Introduction
التيلومير يحمي نهايات الكروموسومات من الانصهار الشاذة والتدهور. يتكون التيلومير الثدييات يكرر G الغنية hexameric، TTAGGG، والمجمعات shelterin. تسلسل التيلومير تكرار الديدان الخيطية هي مماثلة لتلك التي من الثدييات (TTAGGC). معظم حقيقيات النوى الاستفادة تيلوميراز إضافة يكرر التيلومير إلى غاياتهم الكروموسومات. ومع ذلك، 10 - 15٪ من الخلايا السرطانية تستخدم التيلوميراز آلية مستقلة، والمعروفة باسم البديل تطويل التيلوميرات (ALT) 3. سابقا، وذكرت أن يكرر شريط الحامض النووي ومتواليات المرتبطة به، ويدعى تالت، وتضخمت في التيلوميرات من خطوط متحولة التيلوميراز التي نجت العقم حرجة 2.
وقد تم قياس طول التيلومير بواسطة PCR الكمي أو اللطخة الجنوبية، التي تنص على متوسط طول التيلومير من إجمالي 4،5،6،7. قراءة عدد من تكرار التيلومير في كامل البيانات تسلسل الجينوم هو أيضا مؤشرا من إجمالي محتويات التيلومير 8. على الرغم من الخطيئةغلي التيلومير طول تحليل (STELA) يمكن أن توفر طول التيلومير واحد، فإنه لا يمكن أن توفر معلومات المكانية التيلومير 9. في حين POT-1 :: mCherry البروتين مراسل يوفر المعلومات المكانية التيلومير في الجسم الحي، فإنه لا يمكن أن تمثل أطوال التيلومير المزدوج تقطعت بهم السبل، كما POT-1 هو التيلومير واحد حبلا البروتين 10 ملزمة.
بينما توفر طرق المذكورة أعلاه المعلومات المتوسط من تسلسل المتكررة، مضان في الموقع التهجين (FISH) يسمح لمراقبة كمية ونمط المكاني للتسلسل الفردية للاهتمام على نطاق والكروموسومات. بدلا من تنقية الحمض النووي، يتم إصلاح الأنسجة أو الخلايا للحفاظ على المعلومات المكانية المحلية في الأسماك. وهكذا، FISH هو أداة الكمية والنوعية على حد سواء لرصد تسلسل تكرار الفردية، مثل تكرار التيلومير.
يوفر هذا البروتوكول وسيلة فعالة للكشف في وقت واحد على حد سواء TELOمجرد وأخرى يكرر على أساس التحسينات من الأساليب المذكورة سابقا 11،12. C. ايليجانس اليرقات أو البالغين متعددة الخلايا مع خلايا متباينة للغاية. عدم تجانس الخلايا يعرقل على التحليل الكمي لعدد كبير من البقع التيلومير. لزيادة عدد الخلايا تحليلها والأجنة معزولة وانتشرت على الشرائح المغلفة متعدد الليزين للأسماك. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن لهذا البروتوكول أيضا أن تقترن المناعي.
كبرهان أن يعمل البروتوكول، وتبين لنا أنه من الممكن لمراقبة وتحديد اثنين من سلاسل متكررة مختلفة. تم إنشاء مسبار الحمض النووي ضد TALT1 مع بسيطة PCR دمج digoxigenin-dUTP. ثم تم تهجين هذه مسبار TALT1 ومضان المسمى التيلومير السلطة الوطنية الفلسطينية التحقيق في وقت واحد. وفي وقت لاحق، تم الكشف عن digoxigenin بالطرق المناعي الكنسي. نقدم هنا الصور التمثيلية حيث TALT1 colocalized مع التيلومير في TRT-1
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تحقيقات وصفها مع Digoxigenin-dUTP بواسطة PCR
- أداء PCR وضع العلامات مع 10x مزيج dNTP تحتوي على digoxigenin-dUTP كما هو موضح سابقا (13).
- تنقية المنتج PCR مع تنقية تدور العمود وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- إذا كان التحقيق هو أقصر من 200 سنة مضت، وإزالة الحرة digoxigenin-dUTP مع اللوني تدور عمود من خليط التفاعل بدلا من تنقية تدور العمود.
2. إعداد الشرائح متعدد الليزين المغلفة
ملاحظة: الإجراء بأكمله يستغرق حوالي 2 ساعة. تتم معظم الخطوات في درجة حرارة الغرفة باستثناء خطوة التجفيف.
- تنظيف الشرائح
- ضع الشرائح في وعاء من البلاستيك وشطف الشرائح لفترة وجيزة مع الماء المقطر (DW). إزالة المياه وملء حاوية مع DW تحتوي على 1٪ منظف الزجاج.
- تستنهض الهمم الشرائح لمدة 15 دقيقة في 50 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT). تغسل الشرائح مع DW 3مرات لمدة 5 دقائق لكل منهما في RT.
- تغسل الشرائح مع 70٪ من الإيثانول لمدة 15 دقيقة مع الإثارة. تجاهل 70٪ من الإيثانول ووضع الشرائح على كتلة جافة 65 درجة مئوية، والهواء الجاف لمدة 15 دقيقة.
- طلاء متعدد الليزين من الشرائح الزجاجية متعددة جيدا
ملاحظة: طلاء متعدد الليزين من الشريحة الزجاجية خطوة هامة، لأنه يوفر التصاق العينة في جميع أنحاء الداخلي تلطيخ. سيئة الشرائح المغلفة سيؤدي إلى فقدان العينة.- تمييع الحل الأسهم متعدد الليزين إلى 0.01٪ (ث / ت) في الماء المقطر. إضافة 20 ميكرولتر من المخفف 0.01٪ (ث / ت) متعدد الليزين إلى آبار شريحة زجاجية نظيفة.
- احتضان شريحة زجاجية لمدة 5 دقائق على RT.
- ضع الشرائح على 65 درجة مئوية كتلة جافة والهواء الجاف لمدة 1 ساعة.
- تخزين الشرائح متعدد الليزين في مربع مجانا الغبار.
3. التثبيت من الديدان على شريحة زجاجية (الشكل 1)
- إعداد الأجنة لFISH
ملاحظة: الديدان الحصاد قبل كل رويستهلك انه الغذائي البكتيري من خلال مشاهدة وسائط النمو تحت المجهر. الجوع يقلل من إنتاج البيض من الديدان البالغة ويزيد من فقس البيض. وصفت وسائل مفصلة في 14،15.- تنمو الديدان في 50 ملم بيتري طبق وفقا للطرق القياسية 14.
- بعد استهلاك جميع المواد الغذائية البكتيرية، وقطع وسائل الإعلام أجار في الربع مع الملعقة. تعقيم ملعقة قبل قطع لمنع التلوث.
- وضع كل قطعة من أجار على (NGM) لوحة 100 ملم وسائط النمو الخيطية. تحويل قطعة أجار رأسا على عقب للديدان للوصول إلى الغذائي الجرثومي جديدة.
- بعد 48 إلى 72 ساعة، وجمع الديدان مع العازلة M9. إضافة 3-5 مل من العازلة M9 على لوحة NGM. عازلة ماصة M9 على سطح NGM لغسل الديدان.
- جمع السائل مع الديدان وإضافة إلى أنبوب 15 مل.
ملاحظة: إذا كان هناك حطام أجار بعد الحصاد، الطرد المركزي الديدان في محلول السكروز 30٪. بينما مكعبات الحطام والديدان تطفو علىالسطح. - إضافة العازلة M9 لتعويض حجم 15 مل. بيليه الديدان بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 3 دقائق وإزالة معظم عازلة M9. كرر هذه الخطوة 2 مرات أكثر.
ملاحظة: إذا الديدان لا تزال تطفو بعد الطرد المركزي، وتعيين مستوى الفرامل من أجهزة الطرد المركزي لقيمة = 1. - عازلة نضح M9. إضافة محلول تبييض لالديدان. في 0.5 مل من الديدان، وإضافة 6.5 مل من DW، 2 مل من هيبوكلوريت، 1 مل من 5 M KOH.
- احتضان الديدان مع هزاز في RT لمدة 3 دقائق في 50 دورة في الدقيقة. الديدان دوامة لمدة 15 ثانية للقص ميكانيكيا الديدان وفضح البيض.
- مراقبة أنبوب تحت المجهر تشريح خلال التبييض. تأكد من أن يتم قطع الديدان في نصف ويتم إطلاقها البيض. عندما يتم حل معظم الجسم الكبار، إضافة عازلة M9 لتعويض حجم 15 مل.
- أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 3 دقائق. نضح معظم من M9 وإضافة عازلة M9 جديدة لتعويض حجم 15 مل. كرر غسل خطوة 3 مرات.
ملاحظة:تجنب استخدام كمية زائدة من الديدان، لأنها تعيق عملية التبييض. الحفاظ على وقت رد الفعل الكلي أقل من 8 دقائق حتى يغسل. الإفراط في ابيض البيض تنتج تألق ذاتي قوي. - إضافة الفوسفات مخزنة المالحة مع بوليسوربات 20 (PBST) ما يصل إلى 200 ميكرولتر و 200 ميكرولتر من بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) لجعل 2٪ PFA.
تحذير: منذ PFA غير مسرطنة، وارتداء الملابس الواقية والقفازات ودرع العين قبل استخدام منهاج العمل. - إضافة 40 ميكرولتر من البيض في 2٪ PFA على بئر متعدد الليزين المغلفة الشرائح.
- وضع الشرائح في غرفة رطبة واحتضان لمدة 15 دقيقة في RT. إغلاق غرفة رطبة الحق بعد توضع الشرائح في الداخل.
ملاحظة: البيض تترسب في القاع من الشرائح في حين يجري الثابتة.
- إعداد الغدد التناسلية تشريح للأسماك
- الديدان حصاد الكبار نمت على 50 ملم لوحة NGM قبل pipetting 1 مل من العازلة M9. الديدان الحصاد قبل الغذائي الجرثومي المنضب.
- غسل الديدان من أي بكتيريا خفة دمح عازلة M9، 2 مرات.
ملاحظة: البكتيريا المتبقية قد تتداخل مع الغدد التناسلية تشريح من التمسك متعدد الليزين المغلفة الشرائح. - بيليه الديدان بواسطة الطرد المركزي في 300 × ز. إزالة M9 ونقل الديدان لوحة NGM فارغة من micropipette.
- إضافة 30 ميكرولتر من العازلة M9 التي تحتوي على 2 ملي الليفاميزول على بئر متعدد الليزين تعامل الشرائح.
- إضافة 500 ميكرولتر من العازلة M9 إلى أنبوب 1 مل. استخدام هذا المخزن المؤقت لنقل الديدان بواسطة ماصة الفم.
- ملء غيض من ماصة الفم مع العازلة M9 عن طريق وضع الشعرية في أنبوب 1 مل يحتوي المخزن المؤقت M9.
- تحت المجهر تشريح، ووضع غيض من ماصة الفم فقط أمام رئيس الكبار دودة وسحب ماصة الفم حتى أن رئيس الديدان يدخل ماصة الفم. مرة واحدة في الرأس من الديدان تدخل طرف، وسيتم اختيار مجموعة كاملة من دودة إلى الحافة.
- نقل الديدان إلى الشريحة متعدد الليزين المغلفة باستخدام ماصة الفم.
- باستخدام شفرة حلاقة، وقطع منو الرأس أو طرف الذيل من الديدان على الشريحة. عندما يتم قطع دودة، والغدد التناسلية تخرج. والغدد التناسلية التمسك الشرائح.
- إعداد 30 على الأقل الديدان في بئر واحدة. المزيد من الآبار يمكن استخدامها لمدة 30 الديدان آخر.
- ضع الشريحة في غرفة رطبة ونضح قبالة العازلة M9 مع ماصة الفم.
- إصلاح العينة بإضافة 20 ميكرولتر من 2٪ PFA في RT لمدة 15 دقيقة في غرفة رطبة.
4. التثبيت وPermeabilization
- وضع كتلة الألومنيوم على الثلج الجاف وتخزينها في المجمد العميق (-80 درجة مئوية). متجر الميثانول والأسيتون في -20 درجة مئوية.
- بعد PFA تثبيت خطوة 3.1.15 أو 3.2.11، وإزالة تثبيتي باستخدام micropipette ترك ~ 5 ميكرولتر من تثبيتي.
- وضع متعدد الليزين المغلفة شريحة أخرى على الشريحة عينة. إزالة تثبيتي مع منشفة ورقية إذا كان الحل هو المفرط. لا تتحرك الشرائح مرة واحدة عالقون معا.
- تجميد الشرائحعلى كتلة الألومنيوم لمدة 15 دقيقة على الأقل.
ملاحظة: هذه العينات ويمكن تخزين لا يقل عن 2 - 3 أيام. - في حين يتم تجميد الشرائح، ووضع الجرار التي تحتوي على الميثانول البارد والأسيتون على الجليد.
- تأخذ الشرائح من وحيلة لهم لتجميد كسر العينة. تجاهل الشريحة العليا. على الفور نقع الشريحة في الميثانول الجليد البارد لمدة 5 دقائق.
- نقل الشرائح إلى الأسيتون المثلج مدة 5 دقائق.
- تغسل شرائح 3 مرات مع PBST لمدة 5 دقائق لإزالة تثبيتي المتبقية. انتقل إلى الخطوة التالية أو تخزين الشرائح في الإيثانول بنسبة 100٪ في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: هذه العينات ويمكن تخزين لا يقل عن 2 - 3 أيام.
5. تهجين الخلايا الثابتة
- إضافة 20 ميكرولتر من حل ريبونوكلياز (PBST تحتوي على 10 ميكروغرام / مل ريبونوكلياز A). احتضان الشريحة في غرفة رطبة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
- غسل الشريحة مرتين في المياه المالحة 2X و سيترات الصوديوم مع بوليسوربات 20 (2X SSCT) لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
- إضافة 20ميكرولتر من محلول التهجين وضعت غرفة رطبة في الحاضنة 37 درجة مئوية. بعد 1 ساعة، وإزالة حل التهجين من قبل pipetting.
- قبل إزالة حل التهجين، وإعداد التحقيق. إذا كان المسبار المزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي، وتفسد تحقيقات عن طريق التسخين في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق على كتلة جافة. وبعد التسخين، تبريد التحقيق في فترة وجيزة الجليد.
- إضافة 10 ميكرولتر من محلول التهجين التي تحتوي على تحقيقات للعينة. للسلطة الوطنية الفلسطينية التحقيق، تركيز استخدام في نسبة 1: 2000 ولتحقيق المسمى حفر، تركيز استخدام في نسبة 1: 200. تغطية العينة مع غطاء زجاجي.
- وضع منشفة ورقية مبللة بالماء على كتلة الحرارة (80 درجة مئوية). وضع غطاء علبة بلاستيكية على كتلة الحرارة للحفاظ على الرطوبة ودرجة الحرارة.
- بعد درجة حرارة كتلة الحرارة قد استقرت (80 ° C)، ضع الشريحة عينة على منشفة ورقية ساخنة وتغطية العينات مع غطاء علبة بلاستيكية. تفسد العينة لمدة 3 دقائق.
- المؤتمر الوطني العراقيأوباتي الشرائح في غرفة رطبة ليلا 37 درجة مئوية.
6. يغسل والمناعي
- الاحماء الحل غسل التهجين (2X SSC، 50٪ الفورماميد) إلى 37 درجة مئوية.
- غسل العينة في PBST مرتين في RT لمدة 5 دقائق. إزالة الغطاء الزجاجي.
- غسل العينة في التهجين حل غسل عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- غسل الشريحة عينة في PBST 3 مرات في RT. ملاحظة: تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة في غرفة رطبة في RT.
- إضافة 20 ميكرولتر من حل الحجب واحتضان لمدة 1 ساعة على RT في غرفة رطبة.
- إزالة عرقلة الحل وإضافة FITC مترافق مكافحة digoxigenin الأجسام المضادة حل (1: 200) لمدة 3 ساعة على RT أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
7. تركيب والمراقبة
- غسل الشريحة عينة مع PBST 2 مرات لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
- إضافة 10 ميكرولتر من تصاعد حل مع دابي. وضع غطاء زجاجي واضغط بلطف. إزالة أي حل الزائدمع منشفة ورقية.
- لمنع تبخر حل المتصاعدة، وختم حواف الزجاج غطاء بطلاء الأظافر.
- مراقبة تحت المجهر متحد البؤر. استبعاد الأجنة مع خلفية عالية. التركيز على حقل مع 4-20 نوى.
- التقاط صور وفقا لتعليمات الشركة الصانعة مع 100X عدسة الهدف.
ملاحظة: تثير عينة مع 405 نانومتر ليزر لدابي، مع 555 نانومتر ليزر لCY3، مع 488 نانومتر ليزر لFITC.
8. الكمي لالتيلومير الإشارة
ملاحظة: تم الكمي كما هو موضح سابقا (16). جميع الصور التي سيتم مقارنة ينبغي أن تؤخذ مع نفس الإعداد بما في ذلك وقت التعرض ومصدر الضوء.
- تصدير الصورة في شكل. TIF.
- تحميل وتثبيت برنامج تحليل الصور.
- تنفيذ برنامج تحليل الصور وانقر على زر الموافقة.
- انقر زر فتح. فتح الصور مع السمك التيلومير بالنقر المزدوج فوق ملف الصورة.
- انقر[عدل] - [المنطقة المعالجة مختارة]، حدد المنطقة من اهتمام من قبل انقر بزر الماوس الأيسر والسحب. استبعاد جميع تلطيخ غير محددة.
- انقر على [قياس] - [بقعة الكثافة البصرية]، حدد القناة مع إشارة التيلومير وأدخل اسم ملف لحفظ النتائج في ملف txt.
ملاحظة: عمود من النتائج هي بالترتيب التالي: الإسفار من بقعة، وكثافة خلفية بقعة ومنطقة من بقعة. - نسخ القيم وطرح كثافة خلفية بقعة من مضان الفور. ويمكن الآن للقيم يتم تحليلها إحصائيا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وذكر في وقت سابق أن الناجين ALT يمكن أن تنشأ من المسخ-التيلوميراز ناقصة، TRT-1 (ok410)، في التردد المنخفض من تكرار محلية داخليا قالب من ALT "(تالت) تسلسل للصيانة التيلومير 2. عن طريق السلطة الوطنية الفلسطينية التحقيق، كنا قادرين على تصور التيلومير في الغدد التناسلية تشريح (الشكل 2A). تم الكشف عن إشارة التيلومير باهتة سواء في TRT-1 (ok410) والناجي ALT. وقد تتداخل إشارة غامض فقط مع دابي، مما يشير إلى أنها قد لا تكون تألق ذاتي. لوحظ الخلالي مثل التيلومير تكرار (ITR) باستمرار في TRF فحص في دراسة C. ايليجانس التيلومير (4،10). وبالنظر إلى نوعية عالية من السلطة الوطنية الفلسطينية التحقيق، فمن المرجح أن يكون بالميدان المنتشرة في جميع أنحاء الجينوم.
وكان عدد من المواقع التيلومير حوالي 9 في نواة طور التثخن في TRT-1 (ok410).في دراسة سابقة، وقد لوحظ 12 البؤر التي POT-1 :: بروتين mCherry، الذي يربط واحد الذين تقطعت بهم السبل التيلومير الحمض النووي (10). وقد لوحظ أقصاها 24 بؤر في نواة في الأجنة نوع البرية 17. وتشير النتيجة أن mCherry طريقة المراسل هو أفضل للتجربة حيث ينبغي أن يحسب عدد التيلومير. لكن السلطة الوطنية الفلسطينية FISH غير قادرة على الكشف المزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي التيلومير وكذلك احد الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي التيلومير في يتناسب مع طول التيلومير. في المقابل، كان عدد من المواقع التيلومير حوالي 7 في الناجين ALT، التي تنصهر فيها الكروموسومات (N = 3) (2). هذه النتيجة تتفق مع التنبؤ بأن البقع التيلومير ستكون 6 في الناجين ALT. استنتجنا أن قوة إشارة ALT الناجين كانت كافية لملاحظتها.
وقد colocalized التيلومير إشارة مع TALT1 في الناجي ALT، مما يوحي بأن يستخدم TALT1 كقالب نسخة لشريط الحامض النووي في غياب TELOmerase (الشكل 3). إشارة التيلومير الناجين ALT زادت على ذلك من الوالدين TRT-1 (ok410) متحولة، مشيرا إلى أن التيلومير وحافظت بقوة في الناجين ALT دون التيلوميراز (الشكل 4). كانت إشارة من السلطة الوطنية الفلسطينية تحقيق قدر أكبر من ذلك من التحقيق المسمى digoxigenin (الشكل 4). تصميم تحقيقات مع السلطة الوطنية الفلسطينية قليل وحدات قد يؤدي في إشارة أقوى من digoxigenin وضع العلامات.
الشكل 1: لمحة عامة عن الأسماك تجربة البيض ويتم حصاد كتبها تبيض الديدان البالغة وثابتة في 2٪ PFA على شريحة المغلفة متعدد الليزين. عينات تم تجميد تصدع وpermeabilized مع الميثانول والأسيتون لاختراق التحقيق. تضاف تحقيقات لعينة وتهجين بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. تم الكشف عن التحقيق المسمى Digoxigenin من قبل المناعي. يتم تصوير العينات ومن ثم quantifieد بواسطة برنامج تحليل الصور. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تم الكشف عن التيلومير FISH في مبايض تشريح (A) التيلومير (أحمر) من خلال CY3-PNA- (TTAGGC) 3 في الطرف البعيد من الغدد التناسلية (رأس السهم): الشكل 2. كثافة من الناجين ALT أكبر من ذلك من TRT-1 (ok410). صدر صورة ض المكدس مع أقصى قدر من الإسقاط. نوى المشار إليها بواسطة السهم الأبيض هو في مهب المتابعة في الزاوية اليمنى العليا. شريط النطاق، 10 ميكرون. وقد تم قياس (ب) عدد البقع التيلومير في نواة في مرحلة طور التثخن بالمعاينة البصرية. N = 50. أشرطة الخطأ، ووزارة شؤون المرأة. الرجاء انقر هنا لعرضنسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3: التيلومير وTALT1 FISH في الأجنة صورة تمثيلية من التيلومير (الحمراء)، وTALT1 (الأخضر) FISH. تم تهجين التيلومير وTALT1 التحقيق إلى الأجنة في وقت واحد. كان counterstained الحمض النووي مع دابي (الأزرق). شريط النطاق، 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
وتم قياس كمية الكمي لFISH البيانات التيلومير وكثافة TALT1 من الرقم 3 في برنامج تحليل الصور (هدية من الدكتور بيتر Lansdorp): الشكل 4. وكان كميا كل بقعة مع اوف مستوى عتبةإيه 15 لاستبعاد خلفية غير محددة. تم استخدام اختبار (ت) لتقييم دلالة إحصائية. (* P <0.001). أشرطة الخطأ، ووزارة شؤون المرأة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
والميزة الرئيسية لبروتوكول لدينا هي بساطة الإجراء دون ضرر ملحوظ على التشكل من الهيكل الخلوي. تم الأمثل عدة خطوات لC. FISH ايليجانس في هذا البروتوكول. وتشمل الخطوات الحاسمة لFISH الناجح وضع العلامات من تحقيقات، تثبيت الأجنة والاختراق. يوفر Digoxigenin-dUTP طريقة وضع العلامات وسيلة سهلة الاستخدام لطريقة وضع العلامات من قبل PCR أو شق الترجمة. لتسمية طويلة تسلسل الهدف، ويفضل نيك الترجمة. في هذه الحالة، يجب أن يتم هضمها تحقيقات مع انزيم تقييد المناسبة لتسهيل تغلغل تحقيقات. لا ينصح العلامة البيوتين dUTP بسبب تحقيقات المسمى البيوتين تنتج كميات زائدة من إشارة الخلفية من السيتوبلازم. على الرغم الذاتية البيوتين حجب كاشف متاح تجاريا، لم يحاول ذلك.
يستخدم هذا البروتوكول الأجنة المعزولة لزيادة كثافة الخلايا لتقدير كفاءة. نوى المعوية C. ايليجانس كبيرة الحجم وتكون المتعددة الصبغيات، والتي تسهم عدد كبير وكثافة البقع التيلومير مقارنة ببقية نواة جسدية. لهذا السبب، ودودة كاملة ليست مناسبة لتقدير حجم التيلومير في C. ايليجانس. في المقابل، الأجنة المناسبة لتقييم طول التيلومير لأنها توفر الخلايا متجانسة من دون تأثير تعدد الصيغ الصبغية.
يستخدم هذا البروتوكول 2٪ PFA تثبيتي التي عملت غرامة لFISH التيلومير. على الرغم من أن يقال غلوتارالدهيد أن يؤدي إلى انخفاض إشارة الخلفية وتثبيت صعوبة في الحمض النووي الريبي في الموقع التهجين، زاد غلوتارالدهيد تألق ذاتي إلى حد كبير (18). لم تلغ هذه الخلفية الزائدة بعد العلاج من بوروهيدريد الصوديوم، مما يقلل من مجموعة ألدهيد غير المتفاعل. لهذا السبب، لم تستخدم غلوتارالدهيد. إذا كانت نسبة الإشارة إلى الضوضاء منخفضة، وقت prehybridization يمكن تمديد تصل إلى عدة ساعات لمنع مواقع الربط غير محددة. فيبالإضافة إلى ذلك، وقت غسل صرامة ويمكن زيادة لخفض مستوى الخلفية.
تقنية تلطيخ في يمكن C. ايليجانس يكون تحديا للعلاج permeabilization المناسبة. C. يحتوي ايليجانس الهيكل الخارجي جليدية سميكة والذي يمنع اختراق الأجسام المضادة وتحقيقات. ويشمل الطريقة التقليدية تلوين الأجسام المضادة علاج كولاجيناز، الأمر الذي يتطلب الكثير من الوقت وعملية التحسين. طريقة اختراق الأنزيمية أيضا الأضرار على التشكل من الديدان في تبادل كفاءة الاختراق. وقد استخدم تجميد الكراك والعلاج الميثانول الأسيتون لتسهيل اختراق التحقيق. تجميد الكراك بسيط وسريع مقارنة كيتيناز أو yatalase العلاج 19. لم الجفاف أو الإماهة من سلسلة الميثانول لا يبدو أن تؤثر على جودة الأسماك. تم تبسيط هذه الخطوات في هذا البروتوكول. على الرغم من أن أفيد أن بروتين كاف الهضم مطلوب بالنسبة لالحمض النووي الريبي في الموقع التهجينلم يكن لوحظ 19، الفرق واضح بين النتائج التيلومير FISH مع وبدون بروتين العلاج K. وبالإضافة إلى ذلك، وتجميد تكسير الأجنة تقدم وسيلة سهلة الاستخدام لتصور العديد من الخلايا في وقت واحد على متن طائرة تنسيق وحيد للتحليل الكمي واسع.
باستخدام السلطة الوطنية الفلسطينية التحقيق، تم زيادة إشارة التيلومير إلى حد كبير مقارنة مع تلك التي تم الحصول عليها مع لجنة التحقيق الحمض النووي. قد يكون هذا بسبب تقارب ملزم العالي لهدفه التكميلي وصغر حجمها (3 تكرار مقارنة ب 4 تكرار). fluorescently المسمى السلطة الوطنية الفلسطينية التحقيق أيضا يربط مباشرة إلى هدفه، والتقليل من خطوات لاحقة. تقارب قوي الاحتفاظ بها في الخطوات التالية المناعي يجعل ما بعد التثبيت لا لزوم لها، والتي يمكن تجنب الضوضاء في الخلفية.
ومع ذلك، توجد بعض القيود في هذه التقنية. واحد هو أن permeabilization خطوة قليلا الأضرار التشكل على حساب كفاءة اختراق التحقيق. علاج الغدد التناسليةالصورة والأجنة مع الميثانول والأسيتون مشوهة دائرية من نواة مقارنة بالشاهد. للتجارب التي تتطلب التشكل الحفاظ عليها تماما، يجب أن يكون حاول طريقة permeabilization مختلفة. آخر هو أن إشارة التيلومير وكميا في وحدات التعسفي. ويرجع ذلك أساسا إلى الاختلافات بين تجارب مستقلة هذا. ويمكن اعتبار الحمض النووي الريباسي باعتبارها الرقابة الداخلية لتطبيع كل عينة. ويمكن الاطلاع على المزيد من أساليب مفيدة في اشارة 20.
يوصف بروتوكول التيلومير FISH بسيط هنا، الأمر الذي يتطلب خطوات الدنيا. وقد اضطر العديد من الخطوات لتحليل كمية كبيرة من الأجنة. ومع ذلك، يمكن إجراء مزيد من التعديل للإشارة أقوى، مثل العلاج كيتيناز لاختراق، والتجارب المبتكرة الأخرى. في تركيبة مع طريقة زراعة الخلايا، قد تكون فائقة الدقة التصوير ممكن. هذا البروتوكول قد تساعد على اكتشاف آلية جديدة صيانة التيلومير في C. ايليجانس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PNA probe | PANAGENE | custom order | |
| Anti-Digoxigenin-Fluorescein, Fab fragments | Roche | 11207741910 | use 1:200 diluted in PBST |
| Digoxigenin-dUTP | Roche | 11573152910 | |
| Bovine serum albumin | SIGMA-ALDRICH | A-7906 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | P-6148 | prepare 4% paraformaldehyde by heating in DW with few drops of NaOH. add 0.1 volume of 10x PBS. |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Hybridizaiton solution | 3x SSC, 50% formamide, 10% (w/v) dextran sulfate, 50 μg/ml heparin, 100 μg/ml yeast tRNA , 100 μg/ml sonicated salmon sperm DNA | ||
| Hybridizaiton wash solution | 2x SSC, 50% formamide | ||
| Formamide | BIONEER | C-9012 | toxic |
| Methanol | Carlo Erba | ||
| Acetone | Carlo Erba | ||
| Heparin | SIGMA-ALDRICH | H3393 | make 10 mg/ml for stock solution |
| Dextran sulfate | SIGMA-ALDRICH | 67578 | |
| 10x PBS | For 1 L DW : 80 g NaCl, 2.0 g KCl, 27 g Na2HPO4•7H2O, 2.4 g KH2PO | ||
| PBST | 1x PBS, 0.1% tween-20 | ||
| Polysorbate 20 | SIGMA-ALDRICH | P-2287 | Commercial name is Tween-20 |
| Poly-L-Lysine solution (0.1% w/v) | SIGMA-ALDRICH | P-8920 | prepare fresh 0.01% w/v solution before use |
| M9 | 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 L | ||
| Bleaching solution | 20% sodium hypochlorite, 0.5 M KOH | ||
| Antibody buffer | 1x PBST, 1 mM EDTA, 0.1% BSA, 0.05% Sodium azide (toxic) | ||
| Blocking solution | Antibody buffer with 5% bovine serum albumin (BSA) | ||
| illustra Microspin G-50 | GE healthcare | 27-53310-01 | |
| 20x SSC | To make 1 L, 175.3 g of NaCl, 88.2 g of sodium citrate, H2O to 1 L, adjust pH to 7.0 | ||
| 2x SSCT | 2x SSC, 0.1% tween-20 | ||
| 10x digoxigenin-dUTP mix | 1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0.65 mM dTTP, 0.35 mM DIG-11-dUTP | ||
| PCR purification columns | Cosmo genetech | CMR0112 | |
| Glass cleaner / ULTRA CLEAN | Dukssan pure chemicals | 8AV721 | |
| Multi-well glass slide | MP biomedicals | 96041205 | |
| Nematode growth media | To make 1 L, 3 g of NaCl, 17 g of agar, 2.5 g of peptone, H2O to 974 ml. Autoclave and cool the flask. Add 1 ml of 1 M CaCl2, 1 ml of 4 mg/ml cholesterol in ethanol, 1 ml of 1 M MgSO4, 25 ml of 1 M KPO4. | ||
| Levamisole | SIGMA-ALDRICH | 196142 | |
| Razor | Feather | blade No. 11 | |
| Rnase A | Enzynomics | ||
| BSA | SIGMA-ALDRICH | A7906 | |
| Confocal microsope | Zeiss | LSM 510 | EC Plan-Neofluar 100X was used as objective lens. |
| Humid chamber | Plastic box filled with paper towel soaked in DW | ||
| Image Analysis Software | Dr. Peter Landsdorp | TFL-telo | http://www.flintbox.com/public/project/502 |
References
- Reddel, R. R., Bryan, T. M., Murnane, J. P. Immortalized cells with no detectable telomerase activity. A review. Biochemistry-Moscow. 62, 1254-1262 (1997).
- Seo, B., et al. Telomere maintenance through recruitment of internal genomic regions. Nat Commun. 6, 8189 (2015).
- Cesare, A. J., Reddel, R. R. Alternative lengthening of telomeres: models, mechanisms and implications. Nat Rev Genet. 11, 319-330 (2010).
- Meier, B., et al. trt-1 is the Caenorhabditis elegans catalytic subunit of telomerase. Plos Genetics. 2, 187-197 (2006).
- Cawthon, R. M. Telomere measurement by quantitative PCR. Nucleic Acids Res. 30, 47 (2002).
- Raices, M., Maruyama, H., Dillin, A., Karlseder, J. Uncoupling of longevity and telomere length in C. elegans. PLoS Genet. 1, 30 (2005).
- Southern, E. M. Detection of Specific Sequences among DNA Fragments Separated by Gel-Electrophoresis. Journal of Molecular Biology. 98, 503 (1975).
- Lee, M., et al. Telomere extension by telomerase and ALT generates variant repeats by mechanistically distinct processes. Nucleic Acids Res. 42, 1733-1746 (2014).
- Cheung, I., et al. Strain-specific telomere length revealed by single telomere length analysis in Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 32, 3383-3391 (2004).
- Shtessel, L., et al. Caenorhabditis elegans POT-1 and POT-2 repress telomere maintenance pathways. G3. 3, Bethesda. 305-313 (2013).
- Duerr, J. Immunohistochemistry. WormBook (The C. elegans Research Community). , (2006).
- Phillips, C. M., McDonald, K. L., Dernburg, A. F. Cytological analysis of meiosis in Caenorhabditis elegans. Meiosis: Volume 2, Cytological Methods. , Springer. 171-195 (2009).
- Emanuel, J. R. Simple and efficient system for synthesis of non-radioactive nucleic acid hybridization probes using PCR. Nucleic acids research. 19, 2790 (1991).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. J Vis Exp. , e4019 (2012).
- Poon, S. S. S., Martens, U. M., Ward, R. K., Lansdorp, P. M. Telomere length measurements using digital fluorescence microscopy. Cytometry. 36, 267-278 (1999).
- Ferreira, H. C., Towbin, B. D., Jegou, T., Gasser, S. M. The shelterin protein POT-1 anchors Caenorhabditis elegans telomeres through SUN-1 at the nuclear periphery. J Cell Biol. 203, 727-735 (2013).
- Lee, M. H., Schedl, T. RNA in situ hybridization of dissected gonads. WormBook. , 1-7 (2006).
- Tabara, H., Motohashi, T., Kohara, Y. A multi-well version of in situ hybridization on whole mount embryos of Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 24, 2119-2124 (1996).
- Poon, S. S., Lansdorp, P. M. Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH). Curr Protoc Cell Biol. 18, Unit 18 14 (2001).
