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Medicine

छिड़काव के स्थानिक मापन, मध्य द्रव दबाव और ठोस ट्यूमर में Liposomes संचय

Published: August 18, 2016 doi: 10.3791/54226
Automatic Translation
1,2,3, 2, 3,4, 2,4,5, 1,2,3,4,5,6
1Department of Medical Biophysics, University of Toronto, 2Leslie Dan Faculty of Pharmacy, University of Toronto, 3STTARR Innovation Centre, Princess Margaret Cancer Centre, 4Institute of Biomaterials and Biomedical Engineering, University of Toronto, 5Techna Institute, University Health Network, 6Radiation Medicine Program, Princess Margaret Cancer Centre

Abstract

liposomes की विषम इंट्रा-tumoral संचय उनकी प्रभावकारिता का एक महत्वपूर्ण निर्धारक है। दोनों अराजक ट्यूमर microcirculation और IFP बुलंद ऐसे liposomes के रूप में नैनो आधारित दवा वितरण प्रणाली की विषम इंट्रा-tumoral वितरण से जुड़ी हैं। वर्तमान अध्ययन में, ट्यूमर microcirculation, ऊंचा IFP, और नैनोकणों के संचय के बीच संबंधों में विवो प्रयोगों के माध्यम से जांच की गई। इस बढ़ाकर गणना टोमोग्राफी (डीसीई सीटी) गतिशील विपरीत और सूक्ष्म सीटी स्कैनर से जुड़ा एक उपन्यास छवि निर्देशित रोबोट सुई स्थापन प्रणाली का उपयोग कर ट्यूमर IFP के माप का उपयोग कर ट्यूमर microcirculation के मूल्यांकन के द्वारा पूरा किया गया। liposomes की इंट्रा-tumoral संचय एक nanoparticle लिपोसोमल सूत्रीकरण कि स्थिरतापूर्वक विपरीत एजेंट iohexol (सीटी-liposomes) encapsulate की सीटी छवि के आधार पर मूल्यांकन द्वारा निर्धारित किया गया था। सीटी इमेजिंग के स्थानिक वितरण के सह स्थानीयकरण के लिए अनुमति दीट्यूमर hemodynamics, IFP और स्तन कैंसर के एक व्यक्ति के चमड़े के नीचे जेनोग्राफ्ट माउस मॉडल में सीटी-liposome संचय। माप खोज की है कि छिड़काव और प्लाज्मा मात्रा अंश liposomes की इंट्रा-tumoral वितरण के मजबूत मध्यस्थों हैं करने के लिए नेतृत्व किया। इसके अलावा, परिणामों का सुझाव IFP रक्त के प्रवाह को नियमन के माध्यम से liposome वितरण मध्यस्थता में एक अप्रत्यक्ष भूमिका निभाता है।

Introduction

मापने nanoparticle दवा वितरण प्रणाली की इंट्रा-tumoral संचय निर्धारित करने के लिए यदि साइटोटोक्सिक दवा की पर्याप्त एकाग्रता ट्यूमर के भीतर हासिल किया गया एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान कर सकता है। "छवि-सक्षम" लिपोसोमल प्रणालियों के विकास के गैर इनवेसिव और मात्रात्मक के लिए अनुमति देता है इन विवो दवा वितरण ऐसे पोजीट्रान एमिशन टोमोग्राफी (पीईटी) 1, ऑप्टिकल प्रतिदीप्ति 2, और गणना टोमोग्राफी (सीटी) 3 के रूप में इमेजिंग तौर तरीकों का उपयोग कर वाहन का पता लगाने, 4 और चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) 5। इमेजिंग फार्माकोकाइनेटिक्स और liposome वितरण प्रणाली के biodistribution निर्धारित करने के लिए और nanoparticle संचय 6.7 में अंतर-विषय और इंट्रा-tumoral विविधता की हद तक प्रकट करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, नैनोकणों के इमेजिंग अकेले जैविक बाधाओं कि उनके गरीब संचय और वितरण के लिए योगदान की पहचान नहीं है। यह ज्ञान आर लिए सर्वोपरि हैअधिक प्रभावशाली योगों के ational विकास, और रणनीतियों इंट्रा-tumoral संचय 8 में सुधार होगा। यह दिखा दिया है कि चिकित्सीय रणनीतियों में सुधार nanoparticle परिवहन 9 में जिसके परिणामस्वरूप विशिष्ट जैविक बाधाओं को व्यवस्थित करने के लिए लागू किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, nanoparticle योगों विशेष रूप से विशिष्ट जैविक परिवहन बाधा दूर करने के लिए 10 विकसित किया गया है। दोनों स्थितियों में, जैविक बाधाओं के मापन के लिए एक उपयुक्त nanoparticle दवा वितरण रणनीति के उपयोग के मार्गदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

ट्यूमर microcirculation में और ऊंचा IFP ऐसे liposomes के रूप में नैनोकणों के इंट्रा-tumoral संचय के दो प्रमुख निर्धारकों, ठोस ट्यूमर 9,11 में, माना जाता है। हालांकि, अन्य बाधाओं कि गरीब liposome संचय के लिए योगदान करने के लिए एक घने बाह्य मैट्रिक्स, अभेद्य वाहिका, और ठोस ऊतक दबाव 12 में शामिल हैं। इन बाधाओं एक स्थानिक-सामयिक में संबंधित हैंढंग से, असामान्य रक्त प्रवाह और ऊंचा मध्य द्रव दबाव जा रहा है दो महत्वपूर्ण नैनोकणों के प्रारंभिक वितरण और परिस्त्राव ड्राइविंग कारकों के साथ। पहले चर्चा की, ट्यूमर microcirculation, ऊंचा IFP, और liposomes की इंट्रा-tumoral संचय के बीच संबंध स्थापित करने liposome इमेजिंग डेटा की उचित व्याख्या के लिए आवश्यक है। इस के साथ साथ मात्रात्मक तरीकों में एक ठोस ट्यूमर में ट्यूमर microcirculation, ऊंचा IFP, और nanoparticle संचय के बीच के रिश्ते को मापने के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं। यह बड़ा सीटी इमेजिंग, ट्यूमर microcirculation का उपयोग कर गतिशील विपरीत बढ़ाया गणना टोमोग्राफी इमेजिंग का उपयोग कर एक सीटी liposome विपरीत एजेंट की इंट्रा-tumoral वितरण के सह स्थानीय माप प्रदर्शन करके पूरा किया है, और ट्यूमर, एक छवि निर्देशित रोबोट सुई पोजीशनिंग सिस्टम का उपयोग कर IFP करार दिया सीटी-IFP रोबोट 13।

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Protocol

सभी विवो प्रयोगों एक प्रोटोकॉल विश्वविद्यालय के स्वास्थ्य नेटवर्क संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित के तहत प्रदर्शन किया गया।

1. पशु मॉडल

  1. DMEM में 5 से 7 एक्स 10 6 एमडीए MB-231 के लिए स्तन ग्रंथिकर्कटता ट्यूमर कोशिकाओं को एक साथ 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन की 100x कमजोर पड़ने के साथ के बीच संस्कृति।
  2. हार्वेस्ट कोशिकाओं वे 80% एक 0.05% trypsin EDTA समाधान का उपयोग कर रहे हैं, जब मिला हुआ। 3-5 मिनट के बाद DMEM के एक 3x मात्रा के साथ बेअसर trypsin-EDTA। कोशिकाओं के एक 15 μl विभाज्य ले लो और एक hemocytometer का उपयोग गिनती। 200 XG पर 5 मिनट के लिए एक गोली में अपकेंद्रित्र कोशिकाओं, और एचबीएस में मिलीलीटर प्रति 10 x 10 6 कोशिकाओं की एकाग्रता में फिर से निलंबित।
  3. प्रत्यारोपण चमड़े के नीचे (अनुसूचित जाति) प्रत्येक 8 से 12 सप्ताह की महिला एस.सी.आई.डी माउस के हिंद अंग में 1 से 2 x 10 6 कोशिकाओं इंजेक्शन द्वारा ट्यूमर (एन = 5)। इंजेक्शन के लिए एक मानक 25 जी सुई का प्रयोग करें।
  4. मॉनिटर टीumor विकास का उपयोग कर नली का व्यास (आयतन = 0.5 x लंबाई x चौड़ाई 2) और माप शुरू एक बार अनुसूचित जाति ट्यूमर एक मात्रा> 200 मिमी 3 (लगभग 7 से 9 दिन) पर पहुंच गया है।

2. सीटी-liposome तैयारी और विशेषता

  1. liposome तैयारी
    1. , सीटी-liposomes के लिए लिपिड घटकों (200 mmol / एल) भंग 1,2-dipalmitoyl-एस.एन.-glycero-3-phosphocholine (DPPC), कोलेस्ट्रॉल (स्विस), और 1,2-distearoyl-एस.एन.-glycero -3 सहित 70 डिग्री सेल्सियस पर -phosphoethanolamine-एन-पाली (एथिलीन ग्लाइकोल) 2000 (डीएसपीई-PEG2000) निर्जल इथेनॉल में 55 की एक दाढ़ अनुपात में: 40: 5 DPPC: सीएच: डीएसपीई-PEG2000।
    2. 70 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी बनाए रखने के द्वारा इथेनॉल लुप्त हो जाना, तो समाधान के लिए सीटी विपरीत एजेंट iohexol (आयोडीन की 300 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ने ऐसी है कि अंतिम लिपिड एकाग्रता 100 मिमी है।
    3. लगातार vortexing के साथ 4 घंटे के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर समाधान को बनाए रखें।
    4. unilamellar पुटिकाओं प्राप्त करने के लिए, बाहर निकालना नमूना 5 टिमदो के माध्यम से तों 250 साई के दबाव में खड़ी 200 एनएम ताकना आकार झिल्ली और फिर से एक 10 मिलीलीटर लिपिड बाहर निकालना का उपयोग कर 400 साई में दो खड़ी 80 एनएम ताकना आकार झिल्ली के माध्यम से 5 चक्रों से बाहर निकालना। प्रत्येक बाहर निकालना चक्र की शुरुआत में extruder में liposomes की 10 मिलीलीटर की एक मात्रा पिपेट और प्रत्येक चक्र के बाद बाहर निकालना एक बाँझ शंक्वाकार ट्यूब या कांच की शीशी में इकट्ठा।
    5. एक 100 केडीए आणविक वजन काट (MWC) 0.02 मिमी HEPES बफर नमकीन घोल (एचबीएस, 7.4 पीएच) के एक 250 गुना मात्रा अतिरिक्त खिलाफ डायलिसिस बैग का उपयोग डायलिसिस के 16 घंटा करके संयुक्त राष्ट्र समझाया iohexol निकालें। उदाहरण के लिए, एक बीकर में बैग के बाहर एचबीएस के 250 मिलीलीटर के साथ डायलिसिस बैग के अंदर liposome समाधान के 1 मिलीलीटर जगह है।
    6. ध्यान लगाओ निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक 750,000 nomical MWC वाणिज्यिक स्पर्शरेखा प्रवाह प्रणाली का उपयोग करते हुए सीटी-liposomes। लगभग 55 मिलीग्राम मिलीलीटर की एक अंतिम आयोडीन एकाग्रता के लिए ध्यान देना -1।
  2. liposome विशेषता
    1. Ioxehol जारी है और फिर विआयनीकृत पानी की एक 100 गुना मात्रा अतिरिक्त का उपयोग कर कमजोर करने के लिए इथेनॉल के 10 गुना मात्रा अतिरिक्त का उपयोग कर सीटी-liposomes फटने से encapsulation क्षमता को मापने (liposomes की यानी 10 μl इथेनॉल के 100 μl और फिर पतला का उपयोग कर उठी 10 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा के लिए)।
    2. iohexol एकाग्रता का निर्धारण 245 एनएम के तरंग दैर्ध्य में पता लगाने के साथ एक यूवी स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग कर। एजेंट की राशि के लिए जारी किया iohexol एजेंट के अनुपात से राशि लेने के द्वारा encapsulations दक्षता की गणना की तैयारी के दौरान जोड़ा गया है।
    3. hydrodynamic व्यास और जीटा क्षमता को मापने के निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक गतिशील प्रकाश बिखरने कण आकार विश्लेषक प्रणाली का उपयोग करते हुए। माप की सुविधा के लिए विआयनीकृत पानी में (अंतिम मात्रा के 1 मिलीलीटर में यानी 5 liposome की μl) 200x द्वारा सीटी-liposome समाधान पतला।

3. ट्यूमर microcirculation और सीटी-liposome की सीटी इमेजिंगवितरण

नोट: यदि विभिन्न सॉफ्टवेयर संस्करण या उपकरणों का इस्तेमाल किया जाता है एक बड़ा स्कैन प्रदर्शन करने के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें।

  1. 2% isoflurane चिकित्सा हवा या ऑक्सीजन के साथ मिश्रित उपयोग कर प्रत्येक माउस anesthetize और पैर की अंगुली बन्द रखो और कोई प्रतिक्रिया को देख कर इस बात की पुष्टि। आंखों को मरहम लागू जबकि संज्ञाहरण के तहत सूखापन को रोकने के लिए। एक पतली प्लास्टिक बोर्ड के लिए पंजे टेप से एक प्रवण स्थिति में पशु स्थिर।
  2. एक कस्टम 27 जी कैथेटर, PE10 ट्यूबिंग पर 20 सेमी से जुड़े प्लेस, पार्श्व पूंछ नस में और टेप के कई टुकड़े के साथ जगह में सुरक्षित है।
  3. सीटी-liposomes की कम से कम 200 μl को रोकने के लिए एक 1 मिलीलीटर सिरिंज तैयार करें। कैथेटर फ्लश करने के लिए उपयोग करने के नमक के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज तैयार करें। (: मात्रा से 1 के अनुपात 9) अंत में, मुक्त iohexol नमक के साथ मिश्रित की कम से कम 150 μl के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज तैयार करते हैं।
  4. माउस सूक्ष्म सीटी स्कैनर बिस्तर पर प्रवण रखें। Tumo जगह के लिए लेजर पोजीशनिंग सिस्टम का प्रयोग करेंप्रत्येक स्कैन के लिए लगभग एक ही ओरिएंटेशन में आर।
  5. एक सिरिंज पंप में सीटी-liposome सिरिंज रखें और सिरिंज के लिए कैथेटर देते हैं। प्रति सेकंड 10 μl के पंप दर निर्धारित करें।
  6. सीटी स्कैनर सांत्वना सॉफ्टवेयर का उपयोग कर एक उज्ज्वल अंधेरे अंशांकन स्कैन प्रदर्शन से प्रणाली को आरंभ। ब्याज की प्रत्येक इमेजिंग प्रोटोकॉल के लिए उज्ज्वल अंधेरे स्कैन विकल्प का चयन करें, ड्रॉप डाउन मेनू से उज्ज्वल अंधेरे का चयन करें और अंशांकन आरंभ करने के लिए बटन स्कैन दबाएँ।
  7. ट्यूमर किसी भी विपरीत एजेंट इंजेक्शन से पहले का एक बड़ा संरचनात्मक सूक्ष्म सीटी प्रदर्शन करना। सीटी स्कैनर सॉफ्टवेयर सांत्वना सूचक को देखो सीटी स्कैनर सुरक्षा इंटरलॉक साफ हो गया है सुनिश्चित करने के लिए। सीटी स्कैनर सांत्वना का चयन स्कैन पर 80 केवी, 70 मा की एक ट्यूब वर्तमान का एक्स-रे ऊर्जा का चयन करें, और अधिक से अधिक समय 16 सेकंड 1,000 छवि के अनुमानों को दर्शाता है। बटन स्कैन स्कैन आरंभ करने के लिए दबाएँ।
  8. 400 मिलीग्राम आयोडीन किलो की एकाग्रता में सीटी-liposomes की एक सांस में इंजेक्षन करने के लिए सिरिंज पंप का प्रयोग करें-1। लगभग 150 μl (एक 25 ग्राम माउस संभालने) की एक मात्रा इंजेक्षन करने के लिए पंप सेट करें। पंप इंजेक्षन करने पर 'आरंभ' बटन दबाएँ। मैन्युअल खारा के 50 μl (दो बार कैथेटर की मात्रा) के साथ कैथेटर फ्लश पूरे एजेंट राशि इंजेक्ट किया गया था सुनिश्चित करने के लिए और कैथेटर स्पष्ट है।
  9. सीटी-liposomes के इंजेक्शन के बाद 10 मिनट तक प्रतीक्षा करें और फिर एक ही तरीका है और सेटिंग्स 3.5 में वर्णित का उपयोग कर एक दूसरे संरचनात्मक स्कैन प्रदर्शन करते हैं।
  10. (: मात्रा से 1 के अनुपात 9) एक ही इंजेक्शन दर 3.3 में वर्णित सेटिंग का उपयोग कर मुक्त iohexol नमक के साथ मिश्रित के 100 μl की एक मात्रा इंजेक्षन करने के लिए सिरिंज पंप की स्थापना करके एक डीसीई सीटी स्कैन करते हैं।
    1. सीटी स्कैनर कंसोल पर 80 केवी, 90mA की एक ट्यूब ऊर्जा का एक्स-रे ऊर्जा सेटिंग का उपयोग करता है, और पहली बार 30 सेकंड के लिए 416 की छवि अनुमानों हर सेकंड कब्जा है और पीछा किया एक अधिग्रहण हर 10 सेकंड से 5 मिनट के गतिशील स्कैन का चयन । डीसीई सीटी डेटा के 5 सेकंड पर कब्जा है और उसके बाद injectio पर शुरू बटन दबाएँn पंप।
    2. डीसीई सीटी स्कैन करने के बाद एक बड़ा संरचनात्मक सूक्ष्म सीटी स्कैन करते हैं।
  11. सीटी-liposomes की 48 और 72 घंटा के बाद इंजेक्शन के बीच शारीरिक सीटी छवियों पर कब्जा, कदम 3.5 में वर्णित के रूप में एक ही बड़ा सीटी सेटिंग्स का उपयोग।
  12. GPU-पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर संरचनात्मक सीटी और डी सी इ-सीटी डेटा के पुनर्निर्माण।
    1. पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर में छवि को लोड। छवि पर एक रॉय ड्राइंग एक माउस का उपयोग करके खंगाला जा के हित के लिए क्षेत्र का चयन करें। बचाने के लिए स्थान और खंगाला imaged फ़ाइल नाम सेट और '.mat' के रूप में आउटपुट फ़ाइल प्रकार का चयन करें।
      नोट: सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से शारीरिक स्कैन के लिए 0.153 x 0.153 x 0.153 मिमी 3 को खंगाला voxel आकार की स्थापना की जाएगी और 0.153 x 0.153 x 0.462 मिमी डीसीई सीटी स्कैन के लिए 3। 'पुनर्निर्माण शुरू' बटन पर क्लिक करें।
  13. गणना करने के लिए पूर्व इंजेक्शन और सीटी-liposome के 10 मिनट के बाद इंजेक्शन स्कैन का उपयोगप्लाज्मा मात्रा अंश के रूप में पहले 3 में वर्णित है। इसके अलावा, जैसा कि पहले 7 वर्णित मध्य मात्रा अंश गणना करने के लिए पूर्व इंजेक्शन और 5 मिनट के iohexol के बाद इंजेक्शन स्कैन का उपयोग करें।
  14. सॉफ्टवेयर है कि ट्यूमर मात्रा के भीतर ब्याज (आरओआई) के एक क्षेत्र की पहचान करने की क्षमता प्रदान में डीसीई सीटी डेटा आयात करके समय तीव्रता घटता (tics) प्राप्त करते हैं। फिर समय के एक समारोह के रूप में लागत पर लाभ में वृद्धि का मतलब सीटी की गणना। इस प्रयोग में कस्टम सॉफ्टवेयर एक रॉय की पहचान करने और घरेलू गणना करने के लिए विकसित किया गया था।
  15. मापा tics ढाले एक दो डिब्बे दरियाफ्त गतिज मॉडल का उपयोग करके छिड़काव और संवहनी पारगम्यता के मात्रात्मक अनुमान प्राप्त करते हैं। फिटिंग डीसीई सीटी विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग किया जा सकता है और दो डिब्बे दरियाफ्त गतिज मॉडल में तय मानकों के रूप में प्लाज्मा मात्रा अंश का apriori का अनुमान है और मध्य मात्रा भिन्न का उपयोग करें। प्लाज्म का apriori अनुमान प्राप्त करने के लिए पहले से सूचना दी विधियों का प्रयोग करेंएक और मध्य मात्रा भिन्न 14।

4. ट्यूमर मध्य द्रव दबाव के स्थानिक मापन

  1. मापने के लिए IFP PE20 पॉलीथीन ट्यूबिंग के 50 सेमी के माध्यम से दबाव transducer और IFP अधिग्रहण प्रणाली के लिए 25 जी रीढ़ की हड्डी में सुई कनेक्ट। एक हेपरिन सल्फेट / खारा समाधान (1:10) के साथ पूरे सिस्टम फ्लश। उपयोग करने से पहले 70% isopropyl के साथ सुई जीवाणुरहित।
  2. अधिग्रहण प्रणाली को चालू करें और IFP अधिग्रहण सॉफ्टवेयर शुरू करने और एमएमएचजी में IFP माप प्राप्त करने के लिए प्रणाली जांचना करने के लिए सेटिंग्स फ़ाइलों को लोड। लगातार IFP डेटा एकत्र करने के लिए अधिग्रहण बटन पर क्लिक करें।
  3. तरीकों 4.8 में वर्णित का उपयोग कर, सीटी-liposomes की 48 और 72 घंटा के बाद इंजेक्शन के बीच IFP माप (इस ट्यूमर में सीटी-liposomes की चोटी संचय की अनुमानित समय से मेल खाती है) प्रदर्शन करना। सीटी-IFP रोबोट को IFP सुई संलग्न।
  4. के लिए समन्वय स्थापित प्रणालियों के लिए पंक्ति में अंशांकन स्कैन प्रदर्शनसीटी-IFP रोबोट और सीटी स्कैनर। सीटी-IFP रोबोट को असंदिग्ध मार्कर लगाव जोड़े और चार अलग अलग स्थितियों में असंदिग्ध मार्कर के साथ एक चार बड़ा सीटी स्कैन प्रदर्शन करते हैं।
    1. , सीटी-IFP रोबोट नियंत्रक सॉफ्टवेयर लॉन्च रोबोट प्रारंभ, और एक्स, वाई, जेड को निशाना पदों में प्रवेश करने और 'जाना' बटन पर क्लिक करके तीन पदों के लिए रोबोट ले।
    2. पर निम्न एक्स एक सीटी स्कैन ले लो, वाई, जेड निर्देशांक: (1) 0,0,0; (2) -10,0,0; (3) 0,7,0; और (4) 0,0,10। एक 90 केवी, 10 मा, 16 सेकंड स्कैन सीटी स्कैनर सॉफ्टवेयर और प्रेस 'आरंभ' का उपयोग आरंभ करने के लिए स्कैन का चयन करें। 3.10 में वर्णित के रूप में स्कैन पुनर्निर्माण किया।
  5. सीटी-IFP रोबोट संरेखण सॉफ्टवेयर लॉन्च। 'जोड़ें' बटन 'पंजीकरण के आंकड़ों को' क्षेत्र में लोड क्लिक करें और 4.3 में प्राप्त चार खंगाला पंजीकरण स्कैन का चयन करें, तो क्लिक करें 'ओपन'।
    नोट: असंदिग्ध मार्कर के पिक्सेल स्थान स्वचालित रूप से Softwa में दर्ज किया जाएगाफिर से।
    1. 'गणना रूपांतरण' बटन पर क्लिक करें और फिर 'रूपांतरण लागू करें' बटन पर क्लिक करें। इस संरेखण डेटा कि सीटी-IFP रोबोट सीटी स्कैनर के लिए समन्वय प्रणाली समन्वय प्रणाली परिवर्तित करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा उत्पन्न करता है। अंशांकन के बाद पूरा हो, सीटी-IFP रोबोट के लिए पशु मंच देते हैं।
  6. 2% isoflurane चिकित्सा हवा या ऑक्सीजन के साथ मिश्रित उपयोग कर प्रत्येक माउस anesthetize और पैर की अंगुली बन्द रखो और कोई प्रतिक्रिया को देख कर इस बात की पुष्टि। सीटी-IFP रोबोट मंच पर पशु स्थिर करना और माउस की स्थिति ऐसी है कि ट्यूमर सीटी-IFP रोबोट प्रणाली के लिए सुलभ है। ट्यूमर टेप ऐसी है कि यह IFP सुई प्रविष्टि के दौरान कदम नहीं करता है का उपयोग कर स्थिर।
  7. एक शारीरिक सूक्ष्म सीटी स्कैन IFP सुई डालने से पहले प्रदर्शन करना। कदम 3.10 में वर्णित का उपयोग कर सीटी डेटा के पुनर्निर्माण।
  8. सीटी-IFP रोबोट संरेखण सॉफ्टवेयर में पूर्व सुई प्रविष्टि सीटी डेटा लोड। खिड़की और स्तर ट्यूमर कल्पना करने के लिए समायोजित करें। वें पर क्लिक करेंकिसी भी छवि में ट्यूमर की ई रिम, तो एक दूसरे रिम स्थान पर क्लिक करें।
    ध्यान दें: सॉफ्टवेयर दो स्थितियों के बीच एक रेखीय रेखा के साथ पदों की एक श्रृंखला की गणना करेगा। नोट एक्स, वाई और जेड सूची में से 5 से 8 समान स्थान पदों की एक श्रृंखला के लिए निर्देशांक।
  9. हेपरिन खारा समाधान के सम्मिलन से पहले साथ सुई निस्तब्धता द्वारा IFP प्रणाली तैयार करें।
  10. एक्स, वाई, जेड में पहली बार पूर्व निर्धारित सुई पदों में प्रवेश, सीटी-IFP रोबोट नियंत्रण सॉफ्टवेयर में और प्रेस चाल 'जाना' बटन के लिए इच्छित स्थान पर रोबोट ले जाने के लिए। ऊतक में सुई डालने के लिए 'सम्मिलित सुई' बटन पर क्लिक करें।
    1. डालने सुई IFP सुई और बन्द रखो और PE20 ट्यूबिंग रिहा द्वारा ऊतकों के बीच अच्छा तरल पदार्थ संचार सुनिश्चित करने, ध्यान देने योग्य बात है कि IFP माप बढ़ जाती है और IFP अधिग्रहण सॉफ्टवेयर पर पूर्व बन्द रखो के लिए मान देता है के बाद। माप है कि आधारभूत करने के लिए वापस नहीं है अस्वीकार।
  11. मोल एकसुई डाला साथ शारीरिक सीटी स्कैन, तो सीटी-IFP रोबोट नियंत्रण सॉफ्टवेयर पर 'वापस लेना सुई' बटन पर क्लिक ऊतक से सुई वापस लेना। किसी भी IFP माप जहां IFP मूल्य सुई की वापसी के बाद पूर्व सुई प्रविष्टि मूल्य को वापस नहीं करता है अस्वीकार। यह दर्शाता है सुई माप के दौरान भरा गया हो सकता है। दोहराएँ 4.8 प्रत्येक सुई की स्थिति के लिए 4.10 करने के लिए कदम।
  12. एक्स, वाई, जेड और ट्यूमर मात्रा सुई के बाद प्रविष्टि बड़ा सीटी स्कैन में पहचान के रूप में के द्रव्यमान का केंद्र के लिए सुई बंदरगाह रिश्तेदार के पदों की गणना के द्वारा ट्यूमर मात्रा के भीतर सुई की स्थिति का निर्धारण करते हैं।
  13. उनकी पिंजरे में जानवरों वापसी सभी मापन पूरा कर रहे हैं के बाद। जानवरों की पहुंच से बाहर छोड़ देते हैं, और उन्हें निरीक्षण करने के लिए ध्यान रखना जब तक होश आ गया है और वे स्टर्नल लेटना बनाए रखने में सक्षम नहीं हैं।

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Representative Results

ऊपर उल्लिखित प्रोटोकॉल iohexol की एक समझाया एकाग्रता के साथ सीटी-liposomes उपज चाहिए, liposome व्यास, और 55 मिलीग्राम मिलीलीटर -1 की क्षमता जीटा मतलब है, 91.8 ± 0.3 एनएम और -45.5 ± 2.5 एम वी, क्रमशः। चित्रा 1 ए प्रतिनिधि डीसीई सीटी इमेजिंग शामिल परिणाम, बड़ा डेटा है कि iohexol की इंट्रा-tumoral संचय में अस्थायी परिवर्तन दिखाने का एक समय श्रृंखला उपज। ट्यूमर के भीतर एक रॉय का चयन एक घरेलू कि छिड़काव, संवहनी पारगम्यता, प्लाज्मा मात्रा अंश, और मध्य मात्रा अंश (चित्रा 1 बी) के अनुमान को प्राप्त करने के दरियाफ्त गतिज मॉडलिंग तरीकों का उपयोग मात्रा निर्धारित किया जा सकता है अर्जित करता है। इस अध्ययन में, एक दो डिब्बे दरियाफ्त गतिज मॉडल का इस्तेमाल किया गया था और मापा टिक करने के लिए फिट एक गैर रेखीय वक्र ढाले दिनचर्या मैटलैब 14 में लागू इस्तेमाल करते हैं। समान आकार के हित के कई क्षेत्रों में ट्यूमर की मात्रा के आधार पर विभाजित टी की मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता हैवह ट्यूमर मात्रा (चित्रा -1 सी) के भीतर haemodynamic मापदंडों के वितरण स्थानिक। विभाजन जो समय लगता है और मुश्किल है तो स्वयं किया जा सकता है, या स्वचालित रूप से यहां प्रदर्शन के रूप में एक एल्गोरिथ्म है कि कई बराबर आकार ROIs में ट्यूमर बांटता है एक गोलाकार समन्वय प्रणाली का उपयोग कर का उपयोग कर। डीसीई सीटी तरीकों छिड़काव, संवहनी पारगम्यता, प्लाज्मा मात्रा अंश, और मध्य मात्रा अंश के स्थानिक वितरण की मात्रात्मक अनुमान प्रदान करते हैं। इन मानकों परिधि केंद्रीय ट्यूमर मात्रा की तुलना में साथ छिड़काव, प्लाज्मा और मध्य मात्रा भिन्न के उच्च स्तर के साथ स्थानिक विषम होने के लिए मनाया गया।

बड़ा सीटी इमेजिंग विधि biodistribution और सीटी-liposomes की इंट्रा-tumoral वितरण का पता चलता है। चित्रा 2A 48 घंटा के बाद इंजेक्शन पर सीटी-liposomes की biodistribution पता चलता है। एजेंट अभी भी वीं में घूम रहा हैई नाड़ी तंत्र, पर्याप्त तेज प्लीहा और यकृत में मनाया के साथ। के रूप में ट्यूमर मात्रा के भीतर उज्ज्वल क्षेत्रों से चिह्नित सीटी-liposomes की इंट्रा-tumoral संचय, केंद्र की तुलना में मुख्य रूप से परिधीय संचय के साथ विषम, होना करने के लिए मनाया गया (चित्रा 2 बी)।

बड़ा सीटी इमेजिंग IFP माप के स्थान सीटी-IFP रोबोट सेटअप का उपयोग किया जाता ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। चित्रा 3 ए ट्यूमर मात्रा के भीतर IFP सुई के स्थान से पता चलता उच्च संकल्प सूक्ष्म सीटी का उपयोग imaged के रूप में। सुई स्पष्ट रूप से ट्यूमर मात्रा ट्यूमर मात्रा के भीतर IFP माप के स्थानिक स्थानीयकरण के लिए अनुमति में पहचाना जा सकता है (चित्रा 3 बी)। यह ट्यूमर मात्रा के भीतर कई IFP माप प्रदर्शन द्वारा ट्यूमर भर IFP की एक स्थानिक नक्शा उत्पन्न करने के लिए संभव है। स्थानिक IFP तो की इसी माप के साथ सहसंबद्ध किया जा सकताट्यूमर microcirculation और सीटी-liposome संचय।

बड़ा सीटी इमेजिंग सीटी-liposome संचय के स्थानिक सह स्थानीय माप का एक उदाहरण देता है यह संभव सह स्थानीय बनाना haemodynamics की माप, IFP, और सीटी-liposome संचय। 4 चित्रा बनाने संदर्भ का एक आम फ्रेम के लिए अनुमति देता है, IFP, छिड़काव, संवहनी पारगम्यता, प्लाज्मा मात्रा अंश, और मध्य मात्रा अंश। ऐसा नहीं है कि छिड़काव मनाया गया और प्लाज्मा मात्रा अंश काफी चमड़े के नीचे एमडीए MB-231 ट्यूमर में सीटी-liposomes की इंट्रा-tumoral संचय के साथ सहसंबद्ध था। इसके अलावा, IFP के रेडियल वितरण haemodynamic माप के साथ सहसंबद्ध। इन परिणामों का सुझाव एक जटिल स्थानिक-सामयिक संबंध ट्यूमर microcirculation, IFP और liposomes 14 की इंट्रा-tumoral संचय के बीच मौजूद है।

आकृति 1 चित्रा 1: ट्यूमर microcirculation के डीसीई सीटी इमेजिंग (क) ट्यूमर मात्रा के भीतर एकत्र अस्थायी सीटी छवियों, समय के एक समारोह के रूप में विपरीत एजेंट कैनेटीक्स चित्रण का एक प्रतिनिधि श्रृंखला।। लाल समोच्च एक रॉय जहां समय तीव्रता वक्र (घरेलू) में मापा जाता है प्रतिनिधित्व करता है। (ख) घरेलू रॉय के भीतर haemodynamic मापदंडों का मात्रात्मक अनुमान उपज के लिए एक दो डिब्बे दरियाफ्त गतिज मॉडल का उपयोग फिट है। (ग) ट्यूमर में मात्रात्मक haemodynamic मापदंडों के प्रतिनिधि स्थानिक वितरण। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: Liposome accumul का बड़ा सीटी इमेजिंग समझना। (क) एक प्रतिनिधि 3 डी की मात्रा-प्रदान की छवि सीटी-liposomes की biodistribution का प्रदर्शन है। (ख) प्रतिनिधि अक्षीय, राज्याभिषेक, और बाण स्लाइस 48 घंटा के बाद इंजेक्शन पर सीटी-liposomes की इंट्रा-tumoral संचय दिखा ट्यूमर के केंद्र के माध्यम से लिया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। छवि गाइडेड IFP माप (क) एक प्रतिनिधि 3 डी की मात्रा गाया सीटी-liposomes (नारंगी) के 48 घंटे के बाद इंजेक्शन पर एक चमड़े के नीचे ट्यूमर में सीटी-IFP रोबोट प्रणाली (हरा) के बाद सुई प्रविष्टि की छवि। (ख) के बाद सुई प्रविष्टि का एक प्रतिनिधि सीटी छवि।/54226/54226fig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4:। ट्यूमर microcirculation, IFP, और सीटी-liposome संचय के सह स्थानीय माप पैनल सीटी-liposome संचय लिया 48 घंटा के बाद इंजेक्शन, IFP, छिड़काव, संवहनी पारगम्यता, प्लाज्मा मात्रा अंश के एक प्रतिनिधि स्थानिक सह स्थानीयकरण दिखा रहा है और मध्य मात्रा अंश। फिर से प्रिंट 14 से अनुमति के साथ। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

छवि के आधार पर माप के लिए तरीकों के साथ साथ प्रस्तुत ट्यूमर microcirculation गुण, IFP, और सीटी-liposome संचय के स्थानिक वितरण के निर्धारण के लिए सक्षम है। इन गुणों से संबद्ध करने की पिछले प्रयास कई ट्यूमर असर जानवरों भर में थोक माप प्रदर्शन पर भरोसा किया है और इसलिए संवेदनशीलता इंट्रा-tumoral संचय में विविधता है कि आमतौर पर नैनो आकार के दवा वितरण प्रणाली 15 के लिए देखा गया है के लिए जिम्मेदार तंत्र को स्पष्ट करने की कमी है। डीसीई सीटी ट्यूमर microcirculation के गुणों में इंट्रा-tumoral रूपों को मापने के लिए एक उपकरण प्रदान करता है, बड़ा सीटी सीटी-liposome बयान कैनेटीक्स का सही चित्रण प्रदान करता है, और सीटी-IFP रोबोट प्रणाली में IFP के स्थानिक मानचित्रण प्रदर्शन करने के लिए एक उपकरण प्रदान वही जानवर। इसके अलावा, डी सी इ-सीटी इमेजिंग नैदानिक ​​सेटिंग में ट्यूमर hemodynamics मापने, इस अध्ययन के संभावित चिकित्सकीय transl के निष्कर्षों को बनाने के लिए एक चिकित्सकीय विधि को मंजूरी दी हैमेज़।

माप की जटिलता को देखते हुए, वहाँ कई महत्वपूर्ण कारकों मजबूत डेटा सेट का संग्रह सुनिश्चित करने के लिए कर रहे हैं। ट्यूमर microcirculation के डीसीई सीटी आधारित मात्रा का ठहराव यकीनन सबसे ट्यूमर haemodynamics का सटीक अनुमान सुनिश्चित करने के लिए मुश्किल है। यह शोर अनुपात (SNR) के लिए उच्च संकेत के साथ tics प्राप्त करने और एक मजबूत फिटिंग एल्गोरिथ्म रोजगार tics 16,17 यों की आवश्यकता है। Tics के दृश्य निरीक्षण विश्लेषण से कम SNR डेटा निकालने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, अगर ध्यान नहीं लिया जाता है तो उच्च SNR tics की फिटिंग भी ट्यूमर छिड़काव, संवहनी पारगम्यता, प्लाज्मा मात्रा अंश, और मध्य मात्रा अंश 16 के गलत अनुमानों को जन्म दे सकती। आदेश मात्रा का ठहराव सटीकता को अधिकतम करने के लिए एक रणनीति के प्लाज्मा और मध्य मात्रा भिन्न है, जो बाद में मापा जाता tics के मॉडल फिट के दौरान तय मापदंडों के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं के मॉडल स्वतंत्र अनुमान प्राप्त करने के लिए नियुक्त किया गया था। यह विधिसुनिश्चित करता है ट्यूमर छिड़काव और संवहनी पारगम्यता के मजबूत अनुमान 15 प्राप्त कर रहे हैं।

सीटी-liposomes की इंट्रा-tumoral वितरण का मजबूत विश्लेषण एजेंट की पर्याप्त संचय के बाद बड़ा सीटी इमेजिंग प्रदर्शन की आवश्यकता है। पिछले अध्ययनों से, सीटी-liposomes की चोटी ट्यूमर संचय माउस xenografts 3,15 में 48 से 72 घंटा के बीच होता है। इसके अलावा एक रैखिक संबंध सीटी-liposome एकाग्रता और सीटी इमेजिंग में विपरीत वृद्धि सीटी-liposomes 15 की इंट्रा-tumoral संचय में बदलाव की साधारण मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति बीच मौजूद है।

IFP की सटीक मापन सुई आधारित पद्धति का उपयोग कर कैथेटर और ऊतकों के बीच अच्छा तरल पदार्थ संचार की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, यह केवल उपयोग ट्यूमर है कि उच्च केंद्रीय ट्यूमर IFP (> 5 से 10 एमएमएचजी) के लिए महत्वपूर्ण है, अन्यथा वहाँ IFP में कम से कम स्थानिक बदलाव हो जाएगा। IFP के स्थानिक मापन सीटी-IFP लूटने का उपयोग करओटी सुई प्रविष्टि की वजह से ऊतक गति की वजह से चुनौतीपूर्ण हो systemcan। इमेजिंग पूर्व और बाद सुई नियुक्ति को सही सुई स्थापन की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है; हालांकि, यह माप के बीच ऊतक warping के कारण बाद में सुई प्लेसमेंट के बीच स्थिति से संबंधित करने के लिए मुश्किल हो सकता है। यह सुई प्रविष्टि के दौरान पाया गया कि बेतरतीब ढंग से चुनने महत्वपूर्ण ऊतक विरूपण में सुई पदों का परिणाम है। नतीजतन, इस विधि IFP के कम से कम सटीक स्थानिक मानचित्रण प्रदान की है। इसके विपरीत, ट्यूमर मात्रा भर में एक रेखीय ट्रैक के साथ माप प्रदर्शन और सुई ट्रैक IFP माप के स्थानिक सटीकता में सुधार कर सकते हैं के लिए स्पर्शरेखा डालने। सुई ट्रैक के लिए स्पर्शरेखा डालने माप ट्रैक दिशा के साथ ऊतक विरूपण के प्रभाव को कम करता है।

इस अध्ययन के एक व्यक्ति के ट्यूमर में ट्यूमर microcirculation, IFP और सीटी-liposome संचय के स्थानिक वितरण को मापने के लिए क्षमता का प्रदर्शन। इन तकनीकों के माहिर के बाद, यह तो ट्यूमर microenvironment और दवा वितरण पर इसके प्रभाव को चिह्नित करने के लिए स्वतंत्र रूप से या एक साथ इन मापों प्रदर्शन करने के लिए संभव है। एमडीए MB-231 स्तन जेनोग्राफ्ट मॉडल में इन विधियों का प्रयोग से पता चला है कि छिड़काव और प्लाज्मा मात्रा अंश liposomes 14 की इंट्रा-tumoral वितरण के मजबूत मध्यस्थों हैं। वहाँ IFP और liposome वितरण के बीच एक मजबूत संबंध होना नहीं पाया गया था। हालांकि, IFP दृढ़ता से ट्यूमर छिड़काव की माप के लिए सहसंबद्ध था, सुझाव है कि IFP रक्त के प्रवाह के मॉडुलन के माध्यम से liposome वितरण मध्यस्थता में एक अप्रत्यक्ष भूमिका निभा सकते हैं।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
MDA-MB-231 metastatic breast adenocarcinoma tumor cells  ATCC HTB-26
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)  Life Technologies 11965-092
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma-Aldrich F1051
HyClone Penicillin-Streptomycin 100x Solution GE Healthcare Life Sciences SV30010
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red ThermoFisher Scientific 25300-054
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) Avanti Lipids Inc., USA 850355P
Cholesterol (CH) Avanti Lipids Inc., USA 700000P
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-poly(ethylene glycol) 2000 (DSPE-PEG2000) Avanti Lipids Inc., USA 880128P
Omnipaque (Iohexol) 300 mg of iodine/ml  GE Healthcare, CA
80 nm pore size Track-Etch polycarbonate membranes Whatman Inc., USA
200 nm pore size Track-Etch polycarbonate membranes Whatman Inc., USA
10 m Lipex Extruder  Nothern Lipids Inc, CA
Dialysis Bag Molecular Weight Cut Off (MWCO) of 8 kDa Spectrum Labs, USA 
750,000 Nomical Molecular Weight Cut Off (NMWC) Tangential flow column  MidGee ultrafiltration cartridge, GE Healthcare, CA
Peristaltic pump  Watson Marlow Inc., USA
UV spectrometer Helios γ, Spectronic Unicam,  USA
90Plus particle size analyzer  Brookhaven, Holtsville, USA
eXplore Locus Ultra micro-CT system  GE Healthcare, CA Manipulated using CT-Console Software
AxRecon GPU-based Reconstruction  Acceleware Corp. CA
27 G Catheter SURFLO Winged Infusion Set Terumo Medical Products, USA SV*27EL
PE20 polyethylyne tubing Becton Dickinson, USA 427406
Pen tip 25 G × 3.5′′ Whitacre spinal needle  Becton Dickinson, USA 405140 IFP needle
P23XL  pressure transducer  Harvard Apparatus, CA P23XL
PowerLab 4/35, Bridge Amp, with LabChart Pro 7.0 ADInstruments Pty Ltd., USA PL3504, FE221 IFP acquisition system and acquisition software
CT-Sabre Small Animall Intervention system (CT-IFP Robot) Parallax Innovations, CA Manipulated using CT-IFP robot Control Software
CT-IFP robot alignment software Custom Matlab software
DCE-CT Analysis Software Custom Matlab software
Matlab 2013b Mathworks, USA

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References

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चिकित्सा अंक 114 अंतर tumoral विविधता रक्त प्रवाह मध्य द्रव दबाव नैनोकणों Nanomedicine परिवहन दवा वितरण
छिड़काव के स्थानिक मापन, मध्य द्रव दबाव और ठोस ट्यूमर में Liposomes संचय
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Stapleton, S., Mirmilshteyn, D., Zheng, J., Allen, C., Jaffray, D. A. Spatial Measurements of Perfusion, Interstitial Fluid Pressure and Liposomes Accumulation in Solid Tumors. J. Vis. Exp. (114), e54226, doi:10.3791/54226 (2016).

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