक विभेदित कोशिकाओं के साथ बहुकोशिकीय जीव हैं। कोशिकाओं की विविधता टेलोमेर स्थानों में से एक बड़ी संख्या के मात्रात्मक विश्लेषण पर बाधा उत्पन्न करती है। विश्लेषण किया कोशिकाओं की संख्या को अधिकतम करने के लिए, भ्रूण अलग-थलग और मछली के लिए polylysine लेपित स्लाइड पर फैले हुए हैं। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल भी immunofluorescence के साथ जोड़ा जा सकता है।

एक सबूत है कि प्रोटोकॉल काम करता है के रूप में, हम बताते हैं कि यह निरीक्षण और दो अलग अलग दोहराव दृश्यों यों के लिए संभव है। TALT1 के खिलाफ डीएनए जांच सरल पीसीआर को शामिल digoxigenin-dUTP के साथ उत्पन्न किया गया था। तो फिर इस TALT1 जांच और प्रतिदीप्ति लेबल telomere PNA जांच एक साथ संकरित किया गया। बाद में, digoxigenin विहित immunofluorescence विधियों द्वारा खोजा गया था। हम यहाँ प्रतिनिधि छवियों जहां TALT1 टीआरटी -1 में टेलोमेर साथ colocalized पेश

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Protocol

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1. Digoxigenin-dUTP पीसीआर द्वारा के साथ लेबल जांच

  1. 10x dNTP मिश्रण युक्त digoxigenin-dUTP के रूप में पहले 13 में वर्णित के साथ पीसीआर लेबलिंग प्रदर्शन करना।
  2. निर्माता अनुदेश के अनुसार स्पिन स्तंभ शुद्धि के साथ पीसीआर उत्पाद शुद्ध।
    1. जांच में कम से कम 200 बीपी है, बजाय स्पिन स्तंभ शुद्धि प्रतिक्रिया मिश्रण से स्पिन कॉलम क्रोमैटोग्राफी के साथ मुक्त digoxigenin-dUTP को हटा दें।

2. तैयारी polylysine लेपित स्लाइड्स

नोट: इस पूरी प्रक्रिया के बारे में 2 घंटा लेता है। कदम से अधिकांश सुखाने कदम के अलावा कमरे के तापमान पर किया जाता है।

  1. स्लाइड सफाई
    1. एक प्लास्टिक कंटेनर में स्लाइड रखें और संक्षेप में आसुत जल (DW) के साथ स्लाइड कुल्ला। पानी निकालें और DW 1% ग्लास क्लीनर युक्त के साथ कंटेनर भरें।
    2. कमरे के तापमान पर 50 आरपीएम (आरटी) पर 15 मिनट के लिए स्लाइड आंदोलन। DW 3 के साथ स्लाइड्स धो लेंआरटी पर प्रत्येक 5 मिनट के लिए बार।
    3. आंदोलन के साथ 15 मिनट के लिए 70% इथेनॉल के साथ स्लाइड्स धो लें। 70% इथेनॉल त्यागें और 15 मिनट के लिए एक 65 डिग्री सेल्सियस सूखी ब्लॉक और हवा शुष्क पर स्लाइड जगह है।
  2. बहु अच्छी तरह से कांच स्लाइड के polylysine कोटिंग
    नोट: स्लाइड कांच के polylysine कोटिंग, एक महत्वपूर्ण कदम है, क्योंकि यह धुंधला प्रक्रिया के दौरान नमूना आसंजन प्रदान करता है। खराब लेपित स्लाइड नमूने की हानि में परिणाम होगा।
    1. 0.01% polylysine शेयर समाधान पतला (डब्ल्यू / वी) आसुत जल में। पतला 0.01% की 20 μl (डब्ल्यू / वी) एक स्वच्छ कांच स्लाइड के कुओं के लिए polylysine जोड़ें।
    2. आरटी पर 5 मिनट के लिए गिलास स्लाइड सेते हैं।
    3. 1 घंटे के लिए एक 65 डिग्री सेल्सियस सूखी ब्लॉक और हवा शुष्क पर स्लाइड रखें।
    4. धूल मुक्त बॉक्स में polylysine स्लाइड्स स्टोर।

3. स्लाइड कांच पर कीड़े का निर्धारण (चित्रा 1)

  1. मछली के लिए भ्रूण तैयारी
    नोट: हार्वेस्ट कीड़े सभी टी से पहलेवह बैक्टीरिया भोजन माइक्रोस्कोप के तहत विकास मीडिया देख कर भस्म हो जाता है। भुखमरी वयस्क कीड़े के अंडे का उत्पादन कम कर देता है और अंडे सेने बढ़ जाती है। विस्तृत तरीके 14,15 में वर्णित हैं।
    1. मानक तरीकों 14 के अनुसार 50 मिमी पेट्री डिश में कीड़े हो जाओ।
    2. के बाद सभी बैक्टीरिया भोजन सेवन किया जाता है, रंग के साथ तिमाही में अगर मीडिया में कटौती। प्रदूषण को रोकने के काटने से पहले रंग जीवाणुरहित।
    3. 100 मिमी निमेटोड विकास मीडिया (एन जी एम) थाली पर अगर की सभी टुकड़ा डाल दिया। कीड़े के लिए अगर टुकड़ा उल्टा बारी ताजा बैक्टीरिया भोजन तक पहुँचने के लिए।
    4. 48 से 72 घंटा के बाद, M9 बफर के साथ कीड़े इकट्ठा। एन जी एम थाली पर M9 बफर के 5 मिलीलीटर - 3 जोड़े। एन जी एम की सतह पर पिपेट M9 बफर कीड़े धोने के लिए।
    5. कीड़े के साथ तरल लीजिए और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब को जोड़ने।
      नोट: यदि फसल, सेंट्रीफ्यूज एक 30% sucrose के समाधान में कीड़े के बाद अगर मलबे है। मलबे pelleted कर रहे हैं, कीड़े पर नावसतह।
    6. M9 बफर 15 मिलीलीटर मात्रा को बनाने के लिए जोड़ें। 3 मिनट के लिए 300 XG पर centrifugation द्वारा कीड़े गोली और M9 बफर के सबसे को हटा दें। इस चरण 2 बार दोहराएँ।
      नोट: कीड़े अभी भी centrifugation के बाद चल रहे हैं, तो सेंट्रीफ्यूज का ब्रेक स्तर = 1 मूल्य के लिए सेट।
    7. महाप्राण M9 बफर। कीड़े के लिए ब्लीचिंग समाधान जोड़ें। प्रति कीड़े के 0.5 मिलीलीटर, 5 मीटर KOH के DW के 6.5 मिलीलीटर, हाइपोक्लोराइट के 2 मिलीलीटर, 1 मिलीलीटर जोड़ें।
    8. 50 rpm पर 3 मिनट के लिए आरटी पर कमाल के साथ कीड़े सेते हैं। 15 सेकंड के लिए भंवर कीड़े यंत्रवत् कीड़े कतरनी और अंडे को बेनकाब करने के लिए।
    9. विरंजन के दौरान एक विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे ट्यूब का निरीक्षण करें। सुनिश्चित करें कि कीड़े आधे में कटौती कर रहे हैं और अंडे जारी कर रहे हैं सुनिश्चित करें। जब वयस्क शरीर का सबसे भंग कर रहा है, 15 मिलीलीटर मात्रा को बनाने के लिए M9 बफर जोड़ें।
    10. 3 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र। महाप्राण M9 के सबसे अधिक है और 15 मिलीलीटर मात्रा को बनाने के लिए ताजा M9 बफर जोड़ें। दोहराएँ धोने कदम 3 बार।
      ध्यान दें:कीड़े की अत्यधिक मात्रा में प्रयोग करने से बचें, क्योंकि वे विरंजन की प्रक्रिया में बाधा। धोने जब तक कम से कम 8 मिनट समग्र प्रतिक्रिया समय रहते हैं। ओवर-प्रक्षालित अंडे मजबूत autofluorescence उत्पादन।
    11. polysorbate-20 (PBST) के साथ फॉस्फेट खारा बफर 200 μl और 4% paraformaldehyde (पीएफए) के 200 μl 2% पीएफए ​​बनाने के लिए अप करने के लिए जोड़ें।
      सावधानी: चूंकि पीएफए ​​कैंसर है, सुरक्षात्मक कपड़े, दस्ताने और आंख ढाल पहनने पीएफए ​​उपयोग करने से पहले।
    12. polylysine लेपित स्लाइड की अच्छी तरह पर 2% पीएफए ​​में अंडे के 40 μl जोड़ें।
    13. एक नम कक्ष में स्लाइड्स की जगह और आरटी पर 15 मिनट के लिए सेते हैं। नम कक्ष के ठीक बाद स्लाइड के अंदर रखा जाता बंद करें।
      नोट: अंडे स्लाइड के नीचे बसा है जबकि तय किया जा रहा।
  2. मछली के लिए विच्छेदित gonads तैयारी
    1. हार्वेस्ट वयस्क कीड़े M9 बफर के 1 मिलीलीटर pipetting द्वारा 50 मिमी एन जी एम थाली पर हो। बैक्टीरिया भोजन से पहले फसल कीड़े समाप्त हो गया है।
    2. किसी भी बैक्टीरिया बुद्धि से कीड़े धोज M9 बफर, 2 बार।
      नोट: अवशिष्ट बैक्टीरिया polylysine लेपित स्लाइड्स के लिए चिपके से विच्छेदित gonads के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं।
    3. 300 x जी centrifugation द्वारा कीड़े गोली। M9 निकालें और micropipette द्वारा खाली एन जी एम थाली करने के लिए कीड़े हस्तांतरण।
    4. polylysine इलाज किया स्लाइड की एक अच्छी तरह पर 2 मिमी levamisole युक्त M9 बफर के 30 μl जोड़ें।
    5. एक 1 मिलीलीटर ट्यूब M9 बफर के 500 μl जोड़ें। मुंह पिपेट से कीड़े हस्तांतरण करने के लिए इस बफर का प्रयोग करें।
    6. M9 बफर युक्त 1 मिलीलीटर ट्यूब में एक केशिका रखकर M9 बफर के साथ मुंह पिपेट की नोक भरें।
    7. विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, सिर्फ वयस्क कृमि और खींचें मुंह पिपेट के सिर के सामने मुंह पिपेट की नोक डाल इतना है कि कीड़े के सिर मुंह पिपेट प्रवेश करती है। एक बार जब कीड़े के सिर टिप में प्रवेश करती है, कृमि के पूरे शरीर को टिप में तैयार किया जाएगा।
    8. polylysine लेपित स्लाइड मुँह पिपेट का उपयोग करने के लिए कीड़े हस्तांतरण।
    9. एक रेजर का प्रयोग, की कटौतीसिर या स्लाइड पर कीड़े की पूंछ की नोक च। जब कीड़ा काट रहा है, gonads बाहर पॉप जाएगा। Gonads स्लाइड करने के लिए रहना होगा।
      1. एक अच्छी तरह से कम से कम 30 कीड़े तैयार करें। अधिक कुओं और 30 कीड़े के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
    10. उमस भरे कक्ष में स्लाइड रखो और मुंह विंदुक के साथ M9 बफर बंद aspirate।
    11. उमस भरे कक्ष में 15 मिनट के लिए आरटी पर 2% पीएफए ​​के 20 μl जोड़कर नमूना ठीक करें।

4. फिक्सेशन और Permeabilization

  1. सूखी बर्फ पर एक एल्यूमीनियम ब्लॉक प्लेस और एक डीप फ्रीजर में स्टोर (-80 डिग्री सेल्सियस)। स्टोर मेथनॉल और -20 डिग्री सेल्सियस में एसीटोन।
  2. पीएफए ​​निर्धारण कदम 3.1.15 या 3.2.11 के बाद, micropipette छोड़ने का उपयोग कर ~ लगानेवाला के 5 μl लगानेवाला निकालें।
  3. नमूना स्लाइड पर एक और polylysine लेपित स्लाइड रखो। कागज तौलिया के साथ लगानेवाला निकालें यदि समाधान अत्यधिक है। स्लाइड कदम एक बार वे एक साथ अटक कर रहे हैं मत करो।
  4. स्लाइड रुककम से कम 15 मिनट के लिए एल्यूमीनियम ब्लॉक पर।
    नोट: नमूने के कम से कम 2 के लिए भंडारित किया जा सकता है - 3 दिन।
  5. स्लाइड जमे हुए किया जा रहा है, वहीं ठंड मेथनॉल और बर्फ पर एसीटोन युक्त जार में डाल दिया।
  6. स्लाइड बाहर ले जाओ और उन्हें मोड़ नमूना फ्रीज दरार करने के लिए। ऊपरी स्लाइड त्यागें। इसके तत्काल बाद 5 मिनट के लिए ठंडा मेथनॉल में स्लाइड लेना।
  7. 5 मिनट के लिए ठंडा एसीटोन करने के लिए स्लाइड स्थानांतरण।
  8. स्लाइड अवशिष्ट लगानेवाला दूर करने के लिए 5 मिनट के लिए PBST के साथ 3 बार धोएं। अगले कदम के लिए आगे बढ़ें या 4 डिग्री सेल्सियस पर 100% इथेनॉल में स्लाइड्स की दुकान।
    नोट: नमूने के कम से कम 2 के लिए भंडारित किया जा सकता है - 3 दिन।

5. तय कोशिकाओं के संकरण

  1. (PBST युक्त 10 माइक्रोग्राम / एमएल RNase ए) RNase समाधान के 20 μl जोड़ें। 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नम कक्ष में स्लाइड सेते हैं।
  2. polysorbate -20 (2x SSCT) 15 मिनट प्रत्येक के लिए के साथ 2x खारा और सोडियम साइट्रेट में दो बार स्लाइड धो लें।
  3. 20 जोड़ेसंकरण समाधान के μl और 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में नम कक्ष डाल दिया। 1 घंटे के बाद, pipetting द्वारा संकरण समाधान निकालने।
  4. संकरण समाधान निकालने से पहले, जांच को तैयार है। जांच डबल डीएनए असहाय है, तो एक सूखी ब्लॉक पर 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करने से जांच denature। गर्म करने के बाद, बर्फ संक्षिप्त पर जांच शांत।
  5. संकरण नमूना करने के लिए जांच युक्त समाधान के 10 μl जोड़ें। 2,000 और डीआईजी लेबल जांच के लिए, 1 के अनुपात में उपयोग एकाग्रता: 200 PNA जांच, 1 के अनुपात में उपयोग एकाग्रता के लिए। कवर गिलास के साथ नमूना कवर।
  6. एक कागज तौलिया गर्मी ब्लॉक (80 डिग्री सेल्सियस) पर पानी से लथपथ रखो। नमी और तापमान को बनाए रखने के लिए गर्मी ब्लॉक पर एक प्लास्टिक बॉक्स कवर रखो।
  7. बाद गर्मी ब्लॉक के तापमान (80 डिग्री सेल्सियस) स्थिर हो गया है, गर्म कागज तौलिया पर नमूना स्लाइड जगह और प्लास्टिक बॉक्स कवर के साथ नमूनों को कवर किया। 3 मिनट के लिए नमूना denature।
  8. उद्योग जगत37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर एक नम कक्ष में स्लाइड्स Ubate।

6. Washes और immunofluorescence

  1. संकरण धोने समाधान (2x एसएससी, 50% formamide) 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म।
  2. 5 मिनट के लिए आरटी पर दो बार PBST में नमूना धो लें। कांच कवर निकालें।
  3. 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर संकरण धोने के समाधान में नमूना धो लें।
  4. आरटी पर 3 गुना PBST में नमूना स्लाइड धो लें। नोट: आरटी पर नम कक्ष में बाद के सभी चरणों का प्रदर्शन।
  5. अवरुद्ध समाधान के 20 μl जोड़ें और उमस भरे कक्ष में आरटी पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
  6. अवरुद्ध समाधान निकालें और FITC संयुग्मित विरोधी digoxigenin एंटीबॉडी समाधान (1: 200) जोड़ने के आरटी पर या रात 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए।

7. बढ़ते और अवलोकन

  1. 15 मिनट प्रत्येक के लिए PBST के साथ नमूना स्लाइड धो 2 बार।
  2. DAPI के साथ समाधान बढ़ते के 10 μl जोड़ें। कांच कवर और प्रेस धीरे रखो। किसी भी अतिरिक्त समाधान निकालेंएक कागज तौलिया के साथ।
  3. बढ़ते समाधान के वाष्पीकरण को रोकने के लिए, नेल पॉलिश के साथ कवर कांच के किनारों को सील।
  4. confocal खुर्दबीन के नीचे का निरीक्षण करें। उच्च पृष्ठभूमि के साथ भ्रूण को बाहर निकालें। 20 नाभिक - 4 के साथ एक क्षेत्र पर ध्यान दें।
  5. 100X उद्देश्य लेंस के साथ निर्माता के निर्देश के अनुसार छवियों ले लो।
    नोट: DAPI के लिए 405 एनएम लेजर के साथ नमूना उत्तेजित, cy3 के लिए 555 एनएम लेजर के साथ, FITC के लिए 488 एनएम लेजर के साथ।

8. telomere सिग्नल की मात्रा

नोट: के रूप में पहले 16 में वर्णित मात्रा में किया गया था। सभी छवियों कि तुलना हो रहे हैं जोखिम समय और प्रकाश स्रोत सहित एक ही सेटिंग के साथ लिया जाना चाहिए।

  1. .tif प्रारूप में छवि निर्यात करें।
  2. डाउनलोड करें और छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर स्थापित करें।
  3. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर निष्पादित और सहमत बटन पर क्लिक करें।
  4. खुले बटन पर क्लिक करें। छवि फ़ाइल डबल क्लिक करके टेलोमेर मछली के साथ छवियों को खोलें।
  5. क्लिक करें[संपादित करें] - [चुनिंदा प्रसंस्करण क्षेत्र], द्वारा बाएँ क्लिक करें और खींच ब्याज के चुनिंदा क्षेत्र। सभी गैर विशिष्ट धुंधला को बाहर निकालें।
  6. [ऑप्टिकल घनत्व हाजिर] telomere संकेत के साथ चैनल का चयन करें और .txt फ़ाइल में परिणाम को बचाने के लिए फ़ाइल नाम दर्ज - [उपाय है] पर क्लिक करें।
    नोट: परिणामों के स्तंभ निम्न क्रम में हैं: मौके की प्रतिदीप्ति, स्थान और मौके के क्षेत्र की पृष्ठभूमि तीव्रता।
  7. मूल्यों की नकल और मौके की प्रतिदीप्ति से मौके की पृष्ठभूमि तीव्रता घटाना। मानों अब सांख्यिकीय विश्लेषण किया जा सकता है।

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Representative Results

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यह पहले से सूचना मिली थी कि एएलटी उत्तरजीवी द्वारा नकल आंतरिक रूप से 'alt का खाका' (TALT) telomere रखरखाव के लिए 2 दृश्यों स्थानीय कम आवृत्ति में, टेलोमिरेज की कमी उत्परिवर्ती से उभर सकता है टीआरटी-1 (ok410)। PNA जांच उपयोग करना, हम विच्छेदित gonads (2A चित्रा) में telomeres कल्पना करने में सक्षम थे। बेहोश telomere संकेत दोनों में टीआरटी-1 (ok410) और एएलटी उत्तरजीवी का पता चला था। फजी संकेत ही DAPI साथ छा गया था, सुझाव है कि वे autofluorescence नहीं हो सकता। बीच में आने वाले टेलोमेर की तरह दोहराने (आईटीआर) लगातार सी के अध्ययन में टीआरएफ परख में मनाया जाता है एलिगेंस टेलोमेर 4,10। PNA जांच के उच्च विशिष्टता को देखते हुए, वे आईटीआर जीनोम भर में बिखरे होने की संभावना है।

टेलोमेर स्पॉट की संख्या लगभग 9 pachytene नाभिक प्रति टीआरटी-1 (ok410) में था।पिछले एक अध्ययन में, 12 foci पॉट 1 :: mCherry प्रोटीन है, जो एक असहाय telomere डीएनए 10 को बांध से मनाया गया। नाभिक प्रति 24 foci के अधिकतम जंगली प्रकार भ्रूण 17 में मनाया गया। परिणाम से पता चलता है कि mCherry संवाददाता विधि प्रयोग जहां टेलोमेयर की संख्या में गिना जाना चाहिए के लिए बेहतर है। हालांकि PNA मछली टेलोमेर की लंबाई के साथ अनुपात में डबल असहाय telomere डीएनए के साथ ही एकल असहाय telomere डीएनए का पता लगाने में सक्षम है। इसके विपरीत, टेलोमेर स्पॉट की संख्या लगभग 7 एएलटी उत्तरजीवी है, जो क्रोमोसोम जुड़े हुए हैं में था (एन = 3) 2। यह परिणाम भविष्यवाणी के साथ सुसंगत है कि टेलोमेर स्पॉट एएलटी उत्तरजीवी में 6 होगा। हम निष्कर्ष निकाला है कि एएलटी उत्तरजीवी के संकेत तीव्रता मनाया जा करने के लिए पर्याप्त था।

Telomere संकेत एएलटी उत्तरजीवी में TALT1 साथ colocalized था, सुझाव है कि TALT1 Telo के अभाव में telomere के लिए प्रतिलिपि टेम्पलेट के रूप में प्रयोग किया जाता हैmerase (चित्रा 3)। एएलटी जीवित बचे लोगों की telomere संकेत पैतृक टीआरटी-1 (ok410) उत्परिवर्ती की तुलना में वृद्धि हुई है, यह दर्शाता है कि टेलोमेर मजबूती के साथ टेलोमिरेज बिना एएलटी जीवित बचे लोगों में बनाए रखा है (चित्रा 4)। PNA जांच के संकेत digoxigenin लेबल जांच (चित्रा 4) की तुलना में अधिक था। PNA oligomer के साथ डिजाइनिंग जांच digoxigenin लेबलिंग की तुलना में मजबूत संकेत में परिणाम हो सकता है।

आकृति 1
चित्रा 1:। मछली प्रयोग अंडे का अवलोकन विरंजन वयस्क कीड़े ने काटा और एक polylysine लेपित स्लाइड पर 2% पीएफए ​​में तय कर रहे हैं। नमूने फ्रीज फटा और मेथनॉल और जांच पैठ के लिए एसीटोन के साथ permeabilized रहे हैं। जांच नमूने के लिए जोड़ा गया है और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर संकरित हैं। Digoxigenin-लेबल जांच immunofluorescence द्वारा पता चला है। नमूने imaged हैं और फिर quantifieछवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर द्वारा घ। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। विच्छेदित gonads में telomere मछली (ए) telomere (लाल) gonads के बाहर का टिप (नोक) में cy3-PNA- (TTAGGC) 3 द्वारा खोजा गया था। एएलटी उत्तरजीवी की तीव्रता टीआरटी-1 (ok410) की तुलना में अधिक है। जेड ढेर छवि अधिकतम प्रक्षेपण के साथ गाया था। सफेद तीर द्वारा संकेत नाभिक उड़ा रहा है ऊपरी दाहिने कोने पर। स्केल बार, 10 माइक्रोन। (बी) pachytene चरण में नाभिक प्रति टेलोमेर स्पॉट की संख्या में दृश्य निरीक्षण द्वारा मापा गया था। एन = 50. त्रुटि सलाखों, SEM। देखने के लिए यहाँ क्लिक करेंयह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण।

चित्र तीन
चित्रा 3:। Telomere और भ्रूण में TALT1 मछली टेलोमेर (लाल) और TALT1 (हरा) मछली की एक प्रतिनिधि छवि। Telomere और TALT1 जांच एक साथ भ्रूण संकरित किया गया। डीएनए DAPI (नीला) के साथ counterstained गया था। स्केल बार, 10 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4:। मछली डेटा टेलोमेर की मात्रा और चित्रा 3 से TALT1 तीव्रता छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर (डॉ पीटर Lansdorp से एक उपहार) में मात्रा निर्धारित किया गया। हर जगह दहलीज स्तर ov के साथ मात्रा निर्धारित की गई थीएर 15 गैर विशिष्ट पृष्ठभूमि बाहर करने के लिए। टी परीक्षण सांख्यिकीय महत्व के मूल्यांकन के लिए इस्तेमाल किया गया था। (* पी <0.001)। त्रुटि सलाखों, SEM। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

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हमारे प्रोटोकॉल का मुख्य लाभ यह सेलुलर संरचना की आकृति विज्ञान के लिए ध्यान देने योग्य क्षति के बिना प्रक्रिया की सादगी है। कई कदम सी के लिए अनुकूलित किया गया इस प्रोटोकॉल में एलिगेंस मछली। सफल मछली के लिए महत्वपूर्ण कदम जांच की लेबलिंग, भ्रूण और प्रवेश के निर्धारण में शामिल हैं। Digoxigenin-dUTP लेबलिंग विधि पीसीआर या निक-अनुवाद के द्वारा एक आसान करने के लिए उपयोग लेबलिंग तरीका प्रदान करता है। लंबे समय तक लक्ष्य अनुक्रम लेबल, निक-अनुवाद पसंद किया जाता है। इस मामले में, जांच को जांच के प्रवेश की सुविधा के लिए उचित प्रतिबंध एंजाइम के साथ पचा जाना चाहिए। बायोटिन dUTP टैग की सिफारिश नहीं है क्योंकि बायोटिन लेबल जांच कोशिका द्रव्य से पृष्ठभूमि संकेत की अतिरिक्त राशि का उत्पादन किया। हालांकि अंतर्जात बायोटिन अवरुद्ध अभिकर्मक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है, यह प्रयास नहीं किया गया था।

इस प्रोटोकॉल कुशल मात्रा का ठहराव के लिए कोशिकाओं का घनत्व बढ़ाने के लिए पृथक भ्रूण का उपयोग करता है। सी की आंतों नाभिक। एलिगेंस आकार में बड़े होते हैं और polyploid कर रहे हैं, जो अत्यधिक संख्या और दैहिक नाभिक के बाकी की तुलना टेलोमेर स्पॉट की तीव्रता योगदान करते हैं। इस कारण से, पूरे कीड़ा सी में टेलोमेयर की मात्रा का ठहराव के लिए उपयुक्त नहीं है एलिगेंस। इसके विपरीत, भ्रूण टेलोमेर की लंबाई के मूल्यांकन के लिए उचित रूप में वे polyploidy के प्रभाव के बिना सजातीय कोशिकाओं को प्रदान कर रहे हैं।

इस प्रोटोकॉल 2% पीएफए ​​लगानेवाला कि टेलोमेर मछली के लिए ठीक काम करता है। हालांकि glutaraldehyde एक कम पृष्ठभूमि संकेत और सीटू संकरण में शाही सेना में कठिन निर्धारण में परिणाम की सूचना दी है, glutaraldehyde काफी 18 autofluorescence वृद्धि हुई है। इस अतिरिक्त पृष्ठभूमि सोडियम borohydride, जो unreacted एल्डिहाइड समूह कम कर देता है के उपचार के बाद समाप्त कर दिया गया नहीं था। इस कारण से, glutaraldehyde का प्रयोग नहीं किया गया था। यदि संकेत करने वाली शोर अनुपात कम है, prehybridization के समय गैर विशिष्ट बंधन साइटों को ब्लॉक करने में कई घंटे तक बढ़ाया जा सकता है। मेंइसके अलावा, कड़े धोने के समय पृष्ठभूमि के स्तर को कम करने के लिए बढ़ाया जा सकता है।

में धुंधला तकनीक एलिगेंस उचित permeabilization उपचार के लिए एक चुनौती हो सकती है। सी एलिगेंस मोटी चर्म संबंधी बहिःकंकाल जो एंटीबॉडी और जांच के प्रवेश को रोकता है शामिल हैं। पारंपरिक एंटीबॉडी धुंधला विधि collagenase के उपचार, जो ज्यादा समय और अनुकूलन की प्रक्रिया की आवश्यकता शामिल है। एंजाइमी पैठ भी विधि प्रवेश दक्षता के आदान-प्रदान में नुकसान कीड़े की आकृति विज्ञान। रुक-दरार और मेथनॉल एसीटोन उपचार जांच पैठ की सुविधा के लिए इस्तेमाल किया गया था। रुक-दरार काइटिनेस या yatalase उपचार 19 की तुलना में सरल और तेजी से है। निर्जलीकरण या मेथनॉल श्रृंखला के पुनर्जलीकरण मछली की गुणवत्ता को प्रभावित करने के लिए नहीं मालूम था। ये कदम इस प्रोटोकॉल में सरलीकृत किया गया। हालांकि यह बताया गया कि proteinase कश्मीर पाचन सीटू संकरण में शाही सेना के लिए आवश्यक था19, स्पष्ट अंतर के साथ और proteinase कश्मीर उपचार के बिना टेलोमेर मछली परिणाम के बीच नहीं मनाया गया। इसके अलावा, फ्रीज खुर बड़ी मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक एकल फोकल हवाई जहाज़ पर एक साथ कई कोशिकाओं visualizing के लिए एक आसान करने के लिए उपयोग विधि प्रदान की भ्रूण की।

PNA जांच का उपयोग करके, telomere संकेत काफी एक डीएनए जांच के साथ प्राप्त की है कि के साथ तुलना में वृद्धि की गई थी। यह उसके पूरक लक्ष्य है और इसके छोटे आकार (3 दोहराने 4 दोहराने की तुलना में) के लिए उच्च बंधन आत्मीयता के कारण हो सकता है। Fluorescently लेबल PNA जांच भी सीधे अपने लक्ष्य को बांधता है, बाद के चरणों को कम। मजबूत संबंध निम्न immunofluorescence चरणों में बनाए रखा के बाद निर्धारण अनावश्यक है, जो पृष्ठभूमि शोर से बच सकते हैं बनाता है।

हालांकि, कुछ सीमाएं इस तकनीक में मौजूद हैं। एक यह है कि permeabilization थोड़ा नुकसान कुशल जांच पैठ की कीमत पर आकृति विज्ञान कदम है। gonad का उपचारऔर मेथनॉल और एसीटोन के साथ भ्रूण अनुपचारित नियंत्रण की तुलना में विकृत नाभिक का घेरा। प्रयोगों है कि पूरी तरह से संरक्षित आकृति विज्ञान की आवश्यकता के लिए, विभिन्न permeabilization विधि प्रयास किया जाना चाहिए। दूसरा यह है कि टेलोमेर संकेत मनमाना इकाइयों में मात्रा निर्धारित किया जाता है। यह मुख्य रूप से स्वतंत्र प्रयोगों के बीच बदलाव के कारण होता है। Ribosomal डीएनए नमूना प्रत्येक सामान्य करने के लिए एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में माना जा सकता है। अधिक उपयोगी तरीके संदर्भ 20 में पाया जा सकता है।

एक साधारण टेलोमेर मछली प्रोटोकॉल यहाँ वर्णन किया गया है, जो कम से कम चरणों की आवश्यकता है। कई चरणों के भ्रूण की बड़ी राशि के विश्लेषण के लिए कम कर रहे हैं। हालांकि, आगे संशोधन इस तरह के प्रवेश के लिए काइटिनेस उपचार, और अन्य नवीन परीक्षणों के रूप में मजबूत संकेत के लिए बनाया जा सकता है। सेल संस्कृति विधि के साथ संयोजन में, सुपर संकल्प इमेजिंग संभव हो सकता है। इस प्रोटोकॉल सी में उपन्यास telomere रखरखाव तंत्र की खोज करने में मदद कर सकते हैं एलिगेंस।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
PNA probe PANAGENE custom order
Anti-Digoxigenin-Fluorescein, Fab fragments Roche 11207741910 use 1:200 diluted in PBST
Digoxigenin-dUTP Roche 11573152910
Bovine serum albumin SIGMA-ALDRICH A-7906
Paraformaldehyde SIGMA-ALDRICH P-6148 prepare 4% paraformaldehyde by heating in DW with few drops of NaOH. add 0.1 volume of 10x PBS.
Vectashield Vector Laboratories H-1200
Hybridizaiton solution 3x SSC, 50% formamide, 10% (w/v) dextran sulfate, 50 μg/ml heparin, 100 μg/ml yeast tRNA , 100 μg/ml sonicated salmon sperm DNA
Hybridizaiton wash solution 2x SSC, 50% formamide
Formamide BIONEER C-9012 toxic
Methanol Carlo Erba
Acetone Carlo Erba
Heparin SIGMA-ALDRICH H3393 make 10 mg/ml for stock solution
Dextran sulfate SIGMA-ALDRICH 67578
10x PBS For 1 L DW : 80 g NaCl, 2.0 g KCl, 27 g Na2HPO4•7H2O, 2.4 g KH2PO
PBST 1x PBS, 0.1% tween-20
Polysorbate 20 SIGMA-ALDRICH P-2287 Commercial name is Tween-20
Poly-L-Lysine solution (0.1% w/v) SIGMA-ALDRICH P-8920 prepare fresh 0.01% w/v solution before use
M9 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 L
Bleaching solution 20% sodium hypochlorite, 0.5 M KOH
Antibody buffer 1x PBST, 1 mM EDTA, 0.1% BSA, 0.05% Sodium azide (toxic)
Blocking solution Antibody buffer with 5% bovine serum albumin (BSA)
illustra Microspin G-50 GE healthcare 27-53310-01
20x SSC To make 1 L, 175.3 g of NaCl, 88.2 g of sodium citrate, H2O to 1 L, adjust pH to 7.0
2x SSCT 2x SSC, 0.1% tween-20
10x digoxigenin-dUTP mix 1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0.65 mM dTTP, 0.35 mM DIG-11-dUTP
PCR purification columns Cosmo genetech CMR0112
Glass cleaner / ULTRA CLEAN Dukssan pure chemicals 8AV721
Multi-well glass slide MP biomedicals 96041205
Nematode growth media To make 1 L, 3 g of NaCl, 17 g of agar, 2.5 g of peptone, H2O to 974 ml. Autoclave and cool the flask. Add 1 ml of 1 M CaCl2, 1 ml of 4 mg/ml cholesterol in ethanol, 1 ml of 1 M MgSO4, 25 ml of 1 M KPO4.
Levamisole SIGMA-ALDRICH 196142
Razor Feather blade No. 11
Rnase A Enzynomics
BSA SIGMA-ALDRICH A7906
Confocal microsope Zeiss LSM 510 EC Plan-Neofluar 100X was used as objective lens.
Humid chamber Plastic box filled with paper towel soaked in DW
Image Analysis Software  Dr. Peter Landsdorp TFL-telo http://www.flintbox.com/public/project/502

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References

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अवलोकन और टेलोमेर की मात्रा और दोहराव दृश्यों का उपयोग प्रतिदीप्ति<em&gt; बगल में</em&gt; संकरण (मछली) में PNA जांच के साथ<em&gt; Caenorhabditis एलिगेंस</em
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Seo, B., Lee, J. Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with PNA Probes in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (114), e54224, doi:10.3791/54224 (2016).More

Seo, B., Lee, J. Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with PNA Probes in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (114), e54224, doi:10.3791/54224 (2016).

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