Introduction
Telomer olarak anormal füzyon ve bozulma kromozomal uçları korur. Memeli telomer G bakımından zengin heksamerik tekrarlar, TTAGGG ve shelterin kompleksleri oluşur. nematodun telomer tekrar dizisi memelilerde (TTAGGC) benzer olan. Çoğu ökaryotlar kendi kromozom uçları telomer tekrarlar eklemek için telomeraz kullanmaktadır. Ancak, 10 - kanser hücrelerinin% 15 Telomerlerin (ALT) 3 Alternatif uzatma olarak bilinen telomeraz bağımsız bir mekanizma kullanmaktadır. Daha önce, telomer tekrarlar ve tAlt olarak adlandırılan ilişkili diziler, kritik sterilite 2 hayatta telomeraz mutant soylarının telomerlerin amplifiye bildirmiştir.
Telomer uzunluğu kantitatif PCR veya toplam telomerlerin 4,5,6,7 ortalama uzunluğu içerir Southern blot ile ölçülmüştür. Tüm genom dizileme verileri telomer tekrarın Oku sayısı da toplam telomer içeriğinin 8 bir göstergesidir. Sin rağmengle telomer uzunluğunun Analizi (STELA) tek bir telomer uzunluğu, bu telomerlerin 9 mekansal bilgi sağlayamaz sağlayabilir. POT-1 :: MCherry muhabiri protein in vivo telomerlerin mekansal bilgi sağlarken POT-1 proteini 10 bağlayıcı tek iplikli telomer olduğu gibi, bu çift sarmallı telomer uzunluklarını temsil edemez.
Yukarıda bahsedilen yöntemler dizilerin ortalama bilgi sağlar birlikte, in situ hibridizasyon (FISH) floresan kromozomal ölçekte miktarı ve ilgi duyulan tek tek dizilerin uzamsal desen gözlemlenebilir. Bunun yerine DNA saflaştırma, doku ya da hücre FISH nativ uzamsal bilgiler korumak için sabitlenir. Böylece, BALIK gibi telomer tekrarlar gibi bireysel tekrar dizilerinin, gözlem için bir nicel ve nitel bir araçtır.
Bu protokol, hem Telo eş zamanlı saptanması için etkili bir yöntem sağlarsadece ve diğer tekrarlar daha önce açıklanan yöntemlerden 11,12 den iyileştirmeler dayalı. C. elegans larvaları veya yetişkin yüksek farklılaşmış hücreler ile çok hücreli organizma bulunmaktadır. hücrelerin heterojen telomer noktalar sayıda kantitatif analizi engellemektedir. analiz hücrelerin sayısını arttırmak için, embriyolar izole ve FISH için polilisin ile kaplanmış dilimlerin üzerine yayılırlar. Buna ek olarak, bu protokol, aynı zamanda, bağışıklık ile kombine edilebilir.
protokol çalışan bir kanıtı olarak, biz gözlemlemek ve iki farklı tekrarlayan dizileri ölçmek mümkün olduğunu göstermektedir. TALT1 karşı DNA probu basit PCR digoksijenin-dUTP birleşmeyle ile üretilmiştir. Daha sonra, bu TALT1 probu ve floresan işaretli telomer PNA probu aynı zamanda hibridize edildi. Daha sonra, digoksigenin kanonik immünofloresan yöntem ile tespit edilmiştir. Biz burada TALT1 TRT-1'de telomer ile kolokalize temsili görüntüler sunmak
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
PCR ile, Digoksigenin-dUTP ile 1. etiketleme probları
- Daha önce tarif edildiği gibi 13 10x dNTP karışımı digoksijenin-dUTP ihtiva eden PCR etiketlenmesi.
- üreticinin talimatlarına uygun olarak yan kolon kromatografisi ile PCR ürünü saflaştırılır.
- Prob daha kısa 200 bp takdirde, reaksiyon karışımından yan sütun kromatografisi yerine spin kolon saflaştırılması serbest digoksijenin-dUTP çıkarın.
2. Hazırlama Polilisin Kaplı Slaytlar
Not: Tüm işlem yaklaşık 2 saat sürer. adımların çoğu kurutma adımı hariç, oda sıcaklığında gerçekleştirilir.
- slaytlar temizlik
- plastik bir kap slaytlar yerleştirin ve kısaca damıtılmış su (DW) ile slaytlar durulayın. suyu çıkarmak ve DW% 1 cam temizleyici içeren kabı doldurun.
- Oda sıcaklığında 50 rpm'de (RT) 15 dakika boyunca slaytlar çalkalayın. DW 3 slaytlar yıkayınOda sıcaklığında her biri 5 dakika için süre.
- çalkalama ile 15 dakika boyunca% 70 etanol ile slaytlar yıkayın. % 70 etanol atın ve 15 dakika için 65 ° C kuru blok ve kuru hava slaytlar yerleştirin.
- Çok iyi cam slaytların polilisin kaplama
Not: boyama işlemi boyunca örnek yapışma sağlar çünkü slayt cam Polilisin kaplama, önemli bir adımdır. Kötü kaplanmış slayt örnek kaybına neden olacaktır.- % 0.01 polilisin stok solüsyonu seyreltik (a / h), distile su içinde. seyreltilmiş,% 0.01 20 ul temiz bir cam slayt oyuklarına (ağırlık / hacim) polilisin ekleyin.
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca cam slayt inkübe edin.
- 1 saat için 65 ° C kuru blok ve kuru hava slaytlar yerleştirin.
- tozsuz kutuya polilisin slaytlar saklayın.
Slayt Camına Worms 3. Sabitleme (Şekil 1)
- FISH için hazırlanıyor embriyolar
Not: Hasat solucanlar tüm t önceO bakteriyel gıda mikroskop altında büyüme ortamı izleyerek tüketilmektedir. Açlık erişkin solucanlar yumurta üretimini azaltır ve yumurta taramayı artırır. Ayrıntılı yöntemler, 14,15 tarif edilmiştir.- Standart yöntemlere 14 göre 50 mm Petri-çanak solucanlar büyütün.
- tüm bakteriyel gıda tüketilen sonra spatula ile çeyrek agar ortamı kesti. bulaşmasını önlemek için kesmeden önce spatula sterilize edin.
- 100 mm nematod büyüme ortamı (NGM) plaka üzerinde agar tüm parçası koyun. Taze bakteriyel gıda ulaşmak için solucanlar için baş aşağı agar parça çevirin.
- 48 saat 72 sonra M9 tamponu ile solucanlar toplamak. NGM plaka üzerinde M9 tampon 5 ml - 3 ekleyin. NGM yüzeyinde Pipet M9 tampon solucanlar yıkayın.
- solucanlar sıvıyı toplamak ve 15 ml'lik bir tüpe ilave edin.
Not:% 30 sukroz çözeltisi içinde hasat santrifüj solucanlar sonra agar bir pislik değilse. kalıntı pellet haline iken, solucanlar üzerinde yüzeryüzey. - 15 ml hacmi telafi etmek M9 tampon ekleyin. 3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile solucanlar pelet ve M9 tampon en çıkarmak. Bu adımı 2 kez daha tekrarlayın.
Not: Solucanlar hala santrifüj sonra yüzen ise, santrifüj fren seviyesi = 1 değerine ayarlayın. - Aspire M9 tampon. solucanlar ağartma çözüm ekleyin. solucanlar 0.5 ml başına 5 M KOH 6,5 DW ml, hipoklorit 2 mi, 1 ml ilave edilir.
- 50 rpm'de 3 dakika boyunca oda sıcaklığında çalkalanarak solucanlar inkübe edin. 15 saniye vorteks solucanlar mekanik solucanlar kesme ve yumurta ortaya çıkarmak.
- beyazlatma sırasında bir diseksiyon mikroskobu altında tüp gözlemleyin. solucanlar yarıda kesilir ve yumurta serbest olduğundan emin olun. Yetişkin vücudunda en çözülür, 15 ml hacim oluşturan M9 tampon eklemek.
- 3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin. Aspire M9 en ve 15 ml hacmi telafi etmek için taze M9 tampon ekleyin. Tekrarlayın yıkama adımı 3 kez.
Not:Onlar ağartma sürecini engelleyen olarak, solucanlar aşırı miktarda kullanmaktan kaçının. az 8 dk yıkama kadar toplam reaksiyon süresini tutun. Aşırı ağartılmış yumurta güçlü otofloresans üretir. - 200 ul% 2 PFA yapmak için% 4 paraformaldehid (PFA), 200 ul kadar polisorbat-20 (PBST) ile fosfat tamponlu tuzlu su ekleyin.
Dikkat: PFA kanserojen olduğundan, PFA kullanmadan önce koruyucu giysi, eldiven ve göz maskesi kullanınız. - polilizin kaplı slayt kuyusuna üzerine% 2 PFA yumurta 40 ul ekleyin.
- nemli bir oda içinde slaytlar yerleştirin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir. slaytlar içine yerleştirilir hemen sonra nemli odasına kapatın.
Not: Sabit olurken yumurta slayt altına yerleşmek.
- FISH için disseke gonadlar hazırlanması
- Hasat yetişkin kurtlar M9 1 ml tampon pipetleme 50 mm NGM plaka üzerinde büyütülür. Bakteriyel gıda önce hasat solucanlar tükenmiş.
- herhangi bir bakteri zekâ solucanlar yıkayınh M9 tampon, 2 kez.
Not: Artık bakteri polilisin kaplı slaytlar yapışmasını disseke gonadlar ile etkileşime girebilir. - 300 x g santrifüj ile solucanlar Pelet. M9 çıkarın ve mikropipet ile boş NGM plaka solucanlar aktarın.
- polilisin tedavi slayt bir kuyunun 2 mM levamizol içeren M9 tampon 30 ul ekleyin.
- 1 ml tüp M9 tampon 500 ul ekle. ağız pipet ile solucanlar aktarmak için bu tampon kullanın.
- M9 tampon içeren 1 ml tüp bir kılcal koyarak M9 tamponu ile ağız pipet ucu doldurun.
- Solucanların kafa ağız pipet girer, böylece diseksiyon mikroskobu altında, sadece yetişkin solucan ve sürükleme ağız pipet başın önünde ağız pipet ucu koydu. Solucanların baş ucu girdiğinde, solucanın tüm vücut ucu içine çekilecektir.
- ağız pipet kullanarak polilisin kaplı slayt solucanlar aktarın.
- kesmek, bir jilet kullanarakkafa veya slaytta solucanlar kuyruk ucu f. solucan kesildiğinde, gonadlar dışarı çıkacaktır. Gonadlar slaytlar sopa olacak.
- bir kuyuda en az 30 solucanlar hazırlayın. Daha fazla kuyu bir 30 solucanlar için kullanılabilir.
- Nemli odasında slayt koymak ve ağız pipet ile M9 tampon aspire.
- nemli odada 15 dakika boyunca oda sıcaklığında% 2 PFA 20 ul ekleyerek örnek sabitleyin.
4. Sabitleme ve Permeabilization
- kuru buz üzerinde bir alüminyum blok yerleştirin ve derin dondurucuda saklayın (-80 ° C). -20 ° C'de saklayın, metanol ve aseton.
- PFA fiksasyon adımı 3.1.15 veya 3.2.11 sonra ~ sabitleştirici 5 ul mikropipet bırakarak kullanarak fiksatif kaldırın.
- Örnek slaytta başka polilisin kaplı slayt koyun. çözüm aşırı ise kağıt havluyla Fiksatif çıkarın. Onlar araya sıkışmış bir kez slaytlar hareket ettirmeyin.
- slaytlar FreezeEn az 15 dakika süreyle alüminyum bloğunun üzerine.
Not: Örnekler, en az 2 saklanabilir - 3 gün. - slaytlar dondurulmuş edilirken, buz üzerinde soğuk metanol ve aseton içeren kavanoz koydu.
- slaytlar almak ve örnek dondurarak çatlamak bükün. Üst slayt atın. Hemen 5 dakika boyunca buz soğukluğunda metanol içine slayt ıslatın.
- 5 dakika boyunca buz soğukluğunda aseton slaytlar aktarın.
- Kalıntı fiksatif kaldırmak için 5 dakika boyunca slaytlar PBST ile 3 kez yıkayın. Bir sonraki adıma geçin ya da 4 ° C'de% 100 etanol slaytlar saklayın.
Not: Örnekler, en az 2 saklanabilir - 3 gün.
Sabit Hücre 5. Melezleme
- (PBST 10 ug / ml RNase A ihtiva eden) RNaz çözeltisi 20 ul ekle. 1 saat boyunca 37 ° C'de nemli bir oda içinde slayt inkübe edin.
- polisorbat-20 (2x SSCT) her biri 15 dakika için 2x tuzlu su ve sodyum sitrat iki slayt yıkayın.
- 20 eklemelezleştirme çözeltisi ul ve 37 ° C inkübatör nemli odasına koyun. 1 saat sonra, pipetleme hibridizasyon çözeltisi çıkarın.
- hibridizasyon çözüm çıkarmadan önce, probu hazırlamak. Prob, çift sarmallı DNA'dır, kuru bir blok üzerinde 5 dakika boyunca 95 ° C'de ısıtılarak probları denatüre. ısıtıldıktan sonra, buz kısaca probu serin.
- örnek probları içeren hibridizasyon çözeltisi 10 ul ekle. 2,000 DIG etiketli prob için, 1 bir oranda kullanım kesafeti: 200 PNA probu, 1 oranında kullanımı konsantrasyonu için. cam kapak ile örnek örtün.
- ısı bloğu (80 ° C) su ile ıslatılmış kağıt havlu koyun. nem ve sıcaklık korumak için ısı bloğu üzerinde plastik bir kutu kapağını takın.
- ısıtma bloğu sıcaklığı (80 ° C) stabil hale sonra ısıtılmış bir kağıt havlu üzerine Örnek slayt yerleştirin ve plastik kutu kapağı örnekleri kapsamaktadır. 3 dakika boyunca numune denatüre.
- incgece boyunca 37 ° C'de nemli bir oda içinde slaytlar Ubate.
6. yıkar ve İmmünofloresan
- 37 ° C hibridizasyon yıkama solüsyonu (2X SSC,% 50 formamid) ısıtın.
- 5 dakika boyunca oda sıcaklığında iki kez PBST içinde örnek yıkayın. cam kapak çıkarın.
- 30 dakika boyunca 37 ° C'de hibridizasyon yıkama çözeltisi içinde örnek yıkayın.
- 3 kez oda sıcaklığında PBST içinde Örnek slayt yıkayın. Not: oda sıcaklığında nemli odasında sonraki tüm adımları uygulayın.
- Bloke etme çözeltisinin 20 ul ekle ve nemli oda içinde oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
- bloke etme çözeltisi çıkarın ve FITC ile birleşik anti-digoksigenin antikor çözeltisi (1: 200) ekleyin, oda sıcaklığında ya da gece boyunca 4 ° C'de 3 saat karıştırıldı.
7. Montaj ve Gözlem
- 15 dakika her biri için PBST ile 2 kez örnek slayt yıkayın.
- DAPI ile montaj çözümü 10 ul ekle. nazikçe cam kapak ve basın koyun. herhangi bir fazla çözeltiyiBir kağıt havlu ile.
- montaj çözümü buharlaşmasını önlemek için, oje ile kapak cam kenarları mühür.
- konfokal mikroskop altında uyun. yüksek arka plan ile embriyolar hariç. 20 çekirdekleri - 4 sahip bir alan üzerinde odaklanın.
- 100X objektif lens ile üreticinin talimatlarına göre fotoğraf çekmek.
Not: FITC için 488 nm lazer ile Cy3 için 555 nm lazer ile, DAPI için 405 nm lazer ile örnek Excite.
Telomer Sinyal 8. sayısallaştırılması
Not: Daha önce 16 açıklandığı gibi Kantitasyonu yapıldı. karşılaştırılacak olan tüm resimler maruz kalma süresi ve ışık kaynağı içeren aynı ortamda alınmalıdır.
- tif formatında görüntü vermek.
- Indirin ve görüntü analiz yazılımı yükleyin.
- Görüntü analiz yazılımı çalıştırın ve düğmeyi katılıyorum tıklayın.
- Açık düğmesine tıklayın. görüntü dosyasını çift tıklatarak telomer FISH ile görüntüleri açın.
- tıklayın[Değiştir] - [select işleme bölge], sol-tıklayın ve sürükleyerek ilgi seçin bölgesi. Non-spesifik boyama hariç.
- [Optik yoğunlukları nokta] telomer sinyali ile kanalı seçin ve .txt dosyasına sonuçları kaydetmek için dosya adını girin - [tedbiri] tıklayın.
Not: sonuçların sütun aşağıdaki sırayla şunlardır: spot Floresan, spot ve nokta alanının arka plan yoğunluğu. - değerleri kopyalamak ve spot floresan gelen spot arka plan yoğunluğu çıkarın. değerleri artık istatistiksel analiz edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Daha önce ALT kurtulan içten 'ALT Şablon' (tAlt) telomer bakım 2 dizileri lokalize çoğaltarak düşük frekansta, trt-1 (ok410), telomeraz eksikliği mutant ortaya çıkabileceği bildirildi. PNA probu kullanılarak, biz disseke gonadlar (Şekil 2A) 'de telomer görselleştirmek için başardık. Soluk telomer sinyali TRT-1 (ok410) ve ALT kurtulan hem de tespit edildi. Bulanık sinyal onlar otofloresans olmayabilir düşündüren, sadece DAPI ile üst üste edildi. İnterstisyel telomer gibi tekrar (ITR) sürekli C. çalışmada TRF deneyinde gözlenen elegans telomer 4,10. PNA probu yüksek özgüllük göz önüne alındığında, ITR genomu boyunca dağıtılmış olması muhtemeldir.
Telomer lekelerin sayısı TRT-1 (ok410) yaklaşık 9 pachytene çekirdeğin ortalama oldu.Önceki bir çalışmada, 12 odaklar pot 1 :: MCherry proteini, tek şeritli telomer DNA'nın 10 bağlanan tarafından gözlenmiştir. Nükleus başına 24 odaklarının maksimum vahşi tip embriyolar 17 gözlendi. Sonuç MCherry raportör yöntemi telomer sayılmalı gereken deney için daha iyi olduğunu göstermektedir. Ancak PNA BALIK telomer uzunluğunun nispetinde çift kollu telomer DNA'nın yanı sıra tek sarmallı telomer DNA'nın tespit edebilmektedir. Bunun aksine, telomer lekelerin sayısı kromozom kaynaşmış ALT kurtulan, yaklaşık 7 (n = 3) 2. Bu sonuç, telomer noktalar ALT kurtulan 6 olacağı tahmini ile uyumludur. Biz ALT kurtulan sinyal yoğunluğu dikkat edilmesi yeterli olduğu sonucuna vardı.
Telomer sinyali TALT1 Telo yokluğunda telomer kopyalama şablon olarak kullanılır düşündüren, ALT kurtulan TALT1 ile birlikte lokalize edildimerase (Şekil 3). ALT kurtulanların telomer sinyali (Şekil 4) telomer sağlam telomeraz olmadan ALT kurtulan korunur belirten ebeveyn trt-1 (ok410) mutant kıyasla arttığı. PNA prob sinyal digoksigenin-etiketli prob (Şekil 4) göre daha fazla idi. PNA oligomer ile dizayn sondalar digoksijenin-etiketleme daha güçlü sinyal neden olabilir.
Şekil 1:. FISH Deney Yumurta bakış ağartma erişkin solucanlar ile hasat ve polilisin-kaplı slayt% 2 PFA giderilmiştir. Numuneler dondurarak kırık ve sonda penetrasyonu için metanol ve aseton ile permeabilize. Problar numuneye eklenmiş ve 37 ° C'de gece boyunca melezlenir. Digoksigenin işaretli prob immünofloresan ile saptanır. Numuneler daha sonra görüntülenmiş ve edilmektedir quantifieGörüntü analiz yazılımı tarafından d. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2:. Dissected gonadlarda Telomer BALIK (A) Telomer (kırmızı) gonadlar distal ucu (ok başı) cy3-PNA- (TTAGGC) 3 tarafından tespit edildi. ALT kurtulan yoğunluğu TRT-1 (ok410) daha büyüktür. Z-yığın görüntü maksimum projeksiyon ile kılındı. beyaz ok ile gösterilen Çekirdekler havaya uçurulan, üst sağ köşesindeki. Ölçek çubuğu, 10 mikron. Pachytene aşamasında çekirdeğin ortalama telomer noktalar (B) sayısı, görsel inceleme ile ölçülmüştür. N = 50. Hata çubukları, SEM. Görüntülemek için tıklayınızBu rakamın daha büyük bir versiyonu.
Şekil 3:. Telomer ve Embriyolar TALT1 BALIK telomer (kırmızı) ve TALT1 (yeşil) FISH bir temsilcisi görüntü. Telomer ve TALT1 probu aynı zamanda embriyo hibridize edildi. DNA DAPI (mavi) ile zıt edildi. Ölçek çubuğu, 10 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4:. FISH Veri telomer Niceleme ve Şekil 3'te TALT1 yoğunluğu görüntü analizi yazılımı (Dr. Peter Lansdorp'un bir hediye) 'de ölçüldü. Her nokta eşik seviyesi ov ile ölçüldüer 15 non-spesifik bir arka plan dışlamak için. T-testi ile istatistiksel açıdan değerlendirmek için kullanıldı. (* P <0.001). Hata çubukları, SEM. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokolde ana avantajı, hücresel yapının morfolojisine fark zarar vermeden prosedür basitliğidir. Birkaç adım C için optimize edildi Bu protokolde elegans BALIK. Başarılı FISH için kritik adımlar probların etiketleme, embriyo ve penetrasyon tespit sayılabilir. Digoksigenin dUTP etiketleme yöntemi PCR ya da nik-çevirisi ile kolay kullanımlı etiketleme yöntemi temin etmektedir. Uzun hedef dizisi etiketlemek için, nick-çeviri tercih edilir. Bu durumda, sondalar sondaların sızmasını kolaylaştırmak için uygun bir sınırlama enzimi ile sindirilmiş olmalıdır. biyotin-etiketli problar sitoplazma arka plan sinyalinin aşırı miktarda üretilen için biyotin-dUTP etiketi tavsiye edilmez. Endojen biotin blokaj reajanı ticari olarak temin edilebilir, ancak bu teşebbüs değildi.
Bu protokol, etkili bir miktar için bir hücre yoğunluğunu artırmak için izole edilmiş embriyolar, kullanır. C Bağırsak çekirdekleri. elegans boyutu büyük olan ve aşırı sayıda ve somatik çekirdeklerin geri kalanına oranla telomer noktalar yoğunluğunu katkıda bulunan, polyploid bulunmaktadır. Bu nedenle, tüm sonsuz C. telomer ölçümü için uygun değildir elegans. bunlar poliploidi etkisi olmadan homojen bir hücreler sağlar Bunun aksine, embriyolar telomer uzunluğunun değerlendirme için uygundur.
Bu protokol telomer FISH için iyi çalıştı% 2 PFA fiksatif kullanır. Glutaraldehit daha düşük bir arka plan sinyali ve in situ hibridizasyon RNA sert tespit neden olduğu bildirilmiştir, ancak glutaraldehit önemli ölçüde 18 otoflüoresanı artmıştır. Bu fazla arka reaksiyona girmemiş aldehit grubu azaltır, sodyum borohidrid, tedaviden sonra kaldırılmış değildi. Bu nedenle, glutaraldehit kullanılmadı. Sinyal-parazit oranı düşükse, ön melezleme zaman, spesifik olmayan bağlanma yerlerini bloke etmek birkaç saat kadar uzatılabilir. İçindeAyrıca, sıkı yıkama süresi arka plan düzeyi azaltmak için arttırılabilir.
boyama tekniği C. elegans doğru permeabilization tedavisi için bir meydan okuma olabilir. C. elegans antikorları ve prob penetrasyon inhibe kalın cuticular dış iskelet bulunur. Geleneksel antikor boyama yöntemi çok zaman ve optimizasyon süreci gerektirir kollajenaz tedavi gerektirir. penetrasyon verimlilik karşılığında da enzimatik penetrasyon yöntemi zarar solucanlar morfolojisi. Dondurulmuş çatlak ve metanol-aseton tedavisi prob girmesinin kolaylaştırılması için kullanılmıştır. Freeze-çatlak kitinaz veya yatalase tedavisine 19 ile karşılaştırıldığında basit ve hızlıdır. Dehidratasyon veya metanol serisinin rehidrasyon FISH kalitesini etkileyecek görünmüyordu. Bu adımlar, bu protokolde basitleştirilmiş edildi. O proteinaz K sindirimi in situ hibridizasyon RNA için gerekli olduğu bildirilmiştir rağmen19, belirgin fark ve proteinaz K tedavi olmadan telomer FISH sonuçları arasında gözlenmedi. Buna ek olarak, donma-çatlama büyük kantitatif analiz için tek bir odak düzlemi üzerinde aynı anda pek hücreleri görselleştirme için kolay kullanımlı bir yöntem sağlanan embriyolar.
PNA probu kullanarak telomer sinyali anlamlı bir DNA probu ile elde edilene kıyasla arttırılmıştır. Bu onun tamamlayıcı hedef ve (4 tekrarına göre 3 tekrar) daha küçük boyutta yüksek bağlanma afinitesi nedeniyle olabilir. Floresan etiketli PNA probu da doğrudan bir sonraki adım en aza indirerek, hedefine bağlanır. Aşağıdaki immünfloresans adımlarla devam güçlü afinite arka plan gürültü önleyebilirsiniz gereksiz post-fiksasyon yapar.
Bununla birlikte, bazı sınırlamalar bu teknik bulunmaktadır. Bir Permeabilization verimli prob penetrasyon pahasına zarar verir biraz morfoloji adım olmasıdır. gonad tedavisis ve metanol ve aseton ile embriyolar muamele edilmemiş kontrol ile karşılaştırıldığında çekirdeklerin daireselliğe bozuk. mükemmel şekilde korunmuş morfoloji gerektiren deneyler için, farklı permeabilization yöntemi denenmelidir. Başka bir telomer sinyali rasgele birimlerde ölçülür olmasıdır. Bu bağımsız deneyler arasında farklılıklar kaynaklanmaktadır. Ribozomal DNA, her örnek normalleştirmek için bir iç kontrol olarak kabul edilebilir. Daha kullanışlı yöntemler referans 20 bulunabilir.
Basit bir telomer BALIK protokol asgari adımları gerektiren, burada tarif edilir. Çok sayıda basamak embriyoların büyük miktarda analizi için azaltılır. Ancak, daha fazla modifikasyonu kitinaz penetrasyon için tedavi ve yenilikçi denemeler gibi, daha güçlü bir sinyal için yapılabilir. hücre kültürü yöntemi ile birlikte, süper çözünürlüklü görüntüleme mümkün olabilir. Bu protokol C. roman telomer bakım mekanizmasını keşfetmek için yardımcı olabilir elegans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PNA probe | PANAGENE | custom order | |
| Anti-Digoxigenin-Fluorescein, Fab fragments | Roche | 11207741910 | use 1:200 diluted in PBST |
| Digoxigenin-dUTP | Roche | 11573152910 | |
| Bovine serum albumin | SIGMA-ALDRICH | A-7906 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | P-6148 | prepare 4% paraformaldehyde by heating in DW with few drops of NaOH. add 0.1 volume of 10x PBS. |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Hybridizaiton solution | 3x SSC, 50% formamide, 10% (w/v) dextran sulfate, 50 μg/ml heparin, 100 μg/ml yeast tRNA , 100 μg/ml sonicated salmon sperm DNA | ||
| Hybridizaiton wash solution | 2x SSC, 50% formamide | ||
| Formamide | BIONEER | C-9012 | toxic |
| Methanol | Carlo Erba | ||
| Acetone | Carlo Erba | ||
| Heparin | SIGMA-ALDRICH | H3393 | make 10 mg/ml for stock solution |
| Dextran sulfate | SIGMA-ALDRICH | 67578 | |
| 10x PBS | For 1 L DW : 80 g NaCl, 2.0 g KCl, 27 g Na2HPO4•7H2O, 2.4 g KH2PO | ||
| PBST | 1x PBS, 0.1% tween-20 | ||
| Polysorbate 20 | SIGMA-ALDRICH | P-2287 | Commercial name is Tween-20 |
| Poly-L-Lysine solution (0.1% w/v) | SIGMA-ALDRICH | P-8920 | prepare fresh 0.01% w/v solution before use |
| M9 | 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 L | ||
| Bleaching solution | 20% sodium hypochlorite, 0.5 M KOH | ||
| Antibody buffer | 1x PBST, 1 mM EDTA, 0.1% BSA, 0.05% Sodium azide (toxic) | ||
| Blocking solution | Antibody buffer with 5% bovine serum albumin (BSA) | ||
| illustra Microspin G-50 | GE healthcare | 27-53310-01 | |
| 20x SSC | To make 1 L, 175.3 g of NaCl, 88.2 g of sodium citrate, H2O to 1 L, adjust pH to 7.0 | ||
| 2x SSCT | 2x SSC, 0.1% tween-20 | ||
| 10x digoxigenin-dUTP mix | 1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0.65 mM dTTP, 0.35 mM DIG-11-dUTP | ||
| PCR purification columns | Cosmo genetech | CMR0112 | |
| Glass cleaner / ULTRA CLEAN | Dukssan pure chemicals | 8AV721 | |
| Multi-well glass slide | MP biomedicals | 96041205 | |
| Nematode growth media | To make 1 L, 3 g of NaCl, 17 g of agar, 2.5 g of peptone, H2O to 974 ml. Autoclave and cool the flask. Add 1 ml of 1 M CaCl2, 1 ml of 4 mg/ml cholesterol in ethanol, 1 ml of 1 M MgSO4, 25 ml of 1 M KPO4. | ||
| Levamisole | SIGMA-ALDRICH | 196142 | |
| Razor | Feather | blade No. 11 | |
| Rnase A | Enzynomics | ||
| BSA | SIGMA-ALDRICH | A7906 | |
| Confocal microsope | Zeiss | LSM 510 | EC Plan-Neofluar 100X was used as objective lens. |
| Humid chamber | Plastic box filled with paper towel soaked in DW | ||
| Image Analysis Software | Dr. Peter Landsdorp | TFL-telo | http://www.flintbox.com/public/project/502 |
References
- Reddel, R. R., Bryan, T. M., Murnane, J. P. Immortalized cells with no detectable telomerase activity. A review. Biochemistry-Moscow. 62, 1254-1262 (1997).
- Seo, B., et al. Telomere maintenance through recruitment of internal genomic regions. Nat Commun. 6, 8189 (2015).
- Cesare, A. J., Reddel, R. R. Alternative lengthening of telomeres: models, mechanisms and implications. Nat Rev Genet. 11, 319-330 (2010).
- Meier, B., et al. trt-1 is the Caenorhabditis elegans catalytic subunit of telomerase. Plos Genetics. 2, 187-197 (2006).
- Cawthon, R. M. Telomere measurement by quantitative PCR. Nucleic Acids Res. 30, 47 (2002).
- Raices, M., Maruyama, H., Dillin, A., Karlseder, J. Uncoupling of longevity and telomere length in C. elegans. PLoS Genet. 1, 30 (2005).
- Southern, E. M. Detection of Specific Sequences among DNA Fragments Separated by Gel-Electrophoresis. Journal of Molecular Biology. 98, 503 (1975).
- Lee, M., et al. Telomere extension by telomerase and ALT generates variant repeats by mechanistically distinct processes. Nucleic Acids Res. 42, 1733-1746 (2014).
- Cheung, I., et al. Strain-specific telomere length revealed by single telomere length analysis in Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 32, 3383-3391 (2004).
- Shtessel, L., et al. Caenorhabditis elegans POT-1 and POT-2 repress telomere maintenance pathways. G3. 3, Bethesda. 305-313 (2013).
- Duerr, J. Immunohistochemistry. WormBook (The C. elegans Research Community). , (2006).
- Phillips, C. M., McDonald, K. L., Dernburg, A. F. Cytological analysis of meiosis in Caenorhabditis elegans. Meiosis: Volume 2, Cytological Methods. , Springer. 171-195 (2009).
- Emanuel, J. R. Simple and efficient system for synthesis of non-radioactive nucleic acid hybridization probes using PCR. Nucleic acids research. 19, 2790 (1991).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. J Vis Exp. , e4019 (2012).
- Poon, S. S. S., Martens, U. M., Ward, R. K., Lansdorp, P. M. Telomere length measurements using digital fluorescence microscopy. Cytometry. 36, 267-278 (1999).
- Ferreira, H. C., Towbin, B. D., Jegou, T., Gasser, S. M. The shelterin protein POT-1 anchors Caenorhabditis elegans telomeres through SUN-1 at the nuclear periphery. J Cell Biol. 203, 727-735 (2013).
- Lee, M. H., Schedl, T. RNA in situ hybridization of dissected gonads. WormBook. , 1-7 (2006).
- Tabara, H., Motohashi, T., Kohara, Y. A multi-well version of in situ hybridization on whole mount embryos of Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 24, 2119-2124 (1996).
- Poon, S. S., Lansdorp, P. M. Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH). Curr Protoc Cell Biol. 18, Unit 18 14 (2001).
