Introduction
Теломер защищает хромосомные концы от аномальным слияния и деградации. Млекопитающим теломер состоит из G-богатых гексамерных повторами, TTAGGG и shelterin комплексов. Последовательность теломер повторение нематода аналогичны млекопитающих (TTAGGC). Большинство эукариоты используют теломеразы, чтобы добавить теломер повторы к их хромосомными концами. Тем не менее, 10 - 15% раковых клеток используют теломеразы независимый механизм, известный как альтернативной удлинению теломер (ALT) 3. Ранее мы сообщали , что теломер повторы и связанные с ней последовательности, названные в качестве Talt, были усилены в теломер теломераза мутантных линий , которые пережили критический стерильность 2.
Длина теломер была измерена с помощью количественной ПЦР или с помощью саузерн - блоттинга, что обеспечивает среднюю длину теломер общего 4,5,6,7. Прочитайте подсчет теломер повтора в целом данных секвенирования генома также является индикатором общего содержания теломер 8. Хотя Sinгле длину теломер Анализ (STELA) может обеспечить длину одной теломеры, она не может обеспечить пространственную информацию теломер 9. В то время как ПНТ-1 :: mCherry репортер белка обеспечивает пространственную информацию теломер в естественных условиях, он не может представлять длину двухцепочечных теломер, как и ПНТ-1 является одноцепочечной теломер - связывающего белка 10.
В то время как вышеупомянутые методы дают усредненную информацию повторяющихся последовательностей, флуоресцентная гибридизация (FISH) в позволяет наблюдать количество и пространственное распределение отдельных последовательностей , представляющих интерес на хромосомном уровне. Вместо очистки ДНК, ткани или клетки закрепляются, чтобы сохранить нативную пространственную информацию в рыбе. Таким образом, рыба является как количественный и качественный инструмент для наблюдения отдельных последовательностей повторов, таких как теломер повторяется.
Этот протокол обеспечивает эффективный способ для одновременного обнаружения как Teloпростые и другие повторы на основе улучшения из ранее описанных методов 11,12. C. личинки Элеганс или взрослые многоклеточный организм с высоко дифференцированных клеток. Неоднородность клеток препятствует на количественном анализе большого числа теломер пятен. Для того, чтобы максимально увеличить количество клеток, проанализированных, эмбрионы изолированы и распространяются на полилизиновых покрытые слайдами для рыб. Кроме того, этот протокол также может быть объединен с иммунофлюоресценции.
В качестве доказательства того, что работает протокол, мы покажем, что можно наблюдать и количественно две различные повторяющиеся последовательности. ДНК-зонд против TALT1 был сгенерирован с помощью простых ПЦР включения дигоксигенином дУТФ. Затем этот TALT1 зонд и флуоресцентно-меченного теломер ПНА зонд гибридизировали одновременно. Впоследствии дигоксигенина обнаружен каноническим методами иммунофлюоресценции. Мы представляем здесь репрезентативные изображения , где TALT1 локализуется с теломер в ТРТ-1
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. этикетировочные Зонды с дигоксигенином дУТФ методом ПЦР
- Выполните ПЦР - мечение с 10x дНТФ смесь , содержащая дигоксигенином дУТФ , как описано выше 13.
- Очищают ПЦР-продукта с очисткой спин-колонки в соответствии с инструкцией изготовителя.
- Если зонд короче, чем 200 пар оснований, удалить свободный дигоксигенином дУТФ со спин-хроматографии на колонке из реакционной смеси, а не очистки спин-колонки.
2. Подготовка Polylysine Покрытые Слайды
Примечание: Вся процедура занимает около 2 ч. Большинство шагов выполняются при комнатной температуре за исключением стадии сушки.
- Очистка слайдов
- Поместите слайды в пластиковый контейнер и промойте слайды кратко дистиллированной водой (DW). Удалить воду и заполнить контейнер с DW, содержащим 1% средство для мытья стекол.
- Перемешивают слайды в течение 15 мин при 50 оборотах в минуту при комнатной температуре (RT). Вымойте слайды с DW 3раз в течение 5 мин каждый раз при комнатной температуре.
- Вымойте слайды с 70% этанола в течение 15 мин при перемешивании. Откажитесь 70% этанола и поместить слайды на сухой блок 65 ° C и воздушно-сухом состоянии в течение 15 мин.
- Полилизин покрытие многолуночных стеклах
Примечание: Polylysine покрытие предметное стекло является важным шагом, поскольку он обеспечивает адгезию образца в течение всей процедуры окрашивания. Плохо слайд с покрытием приведет к потере образца.- Развести полилизиновый маточного раствора до 0,01% (вес / объем) в дистиллированной воде. Добавьте 20 мкл разбавленного 0,01% (вес / объем) полилизина в лунки чистой предметное стекло.
- Инкубируйте предметное стекло в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Поместите слайды на 65 ° C сухой блок и воздушно-сухом состоянии в течение 1 часа.
- Храните Полилизиновые слайды в свободном пылесборника.
3. Закрепление Worms на предметном стекле (Рисунок 1)
- Подготовка эмбрионов для рыб
Примечание: Урожай червей, прежде чем все тон бактериальная пища потребляется, наблюдая СМИ роста под микроскопом. Голодание уменьшает производство яиц взрослых червей и увеличивает яйца штриховки. Подробные методы описаны в 14,15.- Grow червей в 50 мм чашки Петри в соответствии со стандартными методами 14.
- Ведь бактериальная пища потребляется, разрезать агаре в квартале с лопаточкой. Стерилизовать лопаточку перед нарезкой для предотвращения загрязнения.
- Положите все кусочек агара на 100 мм ростовой среде нематода (NGM) пластины. Поверните агар кусок вверх дном для червей, чтобы достигнуть свежей бактериальной пищи.
- После того, как от 48 до 72 ч, собирают червей с буфером M9. Добавить 3 - 5 мл буфера M9 на пластине NGM. Пипетка M9 буфер на поверхности NGM мыть червей.
- Соберите жидкость с червями и добавляют к 15 мл трубки.
Примечание: Если есть агар мусор после уборки урожая, центрифуге червей в 30% растворе сахарозы. В то время как мусор осаждали, черви плавают наповерхность. - Добавить M9 буфер, чтобы компенсировать объем до 15 мл. Гранул червей центрифугированием при 300 х г в течение 3 мин и удалить большую часть буфера M9. Повторите этот шаг еще 2 раза.
Примечание: Если черви еще плавает после центрифугирования, установите уровень тормозной центрифуги, чтобы значение = 1. - Отберите M9 буфера. Добавить отбеливающий раствор для червей. За 0,5 мл червей, добавляют 6,5 мл DW 2 мл гипохлорита, 1 мл 5 М KOH.
- Инкубируйте червей при встряхивании при комнатной температуре в течение 3 мин при 50 оборотах в минуту. Вихревые червей в течение 15 секунд, чтобы механически сдвига червей и подвергать яйца.
- Обратите внимание на трубку под микроскопом рассечение во время отбеливания. Убедитесь, что черви разрезать пополам и яйца будут освобождены. Когда большая часть взрослого тела растворится, добавляют M9 буфер, чтобы компенсировать объем до 15 мл.
- Центрифуга при 300 мкг в течение 3 мин. Отберите большую часть М9 и добавить свежий буфер М9, чтобы компенсировать объем до 15 мл. Повторите шаг промывки 3 раза.
Заметка:Избегайте использования чрезмерного количества червей, так как они мешают процессу отбеливания. Держите общее время реакции менее 8 мин до мытья. Более беленой яйца производят сильное аутофлюоресценция. - Добавить забуференный фосфатом физиологический раствор с полисорбат-20 (PBST) до 200 мкл и 200 мкл 4% параформальдегида (PFA), чтобы сделать 2% PFA.
Внимание: Поскольку PFA является канцерогенным, носить защитную одежду, перчатки и щит глаз перед использованием PFA. - Добавьте 40 мкл яйца в 2% PFA на лунку полилизиновым покрытием слайда.
- Поместите слайды во влажной камере и инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре. Закройте влажной камере сразу после того, слайды должны быть размещены внутри.
Примечание: Яйца оседают на дно ползуна в то время как фиксированы.
- Подготовка расчлененный гонады для рыб
- Урожай взрослых червей, выращенных на 50 мм NGM пластины пипеткой 1 мл буфера M9. Урожай червей перед бактериальной пищи истощены.
- Вымойте червей от любых бактерий остроумияч буфера M9, 2 раза.
Примечание: Остаточные бактерии могут мешать рассеченных гонад от прилипания к полилизиновых покрытием горками. - Гранул червей центрифугированием при 300 х г. Удалить M9 и передачи червей в пустую тарелку NGM с помощью микропипетки.
- Добавьте 30 мкл буфера М9, содержащей 2 мМ левамизол на лунку полилизиновым лечение ползуна.
- Добавьте 500 мкл буфера M9 в 1 мл пробирку. Используйте этот буфер для передачи червей рот пипеткой.
- Заполните кончик рта пипетки с буфером M9, поместив капилляр в 1 мл пробирку, содержащую буфер М9.
- Под микроскопом рассекает, поместите кончик рта пипеткой только в передней части головы взрослого червя и перетащить рот пипеткой так, чтобы голова червей попадает в рот пипеткой. После того, как глава червей входит наконечник, все тело червя будет нарисована в наконечник.
- Передача червей на полилизиновым покрытием слайд, используя рот пипеткой.
- С помощью бритвы, вырезать изе головы или кончика хвоста червей на слайде. Когда червь режется, гонады высунется. Половые будет прилипать к слайдам.
- Подготовьте по крайней мере 30 червей в одной скважине. Дополнительные скважины могут быть использованы в течение еще 30 червей.
- Поместите слайд в влажной камере и аспирация от буфера M9 с рот пипеткой.
- Закрепить образец путем добавления 20 мкл 2% PFA при комнатной температуре в течение 15 мин во влажной камере.
4. Закрепление и пермеабилизирующего
- Поместите алюминиевый блок на сухом льду и хранить его в морозильной камере глубокой (-80 ° C). Хранить метанол и ацетон в -20 & deg; С.
- После PFA фиксации стадии 3.1.15 или 3.2.11, удалите закрепитель с помощью микропипетки оставляя ~ 5 мкл закрепителя.
- Другими полилизиновых покрытием слайд на образце слайда. Удалите закрепитель с бумажным полотенцем, если решение является чрезмерным. Не перемещайте слайды, как только они склеились.
- Замораживание слайдына алюминиевом блоке, по крайней мере, 15 мин.
Примечание: Образцы могут храниться в течение по крайней мере 2 - 3 дней. - В то время как слайды были заморожены, поместите банки, содержащие холодный метанол и ацетон на льду.
- Возьмите слайды, и крутить их замораживанием взломать образец. Выбросить верхний слайд. Немедленно погрузите слайд в ледяной метанола в течение 5 мин.
- Передача слайдов ледяным ацетона в течение 5 мин.
- Вымойте слайды 3 раза PBST в течение 5 мин для удаления остаточного закрепитель. Перейдите к следующему шагу или хранить слайды в 100% этанола при 4 ° С.
Примечание: Образцы могут храниться в течение по крайней мере 2 - 3 дней.
5. Гибридизация Фиксированные клетки
- Добавьте 20 мкл раствора РНКазы (PBST, содержащие 10 мкг / мл РНКазы А). Выдержите слайд в увлажненной камере при 37 ° С в течение 1 часа.
- Вымойте слайд дважды в 2 раза солевым раствором и цитрат натрия с полисорбат-20 (2x SSCT) в течение 15 минут каждый.
- Добавить 20мкл раствора гибридизации и положить влажную камеру в 37 ° С инкубатор. Через 1 ч удаления раствора гибридизации пипетированием.
- Перед удалением раствора гибридизации, подготовить зонд. Если зонд двухцепочечной ДНК, денатурации зонды путем нагревания при 95 ° С в течение 5 мин в расчете на сухое блоке. После нагревания, охлаждения зонда на льду кратко.
- Добавьте 10 мкл гибридизационного раствора, содержащего зондов к образцу. Для PNA зонда, используемой концентрации в соотношении 1: 2000, а также для DIG-меченным зондом, используемой концентрации в соотношении 1: 200. Накройте образец с защитным стеклом.
- Поместите бумажное полотенце, пропитанный водой на тепловом блоке (80 ° C). Поместите пластиковую крышку коробки на тепловом блоке для сохранения влажности и температуры.
- После того, как температура теплового блока стабилизируется (до 80 & deg; C), поместить образец слайд на бумажное полотенце, нагреваемой и покрывают образцы с пластиковой крышкой коробки. Денатурации образца в течение 3 мин.
- IncУбате слайды во влажной камере в течение ночи при температуре 37 ° С.
6. Моет и Иммунофлуоресценции
- Нагреть гибридизация промывочный раствор (2 x SSC, 50% формамиде) до 37 ° С.
- Промывают образец в PBST в два раза при комнатной температуре в течение 5 мин. Снимите крышку стекла.
- Отмывки образца в растворе для гибридизации стирка при температуре 37 ° С в течение 30 мин.
- Вымойте слайд образца в PBST 3 раза при комнатной температуре. Примечание: Выполнить все последующие шаги в влажной камере при комнатной температуре.
- Добавьте 20 мкл блокирующего раствора и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре во влажной камере.
- Удалить блокирующий раствор и добавляют FITC конъюгированной анти-дигоксигенином раствора антител (1: 200) в течение 3 ч при комнатной температуре или в течение ночи при температуре 4 ° С.
7. Монтаж и наблюдение
- Промыть образец слайдов с PBST 2 раза в течение 15 минут каждый.
- Добавляют 10 мкл раствора монтажа с DAPI. Поместите крышку стекла и слегка нажмите. Удалите излишки растворас бумажным полотенцем.
- Для предотвращения испарения монтажного раствора, запечатать края покровного стекла с лаком для ногтей.
- Соблюдайте под конфокальной микроскопии. Исключить эмбрионов с высоким фоном. Фокус на поле с 4 - 20 ядер.
- Возьмите изображения в соответствии с инструкцией завода-изготовителя с 100X объективом.
Примечание: Excite образца с 405 нм лазер для DAPI, с 555 нм лазер для Cy3, с 488 нм лазер для FITC.
8. Количественное теломер сигнала
Примечание: Количественное было сделано , как описано ранее 16. Все изображения, которые должны быть сравнены должны быть приняты с той же установкой, включая время экспонирования и источника света.
- Экспорт изображения в формате .tif.
- Скачать и установить программное обеспечение для анализа изображений.
- Выполнить программное обеспечение для анализа изображений и нажмите кнопку Согласен.
- Нажмите кнопку Открыть. Откройте изображение с теломер FISH, дважды щелкнув файл изображения.
- Нажмите[Править] - [выберите область обработки], выберите область интереса левой кнопкой мыши и перетаскиванием. Исключить все неспецифического окрашивания.
- Нажмите [меры] - [спот оптических плотностей], выберите канал с сигналом теломер и введите имя файла для сохранения результатов в текстовом файле.
Примечание: В столбце результатов в следующем порядке: флуоресценция пятна, фон интенсивность пятна и площади пятна. - Скопируйте значения и вычесть фон интенсивность пятна от флуоресценции пятна. Значения теперь могут быть статистически проанализированы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ранее сообщалось , что ALT выживших может выйти из теломераза-дефицитных мутантов, ТРТ-1 (ok410), на низкой частоте Реплицируя внутренне локализован 'Шаблон ALT' (Talt) последовательности для поддержания теломер 2. Использование ПНК зонда, мы смогли визуализировать теломеры в расчлененных гонад (рис 2А). Слабый сигнал теломер был обнаружен как в ТРТ-1 (ok410) и ALT оставшегося в живых. Нечеткий сигнал перекрывается только с DAPI, предполагая, что они не могут быть аутофлуоресценция. Интерстициальный теломер , как повтор (ITR) последовательно наблюдается в TRF анализе в исследовании С. Элеганс теломер 4,10. Учитывая высокую специфичность ПНК зонда, они, вероятно, будут РМЭ рассредоточены по всему геному.
Число теломер пятен составляло примерно 9 процентов пахитены ядра в ТРТ-1 (ok410).В предыдущем исследовании, 12 очагов наблюдалась ПНТ-1 :: mCherry белок, который связывается с одноцепочечной ДНК теломер 10. Максимум 24 очагов на ядро наблюдалось у эмбрионов 17 дикого типа. Результат наводит на мысль, что метод mCherry репортер лучше для эксперимента, в котором следует учитывать количество теломер. Однако ПНА FISH способен обнаружить двухцепочечной ДНК теломер, а также одноцепочечной ДНК теломер в пропорции с длиной теломер. В отличие от этого , количество теломер пятен было приблизительно 7 АЛТ оставшийся в живых, которые плавленого хромосомами (N = 3) 2. Этот результат согласуется с предсказанием, что теломер пятна будет 6 в ALT выжившего. Мы пришли к выводу, что интенсивность сигнала ALT оставшегося в живых было достаточно, чтобы наблюдать.
Теломер сигнал локализуется с TALT1 в ALT выжившим, предполагая, что TALT1 используется в качестве шаблона для копирования теломеры при отсутствии Telomerase (рисунок 3). Теломер сигнал ALT выживших увеличилась по сравнению с родительской ТРТ-1 (ok410) мутанта, указывая , что теломеры робастно поддерживается в ALT выживших без теломеразы (рисунок 4). Сигнал PNA зонда был больше , чем у дигоксигенином меченным зондом (рисунок 4). Проектирование зонды с олигомера ПНК может привести к более сильным сигналом, чем дигоксигенин маркировки.
Рисунок 1: Обзор. Рыбы Эксперимент Яйца собирают путем отбеливания взрослых червей и фиксировали в 2% PFA на слайде полилизиновым покрытием. Образцы подвергают сублимационной потрескались и проницаемыми с метанолом и ацетоном для проникновения зонда. Зонды добавляют к образцу и гибридизовали в течение ночи при 37 ° С. Дигоксигенином меченый зонд обнаружен с помощью иммунофлуоресценции. Образцы изображаются и затем quantified с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 2: теломер рыба в расчлененный гонад (А) теломер (красный) был обнаружен Cy- 3 PNA- (TTAGGC) 3 в дистальном кончике гонад (стрелки). Интенсивность ALT оставшегося в живых больше , чем у ТРТ-1 (ok410). Z-стек изображение было вынесено с максимальной проекцией. Ядра, обозначенные белой стрелкой выдувается вверх на верхнем правом углу. Шкала бар, 10 мкм. (B) Количество теломер пятен на ядро в стадии пахитены измеряли при визуальном осмотре. N = 50. Усы, SEM. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы просмотретьувеличенная версия этой фигуры.
Рис . 3: теломер и TALT1 FISH в эмбрионах Представитель образ теломер (красный) и TALT1 (зеленый) FISH. Теломер и TALT1 зонд гибридизировали с эмбрионами одновременно. ДНК контрастно с DAPI (синий). Шкала бар, 10 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 4: Количественная FISH данных теломер и интенсивность TALT1 из рисунка 3 количественно в программном обеспечении для анализа изображений (подарок от Dr. Peter Лэнсдорп). Каждое пятно количественно с порогового уровня OVэ 15, чтобы исключить неспецифическую фон. Т-тест был использован для оценки статистической значимости. (* Р <0,001). Усы, SEM. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Основным преимуществом нашего протокола является простота процедуры без заметного ущерба морфологии клеточной структуры. Несколько шагов были оптимизированы для C. Элеганс FISH в этом протоколе. Критические шаги для успешного рыбы включают маркировку зондов, фиксация эмбрионов и проникновения. Дигоксигенин-дУТФ метод маркировки обеспечивает простой в использовании метод маркировки с помощью ПЦР или ник-трансляции. Для того, чтобы обозначить длинную последовательность-мишень, предпочтительно, ник-перевод. В этом случае, зонды должны быть переварены с соответствующим ферментом рестрикции для облегчения проникновения зондов. Биотин-дУТФ тег не рекомендуется, так как биотин-меченых зондов получают избыточное количество фонового сигнала из цитоплазмы. Хотя эндогенный реагент блокирующий биотин является коммерчески доступным, оно не было предпринято.
Этот протокол использует отдельные эмбрионы для увеличения плотности клеток для эффективной количественной оценки. Кишечные ядра C, Элеганс отличаются большими размерами и полиплоидных, которые способствуют чрезмерное количество и интенсивность теломер пятен по сравнению с остальными соматическими ядрами. По этой причине, весь червь не подходит для количественного определения теломер в C. Элеганс. В противоположность этому, эмбрионы подходят для оценки длины теломер, поскольку они обеспечивают однородные клетки без эффекта полиплоидии.
Этот протокол использует 2% PFA закрепитель, который работал отлично для теломер рыбы. Хотя глутаральдегид , как сообщается, привести к снижению фонового сигнала и труднее фиксации в РНК в гибридизация, глутаральдегид увеличилась значительно аутофлюоресценция 18. Этот избыток фона не был отменен после обработки боргидридом натрия, что снижает непрореагировавший альдегидную группу. По этой причине, глутаровый альдегид не использовался. Если отношение сигнал-шум низкий, время предварительной гибридизации может быть продлен до нескольких часов, чтобы блокировать неспецифические сайты связывания. ВКроме того, время строгой промывки может быть увеличена, чтобы уменьшить уровень фона.
Окрашивание техника в C. Элеганс может быть проблемой для надлежащего лечения пермеабилизации. C. Элеганс содержит толстый кутикулярную экзоскелет , который ингибирует проникновение антител и зондов. Традиционный метод с использованием меченых антител включает обработку коллагеназы, что требует много времени и оптимизации процесса. Метод проникновения ферментативная также повреждает морфологии червей в обмен на эффективность проникновения. Замораживание растрескиванию и обработка метанолом-ацетон использовали для облегчения проникновения зонда. Замерзание трещина простой и быстрый по сравнению с хитиназной или yatalase лечения 19. Обезвоживание или регидратация серии метанола, похоже, не влияет на качество рыбы. Эти шаги были упрощены в этом протоколе. Хотя сообщалось , что протеиназы К пищеварение требовалось для РНК in - situ гибридизации19, очевидное различие не наблюдалось между результатами теломер FISH с и без обработки протеиназой K. Кроме того, при замораживании растрескивание эмбрионов предложен способ простой в использовании для визуализации много ячеек одновременно на одной фокальной плоскости для большого количественного анализа.
При использовании PNA зонда, сигнал теломер была значительно увеличена по сравнению с полученным с помощью ДНК-зонда. Это может быть связано с более высокой способностью к связыванию комплементарной мишени и его меньшего размера (3 повтора по сравнению с 4 повтора). Флуоресцентно меченого зонда ПНА также напрямую связывается с его мишенью, сводя к минимуму последующие шаги. Сильное сродство поддерживается в следующих шагах иммунофлюоресценции делает пост-фиксация ненужной, которая может избежать фонового шума.
Тем не менее, существуют некоторые ограничения в этой технике. Одним из них является, что пермеабилизации слегка шаг повреждает морфологию за счет эффективного проникновения зонда. Лечение гонадеs и эмбрионы с метанолом и ацетоном искажены округлость ядер по сравнению с необработанным контролем. Для экспериментов, которые требуют прекрасно сохранившийся морфологии, другой метод пермеабилизации должно быть предпринято. Другим является то, что сигнал теломер количественно в условных единицах. Это происходит главным образом из-за различий между независимыми экспериментами. Рибосомальной ДНК может рассматриваться в качестве внутреннего контроля для нормализации каждого образца. Более полезные методы можно найти в ссылке 20.
Простой протокол теломер FISH описан здесь, который требует минимальных шагов. Многие шагов уменьшается для анализа большого количества эмбрионов. Тем не менее, дальнейшая модификация может быть сделано для более сильного сигнала, таких как обработка хитиназной для проникновения, а также других инновационных исследований. В сочетании с методом клеточной культуры, работы с изображениями супер-разрешением может оказаться невозможным. Этот протокол может помочь обнаружить механизм романа поддержания теломер в С. Элеганс.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PNA probe | PANAGENE | custom order | |
| Anti-Digoxigenin-Fluorescein, Fab fragments | Roche | 11207741910 | use 1:200 diluted in PBST |
| Digoxigenin-dUTP | Roche | 11573152910 | |
| Bovine serum albumin | SIGMA-ALDRICH | A-7906 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | P-6148 | prepare 4% paraformaldehyde by heating in DW with few drops of NaOH. add 0.1 volume of 10x PBS. |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Hybridizaiton solution | 3x SSC, 50% formamide, 10% (w/v) dextran sulfate, 50 μg/ml heparin, 100 μg/ml yeast tRNA , 100 μg/ml sonicated salmon sperm DNA | ||
| Hybridizaiton wash solution | 2x SSC, 50% formamide | ||
| Formamide | BIONEER | C-9012 | toxic |
| Methanol | Carlo Erba | ||
| Acetone | Carlo Erba | ||
| Heparin | SIGMA-ALDRICH | H3393 | make 10 mg/ml for stock solution |
| Dextran sulfate | SIGMA-ALDRICH | 67578 | |
| 10x PBS | For 1 L DW : 80 g NaCl, 2.0 g KCl, 27 g Na2HPO4•7H2O, 2.4 g KH2PO | ||
| PBST | 1x PBS, 0.1% tween-20 | ||
| Polysorbate 20 | SIGMA-ALDRICH | P-2287 | Commercial name is Tween-20 |
| Poly-L-Lysine solution (0.1% w/v) | SIGMA-ALDRICH | P-8920 | prepare fresh 0.01% w/v solution before use |
| M9 | 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 L | ||
| Bleaching solution | 20% sodium hypochlorite, 0.5 M KOH | ||
| Antibody buffer | 1x PBST, 1 mM EDTA, 0.1% BSA, 0.05% Sodium azide (toxic) | ||
| Blocking solution | Antibody buffer with 5% bovine serum albumin (BSA) | ||
| illustra Microspin G-50 | GE healthcare | 27-53310-01 | |
| 20x SSC | To make 1 L, 175.3 g of NaCl, 88.2 g of sodium citrate, H2O to 1 L, adjust pH to 7.0 | ||
| 2x SSCT | 2x SSC, 0.1% tween-20 | ||
| 10x digoxigenin-dUTP mix | 1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0.65 mM dTTP, 0.35 mM DIG-11-dUTP | ||
| PCR purification columns | Cosmo genetech | CMR0112 | |
| Glass cleaner / ULTRA CLEAN | Dukssan pure chemicals | 8AV721 | |
| Multi-well glass slide | MP biomedicals | 96041205 | |
| Nematode growth media | To make 1 L, 3 g of NaCl, 17 g of agar, 2.5 g of peptone, H2O to 974 ml. Autoclave and cool the flask. Add 1 ml of 1 M CaCl2, 1 ml of 4 mg/ml cholesterol in ethanol, 1 ml of 1 M MgSO4, 25 ml of 1 M KPO4. | ||
| Levamisole | SIGMA-ALDRICH | 196142 | |
| Razor | Feather | blade No. 11 | |
| Rnase A | Enzynomics | ||
| BSA | SIGMA-ALDRICH | A7906 | |
| Confocal microsope | Zeiss | LSM 510 | EC Plan-Neofluar 100X was used as objective lens. |
| Humid chamber | Plastic box filled with paper towel soaked in DW | ||
| Image Analysis Software | Dr. Peter Landsdorp | TFL-telo | http://www.flintbox.com/public/project/502 |
References
- Reddel, R. R., Bryan, T. M., Murnane, J. P. Immortalized cells with no detectable telomerase activity. A review. Biochemistry-Moscow. 62, 1254-1262 (1997).
- Seo, B., et al. Telomere maintenance through recruitment of internal genomic regions. Nat Commun. 6, 8189 (2015).
- Cesare, A. J., Reddel, R. R. Alternative lengthening of telomeres: models, mechanisms and implications. Nat Rev Genet. 11, 319-330 (2010).
- Meier, B., et al. trt-1 is the Caenorhabditis elegans catalytic subunit of telomerase. Plos Genetics. 2, 187-197 (2006).
- Cawthon, R. M. Telomere measurement by quantitative PCR. Nucleic Acids Res. 30, 47 (2002).
- Raices, M., Maruyama, H., Dillin, A., Karlseder, J. Uncoupling of longevity and telomere length in C. elegans. PLoS Genet. 1, 30 (2005).
- Southern, E. M. Detection of Specific Sequences among DNA Fragments Separated by Gel-Electrophoresis. Journal of Molecular Biology. 98, 503 (1975).
- Lee, M., et al. Telomere extension by telomerase and ALT generates variant repeats by mechanistically distinct processes. Nucleic Acids Res. 42, 1733-1746 (2014).
- Cheung, I., et al. Strain-specific telomere length revealed by single telomere length analysis in Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 32, 3383-3391 (2004).
- Shtessel, L., et al. Caenorhabditis elegans POT-1 and POT-2 repress telomere maintenance pathways. G3. 3, Bethesda. 305-313 (2013).
- Duerr, J. Immunohistochemistry. WormBook (The C. elegans Research Community). , (2006).
- Phillips, C. M., McDonald, K. L., Dernburg, A. F. Cytological analysis of meiosis in Caenorhabditis elegans. Meiosis: Volume 2, Cytological Methods. , Springer. 171-195 (2009).
- Emanuel, J. R. Simple and efficient system for synthesis of non-radioactive nucleic acid hybridization probes using PCR. Nucleic acids research. 19, 2790 (1991).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. J Vis Exp. , e4019 (2012).
- Poon, S. S. S., Martens, U. M., Ward, R. K., Lansdorp, P. M. Telomere length measurements using digital fluorescence microscopy. Cytometry. 36, 267-278 (1999).
- Ferreira, H. C., Towbin, B. D., Jegou, T., Gasser, S. M. The shelterin protein POT-1 anchors Caenorhabditis elegans telomeres through SUN-1 at the nuclear periphery. J Cell Biol. 203, 727-735 (2013).
- Lee, M. H., Schedl, T. RNA in situ hybridization of dissected gonads. WormBook. , 1-7 (2006).
- Tabara, H., Motohashi, T., Kohara, Y. A multi-well version of in situ hybridization on whole mount embryos of Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 24, 2119-2124 (1996).
- Poon, S. S., Lansdorp, P. M. Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH). Curr Protoc Cell Biol. 18, Unit 18 14 (2001).
