We report a concise procedure of fluorescence in situ hybridization (FISH) in the gonad and embryos of Caenorhabditis elegans for observing and quantifying repetitive sequences. We successfully observed and quantified two different repetitive sequences, telomere repeats and template of alternative lengthening of telomeres (TALT).
Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase or an alternative pathway, known as alternative lengthening of telomeres (ALT)1. Recently, C. elegans has emerged as a multicellular model organism for the study of telomere and ALT2. Visualization of repetitive sequences in the genome is critical in understanding the biology of telomeres. While telomere length can be measured by telomere restriction fragment assay or quantitative PCR, these methods only provide the averaged telomere length. On the contrary, fluorescence in situ hybridization (FISH) can provide the information of the individual telomeres in cells. Here, we provide protocols and representative results of the method to determine telomere length of C. elegans by fluorescent in situ hybridization. This method provides a simple, but powerful, in situ procedure that does not cause noticeable damage to morphology. By using fluorescently labeled peptide nucleic acid (PNA) and digoxigenin-dUTP-labeled probe, we were able to visualize two different repetitive sequences: telomere repeats and template of ALT (TALT) in C. elegans embryos and gonads.
Télomères protège les extrémités chromosomiques de fusion aberrante et la dégradation. télomères mammalien se compose de séquences répétées riches en G hexamérique, TTAGGG et les complexes shelterin. La séquence répétée télomérique du nématode est similaire à ceux des mammifères (TTAGGC). La plupart des eucaryotes utilisent télomérase pour ajouter des répétitions télomériques à leurs extrémités chromosomiques. Cependant, 10 – 15% des cellules cancéreuses utilisent télomérase mécanisme indépendant, connu sous le nom alternatif Allongement de télomères (ALT) 3. Auparavant, nous avons signalé que les répétitions des télomères et ses séquences associées, nommées comme TALT, ont été amplifiés dans les télomères des lignées mutantes télomérase qui ont survécu à la stérilité critique 2.
La longueur des télomères a été mesurée par PCR quantitative ou par transfert de Southern, qui fournit la longueur moyenne des télomères totaux 4,5,6,7. Lire le nombre de répétition des télomères dans les données ensemble de séquençage du génome est également un indicateur de contenu total des télomères 8. Bien que Single télomères Longueur Analyse (STELA) pourrait fournir la longueur d'un seul télomères, il ne peut pas fournir l' information spatiale des télomères 9. Alors que POT-1 :: mCherry protéine rapporteur fournit l'information spatiale des télomères in vivo, il ne peut pas représenter la longueur de télomères double brin, comme POT-1 est une protéine 10 de liaison d' un seul brin télomère.
Bien que les méthodes mentionnées ci – dessus fournissent les informations moyenne de séquences répétitives, la fluorescence dans l' hybridation in situ (FISH) permet d'observer la quantité et la répartition spatiale des séquences individuelles d'intérêt sur une échelle chromosomique. Au lieu de la purification de l'ADN, les tissus ou les cellules sont fixées pour préserver les informations spatiales natif dans le poisson. Ainsi, FISH est un outil à la fois quantitative et qualitative pour l'observation de séquences répétées individuelles, telles que les répétitions des télomères.
Ce protocole fournit un procédé efficace pour la détection simultanée des deux télosimples et d' autres répétitions basées sur des améliorations de méthodes 11,12 décrites précédemment. C. elegans larves ou adultes sont organisme multicellulaire avec des cellules hautement différenciées. L'hétérogénéité des cellules empêche l'analyse quantitative d'un grand nombre de taches de télomères. Afin de maximiser le nombre de cellules analysées, les embryons sont isolés et se propager sur les lames de polylysine revêtues pour FISH. Par ailleurs, ce protocole peut aussi être combiné avec immunofluorescence.
Comme preuve que le protocole fonctionne, nous montrons qu'il est possible d'observer et de quantifier deux séquences répétitives différentes. sonde d'ADN contre TALT1 a été généré par PCR simple contenant digoxigénine-dUTP. Ensuite, cette sonde TALT1 et télomères sonde PNA marqué par fluorescence ont été hybridées simultanément. Par la suite, la digoxigénine a été détectée par des méthodes d'immunofluorescence canoniques. Nous présentons ici les images représentatives où TALT1 colocalisés avec le télomère dans trt-1 </em> survivants.
Le principal avantage de notre protocole est la simplicité de la procédure sans dommage sensible à la morphologie de la structure cellulaire. Plusieurs étapes ont été optimisés pour C. elegans FISH dans ce protocole. Les étapes essentielles pour FISH succès comprennent l'étiquetage des sondes, la fixation des embryons et la pénétration. méthode de marquage digoxigénine-dUTP fournit une méthode d'étiquetage facile à utiliser par PCR ou pseudo-traduction. Pour marquer la séquence cible ?…
The authors have nothing to disclose.
Mutant worm strains were kindly provided by the Caenorhabditis Genetics Center. This research was supported by a grant of the Korea Health Technology R&D Project through the Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), funded by the Ministry of Health & Welfare, Republic of Korea (grant number: HI14C1277).
PNA probe | PANAGENE | custom order | |
Anti-Digoxigenin-Fluorescein, Fab fragments | Roche | 11207741910 | use 1:200 diluted in PBST |
Digoxigenin-dUTP | Roche | 11573152910 | |
Bovine serum albumin | SIGMA-ALDRICH | A-7906 | |
Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | P-6148 | prepare 4% paraformaldehyde by heating in DW with few drops of NaOH. add 0.1 volume of 10x PBS. |
Vectashield | Vector Laboratories | H-1200 | |
Hybridizaiton solution | 3X SSC, 50% formamide, 10% (w/v) dextran sulfate, 50 ug/ml heparin, 100 ug/ml yeast tRNA , 100ug/ml sonicated salmon sperm DNA | ||
Hybridizaiton wash solution | 2X SSC, 50% formamide | ||
Formamide | BIONEER | C-9012 | toxic |
Methanol | Carlo Erba | ||
Acetone | Carlo Erba | ||
Heparin | SIGMA-ALDRICH | H3393 | make 10 mg/ml for stock solution |
Dextran sulfate | SIGMA-ALDRICH | 67578 | |
10X PBS | For 1 Liter DW : 80 g NaCl, 2.0 g KCl, 27 g Na2HPO4:7H2O, 2.4 g KH2PO | ||
PBST | 1X PBS, 0.1% tween-20 | ||
Polysorbate 20 | SIGMA-ALDRICH | P-2287 | Commercial name is Tween-20 |
Poly-L-Lysine solution (0.1 % w/v) | SIGMA-ALDRICH | P-8920 | prepare fresh 0.01 % w/v solution before use |
M9 | 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 L | ||
Bleaching solution | 20% sodium hypochlorite, 0.5 M KOH | ||
Antibody buffer | 1X PBST, 1mM EDTA, 0.1% BSA, 0.05% Sodium azide (toxic) | ||
Blocking solution | Antibody buffer with 5% bovine serum albumin (BSA) | ||
illustra Microspin G-50 | GE healthcare | 27-53310-01 | |
20X SSC | To make 1L, 175.3 g of NaCl, 88.2 g of sodium citrate, H2O to 1 L, adjust pH to 7.0 | ||
2X SSCT | 2X SSC, 0.1 % tween-20 | ||
10x digoxigenin-dUTP mix | 1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0.65mM dTTP, 0.35mM DIG-11-dUTP | ||
PCR purification columns | Cosmo genetech | CMR0112 | |
Glass cleaner / ULTRA CLEAN | Dukssan pure chemicals | 8AV721 | |
Multi-well glass slide | MP biomedicals | 96041205 | |
Nematode growth media | to make 1 L, 3 g of NaCl, 17 g of agar, 2.5 g of peptone, H2O to 974 mL. Autoclave and cool the flask. Add 1 mL of 1M CaCl2, 1 ml of 4 mg/mL cholesterol in ethanol, 1 ml of 1 M MgSO4, 25 mL of 1 M KPO4. | ||
Levamisole | SIGMA-ALDRICH | 196142 | |
Razor | Feather | blade No. 11 | |
Rnase A | Enzynomics | ||
BSA | SIGMA-ALDRICH | A7906 | |
Equipments | |||
Confocal microsope | Zeiss | LSM 510 | EC Plan-Neofluar 100x was used as objective lens. |
Dry block / aluminum block | Labtech | LBH-T03 | Set temperature to 80℃ |
Humid chamber | Plastic box filled with paper towel soaked in DW | ||
Image Analysis Software | Dr. Peter Landsdorp | TFL-telo | http://www.flintbox.com/public/project/502 |