Abstract
Die heterogene intratumorale Akkumulation von Liposomen ist eine kritische Determinante für ihre Wirksamkeit. Sowohl die chaotische Tumormikrozirkulation und IFP erhöht sind die heterogene intratumorale Verteilung der Nanotechnologie-basierten Wirkstoffabgabesysteme, wie Liposomen verknüpft. In der vorliegenden Studie wird der Zusammenhang zwischen Tumormikrozirkulation, erhöhte IFP und die Akkumulation von Nanopartikeln wurde durch In - vivo - Experimente untersucht. Dies wurde durch die Auswertung der Tumormikrozirkulation erreicht dynamischen Kontrast mit verstärkten Computertomographie (DCE-CT) und die Messung von Tumor IFP ein neuartiges bildgeführte Roboternadelplatzierung System mit dem Mikro-CT-Scanner. Die intratumorale Akkumulation von Liposomen wurde durch CT bildbasierte Beurteilung eines Nanopartikels liposomale Formulierung bestimmt, dass das Kontrastmittel Iohexol (CT-Liposomen) stabil verkapseln. CT-Bildgebung für die Co-Lokalisation der räumlichen Verteilung erlaubt derTumor Hämodynamik, IFP und CT-Liposom-Akkumulation in einer einzelnen subkutanen Xenotransplantat-Mausmodell von Brustkrebs. Messungen führten zu der Entdeckung, dass die Perfusion und Plasmavolumenanteil sind starke Mediatoren der intratumoralen Verteilung von Liposomen. Darüber hinaus legen die Ergebnisse nahe, dass das IFP eine indirekte Rolle spielt bei der Vermittlung von Liposomen Verteilung durch den Blutfluss zu modulieren.
Introduction
Die Messung der intratumoralen Anreicherung von Nanopartikel-Drug-Delivery-Systeme können ein wichtiges Instrument, um zu bestimmen liefern, wenn eine ausreichende Konzentration von zytotoxischen Medikament innerhalb des Tumors erreicht. Die Entwicklung von "Bild-fähig" liposomale Systeme ermöglicht nicht-invasive und quantitative in vivo - Nachweis des Lieferfahrzeugs Medikament Bildgebungsverfahren wie die Positronen - Emissions - Tomographie (PET) 1, optische Fluoreszenz 2 und Computertomographie (CT) 3, 4 und Magnetresonanztomographie (MRI) 5. Imaging wurde verwendet , um die Pharmakokinetik und Bioverteilung von Liposom - Abgabesystemen zu bestimmen und das Ausmaß der interindividuelle und intratumorale Heterogenität in Nanopartikel Akkumulation 6,7 zu offenbaren. Allerdings Bildgebung von Nanopartikeln allein nicht die biologische Barrieren zu identifizieren, die zu ihrer schlechten Anhäufung und Verbreitung beigetragen haben. Dieses Wissen ist von größter Bedeutung für die rnellen Entwicklung wirksamer Formulierungen und Strategien intratumorale Akkumulation 8 zu verbessern. Es wurde gezeigt , dass therapeutische Strategien spezifische biologische Barrieren angewendet werden können , zu modulieren in verbesserte Nanopartikel Transport 9 führt. Zusätzlich Nanopartikelformulierungen entwickelt wurden speziell spezifische biologische Transportbarriere 10 zu überwinden. In beiden Fällen könnten Messungen der biologischen Barrieren verwendet werden, um die Verwendung eines geeigneten Nanopartikels Arzneimittelverabreichungsstrategie zu führen.
Tumormikrozirkulation und erhöhter IFP wird angenommen , dass zwei wichtige Determinanten der intratumoralen Anreicherung von Nanopartikeln zu sein, wie Liposomen, in soliden Tumoren 9,11. Aber auch andere Barrieren , die 12 bis schlechte Liposom Akkumulation umfassen eine dichte extrazelluläre Matrix, undurchlässige Gefäße und feste Gewebedruck beitragen. Diese Barrieren sind in einer räumlich-zeitlichen ZusammenhangArt und Weise, mit abnormen Blutfluss und erhöhter interstitieller Flüssigkeit Druck ist zwei wichtige Faktoren, die die Erstauslieferung und Extravasation von Nanopartikeln zu fahren. Wie zuvor erläutert, die Beziehung zwischen der Tumormikro Gründung, erhöhte IFP und die intratumorale Akkumulation von Liposomen ist für die richtige Interpretation der Liposomenbilddaten unerlässlich. Hierin quantitative Methoden, um die Beziehung zwischen der Tumormikrozirkulation, erhöhte IFP und Nanopartikel Akkumulation in einem soliden Tumor zu messen, werden vorgestellt. Dies wird durch Ausführen kolokalisiert Messungen der intratumoralen Verteilung eines CT Liposom-Kontrastmittel unter Verwendung von volumetrischen CT-Bildgebung, Tumormikrozirkulation unter Verwendung einer dynamischen kontrastverstärkten Computertomographie-Bildgebung durchgeführt, und das Tumor IFP eine bildgeführte Roboternadelpositionierungssystem verwendet, bezeichnet CT-IFP Roboter 13.
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Protocol
Alle in - vivo - Experimente wurden unter einem Protokoll , das von der University Health Network Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt durchgeführt.
1. Tiermodell
- Kultur zwischen 5 bis 7 x 10 6 MDA-MB-231 Brust - Adenokarzinom - Tumorzellen in DMEM mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 100 - facher Verdünnung von Penicillin-Streptomycin.
- Ernten Sie die Zellen, wenn sie 80% konfluent mit einer 0,05% Trypsin-EDTA-Lösung. Trypsin-EDTA mit einem 3-fach Volumen DMEM Nach 3-5 min neutralisieren. Nehmen Sie ein 15-ul-Aliquot von Zellen und zählen eine Zählkammer. Zentrifugen Zellen zu einem Pellet für 5 min bei 200 xg und resuspendieren in einer Konzentration von 10 x 10 6 Zellen pro ml in HBS.
- Implantat subkutan (SC) Tumoren durch Injizieren von 1 bis 2 x 10 6 Zellen in der Hintergliedmaße jeder von 8 bis 12 Wochen alten weiblichen SCID - Maus (n = 5). Verwenden Sie ein Standard 25 G-Nadel für die Injektion.
- Monitor-tumor Wachstum mit Sätteln (Volumen = 0,5 x Länge x Breite 2) und die Messungen beginnen , sobald die SC - Tumoren ein Volumen von > 200 mm 3 (ca. 7 bis 9 Tage) erreicht haben.
2. CT-Liposom-Herstellung und Charakterisierung
- Liposomzubereitung
- Auflösen Lipidkomponenten (200 mmol / L) für die CT-Liposomen, einschließlich 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DPPC), Cholesterin (CH) und 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3 -phosphoethanolamine-N-poly (ethylenglykol) 2000 (DSPE-PEG2000) in wasserfreiem Ethanol bei 70 ° C bei einem Molverhältnis von 55: 40: 5 DPPC: CH: DSPE-PEG2000.
- Verdunsten Ethanol durch Wärme bei 70 ° C gehalten, dann fügen Sie den CT-Kontrastmittel Iohexol (300 mg / ml Jod) zu der Lösung, so dass die endgültige Lipidkonzentration von 100 mM.
- Pflegen Sie die Lösung bei 70 ° C für 4 Stunden mit häufigen Verwirbelung.
- unilamellaren Vesikeln zu erhalten, extrudieren die Probe 5 times durch zwei bei einem Druck von 250 psi 200 nm Porengröße Membranen gestapelt und wiederum durch 5 Zyklen durch zwei gestapelte 80 nm Porengröße Membranen bei 400 psi extrudieren 10 ml Lipid Extruders. Pipette mit einem Volumen von 10 ml von Liposomen in den Extruder zu Beginn jedes Spritzgußzyklus und zu sammeln in ein steriles konisches Rohr oder Glasphiole nach jedem Extrusionszyklus.
- Entfernen Sie die un-verkapselte Iohexol um 16 h Dialyse unter Verwendung einer 100 kDa Molekulargewicht abgeschnitten (MWC) Dialysebeutel gegen einen 250-fachen Volumenüberschuss von 0,02 mM HEPES-gepufferte Salzlösung (HBS, pH 7,4). Zum Beispiel stellen 1 ml Liposomenlösung in der Dialysebeutel mit 250 ml HBS außerhalb des Beutels in einen Becher.
- Konzentrieren sich die CT-Liposomen, die ein 750.000 schaftlich MWC kommerziellen tangentialen Strömungssystem gemäß den Anweisungen des Herstellers. Konzentrat auf eine endgültige Jodkonzentration von ungefähr 55 mg ml -1.
- Liposome Charakterisierung
- Messen Verkapselungseffizienz durch die CT-Liposomen Zerreißen eine 10-fache Volumenüberschuß an Ethanol unter Verwendung des ioxehol freizugeben und dann verdünnen , um eine 100-fachen Volumenüberschuß an entionisiertem Wasser (dh 10 ul Liposomen aufgebrochen 100 ul Ethanol und dann verdünnt auf ein Endvolumen von 10 ml).
- Bestimmen Iohexol Konzentration eines UV-Spektrometers mit Detektion bei einer Wellenlänge von 245 nm verwendet wird. Berechne den Verkapselungen Wirkungsgrad durch das Verhältnis Menge an freigesetztem Iohexol Mittels zu der Menge des Mittels unter zugegeben während der Herstellung.
- Messung des hydrodynamischen Durchmesser und Zeta-Potential ein dynamisches Lichtstreuungs Teilchengrößenanalysator System nach den Anweisungen des Herstellers. Verdünne die CT-Liposom - Lösung durch 200x (dh 5 ul Liposomen in 1 ml Endvolumen) in deionisiertem Wasser Messungen zu erleichtern.
3. CT-Bildgebung von Tumormikrozirkulation und CT-LiposomenVerteilung
Hinweis: Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers für eine volumetrische Scan durchführen, wenn andere Software-Version oder Ausrüstung verwendet wird.
- Anesthetize jede Maus mit 2% Isofluran mit medizinischen Luft oder Sauerstoff gemischt und bestätigen Sie mit der Zehe Kneifen und keine Reaktion zu beobachten. Bewerben Salbe auf die Augen Trockenheit während der Narkose zu verhindern. Unbeweglichkeitseffekt Tier in Bauchlage durch Pfoten auf eine dünne Plastikbrett Taping.
- Legen Sie eine benutzerdefinierte 27 G-Katheter, die mit 20 cm auf PE10 Schläuche, in die seitliche Schwanzvene und befestigen Sie sie mit mehreren Stücken von Klebeband.
- Bereiten einer 1 ml Spritze mindestens 200 & mgr; l der CT-Liposome zu enthalten. Bereiten Sie eine 1-ml-Spritze mit Kochsalzlösung verwenden, um den Katheter zu spülen. Schließlich bereiten mindestens 150 & mgr; l der freien Iohexol mit Kochsalzlösung gemischt, um eine 1-ml-Spritze mit (9: 1 Volumenverhältnis).
- Platzieren Sie die Maus anfällig auf der Mikro-CT-Scanner-Bett. Verwenden Sie die Laser-Positionierungssystem der tumo zu platzierenr in etwa die gleiche Ausrichtung für jede Abtastung.
- Legen Sie die CT-Liposom-Spritze in eine Spritzenpumpe und befestigen Sie den Katheter an der Spritze. Stellen Sie die Pumprate von 10 & mgr; l pro Sekunde.
- Initialisieren Sie das System durch eine Hell-Dunkel-Kalibrierung Scan Durchführung der CT-Scanner-Konsole-Software. Wählen Sie die Hell-Dunkel-Scan-Option für jedes Bildgebungsprotokoll von Interesse, wählen Sie Hell-Dunkel aus dem Dropdown-Menü und drücken Sie die Scan-Taste um die Kalibrierung zu starten.
- Führen Sie eine volumetrische anatomische Mikro-CT des Tumors vor einer Kontrastmittelinjektion. Schauen Sie sich die CT-Scanner Konsolensoftware Anzeige der CT-Scanner Sicherheitsverriegelungen gelöscht wurden, um sicherzustellen. Auf dem CT-Scanner-Konsole wählen Sie Scan eine Röntgenenergie von 80 kV, einem Röhrenstrom von 70 mA aus, und fängt 1000 Bild Projektionen im Laufe der Zeit 16 Sek. Drücken Sie die Scan-Taste um den Scan zu starten.
- Verwenden, um die Spritzenpumpe mit einem Bolus von CT-Liposomen bei einer Konzentration von 400 mg Jod kg einzuspritzen-1. Stellen Sie die Pumpe ein Volumen von etwa 150 & mgr; l injiziert (eine 25 g Maus vorausgesetzt). Drücken Sie die Schaltfläche "Start" auf der Pumpe zu injizieren. Spülen Sie manuell den Katheter mit 50 ul Salzlösung (zweimal das Volumen des Katheters), um das gesamte Mittelmenge, um sicherzustellen, wurde injiziert und der Katheter ist klar.
- Warten Sie 10 Minuten nach der Injektion von CT-Liposomen und dann einen zweiten anatomischen Scan mit der gleichen Methode und Einstellungen vornehmen in 3.5 beschrieben.
- Führen Sie eine DCE-CT-Scan, indem Sie die Spritzenpumpe mit einem Volumen von 100 ul des freien Iohexol mit Kochsalzlösung gemischt zu injizieren (9: 1 Volumenverhältnis) unter Verwendung der gleichen Injektionsrate Einstellung in 3.3 beschrieben.
- Auf dem CT-Scanner-Konsole wählen Sie die 5 min dynamische Scan, der eine Röntgenenergieeinstellung von 80 kV, einem Rohr Energie von 90mA und fängt 416 Bild Projektionen jede Sekunde für die ersten 30 Sekunden, gefolgt von einer Akquisition nutzt alle 10 Sek . Capture 5 sec von DCE-CT-Daten und drücken Sie dann die Start-Taste auf der injection Pumpe.
- Nach der DCE-CT-Scan eine volumetrische anatomischen Mikro-CT-Scan durchführen.
- Erfassen Sie anatomische CT-Bilder zwischen 48 und 72 Stunden nach der Injektion von CT-Liposomen, die gleichen volumetrischen CT-Einstellungen wie in den Schritten 3.5.
- Rekonstruieren der anatomischen CT und DCE-CT-Daten unter Verwendung der GPU-Rekonstruktionssoftware.
- Laden Sie das Bild in die Rekonstruktionssoftware. Wählen Sie die Region von Interesse rekonstruiert werden durch einen ROI auf das Bild unter Verwendung einer Maus. Stellen Sie den Speicherort und den Dateinamen für das abgebildete rekonstruiert und wählen Sie die Ausgabedateityp als ".mat '.
HINWEIS: Die Software wird automatisch das rekonstruierte Voxel Größe auf 0.153 x 0.153 x 0.153 mm 3 für anatomische Scans und 0.153 x 0.153 x 0.462 mm 3 für DCE-CT - Scans. Klicken Sie auf die 'beginnen Wiederaufbau' Button.
- Laden Sie das Bild in die Rekonstruktionssoftware. Wählen Sie die Region von Interesse rekonstruiert werden durch einen ROI auf das Bild unter Verwendung einer Maus. Stellen Sie den Speicherort und den Dateinamen für das abgebildete rekonstruiert und wählen Sie die Ausgabedateityp als ".mat '.
- Verwenden, um die Voreinspritzung und 10 min nach Injektion Scans des CT-Liposom zu berechnen dasPlasmavolumenanteil beschrieben , wie zuvor 3. Darüber hinaus verwenden die Voreinspritzung und 5 min nach der Injektion Scans von Iohexol die interstitielle Volumenanteil zu berechnen , wie zuvor beschrieben 7.
- Erhalten Zeitintensitätskurven (TICs) durch die DCE-CT-Daten in die Software importiert werden, die die Möglichkeit bietet, eine Region of Interest (ROI) innerhalb des Tumorvolumens zu identifizieren. Dann den Mittelwert CT Verbesserung in der ROI als eine Funktion der Zeit. In diesem Experiment wurde kundenspezifische Software entwickelt einen ROI zu identifizieren und die TIC berechnen.
- Erhalten quantitative Schätzungen der Perfusion und der vaskulären Permeabilität, gemessen durch TICs Einbau eines Zweifach-Tracer kinetischen Modells. Fitting kann DCE-CT-Analyse-Software durchgeführt werden und die A-priori-Schätzungen der Plasmavolumenanteil und interstitielle Volumenanteile als feste Parameter in dem Zweifach-Tracer kinetisches Modell verwenden. Verwenden Sie die zuvor beschriebenen Methoden apriori Schätzungen der plasm zu erhaltena und interstitielle Volumenanteile 14.
4. Räumliche Messungen der Tumor Interstitial Fluid Pressure
- Zur Messung der IFP die 25 G Spinalnadel mit dem Druckwandler und dem IFP-Erfassungssystem durch 50 cm von PE20 Polyethylenschlauch anschließen. Spülen Sie das gesamte System mit einer Heparinsulfat / Salzlösung (1:10). Sterilisieren Sie die Nadel mit 70% Isopropyl vor dem Gebrauch.
- Schalten Sie das Erfassungssystem und starten Sie die Erfassungssoftware IFP und laden Sie die Einstellungsdateien das System zu kalibrieren, um IFP Messungen in mmHg erwerben. Klicken Sie auf die Schaltfläche, um acquire IFP Daten zu sammeln.
- Führen IFP Messungen zwischen 48 und 72 Stunden nach der Injektion von CT-Liposomen (dies entspricht der ungefähren Zeit des Spitzen Akkumulation der CT-Liposomen in den Tumor) unter Verwendung der in 4.8 beschriebenen Verfahren. Bringen Sie die IFP Nadel an der CT-IFP Roboter.
- Führen Sie die Kalibrierung scannt die Koordinatensysteme abgestimmt werden, umCT-IFP Roboter und der CT-Scanner. Fügen Sie die Fiducial-Marker Bindung an die CT-IFP Roboter und führen in vier verschiedenen Positionen ein vier volumetrischen CT-Scan mit der Fiducial-Marker.
- Starten Sie die CT-IFP Roboter-Controller-Software, initialisieren Sie die Roboter und bewegen den Roboter in den drei Positionen durch die Eingabe der x, y, z Targeting Positionen und klicken Sie auf die Schaltfläche "GO".
- Nehmen Sie einen CT-Scan auf der folgenden x, y, z-Koordinaten: (1) 0,0,0; (2) -10,0,0; (3) 0,7,0; und (4) 0,0,10. Wählen Sie eine 90 kV, 10 mA, 16 sec Scan der CT-Scanner-Software und klicken Sie auf 'Start' mit Hilfe der Scan zu initiieren. Rekonstruieren Sie das Scan, wie in 3.10 beschrieben.
- Starten Sie die CT-IFP Roboter Ausrichtung Software. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Hinzufügen" in der Region "Registrierungsdaten" geladen, und wählen Sie die vier rekonstruierten Registrierung Scans in 4.3 erhalten, klicken Sie dann auf "Öffnen".
HINWEIS: Die Pixelposition des Fiducial-Marker werden automatisch in das softwa eingegeben werdenRe.- Klicken Sie auf den "Berechnen Transformation" Taste und dann auf die 'Apply-Transformation' Button. Dies erzeugt Datenausrichtung, die verwendet wird, um die CT-IFP Roboter-Koordinatensystem auf das CT-Scanner-Koordinatensystem zu konvertieren. Nachdem die Kalibrierung abgeschlossen ist, heften sich an die CT-IFP Roboter die Tier-Plattform.
- Anesthetize jede Maus mit 2% Isofluran mit medizinischen Luft oder Sauerstoff gemischt und bestätigen Sie mit der Zehe Kneifen und keine Reaktion zu beobachten. Unbeweglichkeitseffekt Tier auf der Roboterplattform CT-IFP und positionieren Sie die Maus, so dass der Tumor auf dem CT-IFP Robotersystem zugänglich ist. Unbeweglichkeitseffekt den Tumor mit Klebeband, so dass es nicht während der IFP Nadelinsertion nicht bewegt.
- Führen Sie eine anatomische Mikro-CT-Scan vor der IFP Nadel eingeführt wird. Rekonstruieren die CT-Daten unter Verwendung der in 3.10 beschriebenen Schritten.
- Laden Sie die Pre-Nadelinsertion CT-Daten in die CT-IFP Roboter Ausrichtung Software. Stellen Sie die Fenster und das Niveau der Tumor sichtbar zu machen. Klicken Sie auf the Rand des Tumors in jedem Bild, klicken Sie dann auf einem zweiten Rand Lage.
Hinweis: Die Software eine Reihe von Positionen entlang einer geraden Linie zwischen den beiden Positionen berechnet wird. Beachten Sie die x, y und z-Koordinaten für eine Reihe von 5 bis 8 gleichmäßig aus der Liste beabstandeten Positionen. - Bereiten Sie die IFP-System durch die Nadel mit Heparin Salzlösung vor dem Einsetzen Spülung.
- Geben Sie die ersten vorbestimmten Nadelpositionen in der x, y, z, in die CT-IFP Robotersteuerungssoftware und Druck Hinwendung zu gehen ', um den Roboter in die gewünschte Position zu bewegen. Klicken Sie auf die "Nadel einführen", um die Nadel in das Gewebe ein.
- Nach dem Einsetzen der Nadel durch Einklemmen und Loslassen der PE20 Schlauch, unter Hinweis darauf, dass die IFP Messung erhöht das gute Fluidverbindung zwischen dem IFP Nadel und dem Gewebe gewährleisten und den Wert zurück auf dem IFP Erfassungs-Software vor-Kneifen. Ablehnen Messungen, die zu den Ausgangsdaten nicht zurück.
- erwerben Sie einanatomischen CT-Scan mit der Nadel eingeführt und dann auf die 'einfahren Nadel' Taste auf der CT-IFP Robotersteuerung Software, um die Nadel aus dem Gewebe zurückzuziehen. Ablehnen alle IFP Messungen, bei denen die IFP-Wert nicht auf die vorge Nadelinsertion Wert zurückkehrt nach dem Herausziehen der Nadel. Dies bedeutet, die Nadel während der Messung verstopft wurden. Wiederholen Sie die Schritte 4,8-4,10 für jede Nadelposition.
- Bestimmen die Nadelposition innerhalb des Tumorvolumens durch Berechnung der x, y und z-Positionen der Nadel-Port in Bezug auf die Mitte der Masse des Tumorvolumens, wie in der Post-Insertion volumetrischen CT-Scan der Nadel identifiziert.
- Zurück Tiere in ihren Käfig, nachdem alle Messungen abgeschlossen sind. Lassen Sie keine Tiere unbeaufsichtigt, und achten Sie darauf, sie zu beobachten, bis das Bewusstsein wiedererlangt hat und sie sind in der Lage Brustlage zu halten.
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Representative Results
Die oben erwähnte Protokoll sollte CT-Liposomen mit einer gekapselten Konzentration von Iohexol, bedeuten Liposom Durchmesser und Zeta - Potential von 55 mg ml -1, 91,8 ± 0,3 nm und -45,5 ± 2,5 mV dar. 1a enthält repräsentative DCE-CT - Bildgebung ergeben Ergebnisse, eine Zeitreihe von volumetrischen Daten ergibt, die die zeitlichen Änderungen in intratumorale Anhäufung von Iohexol zeigen. Eine ROI innerhalb des Tumors Auswählen ergibt eine TIC , die unter Verwendung von Tracer kinetische Modellierungsmethoden quantifiziert werden können Schätzungen der Perfusion, Gefäßpermeabilität, Plasma - Volumenanteil und interstitielle Volumenanteil (1b) zu erhalten. In dieser Studie wurde ein Zwei-Kammer - Tracer kinetisches Modell in Matlab 14 eine nichtlineare Kurvenanpassungsroutine implementiert verwendet und Anpassung an die gemessenen TIC verwenden. Die Segmentierung des Tumorvolumens in mehrere Bereiche von Interesse gleicher Größe ermöglicht die Quantifizierung von Ter räumliche Verteilung der hämodynamischen Parameter innerhalb des Tumorvolumens (Abbildung 1c). Segmentierung kann entweder manuell durchgeführt werden, was zeitaufwendig und schwierig, oder automatisch, wie hier ausgeführt unter Verwendung eines Algorithmus, der den Tumor in mehrere gleich große ROIs teilt unter Verwendung eines sphärischen Koordinatensystems. Die DCE-CT-Verfahren liefern quantitative Abschätzungen der räumlichen Verteilung der Perfusion, Gefäßpermeabilität, Plasma-Volumenanteil und interstitielle Volumenanteil. Diese Parameter wurden beobachtet mit einem höheren Perfusion räumlich heterogen zu sein, Plasma und interstitielle Volumenfraktionen entlang der Peripherie gegenüber dem mittleren Tumorvolumen.
Die volumetrischen CT - Bildgebungsverfahren zeigt die biologische Verteilung und intratumorale Verteilung von CT-Liposomen. Abbildung 2a die Bioverteilung von CT-Liposomen bei 48 Stunden nach der Injektion zeigt. Das Mittel wird immer noch im Umlauf in thGefäßsystem e, mit erheblichen Aufnahme in der Milz und in der Leber beobachtet. Die intratumorale Anreicherung von CT-Liposomen beobachtet wurde heterogen sein, wobei überwiegend peripher Akkumulation im Vergleich zu der Mitte, wie durch die hellen Bereiche innerhalb des Tumorvolumens (2b) bezeichnet.
Volumetric CT - Bildgebung kann verwendet werden , die Position der IFP - Messungen zu verfolgen mit machte die CT-IFP Roboter - Setup. 3a zeigt die Platzierung der IFP Nadel innerhalb des Volumens Tumor abgebildet mittels hochauflösender Mikro-CT. Die Nadel kann eindeutig innerhalb des Tumorvolumens identifiziert werden , so dass für die räumliche Lokalisierung der IFP Messungen innerhalb des Tumorvolumens (Abbildung 3b). Es ist möglich, eine räumliche Karte von IFP im gesamten Tumor zu erzeugen, indem mehrere IFP Messungen innerhalb des Tumorvolumens durchführt. Die räumliche IFP können dann mit den entsprechenden Messungen korreliert werdenTumormikrozirkulation und CT-Liposom-Akkumulation.
Volumetrischen CT - Bildgebung für einen gemeinsamen Referenzrahmen ermöglicht die es ermöglichen , Messungen der Hämodynamik zusammenzuwirken lokalisieren, IFP, und CT-Liposom - Akkumulation dar. 4 zeigt ein Beispiel für räumlich co-lokalisiert Messungen der CT-Liposom - Akkumulation, IFP, Perfusion, Gefäßpermeabilität, Plasma-Volumenanteil und interstitielle Volumenanteil. Es war diese Perfusion und der Plasmavolumenanteil beobachtet wurde signifikant mit der intratumoralen Anreicherung von CT-Liposomen in subkutanen MDA-MB-231-Tumoren korreliert. Außerdem korreliert die radiale Verteilung von IFP mit hämodynamische Messungen. Diese Ergebnisse legen nahe , eine komplexe raum-zeitliche Beziehung besteht zwischen der Tumormikrozirkulation, IFP und der intratumoralen Anreicherung von Liposomen 14.
Abbildung 1: DCE-CT - Bildgebung des Tumormikrozirkulation (a) Eine repräsentative Reihe von zeitlichen CT - Bilder innerhalb des Tumorvolumens gesammelt, die Kontrastmittel - Kinetik als Funktion der Zeit darstellt.. Die rote Kontur stellt einen ROI, wo die Zeitintensitätskurve (TIC) gemessen wird. (B) Das TIC ist fit ein Zweifach - Tracer kinetisches Modell mit quantitativen Schätzungen der hämodynamischen Parameter innerhalb des ROI zu erzielen. (C) Repräsentative räumliche Verteilung der quantitativen hämodynamischen Parameter in den Tumor. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Volumetric CT-Bildgebung von Liposome Accumul ation. (a) Eine repräsentative 3D - Volumen-gerenderten Bild der biologischen Verteilung von CT-Liposomen zu demonstrieren. (B) Repräsentative axialen, koronalen und sagittalen durch das Zentrum des Tumors entnommen Scheiben der intratumoralen Anreicherung von CT-Liposomen bei 48 Stunden nach der Injektion zeigt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3:. Das Bild Geführte IFP Messungen (a) Eine repräsentative 3D - Volumen-gerenderten Bild des CT-IFP Robotersystem (grün) nach Einführen der Nadel in einen subkutanen Tumor bei 48 Stunden nach der Injektion von CT-Liposomen (orange). (B) Ein Vertreter CT - Bild der post-Nadelung./54226/54226fig3large.jpg "Target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4:. Co-lokalisierten Messungen der Tumormikrozirkulation, IFP, und CT-Liposom - Akkumulation - Panel eine repräsentative räumliche Co-Lokalisation von CT-Liposom - Ansammlung genommen 48 Stunden nach der Injektion, IFP, Perfusion, vaskuläre Permeabilität, Plasma - Volumenanteil zeigt , und interstitielle Volumenanteil. Re-Print mit freundlicher Genehmigung von 14. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Die Verfahren zur bildbasierten Messung ermöglichen hierin präsentierten Bestimmung der räumlichen Verteilung der Tumormikro Eigenschaften, IFP, und CT-Liposom-Akkumulation. Frühere Versuche , diese Eigenschaften zu beziehen sind auf die Durchführung Massenmessungen über mehrere tumortragenden Tiere verlassen und fehlt daher die Empfindlichkeit Mechanismen für die Heterogenität der intratumoralen Anreicherung verantwortlich zu erläutern , die für die Nanogröße Drug - Delivery - Systemen beobachtet hat 15 gemeinsam ist. DCE-CT ein Werkzeug liefert die intratumorale Variationen in den Eigenschaften des Tumors die Mikrozirkulation, volumetrischen CT liefert eine genaue Darstellung der CT-Liposomen Abscheidekinetik und das CT-IFP Robotersystem stellt ein Werkzeug zur Durchführung räumliche Zuordnung von IFP zu messen das gleiche Tier. Darüber hinaus ist DCE-CT-Bildgebung eine klinisch bewährte Methode zur Tumor Hämodynamik in der klinischen Einstellung Messung, so dass die Ergebnisse dieser Studie möglicherweise klinisch translein Tisch.
Angesichts der Komplexität der Messungen gibt es mehrere kritische Faktoren, die die Sammlung von robuster Datensätzen zu gewährleisten. DCE-CT basierte Quantifizierung der Tumormikrozirkulation ist wohl der am schwierigsten zu genauen Schätzungen von Tumor Hämodynamik gewährleisten. Es erfordert TICs mit hohem Signal - Rausch - Verhältnisse (SNR) und unter Verwendung eines robusten Anpassungsalgorithmus zu quantifizieren , die Tics 16,17 zu erhalten. Visuelle Inspektion von Tics können verwendet werden, um niedrige SNR-Daten aus der Analyse zu entfernen. Außerdem, wenn man nicht aufpaßt ist dann der Einbau von hohen SNR TICs kann auch 16 bis fehlerhafte Schätzungen der Tumorperfusion, vaskuläre Permeabilität, Plasma - Volumenanteil und interstitielle Volumenanteil führen. Um Modell unabhängige Schätzungen des Plasmas und interstitielle Volumenanteile zu maximieren wurde Quantifizierung Genauigkeit eine Strategie zu erhalten, eingesetzt, die als feste Parameter während der Modellanpassung der gemessenen TICs anschließend verwendet werden. Diese Methodesorgt für robuste Schätzungen der Tumorperfusion und vaskuläre Permeabilität 15 erhalten werden.
Robuste Analyse der intratumoralen Verteilung von CT-Liposomen erfordert nach ausreichender Akkumulation des Mittels volumetrischen CT-Bildgebung durchgeführt wird. Aus früheren Studien, tritt der Spitzentumor Anhäufung von CT-Liposomen zwischen 48 bis 72 Stunden in Maus - Xenotransplantaten 3,15. Weiterhin besteht eine lineare Beziehung zwischen den CT-Liposom - Konzentration und die Kontrastverstärkung bei der CT - Bildgebung ermöglicht eine einfache Quantifizierung der Variationen in intratumorale Anhäufung von CT-Liposomen 15.
Genaue Messungen der IFP die Nadel Basiertes Verfahren erfordern eine gute Fluidverbindung zwischen dem Katheter und dem Gewebe verwendet. Darüber hinaus ist es wichtig, nur den Einsatz Tumoren, die hohe zentralen Tumor IFP (> 5 bis 10 mmHg), sonst wird es in IFP minimalen räumlichen Variationen sein. Räumliche Messungen von IFP mit dem CT-IFP robot systemcan aufgrund von Gewebebewegung durch Einführen der Nadel verursacht eine Herausforderung sein. Imaging vor und nach der Nadel Platzierung ist entscheidend für genau die Nadelplatzierung identifiziert; jedoch kann es schwierig sein, die Position zwischen nachfolgenden Nadelplatzierungen beziehen aufgrund von Gewebe Verwerfungen zwischen den Messungen. Es wurde nach dem Zufallsprinzip die Wahl Nadelpositionen führt zu einer signifikanten Gewebe Verformung während des Einstich gefunden. Als Ergebnis bereitgestellt diese Methode die am wenigsten genaue räumliche Zuordnung von IFP. Im Gegensatz dazu über das Tumorvolumen entlang einer linearen Spur Messungen durchgeführt werden und die Nadel tangential zur Spur Einsetzen kann die räumliche Genauigkeit von IFP-Messungen zu verbessern. Einsetzen der Nadel tangential zu der Spur minimiert die Auswirkungen von Gewebeverformung entlang der Messspurrichtung.
Diese Studie zeigte die Fähigkeit, die räumliche Verteilung der Tumormikrozirkulation, IFP und CT-Liposom-Akkumulation in einem einzelnen Tumor zu messen. Nachdem diese Techniken zu beherrschen, ist es dann möglich, diese Messungen selbständig durchzuführen oder zusammen, um den Tumor-Mikroumgebung und seine Auswirkungen auf die Arzneimittelabgabe zu charakterisieren. Unter Verwendung dieser Verfahren in der MDA-MB-231 - Modell Brust Xenotransplantat ergab , dass die Perfusion und Plasmavolumenanteil sind starke Mediatoren der intratumoralen Verteilung von Liposomen 14. Es wurde nicht als eine starke Beziehung zwischen IFP und Liposom-Verteilung gefunden. Allerdings wurde IFP Messungen der Tumorperfusion stark korreliert, was darauf hindeutet, dass das IFP eine indirekte Rolle bei der Vermittlung der Liposomen Verteilung durch Modulation des Blutflusses spielen kann.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MDA-MB-231 metastatic breast adenocarcinoma tumor cells | ATCC | HTB-26 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F1051 | |
| HyClone Penicillin-Streptomycin 100x Solution | GE Healthcare Life Sciences | SV30010 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300-054 | |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) | Avanti Lipids Inc., USA | 850355P | |
| Cholesterol (CH) | Avanti Lipids Inc., USA | 700000P | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-poly(ethylene glycol) 2000 (DSPE-PEG2000) | Avanti Lipids Inc., USA | 880128P | |
| Omnipaque (Iohexol) 300 mg of iodine/ml | GE Healthcare, CA | ||
| 80 nm pore size Track-Etch polycarbonate membranes | Whatman Inc., USA | ||
| 200 nm pore size Track-Etch polycarbonate membranes | Whatman Inc., USA | ||
| 10 m Lipex Extruder | Nothern Lipids Inc, CA | ||
| Dialysis Bag Molecular Weight Cut Off (MWCO) of 8 kDa | Spectrum Labs, USA | ||
| 750,000 Nomical Molecular Weight Cut Off (NMWC) Tangential flow column | MidGee ultrafiltration cartridge, GE Healthcare, CA | ||
| Peristaltic pump | Watson Marlow Inc., USA | ||
| UV spectrometer | Helios γ, Spectronic Unicam, USA | ||
| 90Plus particle size analyzer | Brookhaven, Holtsville, USA | ||
| eXplore Locus Ultra micro-CT system | GE Healthcare, CA | Manipulated using CT-Console Software | |
| AxRecon GPU-based Reconstruction | Acceleware Corp. CA | ||
| 27 G Catheter SURFLO Winged Infusion Set | Terumo Medical Products, USA | SV*27EL | |
| PE20 polyethylyne tubing | Becton Dickinson, USA | 427406 | |
| Pen tip 25 G × 3.5′′ Whitacre spinal needle | Becton Dickinson, USA | 405140 | IFP needle |
| P23XL pressure transducer | Harvard Apparatus, CA | P23XL | |
| PowerLab 4/35, Bridge Amp, with LabChart Pro 7.0 | ADInstruments Pty Ltd., USA | PL3504, FE221 | IFP acquisition system and acquisition software |
| CT-Sabre Small Animall Intervention system (CT-IFP Robot) | Parallax Innovations, CA | Manipulated using CT-IFP robot Control Software | |
| CT-IFP robot alignment software | Custom Matlab software | ||
| DCE-CT Analysis Software | Custom Matlab software | ||
| Matlab 2013b | Mathworks, USA |
References
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