Introduction
Telomeri protegge le estremità cromosomiche dalla fusione aberranti e degrado. telomeri mammiferi è composta da G-ricchi ripete esamerica, TTAGGG, e complessi shelterin. La sequenza di ripetizione telomerica del nematode è simile a quelle dei mammiferi (TTAGGC). La maggior parte degli eucarioti utilizzano telomerasi per aggiungere le ripetizioni dei telomeri alle loro estremità cromosomiche. Tuttavia, il 10 - 15% delle cellule tumorali utilizzano telomerasi meccanismo indipendente, conosciuto come allungamento dei telomeri alternativo (ALT) 3. In precedenza, abbiamo riportato che ripete telomeri e le sue sequenze associate, come il nome TALT, sono stati amplificati nei telomeri di linee mutanti telomerasi che sono sopravvissuti la sterilità critica 2.
La lunghezza dei telomeri è stata misurata mediante PCR quantitativa o Southern blot, che fornisce la lunghezza media dei telomeri totale 4,5,6,7. Leggi conteggio di ripetizione dei telomeri in tutto il sequenziamento del genoma dei dati è anche un indicatore del totale contenuti telomeri 8. Sebbene SinGLE Telomere Lunghezza Analysis (STELA) potrebbe fornire la lunghezza di un singolo telomero, essa non può fornire informazioni spaziali dei telomeri 9. Mentre POT-1 :: mCherry proteina reporter fornisce le informazioni spaziali dei telomeri in vivo, non può rappresentare lunghezze dei telomeri a doppio filamento, come POT-1 è un telomero singolo filamento proteico il 10 vincolante.
Mentre i metodi di cui sopra prevedono l'informazione media delle sequenze ripetitive, ibridazione in situ fluorescente (FISH) permette di osservare la quantità e la distribuzione spaziale delle singole sequenze di interesse su scala cromosomica. Invece di purificazione del DNA, tessuti o cellule vengono fissate per mantenere le informazioni nativo spaziale FISH. Così, il pesce è uno strumento sia quantitativa e qualitativa per l'osservazione delle singole sequenze ripetute, come ripete telomeri.
Questo protocollo fornisce un metodo efficiente per la rilevazione simultanea di entrambi telomeri e altre repliche basate su miglioramenti da metodi descritti in precedenza 11,12. C. elegans larve o adulti sono organismo multicellulare con cellule altamente differenziate. L'eterogeneità delle cellule impedisce sull'analisi quantitativa di un gran numero di macchie telomeri. Per massimizzare il numero di cellule analizzate, gli embrioni sono isolati e diffondere sugli scivoli polilisina rivestita per i pesci. Inoltre, questo protocollo può anche essere combinato con immunofluorescenza.
Come prova che il protocollo funziona, mostriamo che è possibile osservare e quantificare due differenti sequenze ripetitive. sonda di DNA contro TALT1 è stata generata con semplice PCR che incorpora digossigenina-dUTP. Poi questa sonda TALT1 e sonda PNA telomeri fluorescenza marcati sono stati ibridati simultaneamente. Successivamente, digossigenina stato rilevato con metodi di immunofluorescenza canonici. Vi presentiamo qui le immagini rappresentative dove TALT1 colocalizzava con il telomero in TRT-1
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Protocol
1. Sonde Etichettatura con digossigenina-dUTP mediante PCR
- Eseguire etichettatura PCR con 10x dNTP mix contenente digossigenina-dUTP come descritto in precedenza 13.
- Purificare prodotto di PCR con la purificazione spin-colonna secondo le istruzioni del produttore.
- Se la sonda è più breve di 200 bp, rimuovere libera digossigenina-dUTP con cromatografia spin-colonna dalla miscela di reazione piuttosto che depurazione spin-colonna.
2. Preparare diapositive polilisina rivestiti
Nota: L'intera procedura richiede circa 2 ore. La maggior parte dei passaggi sono eseguiti a temperatura ambiente tranne per la fase di essiccazione.
- Pulizia delle diapositive
- Porre i vetrini in un contenitore di plastica e lavare rapidamente i vetrini con acqua distillata (DW). Rimuovere l'acqua e riempire il contenitore con DW contenente detergente per vetri 1%.
- Agitare i vetrini per 15 min a 50 rpm a temperatura ambiente (RT). Lavare le diapositive con DW 3volte per 5 minuti ciascuno a temperatura ambiente.
- Lavare i vetrini con il 70% di etanolo per 15 minuti con agitazione. Scartare 70% di etanolo e posizionare i vetrini su un blocco secca 65 ° C e asciugare per 15 min.
- Rivestimento polilisina di diapositive di vetro multi-well
Nota: il rivestimento polilisina di vetro scorrevole è un passo importante, in quanto fornisce l'adesione del campione durante la procedura di colorazione. Scarsamente scorrevole rivestito comporterà la perdita di campione.- Diluire la soluzione polilisina magazzino al 0,01% (w / v) in acqua distillata. Aggiungere 20 ml di diluito 0,01% (w / v) polilisina ai pozzetti di un vetrino pulito.
- Incubare il vetrino per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Porre i vetrini su un blocco di 65 ° C asciutto e asciugare per 1 ora.
- Conservare le diapositive polilisina nella scatola senza polvere.
3. Fissazione di Worms sul vetrino (figura 1)
- embrioni Preparazione per FISH
Nota: i vermi Harvest prima di tutto tegli cibo batterica è consumato guardando i mezzi di crescita sotto il microscopio. La fame riduce la produzione di uova di vermi adulti e aumenta la schiusa delle uova. Metodi dettagliati sono descritti in 14,15.- Crescere i vermi in 50 millimetri Petri-piatto secondo i metodi standard di 14.
- Dopo tutto il cibo batterica è consumato, tagliare il supporto agar nel quartiere con la spatola. Sterilizzare la spatola prima del taglio per evitare contaminazioni.
- Mettere tutto il pezzo di agar sul (NGM) piatto 100 millimetri terreni di crescita nematode. Girare il pezzo agar a testa in giù per i vermi per raggiungere il cibo batterica fresca.
- Dopo 48-72 ore, raccogliere i vermi con tampone M9. Aggiungere 3 - 5 ml di tampone M9 sulla piastra NGM. Pipetta M9 tampone sulla superficie della NGM per lavare i vermi.
- Raccogliere il liquido con i vermi e aggiungere in una provetta da 15 ml.
Nota: Se c'è detriti agar dopo il raccolto, centrifuga i vermi in una soluzione di saccarosio al 30%. Mentre i detriti sono pellettato, vermi galleggiano sula superficie. - Aggiungere tampone M9 per compensare il volume a 15 ml. Pellet i vermi mediante centrifugazione a 300 xg per 3 min e rimuovere la maggior parte del buffer M9. Ripetere questa operazione altre 2 volte.
Nota: se i vermi sono ancora a galla dopo la centrifugazione, impostare il livello del freno della centrifuga al Valore = 1. - Aspirare tampone M9. Aggiungere la soluzione sbiancante per i vermi. Per 0,5 ml di vermi, aggiungere 6,5 ml di DW, 2 ml di ipoclorito, 1 ml di 5 M KOH.
- Incubare i vermi con dondolo a temperatura ambiente per 3 minuti a 50 giri al minuto. vermi Vortex per 15 secondi per tosare meccanicamente i vermi ed esporre le uova.
- Osservare il tubo sotto un microscopio di dissezione durante il candeggio. Assicurarsi che i vermi sono tagliati a metà e le uova vengono rilasciati. Quando la maggior parte del corpo adulto è sciolto, aggiungere tampone M9 per compensare il volume a 15 ml.
- Centrifugare a 300 xg per 3 min. Aspirare la maggior parte della M9 e aggiungere tampone M9 fresco per compensare il volume a 15 ml. fase di lavaggio ripetere 3 volte.
Nota:Evitare di utilizzare quantità eccessiva di vermi, in quanto ostacolano il processo di sbiancamento. Mantenere il tempo di reazione complessivo inferiore a 8 minuti fino a quando il lavaggio. Over-sbiancato uova producono forti autofluorescenza. - Aggiungere tampone fosfato con polisorbato-20 (PBST) fino a 200 ml e 200 ml di 4% paraformaldeide (PFA) per rendere il 2% PFA.
Attenzione: Dal momento che PFA è cancerogeno, indossare indumenti protettivi, guanti e protezione per gli occhi prima di utilizzare PFA. - Aggiungere 40 ml di uova a 2% PFA sul pozzo di rivestito polilisina diapositiva.
- Porre i vetrini in una camera umida e incubare per 15 minuti a RT. Chiudere la camera umida subito dopo le diapositive sono collocati all'interno.
Nota: Le uova si depositano sul fondo della slitta pur essendo fisso.
- Preparazione gonadi sezionati per i pesci
- vermi Harvest adulti coltivati sul 50 mm Piastra NGM pipettando 1 ml di tampone M9. vermi Harvest prima di alimentare batterica è esaurito.
- Lavare i vermi da qualsiasi batteri ingegnoh tampone M9, 2 volte.
Nota: i batteri residui possono interferire con le gonadi sezionati si attacchino alle diapositive rivestito polilisina. - Pellet i vermi per centrifugazione a 300 x g. Rimuovere M9 e trasferire i vermi alla piastra NGM vuota micropipetta.
- Aggiungere 30 ml di tampone M9 contenente 2 mM levamisolo su un pozzo di polilisina trattata diapositiva.
- Aggiungere 500 microlitri di tampone M9 ad una provetta 1 ml. Utilizzare questo buffer per trasferire i vermi per bocca pipetta.
- Riempire la punta della pipetta bocca con tampone M9 mettendo un capillare nel tubo 1 ml contenente il tampone M9.
- Sotto il microscopio dissezione, inserire la punta della pipetta bocca di fronte alla testa di adulto verme e trascinare bocca pipetta in modo che la testa di vermi entra pipetta bocca. Una volta che la testa di vermi entra la punta, l'intero corpo di verme sarà disegnato nella punta.
- Trasferire i vermi alla diapositiva rivestito polilisina usando la bocca pipetta.
- Usando un rasoio, taglio dif la testa o la punta della coda di vermi sul vetrino. Quando il worm viene tagliato, le gonadi uscirà fuori. Gonadi si attaccano alle diapositive.
- Preparare almeno 30 vermi in un pozzetto. Più pozzetti possono essere utilizzati per altri 30 vermi.
- Mettere il vetrino nella camera umida e aspirare via il buffer M9 con la bocca pipetta.
- Fissare il campione aggiungendo 20 ml di 2% PFA a temperatura ambiente per 15 minuti in camera umida.
4. Fissazione e permeabilizzazione
- Posizionare un blocco di alluminio in ghiaccio secco e riporla in un congelatore (-80 ° C). Conservare metanolo e acetone -20 ° C.
- Dopo la fissazione PFA passo 3.1.15 o 3.2.11, rimuovere fissativo utilizzando micropipetta lasciando ~ 5 ml di fissativo.
- Mettere un altro vetrino rivestito polilisina sulla diapositiva campione. Rimuovere il fissativo con tovagliolo di carta se la soluzione è eccessiva. Non spostare le diapositive una volta che sono attaccati insieme.
- Congelare le diapositivesul blocco di alluminio per almeno 15 min.
Nota: I campioni possono essere conservati per almeno 2 - 3 giorni. - Mentre le diapositive vengono congelati, mettere i vasi contenenti metanolo freddo e acetone su ghiaccio.
- Prendere le diapositive fuori e torcere loro di congelare-crack del campione. Eliminare la slitta superiore. immergere immediatamente il vetrino in metanolo ghiacciato per 5 min.
- Trasferire i vetrini in acetone ghiacciata per 5 min.
- Lavare i vetrini 3 volte con PBST per 5 minuti per rimuovere fissativo residuo. Procedere alla fase successiva o conservare le diapositive in 100% di etanolo a 4 ° C.
Nota: I campioni possono essere conservati per almeno 2 - 3 giorni.
5. L'ibridazione di cellule fissate
- Aggiungere 20 ml di soluzione di RNasi (PBST contenente 10 ug / ml RNasi A). Incubare il vetrino nella camera umida a 37 ° C per 1 ora.
- Lavare il vetrino due volte in soluzione salina 2x e citrato di sodio polisorbato-20 (2x SSCT) per 15 minuti ciascuno.
- Aggiungere 20ml di soluzione di ibridazione e di mettere la camera umida nel 37 ° C incubatore. Dopo 1 ora, rimuovere la soluzione di ibridazione pipettando.
- Prima di rimuovere soluzione di ibridazione, di preparare la sonda. Se la sonda è DNA a doppia elica, denaturare le sonde mediante riscaldamento a 95 ° C per 5 min su un blocco secca. Dopo il riscaldamento, raffreddare la sonda brevemente ghiaccio.
- Aggiungere 10 ml di soluzione di ibridazione contenente sonde al campione. Per sonda PNA, concentrazione uso con un rapporto di 1: 2.000 e per sonda dig-marcato, la concentrazione uso con un rapporto di 1: 200. Coprire il campione con vetro di copertura.
- Mettere un tovagliolo di carta imbevuto di acqua sul blocco di calore (80 ° C). Mettere un coperchio di plastica sul blocco di calore per preservare l'umidità e la temperatura.
- Dopo che la temperatura del blocco termico è stabilizzata (a 80 ° C), collocare il vetrino campione sul tovagliolo di carta riscaldato e coprire con il coperchio di plastica. Denaturare il campione per 3 min.
- IncUbate i vetrini in camera umida notte a 37 ° C.
6. Lava ed immunofluorescenza
- Riscaldare la soluzione di lavaggio di ibridazione (2x SSC, il 50% formammide) a 37 ° C.
- Lavare il campione in PBST due volte a temperatura ambiente per 5 min. Rimuovere il vetro di copertura.
- Lavare il campione in soluzione di lavaggio ibridazione a 37 ° C per 30 min.
- Lavare il vetrino del campione in PBST 3 volte a temperatura ambiente. Nota: eseguire tutti i passaggi successivi nella camera umida a temperatura ambiente.
- Aggiungere 20 ml di soluzione di blocco e incubare per 1 ora a RT nella camera umida.
- Rimuovere soluzione bloccante e aggiungere FITC coniugato soluzione di anticorpo anti-digossigenina (1: 200) per 3 ore a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C.
7. Montaggio e di osservazione
- Lavare il vetrino campione con PBST 2 volte per 15 minuti ciascuno.
- Aggiungere 10 ml di soluzione di montaggio con DAPI. Mettere delicatamente il vetro di copertura e premere. Rimuovere la soluzione in eccessocon un tovagliolo di carta.
- Per evitare l'evaporazione della soluzione di montaggio, sigillare i bordi del vetro di copertura con smalto.
- Osservare al microscopio confocale. Esclusione di embrioni con fondo elevato. Focus su un campo con 4 - 20 nuclei.
- Prendere le immagini in base alle istruzioni del produttore con lente obiettivo 100X.
Nota: Excite campione con 405 nm laser per DAPI, con 555 nm laser per Cy3, con 488 nm laser per FITC.
8. Quantificazione dei telomeri Signal
Nota: quantificazione è stata effettuata come descritto in precedenza 16. Tutte le immagini che devono essere confrontate vengono presi con stessa impostazione compreso il tempo di esposizione e la sorgente luminosa.
- Esportare l'immagine in formato tif.
- Scaricare e installare il software di analisi delle immagini.
- Eseguire il software di analisi di immagine e fare clic sul pulsante d'accordo.
- Fare clic sul pulsante aperta. Aprire le immagini con telomeri FISH facendo doppio clic sul file di immagine.
- Clic[Modifica] - [seleziona regione di elaborazione], selezionare regione di interesse da parte di sinistra del mouse e trascinamento. Escludere tutte le colorazione aspecifica.
- Fare clic su [misura] - [Spot densità ottiche], selezionare il canale con il segnale dei telomeri e immettere il nome del file per salvare i risultati in file txt.
Nota: La colonna di risultati sono nel seguente ordine: fluorescenza di spot, intensità di spot e area di spot background. - Copiare i valori e sottrarre l'intensità di spot sfondo da fluorescenza della macchia. I valori possono essere analizzati statisticamente.
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Representative Results
In precedenza era stato riferito che sopravvissuto ALT può emergere dal mutante telomerasi-deficienti, TRT-1 (ok410), in bassa frequenza replicando localizzato internamente 'Modello di ALT' (TALT) sequenze per telomeri manutenzione 2. Utilizzando la sonda PNA, siamo stati in grado di visualizzare telomeri nelle gonadi sezionati (Figura 2A). Il segnale telomeri debole è stato rilevato sia in TRT-1 (ok410) e ALT superstite. Il segnale sfocata è stata sovrapposta solo con DAPI, suggerendo che essi non possono essere autofluorescenza. Interstitial telomero-like repeat (ITR) è costantemente osservato nel test FR nello studio di C. elegans telomeri 4,10. Considerando elevata specificità della sonda di PNA, che sono suscettibili di essere la ITR disperso in tutto il genoma.
Il numero di macchie telomeri è stato di circa il 9 per nucleo pachytene in TRT-1 (ok410).Nello studio precedente, 12 focolai è stata osservata dal POT-1 :: proteine mCherry, che si lega al DNA a singolo filamento telomeri 10. Massimo di 24 foci per nucleo è stato osservato negli embrioni di tipo selvatico 17. Il risultato suggerisce che il metodo giornalista mCherry è meglio per l'esperimento in cui deve essere conteggiato il numero dei telomeri. Tuttavia PNA FISH è in grado di rilevare il DNA a doppia elica telomero nonché DNA a singolo filamento telomero in proporzione con la lunghezza dei telomeri. Al contrario, il numero di punti telomeri era approssimativamente 7 reversibilità ALT, che sono fusi cromosomi (N = 3) 2. Questo risultato è coerente con la previsione che macchie telomeri sarebbero 6 in ALT sopravvissuto. Abbiamo concluso che l'intensità del segnale di ALT superstite era sufficiente per essere osservato.
segnale dei telomeri era colocalizzava con TALT1 nel superstite ALT, suggerendo che TALT1 è usato come modello copia per telomeri, in assenza di telopolimerasi (Figura 3). Segnale dei telomeri dei sopravvissuti ALT aumentato rispetto a quello del TRT-1 (ok410) mutante dei genitori, indicando che telomero è robusto mantenuto in sopravvissuti ALT senza telomerasi (Figura 4). Il segnale di sonda di PNA era maggiore di quella sonda marcata con digossigenina (Figura 4). Progettare sonde con PNA oligomero potrebbero comportare il segnale più forte di digossigenina-etichettatura.
Figura 1:. Panoramica di FISH Experiment uova vengono raccolte sbiancando vermi adulti e fissata nel 2% PFA su un vetrino polilisina rivestita. I campioni sono freeze-incrinati e permeabilizzate con metanolo e acetone per la penetrazione della sonda. Le sonde vengono aggiunti al campione e ibridizzati notte a 37 ° C. Sonda marcata con digossigenina viene rilevato mediante immunofluorescenza. I campioni vengono esposte e quindi quantified dal software di analisi di immagine. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2:. Telomere FISH nelle gonadi sezionato (A) telomeri (rosso) è stato rilevato dal Cy3-PNA- (TTAGGC) 3 nella punta distale del gonadi (punta di freccia). L'intensità di ALT reversibilità è maggiore di quella della trt-1 (ok410). immagine Z-stack è stato reso con la massima proiezione. Nuclei indicati dalla freccia bianca è soffiato-up nell'angolo in alto a destra. barra della scala, 10 micron. (B) Numero di punti telomeri per nucleo in fase pachytene è stata misurata mediante ispezione visiva. N = 50. Le barre di errore, SEM. Cliccate qui per vedereuna versione più grande di questa figura.
Figura 3:. Telomeri e TALT1 FISH negli embrioni un'immagine rappresentativa di telomeri (rosso) e TALT1 (verde) FISH. Telomeri e sonda TALT1 sono stati ibridati agli embrioni contemporaneamente. DNA è stato di contrasto con DAPI (blu). Barra della scala, 10 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4:. Quantificazione dei FISH dati dei telomeri e l'intensità TALT1 dalla figura 3 sono stati quantificati nel software di analisi delle immagini (un dono del Dr. Peter Lansdorp). Ogni spot è stato quantificato con il livello di soglia ovER 15 di escludere sfondo non specifico. T-test è stato utilizzato per valutare la significatività statistica. (* P <0,001). Le barre di errore, SEM. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il vantaggio principale del nostro protocollo è la semplicità della procedura senza danni evidenti alla morfologia della struttura cellulare. Diversi passaggi sono stati ottimizzati per C. elegans FISH in questo protocollo. I passaggi critici per i pesci di successo includono l'etichettatura di sonde, la fissazione di embrioni e la penetrazione. metodo di etichettatura digossigenina-dUTP fornisce un metodo di etichettatura di facile utilizzo mediante PCR o nick-translation. Per etichettare lunga sequenza bersaglio, nick-traduzione è preferito. In questo caso, le sonde devono essere digeriti con enzima di restrizione adeguato per facilitare la penetrazione di sonde. tag biotina-dUTP non è raccomandato perché sonde biotina marcata con prodotte in eccesso quantità di segnale di fondo dal citoplasma. Sebbene endogena reagente biotina blocco è disponibile in commercio, non ha tentato.
Questo protocollo utilizza embrioni isolati per aumentare la densità delle cellule per la quantificazione efficiente. Nuclei intestinali di C. elegans sono di grandi dimensioni e sono poliploidi, che contribuiscono il numero e l'intensità delle macchie telomeri rispetto al resto dei nuclei somatici eccessivo. Per questo motivo, tutta verme non è adatto per la quantificazione dei telomeri in C. elegans. Al contrario, gli embrioni sono appropriati per la valutazione della lunghezza dei telomeri in quanto forniscono le cellule omogenee, senza effetto di poliploidia.
Questo protocollo utilizza 2% PFA fissativo che ha funzionato bene per telomeri FISH. Anche se glutaraldeide è segnalato per risultare in un segnale di fondo più basso e più difficile fissazione in RNA ibridazione in situ, glutaraldeide è aumentato in modo significativo autofluorescenza 18. Questo eccesso di sfondo non è stata abolita dopo il trattamento di boroidruro di sodio, che riduce gruppo aldeidico non reagito. Per questo motivo, glutaraldeide non è stato utilizzato. Se il rapporto segnale-rumore è basso, il tempo di prehybridization può essere esteso fino a diverse ore per bloccare non specifici siti di legame. InInoltre, il tempo di lavaggio stringente può essere aumentata per diminuire il livello di sfondo.
tecnica di colorazione in C. elegans può essere una sfida per il corretto trattamento permeabilizzazione. C. elegans contiene spessore esoscheletro cuticolare che inibisce la penetrazione degli anticorpi e sonde. Tradizionale metodo di colorazione anticorpale comporta il trattamento di collagenasi, che richiede molto tempo e processo di ottimizzazione. Il metodo di penetrazione enzimatica danneggia anche la morfologia dei vermi in cambio di efficienza penetrazione. Freeze-crepa e il trattamento metanolo-acetone è stato utilizzato per facilitare la penetrazione della sonda. Freeze-crack è semplice e rapida rispetto a chitinase o yatalase trattamento 19. Disidratazione o la reidratazione di serie metanolo non sembrano influenzare la qualità del pesce. Questi passaggi sono state semplificate in questo protocollo. Anche se è stato riferito che la digestione proteinasi K è stato richiesto per l'RNA di ibridazione in situ19, ovvia differenza non è stata osservata tra i risultati dei telomeri FISH con e senza proteinasi K trattamento. Inoltre, congelamento-cracking di embrioni fornito un metodo semplice da usare per la visualizzazione molte cellule contemporaneamente su un unico piano focale per grandi analisi quantitativa.
Utilizzando la sonda PNA, segnale telomeri era significativamente aumentata rispetto a quella ottenuta con una sonda di DNA. Questo potrebbe essere dovuto ad una maggiore affinità di legame per il suo target complementare e la sua dimensione più piccola (3 ripetizione rispetto ai 4 di ripetizione). Sonda PNA fluorescente anche si lega direttamente al suo obiettivo, riducendo al minimo i passaggi successivi. Forte affinità mantenuto nelle seguenti fasi immunofluorescenza rende post-fissaggio inutili, che può evitare il rumore di fondo.
Tuttavia, alcune limitazioni esistono in questa tecnica. Uno è che la permeabilizzazione passo leggermente danni morfologia a costo di penetrazione della sonda efficiente. Trattamento della gonades ed embrioni con metanolo e acetone distorti circolarità dei nuclei rispetto al controllo non trattato. Per gli esperimenti che richiedono la morfologia perfettamente conservato, diverso metodo di permeabilizzazione dovrebbe essere tentata. Un altro è che il segnale telomero è quantificato in unità arbitrarie. Ciò è dovuto principalmente alle variazioni tra esperimenti indipendenti. DNA ribosomiale può essere considerato come controllo interno per normalizzare ogni campione. Ulteriori metodi utili si possono trovare in riferimento 20.
Un semplice protocollo telomeri FISH è descritta qui, che richiede passaggi minimi. Molti passi sono ridotti per l'analisi di grandi quantità di embrioni. Tuttavia, ulteriori modifiche può essere fatto per il segnale più forte, come il trattamento chitinasi per la penetrazione, e altri processi innovativi. In combinazione con il metodo di coltura cellulare, imaging super-risoluzione può essere possibile. Questo protocollo può aiutare a scoprire il nuovo meccanismo dei telomeri manutenzione in C. elegans.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PNA probe | PANAGENE | custom order | |
| Anti-Digoxigenin-Fluorescein, Fab fragments | Roche | 11207741910 | use 1:200 diluted in PBST |
| Digoxigenin-dUTP | Roche | 11573152910 | |
| Bovine serum albumin | SIGMA-ALDRICH | A-7906 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | P-6148 | prepare 4% paraformaldehyde by heating in DW with few drops of NaOH. add 0.1 volume of 10x PBS. |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Hybridizaiton solution | 3x SSC, 50% formamide, 10% (w/v) dextran sulfate, 50 μg/ml heparin, 100 μg/ml yeast tRNA , 100 μg/ml sonicated salmon sperm DNA | ||
| Hybridizaiton wash solution | 2x SSC, 50% formamide | ||
| Formamide | BIONEER | C-9012 | toxic |
| Methanol | Carlo Erba | ||
| Acetone | Carlo Erba | ||
| Heparin | SIGMA-ALDRICH | H3393 | make 10 mg/ml for stock solution |
| Dextran sulfate | SIGMA-ALDRICH | 67578 | |
| 10x PBS | For 1 L DW : 80 g NaCl, 2.0 g KCl, 27 g Na2HPO4•7H2O, 2.4 g KH2PO | ||
| PBST | 1x PBS, 0.1% tween-20 | ||
| Polysorbate 20 | SIGMA-ALDRICH | P-2287 | Commercial name is Tween-20 |
| Poly-L-Lysine solution (0.1% w/v) | SIGMA-ALDRICH | P-8920 | prepare fresh 0.01% w/v solution before use |
| M9 | 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 L | ||
| Bleaching solution | 20% sodium hypochlorite, 0.5 M KOH | ||
| Antibody buffer | 1x PBST, 1 mM EDTA, 0.1% BSA, 0.05% Sodium azide (toxic) | ||
| Blocking solution | Antibody buffer with 5% bovine serum albumin (BSA) | ||
| illustra Microspin G-50 | GE healthcare | 27-53310-01 | |
| 20x SSC | To make 1 L, 175.3 g of NaCl, 88.2 g of sodium citrate, H2O to 1 L, adjust pH to 7.0 | ||
| 2x SSCT | 2x SSC, 0.1% tween-20 | ||
| 10x digoxigenin-dUTP mix | 1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0.65 mM dTTP, 0.35 mM DIG-11-dUTP | ||
| PCR purification columns | Cosmo genetech | CMR0112 | |
| Glass cleaner / ULTRA CLEAN | Dukssan pure chemicals | 8AV721 | |
| Multi-well glass slide | MP biomedicals | 96041205 | |
| Nematode growth media | To make 1 L, 3 g of NaCl, 17 g of agar, 2.5 g of peptone, H2O to 974 ml. Autoclave and cool the flask. Add 1 ml of 1 M CaCl2, 1 ml of 4 mg/ml cholesterol in ethanol, 1 ml of 1 M MgSO4, 25 ml of 1 M KPO4. | ||
| Levamisole | SIGMA-ALDRICH | 196142 | |
| Razor | Feather | blade No. 11 | |
| Rnase A | Enzynomics | ||
| BSA | SIGMA-ALDRICH | A7906 | |
| Confocal microsope | Zeiss | LSM 510 | EC Plan-Neofluar 100X was used as objective lens. |
| Humid chamber | Plastic box filled with paper towel soaked in DW | ||
| Image Analysis Software | Dr. Peter Landsdorp | TFL-telo | http://www.flintbox.com/public/project/502 |
References
- Reddel, R. R., Bryan, T. M., Murnane, J. P. Immortalized cells with no detectable telomerase activity. A review. Biochemistry-Moscow. 62, 1254-1262 (1997).
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