Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Romlig Målinger av Perfusjons, interstitiell væsketrykk og liposomer akkumulering i solide tumorer

Published: August 18, 2016 doi: 10.3791/54226
Automatic Translation
1,2,3, 2, 3,4, 2,4,5, 1,2,3,4,5,6
1Department of Medical Biophysics, University of Toronto, 2Leslie Dan Faculty of Pharmacy, University of Toronto, 3STTARR Innovation Centre, Princess Margaret Cancer Centre, 4Institute of Biomaterials and Biomedical Engineering, University of Toronto, 5Techna Institute, University Health Network, 6Radiation Medicine Program, Princess Margaret Cancer Centre

Abstract

Den heterogene intra-tumoral akkumulering av liposomer er en kritisk determinant for deres effektivitet. Både den kaotiske tumor mikrosirkulasjonen og forhøyet IFP er knyttet til den heterogene intra-tumoral fordeling av nanoteknologi baserte medikamentleveringssystemer, for eksempel liposomer. I denne studien ble forholdet mellom svulsten mikrosirkulasjonen, forhøyet IFP, og akkumulering av nanopartikler undersøkt gjennom in vivo eksperimentering. Dette ble oppnådd ved evaluering av svulsten mikrosirkulasjonen ved hjelp av dynamisk kontrastforsterket computertomografi (DCE-CT) og måling av tumor IFP anvendelse av en ny bildestyrt robot nål plasseringssystem som er koblet til mikro-CT-skanner. Den intra-tumoral akkumuleringen av liposomer ble bestemt ved CT-bildebaserte vurdering av et nanopartikkel liposomal formulering som stabilt kapsle kontrastmidlet iohexol (CT-liposomer). CT-avbildning er tillatt for ko-lokalisering av den romlige fordelingen avtumor hemodynamikk, IFP og CT-liposom-akkumulering i en enkelt subkutan xenograft musemodell for brystkreft. Målinger har ført til den erkjennelse at perfusjon og plasmavolumfraksjon er sterke mediatorer av den intra-tumoral distribusjonen av liposomer. Videre tyder disse resultatene på at IFP spiller en indirekte rolle i mediering liposom-distribusjonen gjennom modulering av blodstrømmen.

Introduction

Måling av intra-tumoral akkumulering av nanopartikkel medikamentleveringssystemer kan tilveiebringe et viktig verktøy for å finne ut om en tilstrekkelig konsentrasjon av cytotoksiske legemiddel har blitt oppnådd i løpet av tumoren. Utviklingen av "image-stand" liposomale systemer gjør det mulig for ikke-invasiv og kvantitativ in vivo deteksjon av medikamentavgivelse kjøretøyet ved hjelp av bildediagnostikk eksempel positronemisjonstomografi (PET) en optisk fluorescens 2, og computertomografi (CT) 3, 4 og magnetic resonance imaging (MRI) 5. Imaging har vært brukt for å bestemme farmakokinetikk og biofordeling av liposom-leveringssystemer, og for å avsløre graden av interindividuell og intra-tumoral heterogenitet i nanopartikkel akkumulering 6,7. Men avbildning av nanopartikler alene ikke identifiserer de biologiske barrierer som har bidratt til deres dårlige akkumulering og distribusjon. Denne kunnskapen er viktig for å rational utvikling av mer effektive formuleringer, og strategier for å forbedre intra-tumor opphopning 8. Det har blitt demonstrert at terapeutiske strategier kan anvendes for å modulere spesifikk biologiske barrierer som resulterer i forbedret nanopartikkel transport 9. I tillegg er nanopartikkelformuleringer blitt utviklet spesielt for å overvinne spesifikk biologisk transport barriere 10. I begge tilfellene, kan målinger av biologiske barrierer anvendes for å styre bruken av en passende nanopartikkel medikamentavgivelses strategi.

Tumor mikrosirkulasjonen og forhøyet IFP er antatt å være to viktige faktorer som bestemmer den intra-tumoral akkumulering av nanopartikler, slik som liposomer, i faste tumorer 9,11. Men andre barrierer som å bidra til dårlig liposom opphopning inkluderer tett ekstracellulære matrise, ugjennomtrengelig blodkar, og trykket 12 solid vev. Disse barrierene er relatert på et rom-tidmåte, med unormal blodstrøm og forhøyet interstitiell væske trykket er to viktige faktorer som driver den første leveringen og bloduttredelse av nanopartikler. Som tidligere omtalt, å etablere forholdet mellom tumoren mikrosirkulasjonen, forhøyet IFP, og den intra-tumoral akkumulering av liposomer som er viktig for riktig tolkning av liposom-bildedata. Heri kvantitative metoder for å måle forholdet mellom tumoren mikrosirkulasjonen, forhøyet IFP, og nanopartikkel-akkumulering i en fast tumor er presentert. Dette oppnås ved å utføre ko-lokaliserte målinger av intra-tumoral fordeling av et CT-liposom-kontrastmiddel ved bruk av volumetrisk CT-avbildning, tumor mikrosirkulasjonen ved hjelp av dynamisk kontrastforsterket computertomografi avbildning, og tumor IFP ved hjelp av et bildestyrt robot nål posisjoneringssystem, betegnes CT-IFP robot 13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle in vivo eksperimenter ble utført under en protokoll godkjent av University Health Network Institutional Animal Care og bruk komité.

1. Animal Model

  1. Kultur mellom 5 til 7 x 10 6 MDA-MB-231 bryst adenocarcinoma tumorceller i DMEM sammen med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 100 x fortynning av penicillin-streptomycin.
  2. Høste cellene når de er 80% konfluent anvendelse av en 0,05% trypsin-EDTA-oppløsning. Etter 3-5 min nøytralisere trypsin-EDTA med en 3x volum av DMEM. Ta en 15 mL delmengde av celler og telle ved hjelp av en hemocytometer. Sentrifuger cellene til en pellet i 5 minutter ved 200 xg, og re-suspen i HBS i en konsentrasjon på 10 x 10 6 celler pr ml.
  3. Implantat subkutan (SC) tumorer ved å injisere 1 til 2 x 10 6 celler i bakbenet til hver 8 til 12 uker gamle hunn SCID-mus (n = 5). Bruk en standard 25 G nål for injeksjon.
  4. Monitor tumor vekst ved hjelp calipers (Volume = 0,5 x lengde x bredde 2) og starte målingene når SC svulster har nådd et volum> 200 mm 3 (ca 7 til 9 dager).

2. CT-liposomfremstillingen og karakterisering

  1. liposomfremstillingen
    1. Oppløs lipidkomponenter (200 mmol / L) for CT-liposomer, som blant annet 1,2-dipalmitoyl-sn-glysero-3-fosfokolin (DPPC), kolesterol (CH), og 1,2-distearoyl-sn-glysero-3- -phosphoethanolamine-N-poly (etylenglykol) 2000 (DSPE-PEG2000) i vannfri etanol ved 70 ° C ved et molart forhold på 55: 40: 5 DPPC: CH: DSPE-PEG2000.
    2. Fordampe etanol ved å opprettholde varme ved 70 ° C, tilsett deretter midlet iohexol CT kontrast (300 mg / ml jod) til oppløsningen slik at den endelige lipidkonsentrasjon er 100 mM.
    3. Opprettholde oppløsningen ved 70 ° C i 4 timer med hyppig virvling.
    4. For å få unilamellære vesikler, ekstrudere prøve 5 times gjennom to stablede 200 nm porestørrelse membraner ved et trykk på 250 psi og ekstrudere igjen etter 5 sykluser gjennom to stablede 80 nm porestørrelse membraner ved 400 kPa ved å anvende en 10 ml lipid ekstruder. Pipettere et volum på 10 ml av liposomer inn i ekstruderen ved begynnelsen av hver syklus ekstrudering og samles i en steril konisk rør eller hetteglass etter hver ekstrudering syklus.
    5. Fjern det ikke-innkapslede iohexol med 16 timers dialyse ved bruk av et 100 kDa molekylvekt cut off (MWC) dialyseposen mot en 250-gangers volum overskudd av 0,02 mM HEPES-bufret saltoppløsning (HBS, pH 7,4). For eksempel plassere en ml av liposom-oppløsning på innsiden av dialyseposen med 250 ml HBS utenfor posen i et begerglass.
    6. Konsentrer CT-liposomer ved hjelp av en 750 000 misk MWC kommersielle tangential flow system i henhold til produsentens instruksjoner. Konsentrer til en sluttkonsentrasjon på ca. 55 mg ml jod -1.
  2. liposome Karakterisering
    1. Mål innkapslingseffektivitet ved sprengning av CT-liposomer ved bruk av et 10-gangers volum overskudd av etanol for å frigjøre ioxehol og deretter fortynnet ved hjelp av en 100-gangers volum overskudd av deionisert vann (dvs. 10 pl av liposomer brytes ved anvendelse av 100 ul etanol og deretter fortynnet til et sluttvolum på 10 ml).
    2. Bestem iohexol konsentrasjon ved anvendelse av en UV-spektrometer med påvisning ved en bølgelengde på 245 nm. Beregn innkapslinger effektivitet ved å ta forholdet mellom mengden av frigitt iohexol middel til mengden av middel som tilsettes under fremstillingen.
    3. Måle den hydrodynamiske diameter og zeta-potensial ved hjelp av en dynamisk lysspredning partikkelstørrelsesanalysator system i henhold til produsentens instruksjoner. Fortynn CT-liposom-løsning ved 200x (dvs. 5 ul av liposom i 1 ml endelig volum) i avionisert vann for å lette målingene.

3. CT Imaging av Tumor mikrosirkulasjonen og CT-liposomerDistribusjon

MERK: Følg produsentens instruksjoner for å utføre en volumetrisk skanning hvis forskjellig programvareversjon eller utstyr brukes.

  1. Anesthetize hver mus bruker 2% isofluran blandet med medisinsk luft eller oksygen og bekreft ved å knipe på tå og observere ingen reaksjon. Påfør salve til øynene for å hindre tørrhet mens under anestesi. Immobilisere dyr i en utsatt stilling ved taping poter til en tynn plastbrett.
  2. Plasser en tilpasset 27 G kateter som er forbundet med 20 cm på PE10 rør, inn i den laterale halevenen og sikkert på plass med flere stykker av bånd.
  3. Tilbered en 1 ml sprøyte for å inneholde minst 200 ul av CT-liposomer. Forbered en 1 ml sprøyte med saltvann for å bruke til å skylle kateteret. Til slutt, fremstille en 1 ml sprøyte med minst 150 ul av fri iohexol blandet med saltvann (9: 1 volumforhold).
  4. Plasser musen utsatt på mikro-CT skanneren. Bruk laserposisjoneringssystem for å plassere Tumor i omtrent samme retning for hver skanning.
  5. Plasser CT-liposomer sprøyten i en sprøytepumpe og fest kateteret til sprøyten. Angi at pumpehastighet på 10 pl pr sek.
  6. Initial systemet ved å utføre en lys-mørk kalibrering skanning ved hjelp av CT-skanner programvaren i konsollen. Velg lyse og mørke skannealternativ for hver avbildning protokoll av interesse, velg lyse mørke fra rullegardinmenyen, og trykk på skanneknappen for å starte kalibreringen.
  7. Utføre en volumetrisk anatomisk mikro-CT av tumoren før eventuelle kontrastmiddel injeksjon. Se på CT-skanner konsollprogramvaren indikator for å sikre CT-scanner sikkerhetssperrer har blitt ryddet. På CT-skanneren konsollen velger skanning velge et røntgenenergi på 80 kV, et rør strøm på 70 mA, og fanger 1000 bildeprojeksjoner over tid 16 sek. Trykk på Skann for å starte skanningen.
  8. Bruk sprøytepumpe for å injisere en bolus av CT-liposomer ved en konsentrasjon på 400 mg jod kg-1. Sett pumpen å injisere et volum på ca 150 ul (forutsatt en 25 g mus). Trykk på "Start" -knappen på pumpen for å injisere. skylle manuelt kateteret med 50 ul saltvann (to ganger volumet av kateteret) for å sikre at hele mengden midlet ble injisert, og kateteret er klar.
  9. Vent 10 minutter etter injeksjon av CT-liposomer og deretter utføre en andre anatomiske skanning ved hjelp av samme metode og innstillinger beskrevet i 3.5.
  10. Utføre en DCE-CT-scan ved å sette sprøytepumpe for å injisere et volum på 100 pl av den frie iohexol blandes med saltløsning (9: 1 volumforhold) ved bruk av samme injeksjonshastighetsinnstilling som er beskrevet i 3.3.
    1. På CT-scanner konsoll velge 5 min dynamisk scan som bruker en x-ray energiinnstilling på 80 kV, en tube energi av 90mA, og fanger 416 bildeprojeksjoner hver sek for første 30 sek og etterfulgt av et oppkjøp hver 10 sek . Capture 5 sek av DCE-CT data og deretter trykke på startknappen på injeksjon moln pumpe.
    2. Etter DCE-CT scan utføre en volumetrisk anatomiske mikro-CT scan.
  11. Capture anatomiske CT-bilder mellom 48 og 72 timer etter injeksjon av CT-liposomer, med de samme volumetriske CT innstillinger som beskrevet i trinn 3.5.
  12. Rekonstruere de anatomiske CT og DCE-CT data ved hjelp av GPU-rekonstruksjon programvare.
    1. Laste bildet inn i rekonstruksjon programvare. Velg området av interesse å bli rekonstruert ved å tegne en ROI over bildet ved hjelp av en mus. Angi lagringssted og filnavn for rekonstruert avbildes og velg hva slags type fil som ".mat '.
      MERK: Programvaren vil automatisk sette den rekonstruerte voxel størrelse til 0,153 x 0,153 x 0,153 mm 3 for anatomiske skanner og 0,153 x 0,153 x 0,462 mm 3 for DCE-CT-skanning. Klikk "begynne gjenoppbyggingen" -knappen.
  13. Den ferdig-injeksjonen og 10 min etter injeksjon skanninger av CT-liposom for å beregneplasmavolumfraksjon som tidligere beskrevet tre. Videre bruker den pre-injeksjonen og 5 min etter injeksjon skanninger av iohexol å beregne mellomliggende volumfraksjon som tidligere beskrevet 7.
  14. Skaff tid intensitet kurver (tics) ved å importere DCE-CT data i programvare som gjør det mulig å identifisere en region av interesse (ROI) i tumorvolumet. Deretter beregne gjennomsnittet CT forbedring i avkastningen som en funksjon av tiden. I dette forsøket tilpasset programvare ble utviklet for å identifisere en ROI og beregne TIC.
  15. Skaff kvantitative estimater av perfusjon og vaskulær permeabilitet ved å montere målt tics ved hjelp av en to-kupé tracer kinetisk modell. Montering kan utføres ved hjelp DCE-CT analyse programvare og bruke Apriori estimater av plasmavolumet fraksjonen og interstitiell volumfraksjoner som faste parametere i de to-kupé tracer kinetisk modell. Bruk tidligere rapporterte metoder for å skaffe Apriori estimater av plasmaeten og interstitiell volumfraksjonene 14.

4. Areal Målinger av Tumor interstitiell væsketrykk

  1. For å måle IFP kobler 25 G spinalnål til trykktransduseren og til den IFP innsamlingssystemet gjennom 50 cm av PE20 polyetylenrør. Spyle hele systemet med en heparinsulfat / saltløsning (01:10). Steriliser nålen med 70% isopropyl før bruk.
  2. Slå på kjøpet systemet og starte IFP oppkjøpet programvare og laste innstillingsfiler for å kalibrere systemet for å skaffe IFP målinger i mmHg. Klikk erverve knappen for å kontinuerlig samle IFP data.
  3. Utføre IFP målinger mellom 48 og 72 timer etter injeksjon av CT-liposomer (dette svarer til den omtrentlige tidspunkt for maksimal akkumulering av CT-liposomene i tumor), ved hjelp av metoder som er beskrevet i 4.8. Fest IFP nålen til CT-IFP robot.
  4. Utfør kalibrerings skanner for å justere koordinatsystemer forCT-IFP robot og CT-skanner. Tilsett fiducial markør vedlegg til CT-IFP robot og utføre en fire volumetrisk CT scan med fiducial merke i fire forskjellige posisjoner.
    1. Start CT-IFP robot controller programvare, initial roboten, og flytte roboten til de tre stillingene ved å skrive inn x, y, z målretting stillinger og klikke på "go" -knappen.
    2. Ta en CT scan på følgende x, y, koordinerer z: (1) 0,0,0; (2) -10,0,0; (3) 0,7,0; og (4) 0,0,10. Velg en 90 kV, 10 mA, 16 sek skanning ved hjelp av CT-skanner programvare og trykk på "Start" for å starte skanningen. Rekonstruere skanningen som beskrevet i 3.10.
  5. Start CT-IFP robot justering programvare. Klikk på "Legg til" knappen som er lagt i "registreringsdata" region, og velg de fire rekonstruerte registrerings skanninger oppnådd i 4.3, og klikk deretter på "åpen".
    MERK: pixel plasseringen av fiducial markøren vil automatisk legges inn i software.
    1. Klikk på "Beregn Transform" -knappen, og klikk deretter på 'Apply Transform "-knappen. Dette genererer innretting data som vil bli brukt til å omdanne CT-IFP robot koordinatsystem til CT-skanneren koordinatsystem. Etter kalibreringen er fullført, kobler dyret plattformen til CT-IFP robot.
  6. Anesthetize hver mus bruker 2% isofluran blandet med medisinsk luft eller oksygen og bekreft ved å knipe på tå og observere ingen reaksjon. Immobilisere dyr på CT-IFP robot plattform og plasserer muse slik at tumoren er tilgjengelig for CT-IFP robotsystem. Immobilisere svulsten ved hjelp av tape slik at det ikke beveger seg under IFP nålen innsetting.
  7. Utfør en anatomisk mikro-CT scan før innføring av IFP nål. Rekonstruere CT data ved hjelp av trinnene som er beskrevet i 3.10.
  8. Legg den pre-nålen innsetting CT data inn i CT-IFP robot justering programvare. Juster vinduet og nivå for å visualisere tumoren. Klikk på the kanten av svulst i et bilde, klikk deretter på en annen kant plassering.
    MERK: Programvaren vil beregne en rekke stillinger langs en lineær linje mellom de to posisjoner. Legg merke til x-, y- og z-koordinater for en rekke av fem til åtte jevnt fordelte stillinger i listen.
  9. Klargjør IFP-systemet ved å spyle nålen med heparin-saltløsning før innsetting.
  10. Skriv inn de første forhåndsbestemt nålstillinger inn i x, y, z, inn i CT-IFP robot kontroll programvare og trykk-trekk for å "go" knappen for å flytte roboten til ønsket posisjon. Klikk på "Insert Needle-knappen for å sette nålen inn i vevet.
    1. Etter innsetting av nålen sikre god fluidkommunikasjon mellom IFP nålen og vev ved å klemme og slippe PE20 rør, og bemerker at IFP måle øker og går tilbake til pre-klyping verdi på IFP oppkjøpet programvare. Avvis målinger som ikke returnerer til utgangspunktet.
  11. erverve enanatomiske CT scan med den innsatte nål, klikk deretter på 'Retur Needle "-knappen på CT-IFP robot kontroll programvare for å trekke nålen fra vevet. Avvis alle IFP målinger der IFP verdien ikke vender tilbake til den pre-nålen innsetting verdi etter tilbaketrekking av nålen. Dette betyr at nålen kan ha blitt tilstoppet under målingen. Gjenta trinn 04.08 til 04.10 for hver nåleposisjon.
  12. Bestemme nålens posisjon inne i tumorvolum ved å beregne x, y, og z-posisjonene til nålen porten i forhold til massesenteret av tumorvolumet som er identifisert i det etterinnsetting volumetriske CT scan av nålen.
  13. Returner dyr til buret etter at alle målinger er fullført. Ikke la dyr uten tilsyn, og passe på å observere dem før bevisstheten er gjenvunnet, og de er i stand til å opprettholde sternal recumbency.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den forannevnte protokollen bør gi CT-liposomer med en innkapslet konsentrasjon av iohexol, gjennomsnittlig liposomdiameter, og zeta potensial på 55 mg ml -1, 91,8 ± 0,3 nm og -45,5 ± 2,5 mV, respektivt. Figur 1a omfatter representative DCE-CT-avbildning resultater, noe som gir en tidsserie av volumetriske data som viser tidsmessige endringer i intra-tumor opphopning av iohexol. Velge en ROI innen svulsten gir en TIC som kan kvantifiseres ved hjelp av tracer kinetiske modelleringsmetoder for å oppnå estimater av perfusjon, vaskulær permeabilitet, plasmavolum fraksjon, og interstitiell volumfraksjon (Figur 1b). I denne studien ble en to-kammer tracer kinetisk modell som brukes og passer til den målte TIC ved hjelp av en ikke-lineær kurvetilpasningsrutine implementert i Matlab 14. Segmentering av tumorvolumet inn i flere områder av interesse av lik størrelse gjør det mulig for kvantifisering av than romlige fordelingen av hemodynamiske parametre innenfor tumorvolumet (Figur 1c). Segmentering kan utføres enten manuelt, noe som er tidkrevende og vanskelig, eller automatisk, som utføres her ved hjelp av en algoritme som deler tumoren i flere like store ROIs ved hjelp av et sfærisk koordinatsystem. De DCE-CT-metoder gir kvantitative estimater av den romlige fordelingen av perfusjon, vaskulær permeabilitet, plasmavolumfraksjon, og interstitiell volumfraksjon. Disse parameterne ble observert til å være romlig heterogene med høyere nivåer av perfusjon, plasma og interstitielle volumfraksjonene langs periferien i forhold til den sentrale tumorvolumet.

Den volumetriske CT-avbildningsmetode avslører biofordelingen og intra-tumoral fordeling av CT-liposomer. Figur 2a viser biodistribusjonen av CT-liposomer ved 48 timer etter injeksjon. Midlet er fortsatt sirkulerer i the vaskulære system, med betydelig opptak observert i milten og leveren. Ble observert intra-tumoral akkumulering av CT-liposomer for å være heterogen, med overveiende perifert opphopning i forhold til midten, som angitt med de lyse områdene innenfor tumorvolumet (figur 2b).

Volumetrisk CT bildebehandling kan brukes til å spore plasseringen av IFP målinger gjort ved hjelp av CT-IFP robot oppsettet. Figur 3a viser plassering av IFP nål i tumorvolumet som avbildes med høy oppløsning mikro-CT. Nålen kan tydelig identifisert innen tumorvolumet slik at for romlig lokalisering av IFP-målinger inne i tumorvolum (figur 3b). Det er mulig å generere en romlig kart over IFP hele tumoren ved å utføre flere målinger IFP innenfor tumorvolumet. Den romlige IFP kan deretter korreleres med de tilsvarende målinger avtumor mikrosirkulasjonen og CT-liposom akkumulering.

Volumetrisk CT bildebehandling gjør det mulig for en felles referanseramme som gjør det mulig å co-lokalisere målinger av hemodynamikk, IFP, og CT-liposom-akkumulering. Figur 4 gir et eksempel på romlig ko-lokaliserte målinger av CT-liposom-akkumulering, IFP, perfusjon vaskulær permeabilitet, plasmavolumfraksjon, og interstitiell volumfraksjon. Det ble observert at perfusjon og plasmavolumfraksjonen ble signifikant korrelert med den intra-tumoral akkumulering av CT-liposomer i subkutane MDA-MB-231 tumorer. Videre er den radielle fordelingen av IFP korrelert med hemodynamiske målinger. Disse resultatene tyder på en kompleks rom-tid-forhold eksisterer mellom tumor mikrosirkulasjonen, IFP og intra-tumoral akkumuleringen av liposomer 14.

Figur 1 Figur 1: DCE-CT-avbildning av tumoren Microcirculation (a) En representativ serie av tidsmessige CT-bildene som er samlet inne i tumorvolum, som viser kontrastmidlet kinetikken som en funksjon av tiden.. Den røde konturen representerer en ROI der tiden intensitetskurven (TIC) måles. (B) TIC er passe å bruke en to-kupé tracer kinetisk modell for å gi kvantitative estimater av hemodynamiske parametre innenfor ROI. (C) Representant romlige fordelingen av kvantitative hemodynamiske parametre i svulsten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Volum CT-avbildning av Liposome accumul asjon. (a) En representant 3D-volum-gjengitte bildet demonstrere biodistribusjon av CT-liposomer. (B) Representant aksiale, koronale og sagittal skiver tatt gjennom sentrum av svulsten viser intra-tumor opphopning av CT-liposomer i 48 timer etter injeksjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Fig. 3: Bildestyrt IFP Målinger (a) Et representativt 3D volumgjengitte bildet av CT-IFP robotsystem (grønn) etter nål innsetting i en subkutan tumor ved 48 timer etter injeksjon av CT-liposomer (oransje). (B) En representant CT bilde av post-nålen innsetting./54226/54226fig3large.jpg "Target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Fig. 4: samlokalisert Målinger av Tumor mikrosirkulasjonen, IFP, og CT-liposom akkumulering Panel som viser en representativ romlig ko-lokalisering av CT-liposom opphopning tatt 48 timer etter injeksjon, IFP, perfusjon, vaskulær permeabilitet, plasmavolumfraksjon og interstitiell volumfraksjon. Re-print med tillatelse fra 14. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metodene for bildebasert måling presentert her muliggjøre bestemmelse av den romlige fordelingen av tumormikrosirkulasjon egenskaper, IFP, og CT-liposom-akkumulering. Tidligere forsøk på å relatere disse egenskapene har stolt på å utføre bulk målinger over flere tumorbærende dyr og derfor mangler følsomhet å belyse mekanismene som er ansvarlig for heterogenitet i intra-tumor opphopning som ofte har blitt observert i nanostørrelse stoffet leveringssystemer 15. DCE-CT gir et verktøy for å måle intra-tumor variasjoner i egenskapene til svulsten mikrosirkulasjonen, gir volumetrisk CT en nøyaktig gjengivelse av CT-liposom deponering kinetikk, og CT-IFP robot system gir et verktøy for å utføre romlig kartlegging av IFP i det samme dyr. Videre er DCE-CT bildebehandling en klinisk godkjent metode for å måle kreft hemodynamikken i klinisk setting, slik at funnene i denne studien potensielt klinisk translet bord.

På grunn av kompleksiteten av målingene, er det flere viktige faktorer for å sikre samlingen av robuste datasett. DCE-CT basert kvantifisering av svulsten mikrosirkulasjonen er uten tvil den mest vanskelig å sikre nøyaktige beregninger av kreft hemodynamikk. Det krever å få tics med høyt signal til støyforhold (SNR) og sysselsetter et robust passende algoritme for å kvantifisere tics 16,17. Visuell inspeksjon av tics kan brukes til å fjerne lav SNR data fra analysen. Videre, hvis behandling er ikke tatt da monteringen av høy SNR tics kan også føre til feilaktige estimater av tumor perfusjon, vaskulær permeabilitet, plasmavolumfraksjon, og interstitiell volumfraksjon 16. For å maksimere nøyaktigheten kvantifisering en strategi ble anvendt for å oppnå modell uavhengige estimater av plasma og interstitiell volumfraksjonene, som deretter brukes som faste parametre under modell tilpasning av målte tics. denne metodensikrer robuste estimater av svulst perfusjon og vaskulær permeabilitet oppnås 15.

Robust analyse av det intra-tumoral fordeling av CT-liposomer trenger å utføre volumetriske CT-avbildning etter tilstrekkelig opphopning av midlet. Fra tidligere studier, toppen svulst opphopning av CT-liposomer oppstår mellom 48-72 timer i muse xenografter 3,15. Videre finnes en lineær sammenheng mellom CT-liposomkonsentrasjon og kontrastforsterkning i CT bildebehandling som åpner for enkel kvantifisering av variasjonene i intra-tumor opphopning av CT-liposomer 15.

Nøyaktige målinger av IFP ved hjelp av den nål-baserte metode krever god fluidkommunikasjon mellom kateteret og vev. Videre er det viktig å kun bruke tumorer som har høy sentral tumor IFP (> 5 til 10 mmHg), ellers vil det være minimale romlige variasjoner i IFP. Romlig målinger av IFP hjelp av CT-IFP raneot systemcan være utfordrende på grunn av vev bevegelse forårsaket av nålen innsetting. Imaging før og etter nål plassering er avgjørende for nøyaktig identifisering av nålen plassering; imidlertid, kan det være vanskelig å relatere posisjon mellom påfølgende nål plasseringer på grunn av vev vridning mellom målingene. Det ble funnet at tilfeldig velger nåleposisjonene resulterer i betydelig vev deformasjon under nålen innsetting. Som et resultat av denne fremgangsmåte forutsatt at minst nøyaktige romlige tilordning av IFP. Omvendt, utføre målinger langs en lineær bane på tvers av tumorvolum og innsetting av nålen tangentielt til sporet kan øke den romlige nøyaktigheten av IFP målinger. Innføring av nålen tangerer sporet minimerer effekten av vev deformasjon langs måling spor retning.

Denne studien demonstrerte evnen til å måle den romlige fordelingen av tumormikrosirkulasjonen, IFP og CT-liposom-akkumulering i et individ tumor. Etter å mestre disse teknikkene, er det da mulig å utføre disse målingene uavhengig eller sammen for å karakterisere svulsten mikromiljøet og dens virkninger på levering av legemidler. Ved hjelp av disse metodene i MDA-MB-231 bryst xenograft modell avslørt at perfusjon og plasmavolumfraksjon er sterke formidlere av intra-tumor distribusjon av liposomer 14. Det ble ikke funnet å være en sterk sammenheng mellom IFP og liposom distribusjon. Imidlertid IFP var sterkt korrelert til målinger av tumor perfusjon, noe som tyder på at IFP kan spille en indirekte rolle i mediering liposom-distribusjonen gjennom modulering av blodstrømmen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MDA-MB-231 metastatic breast adenocarcinoma tumor cells  ATCC HTB-26
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)  Life Technologies 11965-092
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma-Aldrich F1051
HyClone Penicillin-Streptomycin 100x Solution GE Healthcare Life Sciences SV30010
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red ThermoFisher Scientific 25300-054
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) Avanti Lipids Inc., USA 850355P
Cholesterol (CH) Avanti Lipids Inc., USA 700000P
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-poly(ethylene glycol) 2000 (DSPE-PEG2000) Avanti Lipids Inc., USA 880128P
Omnipaque (Iohexol) 300 mg of iodine/ml  GE Healthcare, CA
80 nm pore size Track-Etch polycarbonate membranes Whatman Inc., USA
200 nm pore size Track-Etch polycarbonate membranes Whatman Inc., USA
10 m Lipex Extruder  Nothern Lipids Inc, CA
Dialysis Bag Molecular Weight Cut Off (MWCO) of 8 kDa Spectrum Labs, USA 
750,000 Nomical Molecular Weight Cut Off (NMWC) Tangential flow column  MidGee ultrafiltration cartridge, GE Healthcare, CA
Peristaltic pump  Watson Marlow Inc., USA
UV spectrometer Helios γ, Spectronic Unicam,  USA
90Plus particle size analyzer  Brookhaven, Holtsville, USA
eXplore Locus Ultra micro-CT system  GE Healthcare, CA Manipulated using CT-Console Software
AxRecon GPU-based Reconstruction  Acceleware Corp. CA
27 G Catheter SURFLO Winged Infusion Set Terumo Medical Products, USA SV*27EL
PE20 polyethylyne tubing Becton Dickinson, USA 427406
Pen tip 25 G × 3.5′′ Whitacre spinal needle  Becton Dickinson, USA 405140 IFP needle
P23XL  pressure transducer  Harvard Apparatus, CA P23XL
PowerLab 4/35, Bridge Amp, with LabChart Pro 7.0 ADInstruments Pty Ltd., USA PL3504, FE221 IFP acquisition system and acquisition software
CT-Sabre Small Animall Intervention system (CT-IFP Robot) Parallax Innovations, CA Manipulated using CT-IFP robot Control Software
CT-IFP robot alignment software Custom Matlab software
DCE-CT Analysis Software Custom Matlab software
Matlab 2013b Mathworks, USA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Seo, J. W., Zhang, H., Kukis, D. L., Meares, C. F., Ferrara, K. W. A novel method to label preformed liposomes with 64Cu for positron emission tomography (PET) imaging. Bioconjugate chemistry. 19 (12), 2577-2584 (2008).
  2. Huang, H., Dunne, M., Lo, J., Jaffray, D., Allen, C. Comparison of Computed Tomography- and Optical Image-Based Assessment of Liposome Distribution. Molecular Imaging. 12 (3), 148-160 (2013).
  3. Stapleton, S., et al. A mathematical model of the enhanced permeability and retention effect for liposome transport in solid tumors. PloS one. 8 (12), e81157 (2013).
  4. Zheng, J., et al. A multimodal nano agent for image-guided cancer surgery. Biomaterials. 67, 160-168 (2015).
  5. Zheng, J., Liu, J., Dunne, M., Jaffray, D. A., Allen, C. In vivo performance of a liposomal vascular contrast agent for CT and MR-based image guidance applications. Pharmaceutical research. 24 (6), 1193-1201 (2007).
  6. Harrington, K. J., et al. Effective targeting of solid tumors in patients with locally advanced cancers by radiolabeled pegylated liposomes. Clinical Cancer Research. 7 (2), 243-254 (2001).
  7. Stapleton, S., Allen, C., Pintilie, M., Jaffray, D. A. Tumor perfusion imaging predicts the intra-tumoral accumulation of liposomes. J Control Release. 172 (1), 351-357 (2013).
  8. Lammers, T., Kiessling, F., Hennink, W. E., Storm, G. Nanotheranostics and image-guided drug delivery: current concepts and future directions. Mol. Pharm. 7, 1899-1912 (2010).
  9. Stapleton, S., Milosevic, M. F. Cancer Targeted Drug Delivery. , Springer. 241-272 (2013).
  10. Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery. Nature biotechnology. 33 (9), 941-951 (2015).
  11. Heldin, C. H., Rubin, K., Pietras, K., Ostman, A. High interstitial fluid pressure - an obstacle in cancer therapy. Nat Rev Cancer. 4 (10), 806-813 (2004).
  12. Chauhan, V. P., Stylianopoulos, T., Boucher, Y., Jain, R. K. Delivery of molecular and nanoscale medicine to tumors: transport barriers and strategies. Annual review of chemical and biomolecular engineering. 2, 281-298 (2011).
  13. Bax, J. S., et al. 3D image-guided robotic needle positioning system for small animal interventions. Medical physics. 40 (1), 011909 (2013).
  14. Stapleton, S., Milosevic, M., Tannock, I. F., Allen, C., Jaffray, D. A. The intra-tumoral relationship between microcirculation, interstitial fluid pressure and liposome accumulation. Journal of Controlled Release. 211, 163-170 (2015).
  15. Stapleton, S., Allen, C., Pintilie, M., Jaffray, D. A. Tumor perfusion imaging predicts the intra-tumoral accumulation of liposomes. J Control Release. 172 (1), 351-357 (2013).
  16. Brix, G., Zwick, S., Kiessling, F., Griebel, J. Pharmacokinetic analysis of tissue microcirculation using nested models: multimodel inference and parameter identifiability. Medical physics. 36 (7), 2923-2933 (2009).
  17. Brix, G., Griebel, J., Kiessling, F., Wenz, F. Tracer kinetic modelling of tumour angiogenesis based on dynamic contrast-enhanced CT and MRI measurements. European journal of nuclear medicine and molecular imaging. 37 (1), 30-51 (2010).

Tags

Medisin Intra-tumor heterogenitet Blood Flow interstitiell væsketrykk Nanopartikler nanomedisin Transport Drug Delivery
Romlig Målinger av Perfusjons, interstitiell væsketrykk og liposomer akkumulering i solide tumorer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stapleton, S., Mirmilshteyn, D.,… More

Stapleton, S., Mirmilshteyn, D., Zheng, J., Allen, C., Jaffray, D. A. Spatial Measurements of Perfusion, Interstitial Fluid Pressure and Liposomes Accumulation in Solid Tumors. J. Vis. Exp. (114), e54226, doi:10.3791/54226 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter