Teknikker til Udviklingen Robust pentose-gæring Gær til Biokonversion af lignocellulose til ethanol

Summary

Adaptive evolution og isolation teknikker er beskrevet og demonstreret at give derivater af Scheffersomyces stipitis stammen NRRL Y-7124, der er i stand til hurtigt at forbruge hexose og pentose blandede sukker i enzym forsukret undetoxified hydrolysater og at akkumulere over 40 g / l ethanol.

Introduction

En anslået årlig 1,3 milliarder tørre tonsvis af lignocellulose biomasse kunne støtte ethanolproduktion og tillade USA at reducere sit forbrug råolie med 30%. ¹ Selv plantebiomasse hydrolyse udbytter sukkerblandinger rige på glucose og xylose, er fermentering hæmmere genereret af kemisk forbehandling nødvendig at nedbryde hemicellulose og eksponere cellulose til enzymatisk angreb. Eddikesyre, furfural, og hydroxymethylfurfural (HMF) menes at være centrale komponenter blandt mange inhibitorer, der dannes under forbehandling. For at flytte lignincellulosematerialet ethanol industrien frem, til forskning og procedurer tillader udviklingen af ​​gærstammer, der kan overleve og effektivt fungerende at bruge både hexose og pentosesukkere i tilstedeværelsen af ​​sådanne hæmmende forbindelser er nødvendige. En væsentlig yderligere svaghed ved de traditionelle industrielle gærstammer, såsom Saccharomyces cerevisiae, er den manglende evne til effektivt at ferment den xylose rådighed i hydrolysater af vegetabilsk biomasse.

Pichia stipitis-stamme NRRL Y-7124 (CBS 5773), for nylig omdøbt Scheffersomyces stipitis, er en nativ pentose gærende gær, der er velkendt at fermentere xylose til ethanol. ^2,3 Udviklingen af stamme NRRL Y-7124 blev forfulgt her, fordi det er dokumenteret, at har det største potentiale af indfødte gærstammer at akkumulere økonomisk genindvindingsværdi ethanol over 40 g / l med lidt xylitol biprodukt. ^4,5,6 i optimal medier, S. stipitis-stamme NRRL Y-7124 producerer 70 g / l ethanol i 40 timer (1,75 g / liter / time) i et udbytte på 0,41 ± 0,06 g / g i høj celledensitet kulturer (6 g / L celler). ^7,8 Resistance til gæring hæmmere ethanol, furfural, og HMF er også rapporteret, ⁹ og S. stipitis er blevet rangeret blandt de mest lovende indfødte pentose-gærende gær til rådighed for kommerciel skala ethanol production fra lignocellulose. ^10. Vores mål var at anvende diverse undetoxified lignocellulose hydrolysater og udvælgelse ethanol pres for at tvinge udviklingen mod en mere robust derivat af stammen NRRL Y-7124 velegnet til industrielle applikationer. Key blandt forbedrede funktioner søgte var hurtigere sukker uptake satser i koncentrerede hydrolysater, reduceret diauxy for mere effektiv blandet udnyttelse sukker og højere tolerancer ethanol og inhibitorer. Anvendelsen af S. stipitis til undetoxified hydrolysater var et centralt fokus for forskning for at fjerne den ekstra driftsudgift forbundet med hydrolysat afgiftning processer, såsom overliming.

To industrielt lovende hydrolysater blev anvendt til at tvinge evolution:. Enzym forsukrede ammoniak fiber ekspansion-forbehandlet majshalm hydrolysat (AFEX CSH) og fortyndet syre-forbehandlet præriegræs hydrolysatvæsken (PSGHL) ^11,12 AFEX forbehandling teknologi udvikles tilminimere produktionen af ​​fermenteringsprodukter inhibitorer, mens forbehandling med fortyndet syre repræsenterer den aktuelle laveste omkostninger teknologi oftest praktiseres at blotlægge cellulosebaseret biomasse til enzymatisk forsukring. PSGHL kan adskilles fra cellulose som bliver tilbage efter forbehandling og er karakteristisk rig på xylose fra den hydrolyserede hemicellulose, men lav i glucose. AFEX CSH og PSGHL kompositioner adskiller sig fra hinanden i vigtige aspekter, som blev udnyttet til at styre udviklingen processen. AFEX CSH er lavere i furan aldehyder og eddikesyre inhibitorer men højere i aminosyrer og ammoniak nitrogenkilder forhold til PSGHL (tabel 1). PSGHL præsenterer den yderligere udfordring af xylose er den fremherskende sukker rådighed. PSGHL er således hensigtsmæssigt at specifikt berige forbedret xylose udnyttelse i hydrolysater, en svaghed forhindrer kommerciel brug af tilgængelige gær. Selv blandt indfødte pentose fermenting gær, afhængigheden af ​​det suboptimale sukker xylose til at understøtte cellevækst og reparation bliver endnu mere udfordrende i hydrolysater på grund af en række årsager:. mangel på næringsstoffer, hæmmere forårsager omfattende skader til celle strukturel integritet, og forstyrrelse af stofskiftet på grund af redox ubalancer ⁹ Kvælstof tilskud, især i form af aminosyrer, kan udgøre en betydelig omkostning for fermenteringer drift. Virkningen af ​​kvælstof tilskud på isolat screening og rangordning blev udforsket med præriegræs hydrolysater.

Forbedret personer blev beriget med et udviklende population ved hjælp af flere udvalg pres afhængige af naturlige genetiske mangfoldighed af S. stipitis befolkning og mutationer induceret af engagementer med to forskellige hydrolysater, ethanol eller UV-stråling. Tryk Selection blev anvendt parallelt og i serie til at udforske udviklingen fremskridt S. stipitis mod ønskede derivater stand til at vokse og gære effektivt i hydrolysater(Figur 1). Den gentagne dyrkning af funktionelle befolkninger i stigende grad udfordrende hydrolysater blev udført i mikroplader ansætte en fortyndingsrække af enten 12% glucan AFEX CSH ellers PGSHL forberedt på 20% tørstof belastning. Anvendelsen af ​​ethanol-udfordrede vækst på xylose i kontinuerlig kultur yderligere forbedret AFEX CSH tilpasset befolkninger ved berigende for fænotyper demonstrerer mindre følsomhed over for ethanol undertrykkelse af xylose udnyttelse. Den sidstnævnte træk blev for nylig vist problematisk at pentose udnyttelse af stammen NRRL Y-7124 efter glucose fermentering. ⁸ berigelse PSGHL blev dernæst undersøgt for at udvide hydrolysat funktionalitet.

Formodede forbedrede derivater af S. stipitis NRRL Y-7124 blev isoleret fra hver fase af udviklingen processen ved hjælp målrettet berigelse under stress betingelser og fortyndingsudstrygning at plukke kolonier fra de mest udbredte befolkninger. dimensionsløs slægtningydeevneværdierne (RPIs) blev brugt til at rangere stammer baseret på den samlede præstation, hvor kinetisk opførsel blev vurderet på de forskellige hydrolysat typer og næringsstoffer kosttilskud anvendt. Selv succeser forskellige tilpasningsstrategier procedurer for at forbedre funktionaliteten af S. stipitis i lignocelluloseholdige hydrolysater er tidligere blevet dokumenteret, stammer demonstrerer økonomisk ethanolproduktion på undetoxified hydrolysater er ikke tidligere blevet rapporteret. ^13-17 Under anvendelse af evolution procedurer, der skal visualiseres mere detaljeret her, Slininger et al. ¹⁸ udviklede stammer, som er forbedret betydeligt i den forælder stammen NRRL Y-7124 og er i stand til at producere> 40 g / l ethanol i AFEX CSH og enzym forsukrede præriegræs hydrolysat (SGH) behørigt suppleret med kvælstof kilder. Disse nye stammer er af fremtidig interesse for udviklingslandene lignocellulose til ethanol industrien og som emner af yderligere genomforskning undersøgelser bygningpå de tidligere sekventeret stamme NRRL Y-11545. ¹⁹ En genomics undersøgelse af top stammer produceret under forskellige faser af evolution et diagram i figur 1 vil belyse historien om genetiske ændringer, der skete under udvikling som en optakt til yderligere belastning forbedring forskning.

Protocol

1. Forbered Start materialer og udstyr til assays

1. Forbered hydrolysater under anvendelse 18.-20% første biomasse tørvægt i forbehandlingen reaktion til anvendelse i udviklingen, isolation og ranking procedurer. Se Slininger et al. 2015 ¹⁸ for de detaljerede metoder til at forberede AFEX CSH, PSGHL, og SGH med kvælstof kosttilskud N1 eller N2, der anvendes i evolution, isolation eller ranking. Se tabel 1 for sammensætningen af hver hydrolysat type.
   BEMÆRK: Nitrogen befæstning SGH blev betegnet som SGH-N1 eller SGH-N2 defineret som følger: SGH-N1 = SGH befæstet til 42: 1 molær kulstof til kvælstof-forhold (C: N) med nitrogen kilder, herunder urinstof, vitamin-fri amino syrer fra kasein, D, L-tryptophan, L-cystein og vitaminer fra definerede kilder (således at ~ 15% af molær kvælstof N er primær aminonitrogen (PAN) og ~ 85% af N er fra urinstof); SGH-N2 = SGH befæstet til 37: 1 C: N med sojamel som den laveste omkostning erhvervsmæssige kilde o urinstof ogf aminosyrer og vitaminer, der giver ~ 12% af N fra PAN og 88% urinstof.
2. Anskaf en frysetørret kultur af den forælder stammen, Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 (CBS 5773) fra ARS Culture Collection (National Center for Agricultural Udnyttelse Forskning, Peoria, Illinois), og forberede glycerol stamkulturer som anvist. Bevar stamkulturer for moder- gær og dets derivater i 10% glycerol ved -80 ° C.
   1. Streak glycerol lagre til gær malt pepton dextrose (YM) agar plader (3 g / l gærekstrakt, 3 g / l maltekstrakt, 5 g / l pepton, 10 g / l dextrose, 20 g / l agar) og inkuberes 48 timers 72 timer ved 25 ° C. ⁸ udviklede plader kan opbevares i op til en uge ved 4 ° C før anvendelse som flydende forkultur inokula.
3. Forbered Optimal Defineret Medium (ODM), et syntetisk medium kompatibel med industrielle formulering procedurer ^20, der tidligere blev udviklet til optimal omdannelse af xylose til ethanol af moderselskabet strain Scheffersomyces (Pichia) stipitis NRRL Y-7124. ^7. Brug det definerede medium i alle forkulturer og kulturer til gæring ydeevne bioassays og også for ethanol udfordret, xylose-fodret kontinuerlig kultur evolution. ODM sammensætning er angivet som reference i tabel 2.
4. Som tidligere beskrevet, ¹⁸ analysere celle biomasse ved hjælp af en cuvette- eller mikro-pladeaflæsningsspektrofotometer i givet fald til at måle kultur absorbans ved 620 nm (A _620). Kvantificere sukkere, ethanol, furfural, hydroxymethylfurfural (HMF), og eddikesyre i kulturprøver ved hjælp af høj performance væske kromatografi (HPLC) eller robot enzymatisk bestemmelse af glucose og xylose til højere gennemløb.

2. Berig Robust Derivater under Serial Transfer på AFEX CSH

1. Inokulere en forkultur af stammen NRRL Y-7124. Overfør celler fra YM agar til 75 ml ODM + 150 g / l xylose at opretholde evnen til at vokse under osmotic stress. Inkuber forkulturer i 125 ml kolber lukket med silikone svamp propper 24 timer ved 25 ° C under omrystning (150 rpm, 1 "kredsløb).
2. Optø frosne portioner af 6-12% glucan AFEX CSH i koldt vand til brug. Indstil pH til 5, hvis nødvendigt, og filteret steriliseres forud for fremstilling af en fortyndingsserie i 96-brønds mikroplader.
3. Fyld mikroplader med 50 pi per brønd og 8 brønde pr hydrolysat fortynding, så pode med et par mikroliter forkultur per brønd for at tillade en indledende absorbans (620 nm) En ₆₂₀ ≥0.1. Pladerne inkuberes statisk 24-48 timer ved 25 ° C i en plastboks med en våd køkkenrulle for fugt.
4. Anvendelse af de mest koncentrerede hydrolysat fortynding, som synligt voksede til A _620> 1, overførsel 1-5 pi til hver brønd i en ny hydrolysat fortyndingsserie at opnå initial A ₆₂₀ ≥0.1.
5. Overvåg vækst kultur A ₆₂₀ i mikroplader med et spektrofotometer. En ikke-podet fortyndingsrække serves som en kontrol og blank. Plate låg er tilbage på under overvågning for at forhindre kontaminering, og aflæsningerne justeres i overensstemmelse hermed.
6. Forbered glycerol lagre af tilpasningsforanstaltninger kulturer regelmæssigt for efterfølgende isolering af forbedrede stammer eller til anvendelse i reinoculating den fortsatte hydrolysat fortyndingsrække. Til fremstilling bestande, pool fire brønde (200 ul) af den største hydrolysat koncentration koloniseret. Bland 1: 1 med 20% steril glycerol i kryohætteglas, at fryse cellerne i 10% glycerol ved -80 ° C.
7. Gentag trin 2,3-2,6 indtil vækst i 12% glucan AFEX CSH er konsekvent synlig ved 24 timer.

3. Isoler Single Cell Tolerante Derivater efter berigelse AFEX CSH

1. Streak valgt glycerol lagre af tilpasningstiltag kulturer til YM agar, og bruge striber til at pode 50 pi 3% eller 6% glucan AFEX CSH (pH 5) i hver af tre mikropladebrøndene (indledende En ₆₂₀ ~ 0,1). Inkuber mikroplader 24 timer som i trin 2.3. Pool replicate koloniseret brønde på højeste hydrolysat styrke med stærk vækst, og fortynding plade til at YM eller 6% glucan AFEX CSH agar. Forbered sidstnævnte som en 1: 1 blanding af filtersteriliseret 12% glucan AFEX CSH med varmt autoklaveres 30 g / l agar løsning.
2. Pick 5 enkelt kolonier fra den højeste fortynding plade viser vækst efter 24-48 timers inkubation ved 25 ° C for at fryse som glycerol stamkulturer. Streak hver koloni til en YM plade. Inkuber 24 timer. Med en steril løkke, overføre et udviklet streak af celler til et lille volumen af ​​10% glycerol, bland at suspendere celler, og distribuere til 2-3 kryohætteglas til frysning ved -80 ° C.

4. Vurdere ydeevne AFEX CSH tolerante Derivater Sammenlignet med Parent

1. Test Isolater i Simple 6% glucan AFEX CSH Batch Cultures.
   1. Overfør celler fra 48 timers plader udstrøget fra glycerol-stamopløsninger til pH 7 kaliumphosphatpuffer (0,4 mM) til fremstilling af cellesuspensioner med A ₆₂₀ = 10. Brug 1 pihver suspension til inokulering hver af fire brønde i 50 pi 3% glucan hydrolysat til indledende A ₆₂₀ = 0,2. Inkuber mikroplader 24 timer som i trin 2.3. Forbered 3% glucan AFEX CSH ved pH 5 ved at fortynde 12% glucan AFEX CSH 1: 3 med sterilt vand.
   2. Overfør to 24 hr mikropladebrønde til podning 25 ml forkulturer af pH 5 12% glucan AFEX CSH anvendt ved 50% af fuld styrke. Inkuber forkulturer i 50 ml kolber med silicium svamp lukninger til 24 timer ved 25 ° C, ~ 150 rpm (1 "orbit) Forbered halv styrke 12% glucan AFEX CSH ved fortynding af hydrolysatet 1:. 1 med sterilt vand.
   3. Brug halv styrke hydrolysat forkulturer til podning lignende 25 ml vækstkulturer initial A ₆₂₀ = 0,1. Inkubér vækstkulturer som ovenfor (4.1.2) og prøve dagligt (0,2 ml). Monitor ophobninger af biomasse (A ₆₂₀₎ og koncentrationer af sukkerarter og gæringsprodukter (HPLC).
2. Alternativt repitch (dvs. høst og rEUSE) populationer af 6% glucan AFEX CSH-dyrket gær til test i 8% glucan hydrolysat batch kulturer, som tidligere beskrevet. ¹⁸
3. Alternativt yderligere test- populationer af repitched 6% glucan AFEX CSH kulturer ved fodring med 12% glucan hydrolysat, som tidligere beskrevet. ¹⁸
4. Test diauxic forsinkelse af isolater i batch-kulturer af ODM med blandede sukker.
   1. Podes forkulturer af 75 ml ODM med 150 g / L xylose i 125 ml kolber med silikone svamp lukninger af loop overførsel fra YM glycerol striber. Inkuber 24 timer som i trin 2.1.
   2. Brug forkulturer til podning lignende 75 ml testkulturer med ODM indeholdende 75 g / l glucose og 75 g / L xylose ved pH 6,5. Rystekolber ved 25 ° C, 150 rpm. Prøve dagligt.
   3. Alternativt teste virkningen på 0-15 g / l eddikesyre på diauxy under fermentering af glucose og xylose ved anvendelse af en lignende protokol, undtagen indledende pH indstilles til 6,0 ± 0,2 i testkulturerne at opretholde pH 6-7 during eddikesyre forbrug, som tidligere beskrevet. ¹⁸

5. Anvend Kontinuerlig Kultur skal Vælg for Ethanol-udfordrede xyloseudnyttelse

1. Forbered ODM som den kontinuerlige foder dyrkningsmediet med 60-100 g / l xylose, 20-50 g / l ethanol ved pH 6,3 ± 0,2. Vælg kombinationer af xylose og ethanol for at simulere den delvise gæring af 150 g / L xylose, under forudsætning af en potentiel udbytte på ~ 0,5 g ethanol / g xylose, og at rumme potentialet for 50-70 g / l ethanol at forekomme. ⁸
2. Til fremstilling af kontinuerlig kultur inokulum, overføre en repræsentant AFEX CSH-tolerant koloni (analog med Colony 5 i eksempel figur 1) ved sløjfe fra en 48 timers YM plade til 75 ml af ethanol-fri ODM (100 g / l xylose, i dette tilfælde) i 125 ml kolber. Inkuber ved 25 ° C, 150 rpm (1 "kredsløb) i 24 timer. Vælg den forkultur ODM xylose koncentration så det passer til den oprindelige kontinuerlige kultur holder volumen.
3. Inokulere en kontinuerlig kultur holding volumen ODM ved pH 6,3 ± 0,2 med 100 g / l xylose + 20 g / l ethanol med ~ 5-10 ml af en forkultur koncentrat af en AFEX CSH-tolerant isolat (analog med Colony 5, figur 1 ) for at opnå 100 ml ved initial A ₆₂₀ ~ 0,5. Opretholde kulturen holding volumen (V _R), ved 25 ° C i en med kappe 100 ml rystekolbe omrørt ved 200 rpm og udstyret med steriliserbart pH-elektrode, pH controller og temperaturstyret cirkulerende vandbad.
4. Indledningsvis da cellevækst vil være langsom på grund af eksponering af ethanol, der er nedsat fødemediet at dosere ved hjælp af et pH-aktiveret pumpe. Indstil pumpen til foder pH-6,3 ODM med 100 g / l xylose og 50 g / l ethanol, når kulturen fermentering falder pH til 5,4, således at standse yderligere pH-fald. Oprethold lydstyrken på 100 ml med en spildevand pumpe kontinuerligt skumme kultur overflade. Følgelig ethanolkoncentration stiger med fortsat metabolisme og fodring. Mål spildevand og trække prøver (1-2 ml) fra kontinuerte kulturer hver 48-72 time i analyse af levedygtige cellekoncentrationen, produkter og substrater, som tidligere beskrevet. ^18. For at finde levedygtige cellekoncentrationen, gør serielle 1:10 fortyndinger af prøverne i buffer (se 4.1.1) og spredning plade fortyndingerne til YM agar (se 1.2.1). Baseret på spildevand indsamlingsrater (Q), beregne fortynding rate (D) (Q / V _R), og, i eksemplet med S. stipitis, det var på mellem 0 til 0,01 ^h-1.
5. Spar glycerol lagre regelmæssigt ved at isolere fra levedygtighed plader af buffer prøvefortyndinger danner 30-100 kolonier, der repræsenterer mest udbredte robuste kolonister på den tid i berigelse. Flood plader med ~ 5 ml 10% glycerol for at tillade fremstilling af dobbelte kryoglas. For vedligeholdelse eller et pusterum, så stop den fortløbende kultur og genstart efter behov bruger mest strøm (resistente) glycerol lager (r).
6. For at genstarte, streak glycerol lager (r) af de flesteresistente populationer til YM agar og overføre 24-48 timers celler ved sløjfe til en for-kultur af ethanol-fri ODM til inkubation som ovenfor. Pode 100 ml holding volumen af ODM til indledende A ₆₂₀ 0.5 ved anvendelse af et koncentrat af fordyrket gær, og tillade kulturen at vokse portionsvis til stationær fase før foderet mediestrøm genstartes.
7. Hvis kulturerne kan vokse støt ved> 0,01 ^h-1 på xylose i nærværelse af> 25 g / l ethanol, starte kontinuerlig kultur foder (ODM + 60 g / L xylose + ethanol intervallet 30 til 50 g / l) ved en lav fortyndingshastighed ~ 0,01 ^h-1 til 100 ml holding volumen (først ODM + 60 g / L xylose + 20 g / l ethanol). Over tid hæve ethanol i foderet mod 50 g / l. Capture avancerede befolkninger i glycerol bestande.
   BEMÆRK: Vedligeholdelse af lav fortynding rate tillader dannelsen af ​​en høj nok celle koncentration til at reducere ilt tilgængelighed og support gæring.
8. Eventuelt anvende ultraviolet (UV) irradiation månedligt til glycerol lager befolkninger, der anvendes til reinoculate kontinuerte kulturer.
   1. Resuspender kolonier fra glycerol lager striber i 10 ml ODM (som i prækulturer) med 60 g / l xylose, og samle alle bestande i en enkelt steril kolbe. Påfør den poolede cellesuspension på ~ 5 x 10 ⁸ levedygtige celler / ml til blot at dække bunden af 4-5 petriskåle med 6 ml / plade. For at få 6 ml dækning af en standard engangs petriskål, dispensere 15 ml for at overvinde overfladespænding, og fjern derefter 9 ml.
   2. Eksponere hver åben dyrkningsplade for UV fra lyskilden i et biologisk sikkerhedsskab. Juster UV eksponeringstid eller afstand til opnåelse af den ønskede drabsrate> 90%. Her udsættes i 45 minutter ved omkring 56 cm fra kilden.
   3. Fortynd plade cellesuspensioner før og efter bestråling. Skøn dræbe sats baseret på kolonidannende enheder. For S. stipitis eksempel kill lå ~ 97%.
   4. Overfør UV-eksponerede kulturer (24-30 ml) til en folie-CoVob- 50 ml kolbe, og der inkuberes ved 25 ° C og 150 rpm i 24 timer for at tillade lille procentdel af levedygtige celler til at genbefolke til ~ 1 x 10 ⁸ levedygtige S. stipitis celler / ml. Ved at forhindre foto reaktiveringer, foliedækket bevarer mutationer mens kulturer inkuberes.
   5. Brug den genopbyggede mutageniserede kultur til inokulering kontinuerlige kulturer til ~ 1 x 10 ⁷ levedygtige celler / ml. Genstart ethanol-berigede ODM + 60 g / L xylose vækstmedium at fortsætte udvælgelsesprocessen.

6. Evaluer glycerolstamme Befolkninger og identificere de med Forbedret Xylose Gæring i Tilstedeværelse af Ethanol

1. Streak valgt glycerol stamkulturer til YM agar som det første skridt på skærmen for bedste vækst og fermentering af xylose i tilstedeværelse af ethanol.
2. Overfør hver udviklede population, der skal screenes fra agar striber til 75 ml forkulturer i ODM med 150 g / l glucose, og der inkuberes i 125 ml kolber 96time før anvendelse som inokula til testkulturerne. De store glucose-dyrket populationer vil kræve induktion af enzymer til xyloseudnyttelse.
   1. For at teste induktion, høste hver kultur, suspendere celler til 30 ml, initial A ₆₂₀ af 40 i ODM +60 g / l xylose + 30-45 g / l ethanol, og der inkuberes ved 25 ° C, 150 rpm (1 "orbit) i 50 ml kolber med silicium svamp lukninger. Tegn prøver to gange dagligt til overvågning xylose optagelse ved HPLC-analyse.
3. Alternativt, som beskrevet i Slininger et al., ¹⁸ at vurdere væksten på xylose i nærvær af ethanol, forberede forkulturer af hver udviklet population af loop overførsel til 75 ml ODM med 150 g / l xylose i 125 ml kolber, og der inkuberes 96 time ved 25 ° C, 150 rpm (1 "orbit). podes testkulturer til en lav initial a ₆₂₀ på 0,1 i 25 ml ODM + 60 g / L xylose + 30-45 g / l ethanol i 125 ml kolber. Inkuber kolber ved 25 ° C, 300 rpm, en "bane og prøve.

1. Baseret på resultater fra trin 6, vælg glycerolstamme populationer udviser overlegne evne til at vokse på og fermentere xylose i nærvær af ethanol. Brug disse til at streak plader. De streak Pladerne anvendes til fremstilling af tætte, pufrede cellesuspensioner af A ₆₂₀ = 5. Derefter cellesuspensioner anvendes til podning forkulturer i 96-dybe brønde til A ₆₂₀ = 0,5. Inokulere 1 ml forkulturer på PSGHL blandet 1: 1 med ODM + 50 g / L xylose (ingen ethanol). Inkuber forkulturer i 96-brønds, dybe brønde med udluftet lav fordampning dækker i 48 timer ved 25 ° C, 400 opm, 1 "kredsløb. Separate forskellige glycerol stock populationer ved tomme brønde.
2. Anvendelse af hver forkultur inokuleres seksten 1 ml replikere kulturer til indledende A ₆₂₀ ~ 0,5 i 1: 1 PSGHL: ODM + 50 g / L xylose med 20, 30 eller 40 g / l ethanol til at berige tolerante kolonister. Inkuber berigelse cultures på samme måde som forkulturer.
3. For hver glycerolstamme, høste kultur brønde med koncentration højeste ethanol tillader vækst og xylose brug. Plate hver cellelinie til YM agar til opnåelse fremherskende enkeltkolonier at bevare i glycerol. Pick ti kolonier pr cellelinie og streak hver til en YM-agarplade for glycerol stock forberedelse.

8. Yderligere Berig Robust Evolved Stammer under Serial Transfer på PSGHL, som for AFEX CSH

1. Forbered pre-kulturer af NRRL Y-7124 (forælder), AFEX CSH-tolerant udviklet isolere og kontinuert kultur udviklede population med forøget evne til at bruge xylose i nærvær af ethanol. Pode 75 ml ODM + 150 g / l xylose med løkke fra glycerol stock striber som beskrevet ovenfor (trin 2.1) for AFEX CSH hydrolysat tilpasningsproces.
2. Fortynd PSGHL med vand for at tilvejebringe en serie af stigende koncentrationer. Der fremstilles en 96-brønds mikro-plade for hver af de tre cellelinier ved hjælp af hvertPSGHL fortynding til at fylde 8 brønde med 50 pl. Brug forkultur til podning hver 50 pi mikro-kultur af fortyndingen serien til indledende En ₆₂₀ ~ 0,1-0,5.
   1. Fortsæt udviklingen af gær i stigende styrker af PSGHL anvendelse af samme procedure som det AFEX CSH hydrolysatet tilpasning beskrevet ovenfor (trin 2), indtil kulturer er stand til at vokse i fuld styrke hydrolysat ved en stabil 14-d gennemsnitlige forhold mellem Aa ₆₂₀ pr Δtime som serielle overførsler fortsatte yderligere fire måneder.

9. isolere enkelte-celle Kolonier Brug PSGHL Gradienter med eller uden Ethanol Challenge

1. Opnå encellede isolerer direkte fra endelige tilpasning plader fuld styrke PSGHL ved fortynding plating til YM agar. Pick ti store kolonier for hver af de tre cellelinjer og bar stribe til YM plader til fremstilling glycerolstamopløsninger som beskrevet tidligere (trin 3.2).
2. Eventuelt udforske tidligere tidspunkter ievolution proces ved at isolere fra lagrede glycerol lagre af de tre cellelinjer.
   1. Inokulere en forkultur for hver cellelinje ved løkke fra glycerolstamopløsning striber og inkuberes 24 timer på 30 ml ODM + 50 g / L xylose (50 ml kolber, 25 ° C, 150 rpm).
   2. Udfordring celler fra forkulturer til væksten i hydrolysat ved at pode 50 pi 50% PSGHL i mikropladebrønde en indledende En ₆₂₀ ~ 0,2 og inkubere statisk 48 timer.
   3. Spred 0,1 ml af hver beriget kultur på PSGHL gradient agarplader spænder fra 0 til 50% styrke hydrolysat (levere ~ 300-400 levedygtige celler per plade), og bryde 10 enkeltkolonier per celle linie fra det højeste mulige hydrolysat koncentration område af gradienten . ²¹ Streak plukket kolonier til YM for glycerol bestand forberedelse som i trin 3.2.
   4. Som et alternativ til trin 9.2.3, i stedet for at pode gradient agarplader, inokulering brønde af 96-brønds mikroplader til indledende A ₆₂₀ ~ 0,2, where brøndene er designet til at indeholde en række hydrolysat koncentrationer fra 50 til 100% styrke og ethanol fra 10 til 40 g / L. I dette tilfælde, udvikle mikro-plader 72-96 timer og ellers som i trin 2.3. Isoler ti enkeltkolonier fra brønde i de hårdeste hydrolysat-ethanol kombinationer viser vækst via fortynding plating, og forberede glycerol lagre som i trin 3.2.

10. I en primær skærm, Eliminer Inferior isolater ved at sammenligne og Ranking Forestillinger om PSGHL på to Næringsstof Betingelser

1. Anvend en high throughput dyb brønd plade skærm PSGHL ydeevne til skærmen fem sæt tredive isolater sammen med NRRL Y-7124 forælder og AFEX CSH-tolerant isolat (analog til Colony 5 i figur 1 evolution eksempel) som kontroller til at vælge seks top stammer (20%) ud fra hvert sæt til at passere til den sekundære screening niveau (trin 12).
2. Udfør skærmen i dybe brønde fyldt 1 ml per brønd og dækket with rustfrit stål låg med sort silikone lave fordampningsemissioner sæler. Clamp alle plader til bestyrelsen for inkubatoren / shaker og drive ved 25 ° C og 400 rpm (1 "shaker kredsløb). Design alle dyb brønd plade påfyldning mønstre for at muliggøre separation af forskellige isolater af åbne brønde.
3. Til at begynde dyrkninger, vælge en vulst af celler fra glycerol striber fremstillet ud fra 30 isolater opnået som ovenfor (i trin 3, 7 og 9) til huller til dobbeltbestemmelse ODM + 50 g / l xylose og inkuberes 48 timer.
4. Som en udfordring medium til prædyrkning isolater, fremstilling af 50% PSGHL ved blanding PSGHL 1: 1 med ODM + 10 g / l glucose + 50 g / L xylose. Til screening 30 isolater og to kontrolstammer, 2 plader med 2 brønde pr hver af 16 isolater er fyldt, efterlader tomme brønde mellem de forskellige isolater.
5. For udfordring kulturer, overførsel, et 50 pi volumen af ODM pre-kulturer (A ₆₂₀ ~ 10) til hvert af to 50% PSGHL udfordring kultur brønde for hver af de isolater og kontroller at opnå en initial A ₆₂₀ ~ 0,5 og inkuberes 72 timer.
6. Brug to test medier af forskellig ernæringsmæssige rigdom til screening isolater: 60% PSGHL + ODM næringsstoffer; og 75% PSGHL + ODM + YM næringsstoffer. Tilføj ODM næringsstoffer (ekskl sukker) på halvdelen af ​​styrken som standard for ODM brug med 50 g / l sukker (trin 1.3). Som udpeget, tilføje YM næringsstoffer (ekskl sukker) på halvdelen af ​​standarden styrke på 3 g / l gærekstrakt, 3 g / l maltekstrakt, 5 g / l pepton.
7. Inokulering testkulturer ved at overføre 50 pi 72 timer 50% PSGHL challenge pre-kulturer til inokulering af 1.000 pi initial A ₆₂₀ ~ 0,5 i fem dybe brønde for hver af to test medier.
8. Prøve hver isolere dagligt. Pipette indholdet af en brønd til et mikrofugerør og centrifugeres (5533 xg, 15 min) for at opnå supernatant for ethanol, glucose og xylose high throughput analyser. Måle biomasse som ₆₂₀ i 96-brønds mikroplader (200 pi / brønd) med et spektrofotometer.
9. Inden for hvert sæt af 30 erolates testet (5 sæt til S. stipitis NRRL Y-7124 udviklet stammer), beregne relative ydeevne indeks (RPI) som beskrevet i trin 11 nedenfor og bruge til at rangere hver stamme baseret på ethanol udbytte (maksimal ethanol akkumuleret pr indledende sukker medfølger) og xylose optagelseshastigheden (xylose koncentration forbruges pr indledende 96 timer) på begge test medier.

11. Rank Isolerer i Primary PSGHL Screen Brug Relativ Performance Index (RPI)

1. Efter primær screening, beregne dimensionsløse relative ydeevneværdierne (RPI) for at rangere de 30 isolater i hver af de fem forskellige eksperimenter til skærmen isolater på PSGHL med to forskellige formuleringer næringsstoffer pr eksperiment, dvs, 60% PSGHL og 75% PSGHL.
2. Beregn den statistiske parameteren F til brug i ranking isolere præstation inden for en gruppe af testet i et givet eksperiment isolater: F = (XX _avg) / s. Her er X parameteren ydeevne, såsom udbytte (Y)eller sats (R), observeret for hver enkelt isolat, mens X _avg og s er gennemsnittet og standardafvigelsen af henholdsvis X observeret for alle isolater inden for en given eksperiment. For normale fordelinger, -2 <F <2.
3. For hvert isolat i et eksperiment, beregne relative resultater baseret på hastighed, RPI _R = (2 + F _R) × 100/4, og tilsvarende beregne relative resultater baseret på udbytte, RPI _Y = (2 + F _Y) × 100/4 . Værdien af ​​RPI spænder fra ~ 0 til 100 percentil (laveste til højeste). Så beregne RPI gennemsnit for hver isolere inden for en given hydrolysat eksperiment som følger: RPI _avg = (RPI _Y + RPI _R) / 2, hvor udbytte og sats bidrag er givet lige vægtning i denne ansøgning.
   Bemærk, at i almindelighed, kan udbytte og rente parametre vægtes hvis det skønnes ulige betydning.
4. Beregn RPI _samlet tværs de n typer af testede hydrolysater: RPI _samlede i = 1, n [(RPI _Y + RPI _R) / 2] _i / n. Overvej hvert isolat i en eksperimentel sæt af 30 isolater og 2 kontroller. Under primær rangordning af ~ 150 single-koloni isolater tilpasset til xylose-rige PSGHL, at RPI _samlede beregnes for priser og udbytter på tværs af de to PSGHL formuleringer anvendes i skærmen, dvs 60% PSGHL og 75% PSGHL, hvor n = 2.
5. Baseret på RPI _samlet inden hvert eksperiment vælge den øverste procentdel af isolater passere til den sekundære skærm. I dette eksempel er de øverste 20% af stammer valgt at passere (dvs. 30 ud af 150 testede).

12. I en sekundær skærm, sammenligne Top Primær Screen Performers på Multiple Complete hydrolysater (> 100 g / l Blandet Sukker) at afsløre Højeste Fungerende Robuste Stammer

1. Sammenlign Top PSGHL kunstnere på 6% glucan AFEX CSH og SGH ændret med to niveauer af kvælstof, SGH-N1 og SGH-N2 (sammensætnings som i tabel 1) til endelige placering. Screen de 30 isolater, der var de bedste lande i den primære dybe tallerken godt skærm PSGHL (trin 10 og 11) og de to kontroller (forælder stamme NRRL Y-7124 og AFEX CSH-tolerant isolat (analogt med Colony 5, Figur 1 eksempel ).
2. Begynd dyrkninger ved at vælge en vulst af celler fra glycerol striber at duplikere dybe brønde i 1 ml ODM + 50 g / L xylose som før og inkuberes 48 timer i den dybe plade brønd-system (trin 10.2). Derefter overføre 50 ul ODM forkulturer til 50% SGH udfordring kulturer, og inkuberes i den dybe tallerken godt system til 72 timer for at opnå en ₆₂₀ på ~ 10). Forbered 50% SGH ved at blande SGH 1: 1 med sukkerfrit ODM + 50 g / l xylose (pH 5,6).
3. For hvert af isolaterne, inokulere en 16 ml prøve af SGH-N1 eller SGH-N2 med cellepelleten (15 min, 2.711 xg) fra tre brønde af udfordring kultur til opnåelse indledende test kultur A ₆₂₀ ~ 2,0. Inkuber testkulturer ved 25 & #176,. C, 180 rpm (1 "orbit) i 25 ml kolber med silikone svamp lukninger Sample kolber dagligt og analysere pr PSGHL skærmen.
4. Tilsvarende skærm isolater som i trin 12.2 og 12.3, men denne gang erstatning SGH-N1 og SGH-N2 med 6% glucan AFEX CSH ved pH 5,2 til anvendelse ved fremstilling udfordringen dyrkningsmedium og test dyrkningsmedium. For de 50% styrke udfordring kulturer, bruge 6% AFEX CSH fortyndet 1: 1 med vand, da det er nitrogen tilstrækkeligt uden ændringer.
5. Gentag trin 12.1-12.4 at duplikere resultater.

13. Rank opførelser af isolater i den sekundære skærm Brug RPI _samlet til Rate Anvendelse af Multiple Complete hydrolysater

1. Beregn relative ydeevneværdierne (RPI) for at rangere hver af de øverste 20% af isolater (~ 30 ud af 150) fra den primære skærm, der er blevet testet i den sekundære skærm på enzym forsukret hydrolysat formuleringer af varierende ernæringsmæssige rigdom.
2. Score hverisolat testet i den sekundære skærm baseret på xylose optagelseshastighed og ethanol udbytte udført på tre enzymforsukret forbehandlet hydrolysat formuleringer kørt in duplo, herunder AFEX CSH (i = 1 og 2), SGH-N1 (i = 3 og 4) og SGH -N2 (i = 5 og 6).
3. Beregn RPI _samlet for hvert isolat, og anvende denne rangordning parameter for yderligere at kaste listen over overlegen isolater: RPI _samlet = Σ _{i = 1, n} [(RPI _Y + RPI _R) / 2] _i / n, hvor n = 6 .
   BEMÆRK: Demonstrere kinetik for overlegne isolater i SGH-N2 hydrolysater i kolbe kulturer ved at følge procedurerne i Slininger et al ^18.

Representative Results

S. stipitis blev udviklet under anvendelse af kombinationer af tre udvælgelse kulturer, som omfattede AFEX CSH, PSGHL, og ethanol-udfordrede xylose-fodret kontinuerlig kultur. Figur 1 viser skematisk diagram af evolution eksperimenter udført sammen med isolaterne fundet enten at udføre mest effektivt samlet, eller mest effektivt på en af de testede hydrolysaterne. tabel 3 viser antallet af disse overlegne isolater NRRL tiltrædelse og opsummerer tilpasning spændinger anvendes i processen med at opnå den berigede population, hvorfra hver stamme blev isoleret. Nogle isolater blev set at have overlegen relative resultater på en eller to hydrolysat typer, men 7 ud af 11 isolater klarede sig godt på alle de hydrolysat typer, selv om de fleste af disse blev eksponeret og udfordret af kun en enkelt type i evolution. De succeser i de forskellige evolution tilgange taget her er demonstreret i figur 2 -7 og tabel 4.

Figur 2 viser de forskellige forbedringer set efter den første fase af tilpasningen, hvor robuste derivater af stammen NRRL Y-7124 blev beriget ved seriel overførsel til stigende koncentrationer af AFEX CSH (trin 2). I kulturer, der vokser på 6% glucan AFEX CSH, den udviklede befolkning demonstrerer hurtigere ophobning og højere endelige titre af ethanol end den forælder stamme. Hurtigere glukoseudnyttelse også ses sammen med hurtigere xylose optagelse umiddelbart efter udtømning af glucose. Derudover i figur 3, stabiliteten af den ændrede befolkning funktioner demonstreres i det syntetiske medium ODM med en blanding af 87 g / l glucose og 66 g / L xylose. I dette tilfælde både den berigede population (figur 3B) og isolerede kolonier (Colony 1 og Colony 5, figur 3C og 3D, respectively) er i stand til at udkonkurrere den forælder stamme ved hjælp af xylose mere effektivt at gøre ethanol hurtigere, hvilket reducerer tiden til maksimal ethanol med mindst 4 dage. Markant højere koncentrationer ethanol blev akkumuleret af udviklede stammer på ODM (55-60 g / L) sammenlignet med den forælder (40-45 g / l). De mutationer, hvilket førte til en stabil fænotype af reduceret diauxy under glukose-xylose overgang og mere effektiv xylose gæring, opstod som gær befolkning udviklet sig i AFEX CSH.

Yderligere forbedringer af Colony 5 blev forfulgt ved at indsende det til naturlig selektion i xylose-fodret kontinuerlig kultur i tilstedeværelse af stigende niveauer af ethanol op til 50 g / l. Under denne betingelse, skal gær befolkning tilbageholdes i kontinuerlig kultur kunne inducere enzymer til xyloseudnyttelse som eneste carbonkilde, for at det skal kunne vokse med en hastighed stor nok til at befolke fermentoren trods en støt fortyndingsats. I den forælder stammen, begynder induktion af xylose enzymer til at hæmmes ved ethanol koncentrationer så lave som 15-20 g / l. ⁸ Derivater af Colony 5 blev fanget i glycerol bestande på tidlige og sene tidspunkter drift af den kontinuerlige kultur, og Figur 4 viser den vellykkede forbedring i xyloseudnyttelse i nærvær af 40 g / l ethanol observeret i udviklede derivater af Colony 5 sammenlignet hos NRRL Y-7124 forælder og den oprindelige koloni 5 inokuleret til processen.

Isolater forbindelse med alle faser af tilpasning arrangement med figur 1 blev screenet i PSGHL at identificere dem med overlegne evne til at fermentere xylose (Trin 10.1). De i figur 5 isolater er blandt de bedste resultater på PSGHL ud af ~ 150 rangeret i denne primære skærm og i alle sekundære skærme af ydeevne som beskrevet nedenfor. At angive forbedring af udviklet isolateri forhold til deres forælder, blev effektiviteten af ​​hver isolat udtrykt som forholdet af kinetiske parameterværdier af isolat til moderstammen. Ratio værdier for "en" opstået, hvis isolatet præstation var ækvivalent med den forælder. 5a og 5b opsummere top isolere forestillinger på 60% og 75% styrker PSGHL med ODM eller ODM + YM næringsstoffer kosttilskud. Som det hydrolysat koncentration og hårdhed blev øget, performance nøgletal faldet. I 60% styrke PSGHL, fem af syv top isolater udsat for PSGHL selektionspres udførte mange gange bedre end NRRL Y-7124 (isolat 1). Fire isolater klaret sig bedre end Colony 5 (isolere 33), der havde udviklet sig under eksponering for AFEX CSH men havde ingen tidligere selektiv eksponering for PSGHL. Men i 75% styrke PSGHL, kun 3 isolater markant overgik både moderselskabet og Colony 5 (isolere 33) på trods af de tilsatte næringsstoffer. Af disse, overlegen isolerer 15 og 16 var previously udfordret med stigende koncentrationer af PSGHL som selektionspres vejledende evolution. Isolerer 15, 14 og 3 blev kun udsat for PSGHL, mens 11, 13 og 16 havde flere eksponeringer. Isolerer 3, 11, og 13 var fra tidligere tidspunkter i løbet af evolutionen på PSGHL og så havde noget mindre mulighed for at udvikle tolerance i forhold til 14, 15 og 16. Selv om det er tydeligt i figur 5, at seriel overførsel til stigende styrker PSGHL tjente at udvikle stammer robuste til sin hæmmende miljø, er det også klart, at eksponering af den forælder stammen NRRL Y-7124 til AFEX CSH alene potentielt kunne generere isolater såsom Colony 5 (33) med cross tolerance over PSGHL. Det blev således angivet, at robuste stammer stand til at udføre i flere hydrolysater kunne findes ved berigelse af tolerance i et hydrolysat efterfulgt af ydeevne screening i en anden. Isolater fra den xylose-fodret kontinuerlig kultur blev også screenet på PSGHL 60% og 75% styrker mednæringsstoffer og også tilføjet glukose ved 75 g / l for at opretholde den udfordring ethanol og teste diauxic forsinkelse på xylose efter glukose udnyttelse. Mens isolerer 27, 28 og 30 var overlegen i forhold til andre i denne fase af tilpasning, både udbytte og xylose optagelse sats ydeevne nøgletal lignede den forælder på 75% PSGHL tilsat ODM og YM næringsstoffer, hvilket ikke nødvendigvis er overraskende i, at ingen havde tidligere eksponering for dette hydrolysat (se også Slininger et al. ¹⁸ for yderligere data ikke vist her for kulturerne forudsat 75 g / l glucose).

De bedste stammer valgt fra den primære skærm på xylose-rige PSGHL blev efterfølgende screenet på tre komplette hydrolysater. Disse hydrolysater (tabel 1) inkluderet AFEX CSH og fortyndet syre forbehandlet SG behandlet med kommercielle cellulaser og suppleret ved to forskellige kvælstof niveauer (SGH-N1 og SGH-N2) til at identificere den mest alsidige isolates med hensyn til variationer i inhibitor og ernæringsmæssige miljø. De relative ydeevneværdierne (RPIs) blev beregnet for fermentering af hver isolere inden for hver hydrolysat (figur 6A). Figur 6B viser de kombinerede samlede præstation indekser beregnet for hvert isolat. Fem isolater (3, 14, 27, 28, 33) havde samlet RPI over 60, der rangeret dem som de mest robuste til alle de variationer af hydrolysat og næringsstoffer forhold kombineret. Gennemgang tabel 3, både isolerer 3 og 14 blev udviklet i PSGHL mens 27, 28, og 33 blev udviklet i AFEX CSH eller AFEX CSH og ethanol-udfordret kontinuerlig kultur på xylose. Ingen af ​​stammerne udviser overlegen flere hydrolysat brug blev udviklet på mere end én hydrolysat.

Nogle stammer var "specialister", der udfører bedre på enten SGH-N1 / 2 eller AFEX CSH. Disse isolater udfører bedst som specialister på SGHhydrolysater (11, 16 og 9) blev opnået ved evolution på PSGHL som den endelige eller eneste udfordring. For isolerer 11 og 16, som i første omgang blev beriget via øget AFEX CSH udfordring, blev evnen til effektivt at udnytte AFEX CSH ikke aktivt valgt under den langvarige endelige berigelse i PSGHL, og de vigtigste genetiske faktorer understøtter brugen blev åbenbart tabt. Omvendt isolerer 14, 25, 27, 30 og 33 var overlegne kunstnere på AFEX CSH, og alle undtagen isolat 14 blev udviklet på AFEX CSH med eller uden ethanol udfordring. Så som forventet, instrueret evolution på AFEX CSH eller PSGHL tendens til at vælge for gær godt tilpasset til markeringen hydrolysat. Den eneste undtagelse i denne henseende var isolat 14. Isoler 14 stammede fra PSGHL kun udfordre og blev isoleret fra YM agar fortynding plating af den endelige PSGHL berigelse kultur. Slininger et al. ¹⁸ viste dette isolat at have overlegen evne af xylose enzyminduktion i glucose-dyrket celler i nærvær af5-15 g / l eddikesyre og reduceret diauxic lag på ODM med 75 g / l hver af glucose og xylose, trods> 30 g / l ethanol forekommende forud for glucose-xylose overgangspunkt.

De overlegne kinetik udviklede stammer i forhold til den forælder stammen S. stipitis NRRL Y-7124 blev påvist som vist i tabel 4, som repræsenterer resultaterne af lavniveau beluftning kolbe kulturer podet til indledende A ₆₂₀ 8,4 ± 2,5 75 ml SGH-N2 (pH 6,2) inkuberet i 125 ml kolber med silikone svamp caps på 25 ° C, 150 rpm (1 "kredsløb), og i figur 7, der repræsenterer moderate beluftning kolbe kulturer podet til indledende En ₆₂₀ 0,5 i 23 ml SGH-N2 pr 50 ml kolbe. ^18. Disse betingelser udgør to forskellige typer af operationer foreslået af litteratur som værende potentielt kommercielt lovende for ethanolproduktion af S. stipitis. ^8,22 I granert eksempel på lavt niveau luftning, den høj celledensitet giver hurtig gæring til at begynde med det samme. Henviser i det andet tilfælde, den lave celledensitet og højere beluftning føring til logaritmisk vækst opbygge befolkningen og accelerere vækst-associeret sukker omdannelse til ethanol. Disse data viser, at den udviklede stammer har betydelige kinetiske fordele i forhold moderstammen: hurtigere glukoseoptagelse sats (tabel 4), hurtigere specifik xylose optagelseshastighed (tabel 4), hurtigere ethanol produktivitet på både glucose og xylose og samlet (tabel 4), til kortere forsinkelse forud vækst (figur 7), og kortere diauxic glucose xylose overgangsperiode forsinkelse. Disse forbedringer er tilladt ethanol at akkumulere til over 40 g / L og at toppe dage tidligere (figur 7), end der blev set for den forælder NRRL Y-7124. Højere samlet ethanol produktivitet (tabel 4) blev opnået ved 1,5-5 tids, at den forælder stamme (tabel 4), afhængigt udviklet stamme.

Figur 1:. Scheffersomyces stipitis tilpasning flowdiagram Det viste diagram viser rækkefølgen af de belastninger, der anvendes under tilpasningsprocessen og de punkter for inddrivelse af fineste isolater (tal i parentes). Se også tabel 3 isolat nøgle som reference for strain identiteter. At give tid orientering, tallene i rødt angiver antallet af dage i hver fase af tilpasning. For de serielle transfer faser i AFEX CSH og xylose-rige PSGHL, hver dag med tilpasning repræsenterer ca. 2-4 generationer. For den kontinuerlige fase kultur (205 dage i alt), fortyndingen sats D var variabel på ~ 0-0,1 time ^-1 løbet 125 d af drift med pH-aktiveret fodring. I den næste80 dage, operation var ved en kontinuerlig strøm med D ved 0,012 ^h-1, hvilket giver en generationstid (ln 2) / (D) på 58 timer, eller 1 generation pr 2,4 d ved steady state. Næste en prøve af den tilpassede population fra 205-dages kontinuerlig kultur blev mutageniseret med UV-lys og inokuleret til en kontinuerlig kultur betjenes med D ved 0,012 ^h-1. (Gengivet fra Slininger et al. ¹⁸⁾ Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2:. Forbedret batch fermentering af 6% glucan AFEX CSH Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 forælder stamme fermentering af 6% glucan AFEX CSH (A) sammenlignes med tilpasset Colony 5 fermentering af 6% glucan AFEX-forbehandlet majsstængler hydrolyzate (B). Symboler udpege biomasse (rød firkant), glucose (sort cirkel med stiplet linje), xylose (blå cirkel med optrukket linie), ethanol (grøn trekant), og xylitol (lilla diamant). (Gengivet fra Slininger et al. ¹⁸⁾ Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: Reduceret diauxic forsinkelse i defineret medium med blandede sukkerarter Fermentering forestillinger er sammenlignet i ODM med 66 g / l glucose og 87 g / l xylose til moderstammen S.. stipitis NRRL Y-7124 (A), den AFEX CSH tilpasset population afledt fra Y-7124 (B), enkelt celle Colony 1 isoleret fra den tilpassede S. stipitis population (C), enkelt celle ColoNY 5 isoleret fra den tilpassede population (D). Symboler udpege biomasse (rød firkant), glucose (sort cirkel med stiplet linje), xylose (blå cirkel med optrukket linie), ethanol (grøn trekant), xylitol (lilla diamant), og adonitol (guld diamant med sort kant). (Gengivet fra Slininger et al. ¹⁸⁾ Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: Ethanol resistente derivater af Colony 5. hydrolysat tolerant Colony 5 blev videreudviklet ved kontinuerlig kultur udvælgelse på ODM indeholder xylose som eneste kulstofkilde og høje niveauer af ethanol. To afledte glycerol lager befolkninger opnået tidligt i udvælgelsesprocessen (2A.1.53R, orange trekant og stiplet linje) og enfter UV bestråling af kontinuert kultur inokula (2A.1.30R.2, lilla cirkel og stiplet linje) er vist i sammenligning med NRRL Y-7124 forælder stamme (grøn cirkel med optrukket linje) og AFEX CSH tolerant Colony 5 (sort trekant med optrukket linje). Xylose optagelse af tætte populationer af glucose-dyrket gær (A ₆₂₀ = 50) i ODM med 40 g / l ethanol viste, at alle tilpassede stammer overgik utilpassede forælder i evnen til at inducere xylose metabolisme. (Gengivet fra Slininger et al. ¹⁸⁾ Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5:. Ratio af performance forbedringer af tolerante isolat forhold til forælder opførelser af overlegne tolerante isolater er sammenfattet i forhold tilkontrol udgangsstammen NRRL Y-7124 for hver formulering af PSGHL (A, B). Forestillinger blev vurderet i form af xylose optagelseshastighed (blå søjler repræsenterer forhold mellem isolat til forælder) og ethanol udbytte pr sukker leveret (grønne søjler repræsenterer forhold mellem isolat til forældre). (Gengivet fra Slininger et al. ¹⁸⁾ Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6: Isoler ranking baseret på RPI. Den relative performance index (RPI) Begrebet blev anvendt på resultater af den sekundære skærm for at rang 33 isolater inden for hver hydrolysat typer baseret på xylose optagelseshastighed og ethanol udbytte pr sukker leveret. (A) Den relative løbkonge af enhver given isolat afhang af hydrolysat type (P <0,001): SGH-N1 (blå søjler), SGH-N2 (røde søjler) og AFEX CSH (grønne bjælker). (B) Den overordnede RPI beregnet på tværs af alle hydrolysat typer (lyseblå søjler) angivet overlegne stammer med de fleste robust ydeevne på tværs af forskellige hydrolysat betingelser. (Gengivet fra Slininger et al. ¹⁸⁾ Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 7: Komparative SGH forgæring af overlegne tilpassede isolater af S. stipitis. Superior tilpasset isolater og deres moderstamme NRRL Y-7124 sammenlignes fermentere enzymatiske hydrolysater af fortyndet syre-forbehandlet præriegræs (20% tørstof loading) ved 25 ° C og initial pH 6,2 ved lav initial celledensitet. Tidsforløb for biomasse (røde firkanter), glucose (sorte cirkler og stiplet linie), xylose (blå cirkler og fuldt optrukken linie) og ethanol (grønne trekanter) er vist. Fejlsøjler viser størrelsesordenen omkring middelværdien markeret med symboler. (Gengivet fra Slininger et al. ¹⁸⁾ Klik her for at se en større version af dette tal.

Tabel 1:. Kompositioner af hydrolysater anvendes i dyrkninger (. Gengivet fra Slininger et al ¹⁸⁾ Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2: Optimal defineret medium for Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 ⁷TPS: //www.jove.com/files/ftp_upload/54227/54227table2.xlsx "> Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 3:. Oversigt over overlegne tolerante Scheffersomyces stipitis stammer til fermentering af hydrolysater af plantebiomasse (. Gengivet fra Slininger et al ¹⁸⁾ Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 4: Sammenlignende kinetik for isolater på præriegræs hydrolysat SGH-N2 podet til indledende A ₆₂₀ = 8,4 ± 2,5 Priser er normaliserede satser pr absorbans under glucose eller xylose forbrug.. (Gengivet fra Slininger et al. ¹⁸⁾ Klik her for at downloade denne table.

Discussion

Flere trin var afgørende for succes af udviklingen processen. Først er det vigtigt at vælge passende selektionstryk at drive befolkningen udvikling mod de ønskede fænotyper, der er nødvendige for vellykket anvendelse. Følgende selektive spændinger blev valgt for S. stipitis udvikling og anvendes på passende tidspunkter at guide berigelse for de ønskede fænotyper: stigende styrker af 12% glucan AFEX CSH (som tvinger vækst og fermentering af forskellige sukkere i nærværelse af eddikesyre og lave niveauer af furan aldehyder og andre inhibitorer); xylose fodret kontinuerte kulturer med stigende koncentration ethanol (som tvinger xylose enzyminduktion at reducere diauxic lag); og stigende styrker af 20% faststoffer loading PSGHL (som tvinger vækst og fermentering af xylose i nærvær af høje eddikesyre, furaner og andre inhibitorer). For det andet er det vigtigt at bevare de skiftende gær befolkninger ved frysning glycerol sTocks af udsnit af befolkningen, som berigningsprocessen skrider frem. Sådanne snapshots af befolkningen kan opbevares i periodisk funktionel test for at dokumentere evolution fremskridt og for at tillade efterfølgende isoleringer som ønsket, eller at genstarte evolution processer efter en pause. Et tredje vigtigt skridt i udviklingen procedure var at genvinde ekstraordinære isolater ved at berige udvælgelse kultur populationer eller glycerol lager befolkninger på en bekvem selektive medier (såsom agar eller mikro-plader indeholdende en stress gradient præsentere en serie af hydrolysat og / eller ethanol koncentrationer) . Så overlevende kolonier vokser under de mest stressende tilstand kan plukkes at bevare for karakterisering senere. Disse tre grundlæggende trin kan gentages for at forfølge hver yderligere ønsket fænotype selektionspres, eller alternativt flere pres i en enkelt cyklus, hvis det er relevant. Når den indfødte forælder gær befolkning er udsat for de forskellige påvirkninger, forventes den genetiske mangfoldighed at opstå th ru naturlige eller inducerede mutationer, og fortsatte eksponering vil give naturlig selektion at berige for personer med de mest gavnlige mutationer støtter konkurrencedygtig overlevelse. Det forventes, at den udvalgte phenotype vil opstå som følge af multiple genetiske mutationer. I protokollen ovenfor kan mutationer induceres i løbet af UV-behandling eller potentielt under udsættelse af gær til hydrolysater. Hydrolysater er kendt for at indeholde tre klasser af forbindelser skadelig for mikroorganismer:. Carboxylsyrer, aldehyder og phenoler ²² Reaktive aldehyder, såsom furfural og 5-hydroxymethylfurfural, kan beskadige celler og forårsage en stigning af reaktive oxygenarter (ROS), genereres typisk i mitokondrier. ROS er godt kendt for at forårsage DNA-mutationer i eukaryote celler. ^23,24 De phenoler stede i hydrolysater, men ikke tidligere kendt for at være genotoksisk, kan fremme og synergi de mutagene virkninger af aldehyder og mutagent ROS. ²⁵

jove_content "> Den trinvise strategi progressivt udfordrende miljøer forventes at bygge udviklet stammer med en serie af fænotype forbedringer, både målrettet og også ikke-målrettede. Det er muligt, at visse ikke-målrettede fænotyper kan opstå som er uønskede eller ustabil. For at fange de mest fungerende og robuste stammer, et yderligere vigtigt skridt, der skal tages, er at vurdere og sammenligne udvalgte isolater for kommercielt relevante træk og nåede både målrettede og ikke-målrettede fænotyper. for at gøre dette, isolat forestillinger skal sammenlignes i en række forskellige applikationsorienterede stressbetingelser, såsom i hydrolysater med forskellige inhibitorkoncentrationer udfordringer og næringsstoffer formuleringer, der tillader udvælgelse af bedste samlede stammer, som er stabil og robust til bred industriel lignocellulosesubstrat variation. Derudover kan en stamme stabilitet udfordring inkorporeres i skærmen som blev gjort i eksemplet ved at inkludere prædyrkning trin involving indledende vækst gær på to selektive medier, YM agar i flere generationer efterfulgt af syntetisk ODM med 50 g / L xylose i yderligere 6-7 generationer, der giver mulighed for destabilisering af ønskede kultur træk forud for udsættelse for den udfordring præstation i hydrolysat. Baseret på væsentlige ydeevne funktioner, såsom ethanol udbytte og xylose optagelseshastighed, er isolaterne derefter placeret i hver af de forskellige stress tilstand, såsom hver testet hydrolysat miljø, som kan være forskellige fra isolatet berigelse dyrkningsmedium. Den dimensionsløse RPI kan bruges til at beregne den gennemsnitlige samlede relative ydeevne og rang af isolater, der sammenlignes. En dimensionsløs faktor er hensigtsmæssigt at afspejle relative præstation i forskellige typer af hydrolysater og baseret på forskellige ydeevne vurderinger, såsom udbytter versus satser. Denne rangordning procedure identificerer stammer, der udfører konsekvent godt tværs brede variationer i vækstbetingelser og hydrolyzates og er tilbøjelige til at være både robuste og genetisk stabil.

Forskellige iterationer og modifikationer af disse grundlæggende trin kan være nødvendige for at imødekomme udviklingen i enhver mikrobielle stamme er i stand til specifikke eller unikke features på lignocellulose hydrolysater eller andre substrater af interesse. I S. stipitis eksempel, er det vigtigt at bemærke, at tilskud af næringsstoffer, herunder billige kommercielle kilder, til hydrolysater fremstillet med højt faststofindhold loading var nøglen til styring af dynamiske område isolate forestillinger for forbedrede statistiske adskillelse under screening. Betydningen af ​​næringsstoffer til vellykket fermentering af koncentrerede inhibitoriske hydrolysater er også rapporteret tidligere og menes at skyldes en forhøjet behov for aminosyrer og andre næringsstoffer, der kræves for celle vedligeholdelse, redox balancering, og reparation som følge af sådanne stressbetingelser, især under xyloseudnyttelse. ^9,26,27Desuden, hvis næringsstoffer er for sparsomme eller for voldsom, kan forskelle i isolate forestillinger være svære at opdage statistisk grundet alle isolater gøre overordentlig dårligt, eller alle gør overordentlig godt, hhv. Isolerer stand til at udføre godt under forskellige forhold forventes at være pålidelige, eller robust over for variationer i industrielle betingelser.

Den væsentligste begrænsning af denne protokol er, at adaptiv evolution og screening er meget bogstavelig i resultatet, i at "man får hvad man beriger og skærme for". Således behøver at være designet til at forstærke og identificere enkeltpersoner, henholdsvis med de ønskelige ændringer i fænotyper, men bevare ønskelige allerede eksisterende træk for berigelses- og skærmen betingelser. Evolution kan påvirke ikke-valgt til træk, der er afgørende for industriens ydeevne (f.eks vækstfaktor krav). Derfor population berigelse fremgang for et træk skal periodisk overvågeed for andre egenskaber som en metode til fejlfinding for uønskede ændringer. For eksempel er en af de unikke træk ved S. stipitis er dens native evne til at vokse på og fermentere xylose. Alle berigelse og screening substrater inkluderet xylose som eneste eller nøgle bidragende kulstofkilde i tilstedeværelse af inhibitorer. Følgelig et fælles træk ved alle de berigelse kulturer i dette eksempel var, at de direkte valgt til hurtigere xylose under anvendelse stammer, hvis populationer blev mere og mere beriget med seriel eller kontinuerlig dyrkning, fordi de var bedre konkurrenter. Som et tilsigtet resultat, forbedrede stammer var alle i stand til hurtigere xylose optagelse, men forbedringer af ethanol udbytte var langt mindre dramatisk end forbedringer i xylose optagelseshastighed. Sidstnævnte tendens sandsynligvis opstod, da ethanol udbytte ved moderstammen var forholdsvis høj på omkring 0,3 g / g eller 60% af det teoretiske (0,51 g / g), som cellevæksten blev stationært i hydrolysater, efterlader mindre plads tilforbedring. I kulturer, kunne højere ethanol udbytte skal muligvis valgt imod, fordi ethanol er en vækst-hæmmer, som nødvendiggjorde ydeevne overvågning af den udviklede befolkning for dette træk. Ethanolkoncentrationer holdes under niveauet for væksthæmning ville have tendens til at neutralisere dette som en markering faktor. For S. stipitis NRRL Y-7124, 40 g / L ethanol halvdele specifikke vækstrate, mens 64 g / L forhindrer væksten helt. ²⁸ I ethanol udfordret kontinuerte kulturer fodret xylose, beluftning blev holdt lav og udvanding satser blev også holdt lav nok med rigelig xylose til stede for at fremme gæring i stedet respiration af ethanol og forhindre berigelse for en uønsket brug ethanol ejendom. Derudover blev næringsstoffer supplementer til hydrolysaterne anvendes i ydeevne skærme omtanke designet for at undgå selektion for stammer, der kræver en kostbar rig næringsstofforsyning, såsom gærekstrakt. Kosttilskud altid inkluderet laveste omkostninger kommercielle kilder tilrådighede, såsom sojamel og urinstof, selvom rigere komponenter såsom i YM blev anvendt i tandem kulturer til sammenlignende prøvning, såsom i formuleringerne ifølge 60% og 75% PSGHL som normalt nedbryder af nitrogen. Den ODM syntetisk medium, der anvendes i forkultur Holme og performance kultur skærme, blev oprindeligt designet til optimal ydeevne af den forælder stammen S. stipitis NRRL Y-7124 ⁷ i overensstemmelse med dyrkningsmediet optimering rutine beskrevet af Traders Protein ^20, som anbefaler, definerede ingredienser, herunder vitaminer, mineraler, puriner og pyrimidiner, og aminosyre kilder til at levere næringsstoffer er kompatible med omkostningseffektive industriel opskalering hjælp kommercielle kilder. En sidste anbefaling i at designe relevante stammer, er at holde udformningen af ​​berigelses- og skærmen betingelser som er relevante som muligt til de forventede industrielle procesbetingelser.

Cost-konkurrencedygtig vedvarende ethanol har længe været forfulgt til reduce afhængighed af fossile brændstoffer. At forbedre muligheden for S. stipitis NRRL Y-7124 til at tolerere, vokse og fermentere inhibitoriske hydrolysater af lignocellulose, har flere forskere anvendt gentagne dyrkning i xylose-rige væske, der følger af fortyndet syre-forbehandling af lignocelluloseholdigt biomasse. ^13,14,16,17 Over-kalkning at afgifte hæmmere var stadig behov for at tillade en rimelig grad af opfyldelse af tidlig tilpassede pres på hårdttræ og hvede halm forbehandling væsker. ^13,14 Flere gentagne runder af UV mutagenese og genom blander er anvendt til at udvikle derivater af S. stipitis NRRL Y-7124 med forbedret inhibitor tolerance og vækst i hårdttræ brugt sulfitlud (HWSSL). ^16,17 imidlertid ethanolkoncentrationer produceret af disse stammer i HWSSL var under 10 g / l efter 6 til 7 dage. Anvendelse af teknikkerne er vist og beskrevet her, nye udviklede stammer af S. stipitis NRRL Y-7124 er udviklet til at imødekomme phenotype mål er nødvendige for økonomisk kommerciel brug: gæring af hydrolysater ved pH 5-6 uden forudgående afgiftning foranstaltninger, såsom over-kalkning, hvilket fører til bortskaffelse dyrt affald; stærkt reduceret vækst og diauxic forsinkelser; ethanol ophobninger høje nok til kommerciel destillation (> 40 g / l ethanol); hurtigere vækst og ethanol produktivitet end tidligere rapporteret for indfødte gærstammer fermentering undetoxified hydrolysater; og ydeevne i forskellige hydrolysater ved høj tørstof lastning, herunder passende soja kvælstof-suppleret SGH (som ellers kvælstof dårlig) og ikke-suppleret AFEX CSH. De forbedrede stammer udviklet ved hjælp romanen aggressive tilgange til udvikling som udtryk i de vigtigste skridt sammenfattet ovenfor, forventes at gavne økonomien i at producere ethanol fra biomasse fra landbruget ved at sænke driftsomkostninger, kapitalomkostninger og energi og vand indgange. Dette er den første stamme evolution plan rapporteret til opnåelse tilpassede stammer af S. stipiter demonstrerer økonomisk erstattes ethanolproduktion på undetoxified hydrolysater.

De hidtil ukendte stammer af S. stipitis følge hver fase af udviklingen processen (figur 1) er kandidater til fremtidige undersøgelser for at bestemme de genetiske ændringer, der er forbundet med specifikke udvælgelseskriterier pres anvendt, og de mekanismer underliggende centrale attributter af forbedret hydrolysat gæring, såsom inhibitor tolerance og reduceret diauxic forsinkelse. En sådan værdifuld ny viden vil hjælpe engineering af næste generation af gær biokatalysatorer og processer til omdannelse af lignocellulose til biobrændstoffer og andre produkter. Som nye stammer er afledt, vil det sandsynligvis være gavnligt at igen passere derivat befolkning gennem en stamme evolution protokol svarende til den, der er beskrevet her, for at vælge de mest nyttige transformanter til kommerciel brug i hydrolysater. Ligeledes som nye mikrobielle stammer bliver opdaget med potentiale til at gøre en minriad af nyttige nye produkter fra vedvarende biomasse, kunne udviklingen processen yderligere anvendes til at forbedre stammen robusthed og produktivitet i hydrolysater, potentielt tillade nye bio-katalytisk processer og produkter, der skal stilles til rådighed.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cellic Ctec, Contains Xylanase (endo-1,4-)	Novozymes	No product number	www.novozymes.com, 1-919-494-3000
Cellic Htec, Contains Cellulase and Xyalanase	Novozymes	No product number	www.novozymes.com, 1-919-494-3000
Toasted Nutrisoy Flour	Archer Daniels Midland Co. (ADM)	63160	ADM, 4666 Faries Parkway, Decatur, IL  1800-37-5843
Pluronic F-68 (Surfactant)	Sigma-Aldrich	P1300	Sigma-Aldrich
Difco Vitamin Assay Casamino Acids	Becton Dickinson and Company	228830	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
D,L-tryptophan	Sigma-Aldrich	T3300	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
L-cysteine	Sigma-Aldrich	C7352	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, Sigma-Aldrich
Bacto Agar	Becton Dickinson and Company	214010	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Bacto Malt Extract	Becton Dickinson and Company	218630	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Bacto Yeast Extract	Becton Dickinson and Company	212750	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Peptone Type IV from soybean	Fluka	P0521-500g	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Adenine, >99% powder	Sigma-Aldrich	A8626	CAS 73-24-5. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Cytosine, >99%	Sigma-Aldrich	C3506	CAS 71-30-7. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Guanine, SigmaUltra	Sigma-Aldrich	G6779	CAS 73-40-5. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Thymine, 99%	Sigma-Aldrich	T0376	CAS 65-71-4. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Uracil, 99%	Sigma-Aldrich	U0750	CAS 66-22-8. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Dextrose (D-Glucose), Anhydrous, Certified ACS	Fisher Chemical	D16-500	CAS 50-99-7. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich
D-Xylose, assay >99%	Sigma-Aldrich	X1500	CAS 58-86-6. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich
96-well, flat bottom plates	Becton Dickinson Falcon	351172	multiple suppliers: e.g., Thermo-Fisher, VWR, Daigger
Wypall L40 Wiper	Kimberly-Clark		towel in microplate boxes to absorb water for humidification; multiple suppliers e.g., Thermo-Fisher, uline, Daigger
Corning graduated pyrex flask, 125 ml, narrow opening (stopper #5)	Corning Life Science Glass	4980-125	multiple suppliers: e.g., Thermo-Fisher, VWR, Daigger
Innova 42R shaker/incubator, 2.5 cm (1") rotation	New Brunswick Scientific (1-800-631-5417)	M1335-0016	multiple suppliers: e.g., Eppendorf, Thermo-Fisher. Other shaker/incubators with a 2.5 cm (1") throw could be used.
Duetz Cover clamp for 4 deep well MTP plates	Applikon Biotechnology	Z365001700	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Duetz System sandwich cover for 96 deep well plates	Applikon Biotechnology	Z365001296	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Duetz System silicone seal (0.8 mm black low evap) for 96 deep well plate cover	Applikon Biotechnology	V0W1040027	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Blue microfiber layer for Duetz system sandwich cover	Applikon Biotechnology	V0W1040001	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
96 well, 2 ml square well pyramid bottom plates, natural popypropylene	Applikon Biotechnology	ZC3DXP0240	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Bellco 32 mm silicon sponge plug closures, pk of 25 for 125 ml flasks	Bellco	1924-00032	Thomas Scientific, their Catalog number is 1203K27
Bellco Spinner Flask, 1968-Glass Dome, Sealable Flange Type, 100 ml working volume. This design no longer manufactured.	Bellco	1968-00100 (original Cat. No.)	Jacketed vessels have lower inlet & upper outlet ports for temp. control with circulating water bath. Vessels are 75 mm in outer diam and 200 mm in height. There are four side ports at ~45° angles and one top port. Port openings appropriate size for size 0 neoprene stoppers (21-22 mm inner diameters on ports).
Mathis Labomat IR Dryer Oven	MathisAg	Typ-Nbr BFA12 215307	Werner Mathis U.S.A. Inc. usa@mathisag.com, 704-786-6157
Dual Channel Biochemistry Analyzer	YSI Life Sciences	2900D-UP	www.ysi.com, robotic system for rapid sugars assay in 96-well microplate format
PowerWave XS Microplate Spectrophotometer	Bio-Tek Instruments, Inc	MQX200R	www.biotek.com