Abstract
Den heterogene intratumoral akkumulering af liposomer er en kritisk faktor for deres effektivitet. Både den kaotiske tumor mikrocirkulationen og forhøjede IFP er knyttet til den heterogene intratumoral fordeling af nanoteknologi-baserede drug delivery systemer såsom liposomer. I nærværende undersøgelse blev forholdet mellem tumor mikrocirkulationen, forhøjet IFP, og akkumulering af nanopartikler undersøgt gennem in vivo eksperimenter. Dette blev udført ved evaluering af tumoren mikrocirkulationen bruge dynamisk kontrastforbedret computertomografi (DCE-CT) og måling af tumor IFP anvendelse af en hidtil ukendt billede-guided robot nåleplacering system tilsluttet mikro-CT-scanner. Den intratumoral ophobning af liposomer blev bestemt ved CT-billede-vurdering af en nanopartikel liposomal formulering, der stabilt indkapsle kontrastmidlet iohexol (CT-liposomer). CT scanning tilladt for co-lokalisering af den rumlige fordeling aftumor hæmodynamik, IFP og CT-liposom akkumulering i en individuel subkutan xenotransplantat musemodel for brystkræft. Målinger førte til den opdagelse, at perfusion og fraktion plasmavolumen er stærke mediatorer af intratumoral fordeling af liposomer. Endvidere tyder resultaterne på, at IFP spiller en indirekte rolle i mediering liposom distribution gennem modulering blodgennemstrømning.
Introduction
Måling af intratumoral ophobning af nanopartiklers lægemiddeltilførselssystemer kan tilvejebringe et vigtigt redskab til at afgøre, om en tilstrækkelig koncentration af cytotoksisk lægemiddel er opnået inden tumoren. Udviklingen af "billed-stand" liposomale systemer giver mulighed for ikke-invasiv og kvantitativ in vivo detektion af afgivelsesenheden køretøjet ved hjælp billeddannende modaliteter såsom positronemissionstomografi (PET) 1, optisk fluorescens 2, og computertomografi (CT) 3, 4 og magnetisk resonans imaging (MRI) 5. Imaging er blevet anvendt til at bestemme farmakokinetikken og biofordeling af liposomafgivelsessystemer og at vise omfanget af inter-subjekt og intratumoral heterogenitet i nanopartikel akkumulering 6,7. Men billeddannelse af nanopartikler alene ikke identificere de biologiske barrierer, der har bidraget til deres dårlige ophobning og distribution. Denne viden er altafgørende for rational udvikling af mere effektive formuleringer, og strategier til at forbedre intratumoral akkumulation 8. Det er blevet påvist, at terapeutiske strategier kan anvendes til at modulere specifikke biologiske barrierer resulterer i forbedret nanopartikel transport 9. Derudover er der udviklet nanopartikel formuleringer til specifikt overvinde specifik biologisk transport barriere 10. I begge scenarier, kunne målinger af biologiske barrierer bruges til at styre brugen af en passende nanopartikel drug delivery-strategi.
Tumor mikrocirkulationen og forhøjet IFP menes at være to centrale determinanter for den intratumoral ophobning af nanopartikler, såsom liposomer, i solide tumorer 9,11. Men andre barrierer, der kan bidrage til dårlig liposom ophobning omfatter en tæt ekstracellulær matrix, uigennemtrængelige kar, og fast væv pres 12. Disse barrierer er relateret i en spatio-temporalemåde med unormal blodgennemstrømning og forhøjet interstitielt fluid tryk er to vigtige faktorer for første levering og ekstravasation af nanopartikler. Som tidligere beskrevet er afgørende for korrekt fortolkning af liposom billeddata etablere et forhold mellem tumor mikrocirkulationen, høj IFP, og den intratumoral akkumulering af liposomer. Heri kvantitative metoder til at måle forholdet mellem tumor mikrocirkulationen, høj IFP, og nanopartikel-akkumulering i en fast tumor præsenteres. Dette opnås ved at udføre co-lokaliserede målinger af intratumoral fordeling af en CT liposom kontrastmiddel hjælp volumetrisk CT billeddannelse, tumor mikrocirkulationen bruge dynamisk kontrastforbedret computertomografi billeddannelse, og tumor IFP med billedbærer-guided robot nål positioneringssystem, betegnet CT-IFP robot 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle in vivo eksperimenter blev udført under en protokol godkendt af University Health Network Institutional Animal Care og brug Udvalg.
1. Animalske Model
- Kultur mellem 5 til 7 x 10 6 MDA-MB-231 brystadenocarcinom tumorceller i DMEM sammen med 10% kalvefosterserum (FBS) og 100x fortynding af penicillin-streptomycin.
- Harvest celler, når de er 80% sammenflydende ved anvendelse af en 0,05% trypsin-EDTA-opløsning. Efter 3-5 min neutralisere trypsin-EDTA med en 3 x volumen af DMEM. Tage en 15 pi alikvot af celler og tælle anvendelse af et hæmocytometer. Centrifuge celler i en pellet i 5 minutter ved 200 xg, og re-suspendere HBS i en koncentration på 10 x 10 6 celler pr.
- Implantat subkutan (SC) tumorer ved injektion af 1 til 2 x 10 6 celler i bagbenet på hver 8 til 12 uger gamle SCID mus (n = 5). Brug en standard 25 G nål til injektion.
- Monitor tumor vækst ved hjælp af skydelære (Volume = 0,5 x Længde x Bredde 2) og starte målingerne, når SC tumorer har nået et volumen> 200 mm 3 (ca. 7 til 9 dage).
2. CT-liposom Forberedelse og karakterisering
- Liposomfremstillinq
- Opløs lipidbestanddele (200 mmol / L) for CT-liposomer, herunder 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DPPC), cholesterol (CH) og 1,2-distearoyl-sn-glycero-3 -phosphoethanolamine-N-poly (ethylenglycol) 2000 (DSPE-PEG2000) i vandfri ethanol ved 70 ° C ved et molært forhold på 55: 40: 5 DPPC: CH: DSPE-PEG2000.
- Fordampe ethanol ved at opretholde varme ved 70 ° C, tilsæt derefter CT kontrastmiddel iohexol (300 mg / ml iod) til opløsningen, således at den endelige lipidkoncentration er 100 mM.
- Opretholde opløsningen ved 70 ° C i 4 timer med hyppige vortexbehandling.
- At opnå unilamellare vesikler, ekstrudere prøve 5 times gennem to stablede 200 nm porestørrelse membraner ved et tryk på 250 psi og ekstrudere igen ved 5 cykler gennem to stablede 80 nm porestørrelse membraner ved 400 psi under anvendelse af en 10 ml lipid ekstruder. Afpipetteres en volumen på 10 ml liposomer ind i ekstruderen ved begyndelsen af hver ekstrudering cyklus og anbring i en steril konisk rør eller hætteglas efter hver ekstrudering cyklus.
- Fjern un-indkapslede iohexol ved 16 timer af dialyse under anvendelse af et 100 kDa molekylvægtsafskæring (MWC) dialysepose mod en 250-folds volumen overskud af 0,02 mM HEPES-bufret saltopløsning (HBS, pH 7,4). For eksempel, placere 1 ml liposomopløsningen inde dialyseposen med 250 ml HBS uden for posen i et bæger.
- Koncentrer CT-liposomer under anvendelse af en 750.000 misk MWC kommerciel tangential flow system ifølge producentens instruktioner. Koncentrer til en endelig jod koncentration på ca. 55 mg ml-1.
- Liposome Karakterisering
- Mål indkapslingseffektivitet ved at bryde CT-liposomer under anvendelse af en 10-folds volumen overskud af ethanol for at frigøre ioxehol og derefter fortynde anvendelse af en 100-folds volumen overskud af deioniseret vand (dvs. 10 pi liposomer sprænges under anvendelse af 100 pi ethanol og derefter fortyndet til et endeligt volumen på 10 ml).
- Bestem iohexol koncentration på en UV-spektrometer med detektion ved en bølgelængde på 245 nm. Beregn indkapslinger effektivitet ved at tage forholdet mængde frigjort iohexol middel til mængde middel tilsættes under fremstillingen.
- Mål den hydrodynamiske potentiale diameter og zeta anvendelse af en dynamisk lysspredning partikelstørrelsen analysator ifølge producentens instruktioner. Fortynd CT-liposom opløsning ved 200x (dvs. 5 pi liposom i 1 ml slutvolumen) i deioniseret vand for at lette målinger.
3. CT Imaging af Tumor Microcirculation og CT-liposomFordeling
BEMÆRK: Følg producentens anvisninger til at udføre en volumetrisk scanning, hvis der anvendes forskellige software version eller udstyr.
- Bedøver hver mus ved hjælp af 2% isofluran blandet med medicinsk luft eller ilt og bekræft ved at knibe tå og observere ingen reaktion. Påfør salve til øjnene for at forhindre tørhed, mens under anæstesi. Immobilisere dyr i en liggende stilling ved at tape poter til en tynd plastplade.
- Placer en brugerdefineret 27 G kateter, forbundet til 20 cm på PE10 rør, i den laterale halevene og fastgør på plads med flere stykker tape.
- Der fremstilles en 1 ml sprøjte til at indeholde mindst 200 pi af CT-liposomer. Der fremstilles en 1 ml sprøjte med saltvand for at bruge til at skylle kateteret. Endelig fremstilles en 1 ml sprøjte med mindst 150 pi fri iohexol blandet med saltvand (9: 1 volumenforhold).
- Placer musen tilbøjelige på mikro-CT-scanner seng. Brug af laseren positioneringssystemet at placere Tumor i omtrent samme retning for hver scanning.
- Placer CT-liposom sprøjten i en sprøjtepumpe og fastgøre kateteret til sprøjten. Indstil pumpen på 10 pi pr sek.
- Initialiser systemet ved at udføre en lys-mørke kalibrering scanning ved brug af CT-scanner konsol software. Vælg den lyse mørke scan mulighed for hver imaging protokol af interesse, skal du vælge lyse mørke fra drop down menuen og tryk på knappen scanning for at starte kalibreringen.
- Udfør en volumetrisk anatomisk mikro-CT af forud for enhver kontrastmiddel injektion tumoren. Kig på indikatoren konsol software CT-scanner for at sikre CT-scanner sikkerhedslåse er blevet ryddet. På computertomografen konsollen Vælg Scan vælge en x-ray energi på 80 kV, en tube strøm på 70 mA, og indfanger 1.000 billedfiler fremspring med tiden 16 sek. Tryk på knappen Scan for at starte scanningen.
- Brug sprøjtepumpen at injicere en bolus af CT-liposomer ved en koncentration på 400 mg jod kg-1. Indstil pumpen til at injicere et volumen på ca. 150 pi (under antagelse af en 25 g mus). Tryk på knappen "Start" på pumpen at injicere. skylle manuelt kateteret med 50 gi saltvand (det dobbelte af volumen af kateteret) for at sikre at hele agent beløbet blev injiceret og kateteret er klar.
- Vent 10 minutter efter injektion af CT-liposomer og derefter udføre en anden anatomisk scanning ved brug af samme metode og indstillinger beskrevet i 3.5.
- Udfør en DCE-CT-scanning ved at indstille sprøjtepumpen at injicere et volumen på 100 pi af den frie iohexol blandet med saltvand (9: 1 volumenforhold) under anvendelse af samme injektionshastighed indstilling beskrevet i 3.3.
- På CT-scanner konsol vælge 5 min dynamiske scanning, der bruger en x-ray energiindstilling på 80 kV, en tube energi 90mA, og indfanger 416 billedfiler fremskrivninger hver sek for første 30 sek og efterfølges af en overtagelse hver 10 sek . Capture 5 sek af DCE-CT-data, og tryk derefter på startknappen på injektionsvæskenn pumpe.
- Efter DCE-CT-scanning udføre en volumetrisk anatomisk mikro-CT-scanning.
- Capture anatomiske CT-billeder mellem 48 og 72 timer efter injektion af CT-liposomer, ved anvendelse af de samme volumetriske CT indstillinger som beskrevet i trin 3.5.
- Rekonstruere de anatomiske CT og DCE-CT data ved hjælp af GPU-genopbygning software.
- Læg billedet ind i genopbygning software. Vælg den region af interesse, der skal rekonstrueres ved at tegne en ROI over billedet ved hjælp af en mus. Indstil spare placering og filnavn for det rekonstruerede afbildet og vælge output filtypen som ".mat«.
BEMÆRK: Softwaren vil automatisk den rekonstruerede voxelstørrelsen til 0,153 x 0,153 x 0,153 mm 3 for anatomiske scanninger og 0,153 x 0,153 x 0,462 mm 3 for DCE-CT-scanninger. Klik på 'begynde genopbygningen' knappen.
- Læg billedet ind i genopbygning software. Vælg den region af interesse, der skal rekonstrueres ved at tegne en ROI over billedet ved hjælp af en mus. Indstil spare placering og filnavn for det rekonstruerede afbildet og vælge output filtypen som ".mat«.
- Brug præ-injektion og 10 min efter injektion scanninger af CT-liposom til at beregnefraktion plasmavolumen som tidligere beskrevet 3. Desuden bruge pre-indsprøjtning og 5 min efter injektion scanninger af iohexol at beregne den interstitielle volumenfraktion som tidligere beskrevet 7.
- Få tid intensitet kurver (TIC) ved at importere de DCE-CT data i software, der giver mulighed for at identificere et område af interesse (ROI) i tumor volumen. Derefter beregne middelværdien CT forbedring i ROI som funktion af tiden. I dette eksperiment blev specialbygget software udviklet til at identificere en ROI og beregne TIC.
- Opnå kvantitative skøn over perfusion og vaskulær permeabilitet ved montering målte TIC ved hjælp af en to-kompartment sporstof kinetisk model. Montering kan udføres under anvendelse DCE-CT analyse software og bruge Apriori estimater af fraktion plasmavolumen og interstitiel volumenfraktioner som faste parametre i to-kompartment sporstof kinetisk model. Brug tidligere rapporterede metoder til at opnå apriori estimater af plasma og interstitielle volumenfraktioner 14.
4. Rumlige Målinger af Tumor Interstitiel Fluid Pressure
- Til måling IFP forbinde 25 G spinalnålen til tryktransduceren og til IFP erhvervelse systemet gennem 50 cm af PE20 polyethylenrør. Skylle hele systemet med en heparinsulfat / saltopløsning (1:10). Sterilisere nålen med 70% isopropyl før brug.
- Tænd for erhvervelse systemet og starte IFP erhvervelse software og indlæse indstillingsfiler at kalibrere systemet til at erhverve IFP målinger i mmHg. Klik på knappen erhverve til løbende indsamle IFP data.
- Udfør IFP målinger mellem 48 og 72 timer efter injektion af CT-liposomer (dette svarer til det omtrentlige tidspunkt for maksimal akkumulering af CT-liposomer i tumoren), ved anvendelse af metoderne beskrevet i 4.8. Fastgør IFP nål til CT-IFP robot.
- Udfør kalibrering scanninger at justere koordinatsystemer tilCT-IFP robot og CT-scanner. Tilsæt referenceenergi markør fastgørelse til CT-IFP robot og udføre en fire volumetrisk CT-scanning med referenceenergi markør i fire forskellige positioner.
- Start CT-IFP robot controller software, initialisere robotten, og flytte robotten til de tre positioner ved at indtaste x, y, z målrettet positioner, og klikke på "Book" -knappen.
- Tag en CT-scanning på følgende x, y, z koordinater: (1) 0,0,0; (2) -10,0,0; (3) 0,7,0; og (4) 0,0,10. Vælg en 90 kV, 10 mA, 16 sek scanning ved brug af CT-scanner-software og tryk på 'Start' for at starte scanningen. Rekonstruere scanningen som beskrevet i 3.10.
- Start CT-IFP robot justering software. Klik på knappen "tilføj" lagt i "Registreringsdata 'region, og vælg de fire rekonstruerede registrering scanninger opnået i 4.3, og klik derefter på" åben ".
BEMÆRK: pixel placering referenceenergi markør automatisk indtastes i software.- Klik på knappen "Beregn Transform" og klik derefter på knappen 'Anvend Transform ". Dette genererer alignment data, som vil blive anvendt til at omdanne CT-IFP robot koordinatsystem til computertomografen koordinatsystem. Efter kalibreringen er færdig, lægger dyret platform til CT-IFP robot.
- Bedøver hver mus ved hjælp af 2% isofluran blandet med medicinsk luft eller ilt og bekræft ved at knibe tå og observere ingen reaktion. Immobilisere dyr på CT-IFP robot platform og placer musen, således at tumor er tilgængelig for CT-IFP robotsystem. Immobilisere tumor ved hjælp tape, så den ikke bevæger sig under IFP nål indsættelse.
- Udfør en anatomisk mikro-CT-scanning ved indsætning IFP nål. Rekonstruere CT data ved hjælp af de trin, der beskrives i 3.10.
- Indlæse pre-nåleindføring CT data i CT-IFP robot alignment software. Juster vinduet og niveau for at visualisere tumoren. Klik på the rand af tumor i et billede, og klik derefter på en anden kant placering.
BEMÆRK: Softwaren vil beregne en række positioner langs en lineær linje mellem de to positioner. Bemærk x-, y- og z-koordinater for en serie på 5 til 8 jævnt fordelte positioner fra listen. - Forbered IFP systemet ved skylning af nålen med før indføring heparin saltvandsopløsning.
- Indtast de første forudbestemte nålepositioner i x, y, z, i CT-IFP robot kontrol software og tryk-træk til knap "Book" for at flytte robotten til den ønskede position. Klik på knappen 'Indsæt Needle "for at indsætte nålen ind i vævet.
- Efter indsættelse af nålen sikre en god fluidforbindelse mellem IFP nål og vævet ved at knibe og slippe PE20 slange, der konstaterer, at IFP måling stiger og vender tilbage til pre-klemme værdi på IFP erhvervelse software. Afvis målinger, der ikke returnerer til baseline.
- Anskaf enanatomisk CT-scanning med nålen indsættes, klik derefter på knappen "tilbagetrækning Needle 'på CT-IFP robotstyring software til at trække nålen fra vævet. Afvis enhver IFP målinger, hvor IFP værdi ikke vende tilbage til før-nål indsættelse værdi efter tilbagetrækning af nålen. Dette betyder, at nålen kan være blevet tilstoppet under målingen. Gentag trin 4.8 til 4.10 for hver nål position.
- Bestem nålen holdning i tumorvolumen ved at beregne x, y og z positioner af nålen port i forhold til centrum af massen af tumorvolumen som identificeret i post-insertion volumetrisk CT-scanning af nålen.
- Retur dyr til deres bur efter alle målinger er færdige. Efterlad ikke dyr uden opsyn, og sørge for at observere dem, indtil bevidstheden er genvundet, og de er i stand til at opretholde brystleje.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den førnævnte protokol bør give CT-liposomer med en indkapslet koncentration af iohexol, betyder liposom diameter, og zeta potentiale på 55 mg ml -1, 91,8 ± 0,3 nm og -45,5 ± 2,5 mV hhv. Figur 1a omfatter repræsentativt DCE-CT scanning resultater, hvilket giver en tidsserie af volumetriske data, der viser de tidsmæssige ændringer i intratumoral ophobning af iohexol. Valg af en ROI inden tumoren giver en TIC, der kan kvantificeres ved hjælp af tracer kinetiske modellering metoder til at opnå estimater af perfusion, vaskulær permeabilitet, fraktion plasmavolumen, og interstitiel volumen fraktion (figur 1b). I denne undersøgelse blev en to-kompartment sporstof kinetisk model, der anvendes og passer til den målte TIC anvendelse af et ikke-lineær kurvetilpasning rutine implementeret i Matlab 14. Segmentering af tumorvolumen i flere områder af interesse af samme størrelse muliggør kvantificering af than rumlige fordeling af hæmodynamiske parametre i tumorvolumen (fig 1c). Segmentering kan udføres enten manuelt, hvilket er tidskrævende og vanskelig, eller automatisk som udføres her ved hjælp af en algoritme, der deler tumoren i multiple lige store ROI'er ved anvendelse af et sfærisk koordinatsystem. De DCE-CT metoder giver kvantitative skøn over den rumlige fordeling af perfusion, vaskulær permeabilitet, fraktion plasmavolumen, og fraktion interstitiel volumen. Disse parametre blev observeret at være rumligt heterogen med højere niveauer af perfusion, plasma og interstitielle volumenfraktioner langs periferien i forhold til den centrale tumorvolumen.
Den volumetriske CT billeddannelse metode afslører biofordelingen og intratumoral fordeling af CT-liposomer. Figur 2a viser biofordelingen af CT-liposomer ved 48 timer efter injektion. Agenten er stadig cirkulerer i the vaskulære system, med betydelig optagelse observeret i milten og leveren. Den intratumoral akkumulering af CT-liposomer viste sig at være heterogen, med overvejende perifer akkumulering i forhold til centrum, som angivet ved de lyse regioner inden for tumorvolumen (figur 2b).
Volumetrisk CT billeddannelse kan anvendes til at spore placeringen af IFP målinger foretaget ved anvendelse af CT-IFP robot setup. Figur 3a viser placeringen af IFP nålen i tumorvolumen som afbildet ved hjælp af høj opløsning mikro-CT. Nålen kan tydeligt identificeres i tumorvolumen tillader rumlig lokalisering af IFP målinger inden for tumorvolumen (figur 3b). Det er muligt at generere et rumligt kort over IFP i hele tumoren ved at udføre flere IFP målinger i tumorvolumen. Den rumlige IFP kan derefter korreleres med de tilsvarende målinger aftumor mikrocirkulationen og CT-liposom akkumulering.
Volumetrisk CT scanning giver mulighed for en fælles referenceramme som gør det muligt at co-lokalisere målinger af hæmodynamik, IFP, og CT-liposom akkumulation. Figur 4 giver et eksempel på rumligt co-lokaliserede målinger af CT-liposom ophobning, IFP, perfusion, vaskulær permeabilitet, fraktion plasmavolumen, og fraktion interstitiel volumen. Det blev observeret, perfusion og fraktion plasmavolumen var signifikant korreleret med intratumoral akkumulering af CT-liposomer i subkutane MDA-MB-231 tumorer. Endvidere den radiale fordeling af IFP korreleret med hæmodynamiske målinger. Disse resultater antyder eksisterer en kompleks spatio-temporale forhold mellem tumor mikrocirkulationen, IFP og intratumoral akkumulering af liposomer 14.
Figur 1: DCE-CT Imaging af tumoren Microcirculation (a) En repræsentativ række tidsmæssige CT billeder indsamles i tumorvolumen, der afbilder kontrastmiddel kinetik som funktion af tid.. Den røde kontur repræsenterer en ROI hvor tiden intensiteten kurven (TIC) måles. (B) TIC er egnet ved en to-kompartment sporstof kinetisk model til opnåelse af kvantitative estimater af hæmodynamiske parametre i ROI. (C) Repræsentant rumlige fordeling af kvantitative hæmodynamiske parametre i tumoren. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Volumetrisk CT-Imaging af Liposome accumul tion. (a) Et repræsentativt 3D volumen-renderet billede viser biofordelingen af CT-liposomer. (B) Repræsentant aksial, koronale og sagittale skiver taget gennem midten af tumoren viser intratumoral ophobning af CT-liposomer ved 48 timer efter injektion. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:. Image Guided IFP Målinger (a) Et repræsentativt 3D volumen-gengivet billede af CT-IFP robotsystem (grøn) post-nål indføring i en subkutan tumor ved 48 timer efter injektion af CT-liposomer (orange). (B) Et repræsentativt CT billedet af post-nåleindføring./54226/54226fig3large.jpg "Target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4:. Co-lokaliserede Målinger af Tumor Microcirculation, IFP, og CT-liposom akkumulering Panel viser en repræsentativ rumlig co-lokalisering af CT-liposom akkumulering taget efter injektion, IFP, perfusion, vaskulær permeabilitet, plasmavolumen fraktion 48 timer og interstitiel volumenfraktion. Re-print med tilladelse fra 14. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoderne til billedbaseret måling præsenteret heri muliggøre bestemmelse af den rumlige fordeling af tumor microcirculation egenskaber, IFP, og CT-liposom akkumulation. Tidligere forsøg på at relatere disse egenskaber har påberåbt sig at udføre bulk-målinger på tværs af flere tumor-bærende dyr og mangler derfor følsomheden at belyse mekanismer der er ansvarlige for heterogenitet i intratumoral akkumulation, der almindeligvis blevet observeret for nanostørrelse lægemiddelafgivelsessystemer 15. DCE-CT giver et værktøj til at måle intratumoral variationer i egenskaber af tumoren mikrocirkulationen, volumetrisk CT giver en nøjagtig skildring af CT-liposom deposition kinetik, og CT-IFP robot system giver et værktøj til at udføre rumlig kortlægning af IFP i det samme dyr. Desuden DCE-CT scanning er en klinisk godkendt metode til måling af tumor hæmodynamik i kliniske omgivelser, hvilket gør resultaterne af denne undersøgelse potentielt klinisk translet bord.
I betragtning af kompleksiteten af målingerne, er der flere kritiske faktorer for at sikre opkrævning af de robuste datasæt. DCE-CT baseret kvantificering af tumor mikrocirkulationen er velsagtens den mest vanskelige at sikre nøjagtige estimater af tumor hæmodynamik. Det kræver at opnå TIC med høj signal-støj-forhold (SNR) og ansætte en robust montering algoritme til at kvantificere tics 16,17. Visuel inspektion af TIC kan anvendes til at fjerne lav SNR data fra analysen. Desuden, hvis man ikke passer så montering af høj SNR TIC kan også føre til fejlagtige skøn over tumor perfusion, vaskulær permeabilitet, fraktion plasmavolumen og intramuskulært volumenfraktion 16. For at maksimere kvantificering nøjagtighed en strategi var ansat til at opnå model uafhængige estimater af plasma og interstitielle volumenfraktioner, som efterfølgende anvendes som faste parametre under model fit af målte TIC. denne fremgangsmådesikrer robuste estimater af tumor perfusion og vaskulær permeabilitet opnås 15.
Robust analyse af intratumoral fordeling af CT-liposomer kræver udførelse volumetrisk CT billeddannelse efter tilstrækkelig akkumulation af midlet. Fra tidligere undersøgelser, peak tumor akkumulering af CT-liposomer sker mellem 48 til 72 timer i muse-xenotransplantater 3,15. Desuden eksisterer en lineær sammenhæng mellem CT-liposom koncentration og kontrastforbedring i CT billeddannelse giver mulighed for enkel kvantificering af variationerne i intratumoral ophobning af CT-liposomer 15.
Nøjagtige målinger af IFP hjælp af nålen-baserede metode kræver god fluidforbindelse mellem kateteret og vævet. Desuden er det vigtigt kun at bruge tumorer, der har høj central tumor IFP (> 5 til 10 mmHg), ellers vil der være minimale rumlige variationer i IFP. Rumlige målinger af IFP ved hjælp af CT-IFP røveot systemcan være udfordrende på grund af væv bevægelse forårsaget af nål indsættelse. Imaging før og efter placering af nålen er afgørende for nøjagtig identifikation af placering af nålen; men det kan være vanskeligt at relatere position mellem efterfølgende needle placeringer på grund af væv vridning mellem målingerne. Det konstateredes, at tilfældigt vælger nålepositioner resulterer i signifikant væv deformation under nåleindføring. Som et resultat, denne metode forudsat mindst præcise rumlige kortlægning af IFP. Omvendt foretages målinger langs et lineært spor på tværs af tumorvolumen og nålen indføres der tangerer spor kan forbedre den rumlige nøjagtighed IFP målinger. Indsættelse af nålen tangerer sporet minimerer effekten af væv deformation langs målingen sporet retning.
Denne undersøgelse har vist evnen til at måle den rumlige fordeling af tumor mikrocirkulationen, IFP og CT-liposom akkumulering i en individuel tumor. Efter mastering disse teknikker, er det så muligt at udføre disse målinger uafhængigt eller sammen for at karakterisere tumor mikromiljø og dens virkninger på drug delivery. Under anvendelse af disse metoder i MDA-MB-231 breast xenograftmodel afslørede, at perfusion og fraktion plasmavolumen er stærke mediatorer af den intratumoral fordeling af liposomer 14. Der blev ikke fundet at være en stærk sammenhæng mellem IFP og liposom distribution. Men IFP var stærkt korreleret til målinger af tumor perfusion, hvilket tyder på, at IFP kan spille en indirekte rolle i formidling liposom distribution gennem modulation af blodgennemstrømningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MDA-MB-231 metastatic breast adenocarcinoma tumor cells | ATCC | HTB-26 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F1051 | |
| HyClone Penicillin-Streptomycin 100x Solution | GE Healthcare Life Sciences | SV30010 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300-054 | |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) | Avanti Lipids Inc., USA | 850355P | |
| Cholesterol (CH) | Avanti Lipids Inc., USA | 700000P | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-poly(ethylene glycol) 2000 (DSPE-PEG2000) | Avanti Lipids Inc., USA | 880128P | |
| Omnipaque (Iohexol) 300 mg of iodine/ml | GE Healthcare, CA | ||
| 80 nm pore size Track-Etch polycarbonate membranes | Whatman Inc., USA | ||
| 200 nm pore size Track-Etch polycarbonate membranes | Whatman Inc., USA | ||
| 10 m Lipex Extruder | Nothern Lipids Inc, CA | ||
| Dialysis Bag Molecular Weight Cut Off (MWCO) of 8 kDa | Spectrum Labs, USA | ||
| 750,000 Nomical Molecular Weight Cut Off (NMWC) Tangential flow column | MidGee ultrafiltration cartridge, GE Healthcare, CA | ||
| Peristaltic pump | Watson Marlow Inc., USA | ||
| UV spectrometer | Helios γ, Spectronic Unicam, USA | ||
| 90Plus particle size analyzer | Brookhaven, Holtsville, USA | ||
| eXplore Locus Ultra micro-CT system | GE Healthcare, CA | Manipulated using CT-Console Software | |
| AxRecon GPU-based Reconstruction | Acceleware Corp. CA | ||
| 27 G Catheter SURFLO Winged Infusion Set | Terumo Medical Products, USA | SV*27EL | |
| PE20 polyethylyne tubing | Becton Dickinson, USA | 427406 | |
| Pen tip 25 G × 3.5′′ Whitacre spinal needle | Becton Dickinson, USA | 405140 | IFP needle |
| P23XL pressure transducer | Harvard Apparatus, CA | P23XL | |
| PowerLab 4/35, Bridge Amp, with LabChart Pro 7.0 | ADInstruments Pty Ltd., USA | PL3504, FE221 | IFP acquisition system and acquisition software |
| CT-Sabre Small Animall Intervention system (CT-IFP Robot) | Parallax Innovations, CA | Manipulated using CT-IFP robot Control Software | |
| CT-IFP robot alignment software | Custom Matlab software | ||
| DCE-CT Analysis Software | Custom Matlab software | ||
| Matlab 2013b | Mathworks, USA |
References
- Seo, J. W., Zhang, H., Kukis, D. L., Meares, C. F., Ferrara, K. W. A novel method to label preformed liposomes with 64Cu for positron emission tomography (PET) imaging. Bioconjugate chemistry. 19 (12), 2577-2584 (2008).
- Huang, H., Dunne, M., Lo, J., Jaffray, D., Allen, C. Comparison of Computed Tomography- and Optical Image-Based Assessment of Liposome Distribution. Molecular Imaging. 12 (3), 148-160 (2013).
- Stapleton, S., et al. A mathematical model of the enhanced permeability and retention effect for liposome transport in solid tumors. PloS one. 8 (12), e81157 (2013).
- Zheng, J., et al. A multimodal nano agent for image-guided cancer surgery. Biomaterials. 67, 160-168 (2015).
- Zheng, J., Liu, J., Dunne, M., Jaffray, D. A., Allen, C. In vivo performance of a liposomal vascular contrast agent for CT and MR-based image guidance applications. Pharmaceutical research. 24 (6), 1193-1201 (2007).
- Harrington, K. J., et al. Effective targeting of solid tumors in patients with locally advanced cancers by radiolabeled pegylated liposomes. Clinical Cancer Research. 7 (2), 243-254 (2001).
- Stapleton, S., Allen, C., Pintilie, M., Jaffray, D. A. Tumor perfusion imaging predicts the intra-tumoral accumulation of liposomes. J Control Release. 172 (1), 351-357 (2013).
- Lammers, T., Kiessling, F., Hennink, W. E., Storm, G. Nanotheranostics and image-guided drug delivery: current concepts and future directions. Mol. Pharm. 7, 1899-1912 (2010).
- Stapleton, S., Milosevic, M. F. Cancer Targeted Drug Delivery. , Springer. 241-272 (2013).
- Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery. Nature biotechnology. 33 (9), 941-951 (2015).
- Heldin, C. H., Rubin, K., Pietras, K., Ostman, A. High interstitial fluid pressure - an obstacle in cancer therapy. Nat Rev Cancer. 4 (10), 806-813 (2004).
- Chauhan, V. P., Stylianopoulos, T., Boucher, Y., Jain, R. K. Delivery of molecular and nanoscale medicine to tumors: transport barriers and strategies. Annual review of chemical and biomolecular engineering. 2, 281-298 (2011).
- Bax, J. S., et al. 3D image-guided robotic needle positioning system for small animal interventions. Medical physics. 40 (1), 011909 (2013).
- Stapleton, S., Milosevic, M., Tannock, I. F., Allen, C., Jaffray, D. A. The intra-tumoral relationship between microcirculation, interstitial fluid pressure and liposome accumulation. Journal of Controlled Release. 211, 163-170 (2015).
- Stapleton, S., Allen, C., Pintilie, M., Jaffray, D. A. Tumor perfusion imaging predicts the intra-tumoral accumulation of liposomes. J Control Release. 172 (1), 351-357 (2013).
- Brix, G., Zwick, S., Kiessling, F., Griebel, J. Pharmacokinetic analysis of tissue microcirculation using nested models: multimodel inference and parameter identifiability. Medical physics. 36 (7), 2923-2933 (2009).
- Brix, G., Griebel, J., Kiessling, F., Wenz, F. Tracer kinetic modelling of tumour angiogenesis based on dynamic contrast-enhanced CT and MRI measurements. European journal of nuclear medicine and molecular imaging. 37 (1), 30-51 (2010).
