Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

इथेनॉल के लिए Lignocellulose की bioconversion के लिए मजबूत pentose-fermenting खमीर के विकास के लिए तकनीक

doi: 10.3791/54227 Published: October 24, 2016

Summary

अनुकूली विकास और अलगाव की तकनीक का वर्णन किया और Scheffersomyces stipitis तनाव के डेरिवेटिव NRRL वाई-7124 है कि सक्षम हैं तेजी से उपभोग करने के लिए hexose और एंजाइम में pentose मिश्रित शर्करा undetoxified hydrolyzates saccharified और 40 ग्राम / एल इथेनॉल पर जमा करने के लिए उपज के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं।

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

एक अनुमान के अनुसार वार्षिक 1.3 अरब lignocellulosic बायोमास की सूखी टन इथेनॉल उत्पादन का समर्थन और अमेरिका के 30% द्वारा अपने पेट्रोलियम की खपत को कम करने के लिए अनुमति दे सकता है। 1 हालांकि बायोमास संयंत्र हाइड्रोलिसिस पैदावार चीनी ग्लूकोज और सिलोज़ में अमीर मिश्रण, किण्वन अवरोधकों आवश्यक रासायनिक pretreatment द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं नीचे hemicellulose तोड़ने और enzymatic हमले के लिए सेल्यूलोज को बेनकाब करने के लिए। एसिटिक एसिड, furfural, और hydroxymethylfurfural (HMF) कई अवरोधकों कि pretreatment के दौरान फार्म के बीच प्रमुख घटक माना जाता है। आदेश lignocellulosic इथेनॉल उद्योग आगे बढ़ने के लिए, अनुसंधान और प्रक्रियाओं खमीर जीवित और कुशलता से इस तरह के निरोधात्मक यौगिकों की उपस्थिति में दोनों hexose और pentose शर्करा का उपयोग करने की जरूरत है कार्य करने में सक्षम उपभेदों के विकास की अनुमति है। ऐसे Saccharomyces cerevisiae के रूप में पारंपरिक औद्योगिक खमीर में तनाव, का एक महत्वपूर्ण अतिरिक्त कमजोरी, असमर्थता कुशलतापूर्वक fermen करने के लिए हैसिलोज़ बायोमास संयंत्र की hydrolyzates में उपलब्ध टी।

Pichia stipitis प्रकार के तनाव NRRL वाई-7124 (CBS 5773), हाल ही में नाम बदलकर Scheffersomyces stipitis, एक देशी pentose fermenting खमीर कि अच्छी तरह से इथेनॉल के लिए सिलोज़ विक्षोभ के लिए जाना जाता है तनाव NRRL वाई-7124 के विकास के लिए यहां अपनाई थी क्योंकि यह करने के लिए दस्तावेज किया गया है। 2,3 इष्टतम मीडिया, एस में थोड़ा xylitol प्रतिफल के साथ 40 ग्राम / एल से अधिक आर्थिक रूप से वसूली इथेनॉल जमा करने के लिए मूल निवासी खमीर उपभेदों की सबसे बड़ी क्षमता है। 4,5,6 stipitis तनाव NRRL वाई-7124 0.41 ± 0.06 छ उच्च घनत्व सेल संस्कृतियों (6 ग्राम / एल कोशिकाओं) में / जी। 7,8 प्रतिरोध की उपज में 40 घंटा (1.75 छ / एल / घंटा) में 70 ग्राम / एल इथेनॉल का उत्पादन किण्वन अवरोधकों इथेनॉल, furfural, और HMF को भी सूचना दी गई है, 9 और एस stipitis सबसे होनहार मूल निवासी pentose-fermenting व्यावसायिक पैमाने इथेनॉल productio के लिए उपलब्ध yeasts के बीच में स्थान दिया गया हैn lignocellulose से। 10 हमारा उद्देश्य औद्योगिक अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त तनाव NRRL वाई-7124 की एक और अधिक मजबूत व्युत्पन्न की ओर विकास के लिए मजबूर करने के लिए विविध undetoxified lignocellulosic hydrolyzates और इथेनॉल के चयन के दबाव लागू करने के लिए किया गया था। मांग की बेहतर सुविधाओं के बीच कुंजी केंद्रित hydrolyzates में तेजी से चीनी तेज दर, अधिक कुशल मिश्रित चीनी उपयोग के लिए कम diauxy, और इथेनॉल और अवरोधकों के उच्च tolerances थे। एस के आवेदन undetoxified hydrolyzates करने के लिए इस तरह के stipitis overliming रूप हायड्रोलायसेट विषहरण प्रक्रियाओं, के साथ जुड़े जोड़ा परिचालन खर्च को खत्म करने के लिए अनुसंधान के एक प्रमुख ध्यान केंद्रित किया गया था।

दो औद्योगिक रूप से होनहार hydrolyzates विकास के लिए मजबूर करने के लिए लागू किया गया:। Saccharified अमोनिया फाइबर विस्तार-pretreated मकई पशुओं का चारा हायड्रोलायसेट (AFEX CSH) एंजाइम और तनु अम्ल-pretreated switchgrass हायड्रोलायसेट शराब (PSGHL) 11,12 AFEX pretreatment प्रौद्योगिकी के लिए विकसित किया जा रहा हैकिण्वन अवरोधकों के उत्पादन को कम करते हुए तनु अम्ल pretreatment वर्तमान सबसे कम लागत प्रौद्योगिकी का प्रतिनिधित्व सबसे अधिक एंजाइमी शर्करीकरण के लिए cellulosic बायोमास को बेनकाब करने का अभ्यास किया। PSGHL सेल्यूलोज pretreatment के बाद शेष से वियोज्य है और विशेषतया hydrolyzed hemicellulose से सिलोज़ में समृद्ध है, लेकिन ग्लूकोज में कम है। AFEX CSH और PSGHL रचनाओं महत्वपूर्ण पहलुओं जो विकास की प्रक्रिया का प्रबंधन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था में एक-दूसरे से भिन्न होते हैं। AFEX CSH PSGHL (तालिका 1) के साथ तुलना furan एल्डीहाइड और एसिटिक एसिड अवरोधकों में कम है, लेकिन अमीनो एसिड और अमोनिया नाइट्रोजन स्रोतों में अधिक है। PSGHL प्रमुख चीनी उपलब्ध होने सिलोज़ के अतिरिक्त चुनौती प्रस्तुत करता है। इस प्रकार PSGHL विशेष रूप से, hydrolyzates में सिलोज़ उपयोग में सुधार के लिए संतुष्ट करने के लिए एक कमजोरी उपलब्ध खमीर के वाणिज्यिक उपयोग को रोकने के लिए उचित है। यहाँ तक कि मूल निवासी pentose fermenting खमीर बीच, सबऑप्टिमल चीनी जाइलो पर निर्भरताएसई सेल के विकास का समर्थन करने के लिए और मरम्मत के लिए और भी अधिक कारणों की एक किस्म की वजह से hydrolyzates में चुनौतीपूर्ण हो जाता है। पोषक तत्वों की कमी, अवरोधकों संरचनात्मक अखंडता, और चयापचय के लिए व्यवधान सेल व्यापक क्षति के कारण redox असंतुलन के कारण 9 नाइट्रोजन पूरकता, खासकर के रूप में अमीनो एसिड, fermentations के लिए एक महत्वपूर्ण परिचालन लागत का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं। अलग स्क्रीनिंग और रैंकिंग पर नाइट्रोजन पूरकता का प्रभाव switchgrass hydrolyzates साथ पता लगाया था।

सुधार व्यक्तियों एस के प्राकृतिक आनुवंशिक विविधता पर निर्भर एकाधिक चयन के दबाव का उपयोग कर एक उभरती आबादी में समृद्ध थे stipitis जनसंख्या और म्यूटेशन दो विविध hydrolyzates, इथेनॉल या पराबैंगनी विकिरण के लिए जोखिम द्वारा प्रेरित किया। चयन के दबाव में समानांतर और श्रृंखला में लागू किया गया एस के विकास प्रगति का पता लगाने के लिए वांछित बढ़ने और hydrolyzates में कुशलता विक्षोभ करने में सक्षम डेरिवेटिव की ओर stipitis(चित्रा 1)। तेजी से चुनौतीपूर्ण hydrolyzates में कार्यात्मक आबादी का दोहराव संवर्धन या तो 12% Glucan AFEX CSH के कमजोर पड़ने श्रृंखला रोजगार वरना PGSHL 20% ठोस लोडिंग पर तैयार microplates में पूरा किया गया। निरंतर संस्कृति में सिलोज़ पर इथेनॉल को चुनौती दी विकास के आवेदन के आगे कम संवेदनशीलता का प्रदर्शन सिलोज़ उपयोग का दमन इथेनॉल के लिए phenotypes के लिए समृद्ध AFEX CSH अनुकूलित आबादी में सुधार हुआ। उत्तरार्द्ध सुविधा हाल ही में ग्लूकोज किण्वन के बाद तनाव NRRL वाई-7124 से pentose उपयोग करने के लिए समस्याग्रस्त दिखाया गया था। PSGHL पर 8 संवर्धन अगले हायड्रोलायसेट कार्यक्षमता को व्यापक बनाने का पता लगाया था।

एस के ख्यात में सुधार डेरिवेटिव stipitis NRRL वाई-7124 विकास प्रक्रिया तनाव की स्थिति और कमजोर पड़ने चढ़ाना के तहत लक्षित संवर्धन का उपयोग करते हुए सबसे अधिक प्रचलित आबादी से कालोनियों लेने के लिए के प्रत्येक चरण से अलग थे। आयामरहित रिश्तेदारप्रदर्शन सूचकांक (RPIs) समग्र प्रदर्शन, जहां गतिज व्यवहार अलग हायड्रोलायसेट प्रकार और पोषक तत्वों की खुराक लागू किया पर मूल्यांकन किया गया था पर आधारित उपभेदों पद के लिए इस्तेमाल किया गया। विभिन्न प्रक्रियाओं अनुकूलन की सफलता एस की कार्यक्षमता में सुधार करने के लिए यद्यपि lignocellulosic hydrolyzates में stipitis पहले से प्रलेखित किया गया है, undetoxified hydrolyzates पर किफायती इथेनॉल उत्पादन का प्रदर्शन उपभेदों पहले से नहीं बताया गया है। 13-17 विकास प्रक्रियाओं का उपयोग और अधिक विस्तार में यहाँ देखे जा करने के लिए, Slininger एट अल। 18 विकसित उपभेदों कि काफी अधिक सुधार कर रहे हैं माता पिता के तनाव NRRL वाई-7124 और AFEX CSH में> 40 ग्राम / एल इथेनॉल का उत्पादन और saccharified switchgrass हायड्रोलायसेट (SGH) उचित रूप से नाइट्रोजन स्रोतों के साथ पूरक एंजाइम करने में सक्षम हैं। ये उपन्यास उपभेदों इथेनॉल उद्योग को विकसित करने के lignocellulose को भविष्य में ब्याज की और अतिरिक्त जीनोमिक्स के अध्ययन के निर्माण के विषय के रूप में कर रहे हैं19 पहले से अनुक्रम तनाव NRRL वाई-11545 के उन लोगों पर। चित्रा 1 में diagramed आनुवंशिक परिवर्तन है कि एक प्रस्तावना तनाव सुधार अनुसंधान और आगे के रूप में विकास के दौरान हुई के इतिहास को स्पष्ट होता है विकास के विभिन्न चरणों के दौरान उत्पादन शीर्ष उपभेदों के एक अध्ययन जीनोमिक्स।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Assays के लिए सामग्री और उपकरण शुरू तैयार

  1. रैंकिंग प्रक्रियाओं विकास, अलगाव में उपयोग और के लिए pretreatment प्रतिक्रिया में 18 से 20% प्रारंभिक बायोमास सूखी वजन का उपयोग कर hydrolyzates तैयार करें। Slininger एट अल। विस्तृत तरीकों के लिए 2015 18 नाइट्रोजन की खुराक एन 1 एन 2 या विकास, अलगाव या रैंकिंग में इस्तेमाल के साथ AFEX CSH, PSGHL, और SGH तैयार करने के लिए देखें। प्रत्येक हायड्रोलायसेट प्रकार की रचना के लिए 1 टेबल देखें।
    नोट: यूरिया, विटामिन-मुक्त अमीनो सहित नाइट्रोजन स्रोतों के साथ: नाइट्रोजन अनुपात (एन सी) के लिए 1 दाढ़ कार्बन: SGH-एन 1 = SGH 42 के लिए दृढ़: SGH की नाइट्रोजन किलेबंदी के रूप में निम्नानुसार SGH-एन 1 या SGH-एन 2 परिभाषित के रूप में नामित किया गया था परिभाषित स्रोतों से कैसिइन, डी, एल tryptophan, एल सिस्टीन, और विटामिन से एसिड (जैसे कि ~ दाढ़ नाइट्रोजन एन के 15% प्राथमिक अमीनो नाइट्रोजन (पैन) और है ~ एन के 85% यूरिया से है); 1: C: SGH-एन 2 = SGH 37 के लिए दृढ़ एन यूरिया और सबसे कम लागत वाणिज्यिक स्रोत ओ के रूप में सोया आटा के साथएफ अमीनो एसिड और विटामिन, पैन से एन के 12% और यूरिया के रूप में 88% प्रदान ~।
  2. निर्देशन के रूप में माता पिता के तनाव का एक lyophilized संस्कृति मोल, Scheffersomyces stipitis NRRL वाई-7124 (CBS 5773) एआरएस संस्कृति संग्रह से (कृषि उपयोग अनुसंधान के लिए राष्ट्रीय केन्द्र, न्यू यॉर्क, इलेनॉइस), और ग्लिसरॉल शेयर संस्कृतियों तैयार करते हैं। माता-पिता खमीर का जायजा संस्कृतियों और -80 डिग्री सेल्सियस पर 10% ग्लिसरॉल में उसके डेरिवेटिव बनाए रखें।
    1. खमीर माल्ट peptone डेक्सट्रोज (YM) प्लेटों अगर करने के लिए स्ट्रीक ग्लिसरॉल शेयरों (3 जी / एल खमीर निकालने, 3 जी / एल माल्ट निकालने, 5 ग्राम / एल peptone, 10 ग्राम / एल डेक्सट्रोज, 20 ग्राम / एल अग्रवाल) और सेते 48 25 डिग्री सेल्सियस। 8 विकसित प्लेटों पर 72 घंटा 4 डिग्री सेल्सियस पर एक सप्ताह तक रखा जा सकता है के रूप में तरल पूर्व संस्कृति inocula उपयोग करने से पहले।
  3. तैयार इष्टतम परिभाषित माध्यम (ODM), एक सिंथेटिक मध्यम औद्योगिक निर्माण प्रक्रियाओं 20 के साथ संगत है कि पहले माता-पिता एसटीआर से इथेनॉल के लिए सिलोज़ का इष्टतम रूपांतरण के लिए विकसित किया गया थाऐन Scheffersomyces (Pichia) stipitis NRRL वाई-7124। 7 उपयोग सभी precultures और किण्वन प्रदर्शन bioassays के लिए संस्कृतियों में परिभाषित मध्यम और भी इथेनॉल के लिए चुनौती दी है, सिलोज़ खिलाया निरंतर संस्कृति विकास। थोक व्यापारी और रचना तालिका 2 में संदर्भ के लिए सूचीबद्ध है।
  4. पहले से वर्णित के रूप में, 18, एक cuvette- या सूक्ष्म प्लेट पढ़ने स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग उचित रूप में, 620 एनएम (ए 620) पर संस्कृति absorbance को मापने के लिए सेल बायोमास का विश्लेषण। शक्कर, इथेनॉल, Furfural, hydroxymethylfurfural (HMF), और उच्च throughput के लिए उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) या ग्लूकोज की रोबोट enzymatic दृढ़ संकल्प और सिलोज़ का उपयोग कर संस्कृति के नमूनों में एसिटिक एसिड quantitate।

2. AFEX CSH पर सीरियल स्थानांतरण के दौरान मजबूत संजात को समृद्ध

  1. तनाव NRRL वाई-7124 की एक preculture टीका लगाना। 75 मिलीलीटर ODM + 150 ग्राम / एल सिलोज़ को YM अगर से कोशिकाओं स्थानांतरण ओ के तहत विकसित करने की क्षमता बनाए रखने के लिएsmotic तनाव। सेते 125 मिलीलीटर बोतल सिलिकॉन स्पंज के साथ बंद में precultures मिलाते (150 आरपीएम, 1 "की कक्षा) के साथ 25 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटा प्लग।
  2. पिघलना जमे हुए प्रयोग के लिए ठंडे पानी में 6-12% Glucan AFEX CSH की aliquots। यदि आवश्यक हो तो 5 पीएच को समायोजित करें और फिल्टर में एक कमजोर पड़ने श्रृंखला की तैयारी 96 अच्छी तरह से microplates करने से पहले बाँझ।
  3. अच्छी तरह से प्रति 50 μl और हायड्रोलायसेट कमजोर पड़ने के अनुसार 8 कुओं के साथ microplates भरें, तो अच्छी तरह से प्रति preculture के कुछ microliters के साथ टीका लगाना एक प्रारंभिक absorbance अनुमति देने के लिए (620 एनएम) एक 620 ≥0.1। नमी के लिए एक गीला कागज तौलिया के साथ एक प्लास्टिक के डिब्बे में 25 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर रुप से 24-48 घंटा प्लेटें सेते हैं।
  4. प्रारंभिक ए 620 ≥0.1 प्राप्त करने के लिए सबसे केंद्रित हायड्रोलायसेट कमजोर पड़ने कि जाहिरा तौर पर एक नया हायड्रोलायसेट कमजोर पड़ने श्रृंखला के प्रत्येक अच्छी तरह से एक 620> 1, स्थानांतरण 1-5 μl करने के लिए बढ़ी उपयोग करना।
  5. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ मॉनिटर विकास संस्कृति एक microplates में 620। एक uninoculated कमजोर पड़ने श्रृंखला सेवाएक नियंत्रण और खाली के रूप में Ves। प्लेट पलकों प्रदूषण को रोकने के लिए निगरानी के दौरान पर छोड़ दिया जाता है, और रीडिंग के अनुसार समायोजित।
  6. नियमित रूप से सुधार हुआ है स्ट्रेन के बाद अलगाव के लिए या जारी रखने हायड्रोलायसेट कमजोर पड़ने श्रृंखला reinoculating में उपयोग के लिए अनुकूलन संस्कृतियों के ग्लिसरॉल शेयरों तैयार करें। शेयरों में सबसे बड़ी हायड्रोलायसेट एकाग्रता उपनिवेश के चार कुओं (200 μl) तैयार करने के लिए, पूल। 1 मिक्स: 1 cryovials में 20% बाँझ ग्लिसरॉल के साथ, -80 डिग्री सेल्सियस पर 10% ग्लिसरॉल में कोशिकाओं को फ्रीज करने के लिए।
  7. दोहराएँ कदम 2.3-2.6 जब तक 12% Glucan AFEX CSH में वृद्धि 24 घंटे में लगातार दिख रहा है।

AFEX CSH पर संवर्धन के बाद 3. अलग सिंगल सेल सहिष्णु संजात

  1. स्ट्रीक का चयन किया YM अगर करने के लिए अनुकूलन संस्कृतियों, और उपयोग धारियाँ के ग्लिसरॉल शेयरों तीन microplate कुओं (प्रारंभिक ए 620 ~ 0.1) में से प्रत्येक में 3% या 6% Glucan AFEX CSH (5 पीएच) के 50 μl टीका लगाना। 2.3 कदम के रूप में 24 घंटा microplates सेते हैं। पूल प्रतिकृतिते मजबूत वृद्धि, और कमजोर पड़ने की थाली YM करने के लिए या 6% Glucan AFEX CSH अगर साथ उच्चतम हायड्रोलायसेट ताकत पर कुओं उपनिवेश। फिल्टर का 1 मिश्रण निष्फल गर्म autoclaved 30 ग्राम / एल अगर समाधान के साथ 12% Glucan AFEX CSH: के रूप में एक 1 उत्तरार्द्ध तैयार करें।
  2. ग्लिसरॉल शेयर संस्कृतियों के रूप में फ्रीज करने के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर बाद 24-48 घंटा ऊष्मायन उच्चतम कमजोर पड़ने की थाली दिखा विकास से 5 एकल कालोनियों उठाओ। स्ट्रीक एक YM थाली करने के लिए प्रत्येक कॉलोनी। 24 घंटा सेते हैं। एक बाँझ पाश के साथ, 10% ग्लिसरॉल की एक छोटी मात्रा के लिए कोशिकाओं का एक विकसित लकीर हस्तांतरण कोशिकाओं को निलंबित करने के मिश्रण, और -80 डिग्री सेल्सियस पर ठंड के लिए 2-3 cryovials के लिए वितरित।

4. जनक की तुलना में AFEX CSH सहिष्णु संजात के प्रदर्शन का मूल्यांकन

  1. टेस्ट सरल 6% Glucan AFEX CSH बैच संस्कृतियों में आइसोलेट्स।
    1. 48 घंटा प्लेटों से कोशिकाओं स्थानांतरण के 1 μl एक 620 = 10 उपयोग के साथ सेल निलंबन तैयार करने के लिए पीएच 7 पोटेशियम फॉस्फेट बफर (0.4 मिमी) ग्लिसरॉल शेयरों से परेशानप्रत्येक निलंबन 50 μl 3% Glucan हायड्रोलायसेट के चार कुओं में से प्रत्येक टीका लगाना करने के लिए प्रारंभिक करने के लिए एक 620 = 0.2। 2.3 कदम के रूप में 24 घंटा microplates सेते हैं। 3 बाँझ पानी के साथ: गिराए 12% Glucan AFEX CSH 1 से पीएच 5 पर 3% Glucan AFEX CSH तैयार करें।
    2. स्थानांतरण दो 24 घंटा microplate कुओं पूरी ताकत के 50% पर इस्तेमाल किया पीएच 5 से 12% Glucan AFEX CSH के 25 मिलीलीटर precultures टीका लगाना। 25 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए सिलिकॉन स्पंज closures के साथ 50 मिलीलीटर बोतल में precultures सेते हैं, ~ 150 आरपीएम (1 "की कक्षा) हायड्रोलायसेट 1 गिराए द्वारा आधा-शक्ति Glucan AFEX CSH तैयार 12%:। बाँझ पानी के साथ 1।
    3. इसी तरह की 25 मिलीलीटर विकास संस्कृतियों प्रारंभिक ए 620 = 0.1 टीका लगाना आधा ताकत हायड्रोलायसेट precultures का प्रयोग करें। ऊपर (4.1.2) के रूप में विकास संस्कृतियों सेते हैं और दैनिक (0.2 मिलीलीटर) नमूना। बायोमास के मॉनिटर राशि (ए 620) और शर्करा और किण्वन उत्पादों (एचपीएलसी) की सांद्रता।
  2. वैकल्पिक रूप से, repitch (यानी, फसल और आरeuse) 8% Glucan हायड्रोलायसेट बैच संस्कृतियों में परीक्षण के लिए 6% Glucan AFEX CSH देसी खमीर की आबादी, जैसा कि पहले वर्णन किया। 18
  3. वैकल्पिक रूप से, के रूप में पहले से वर्णित 12% Glucan हायड्रोलायसेट के साथ खिलाने से repitched 6% Glucan AFEX CSH संस्कृतियों के आगे परीक्षण की आबादी। 18
  4. मिश्रित शर्करा के साथ थोक व्यापारी के बैच संस्कृतियों में वियोजन की diauxic अंतराल का परीक्षण करें।
    1. YM ग्लिसरॉल धारियाँ से पाश हस्तांतरण द्वारा सिलिकॉन स्पंज closures के साथ 125 मिलीलीटर बोतल में 150 ग्राम / एल सिलोज़ के साथ 75 मिलीलीटर ODM के precultures टीका लगाना। 2.1 कदम के रूप में 24 घंटा सेते हैं।
    2. थोक व्यापारी और पीएच 6.5 से 75 ग्राम / एल ग्लूकोज की और 75 जी / सिलोज़ के एल युक्त साथ इसी तरह की 75 मिलीलीटर की परीक्षा संस्कृतियों टीका लगाना precultures का प्रयोग करें। 25 डिग्री सेल्सियस, 150 rpm पर बोतल हिला। दैनिक नमूना।
    3. वैकल्पिक रूप से, एक समान प्रोटोकॉल का उपयोग करके ग्लूकोज और सिलोज़ के किण्वन के दौरान diauxy पर 0-15 छ / एल एसिटिक एसिड के प्रभाव का परीक्षण को छोड़कर प्रारंभिक पीएच परीक्षण संस्कृतियों में 6.0 ± 0.2 पर सेट है पीएच 6-7 du बनाए रखने के लिएएसिटिक एसिड की खपत की अंगूठी के रूप में पहले से वर्णित। 18

5. इथेनॉल को चुनौती दी सिलोज़ उपयोग के लिए चयन करने के लिए सतत संस्कृति लागू करें

  1. थोक व्यापारी और पीएच 6.3 ± 0.2 पर 60-100 जी / एल सिलोज़, 20-50 छ / एल इथेनॉल के साथ निरंतर संस्कृति फ़ीड माध्यम के रूप में तैयार करें। 150 ग्राम / एल सिलोज़ का आंशिक किण्वन अनुकरण करने के लिए सिलोज़ और इथेनॉल के संयोजन का चयन, ~ 0.5 ग्राम इथेनॉल / जी सिलोज़ का एक संभावित उपज मानते हुए, और 50-70 छ / एल घटित करने के लिए इथेनॉल के लिए क्षमता को समायोजित करने के लिए। 8
  2. निरंतर संस्कृति inoculum तैयार करने के लिए, इथेनॉल मुक्त ODM (100 ग्राम / एल सिलोज़ के 75 मिलीलीटर के लिए एक 48 घंटा YM थाली से AFEX CSH-सहिष्णु कॉलोनी (कालोनी 5 के अनुरूप उदाहरण में, चित्रा 1) पाश से एक प्रतिनिधि के हस्तांतरण, इस मामले) 125 मिलीलीटर बोतल में में। 24 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस, 150 आरपीएम (1 "की कक्षा) पर सेते हैं। प्रारंभिक निरंतर संस्कृति पकड़े मात्रा की है कि मैच के लिए preculture ODM सिलोज़ एकाग्रता चुनें।
  3. पीएच पर थोक व्यापारी की एक सतत संस्कृति पकड़े मात्रा टीका लगाना 6.3 ± 0.2 होने के 100 ग्राम / एल सिलोज़ + 20 ग्राम / एल के साथ इथेनॉल ~ एक AFEX CSH-सहिष्णु को अलग से एक preculture ध्यान केंद्रित करने के 5-10 मिलीलीटर (कालोनी 5, चित्रा 1 के अनुरूप ) प्रारंभिक ए 620 ~ 0.5 से कम 100 मिलीलीटर प्राप्त करने के लिए। एक जैकेट 100 मिलीलीटर स्पिनर कुप्पी 200 rpm पर हड़कंप मच गया और sterilizable पीएच इलेक्ट्रोड, पीएच नियंत्रक और तापमान नियंत्रित घूम पानी स्नान के साथ outfitted में संस्कृति पकड़े मात्रा (वी आर), 25 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें।
  4. प्रारंभ में, के बाद से सेल के विकास इथेनॉल प्रदर्शन के कारण धीमी हो जाएगी, ऊपर फ़ीड मध्यम पीएच-actuated पंप का उपयोग कर खुराक के लिए निर्धारित किया है। पंप जब संस्कृति किण्वन 5.4 पीएच को आ जाता है, इस प्रकार आगे पीएच बूंद को रोकने की 100 ग्राम / एल सिलोज़ और 50 ग्राम / एल इथेनॉल के साथ पीएच 6.3 थोक व्यापारी को खिलाने के लिए सेट करें। एक प्रवाह पंप लगातार संस्कृति सतह उड़े के साथ 100 मिलीलीटर की मात्रा को बनाए रखें। नतीजतन, इथेनॉल एकाग्रता निरंतर चयापचय और खिलाने के साथ बढ़ जाता है। प्रवाह को मापने और व्यवहार्य सेल एकाग्रता, उत्पादों और substrates के विश्लेषण के लिए निरंतर संस्कृतियों से नमूने (1-2 मिलीलीटर) आकर्षित हर 48-72 घंटा के रूप में पहले से वर्णन किया। 18 व्यवहार्य सेल एकाग्रता प्राप्त करने के लिए, में नमूने के धारावाहिक 1:10 dilutions बनाना बफर (4.1.1 देखें) और प्रसार प्लेट YM अगर करने के लिए dilutions (1.2.1 देखें)। प्रवाह संग्रह दरों (क्यू) के आधार पर, कमजोर पड़ने दर (डी) (क्यू / वी आर) की गणना, और एस के उदाहरण में, stipitis, यह 0 से 0.01 घंटा तक विविध -1।
  5. बफर नमूना dilutions की व्यवहार्यता प्लेटों से अलग-थलग 30-100 कालोनियों के गठन, संवर्धन में उस समय सबसे अधिक प्रचलित मजबूत उपनिवेशों का प्रतिनिधित्व करने के लिए नियमित रूप से ग्लिसरॉल शेयरों को बचाओ। 10% ग्लिसरॉल के ~ 5 मिलीलीटर के साथ बाढ़ प्लेटों डुप्लिकेट cryovials की तैयारी की अनुमति है। रखरखाव या एक राहत के लिए, निरंतर संस्कृति रोकने के लिए और के रूप में सबसे वर्तमान (प्रतिरोधी) ग्लिसरॉल स्टॉक (एस) का उपयोग जरूरत को पुनः आरंभ।
  6. पुनः आरंभ करने के लिए, सबसे की लकीर ग्लिसरॉल स्टॉक (s)YM अगर करने के लिए प्रतिरोधी आबादी और 24-48 घंटा कोशिकाओं के रूप में ऊपर ऊष्मायन के लिए इथेनॉल मुक्त थोक व्यापारी के एक पूर्व संस्कृति के पाश से हस्तांतरण। थोक व्यापारी की मात्रा पकड़े precultured खमीर की एक ध्यान का उपयोग कर एक 620 0.5 प्रारंभिक 100 मिलीलीटर टीका लगाना, और संस्कृति बैच के लिहाज से स्थिर चरण के लिए विकसित करने से पहले फ़ीड मध्यम प्रवाह फिर आरंभ होता है अनुमति देते हैं।
  7. संस्कृतियों> 25 ग्राम / एल इथेनॉल की उपस्थिति में> 0.01 मानव संसाधन -1 में तेजी से विकसित कर सकते हैं, तो सिलोज़ पर, निरंतर संस्कृति फ़ीड (ODM + 60 ग्राम / एल सिलोज़ + इथेनॉल लेकर 30 करने के लिए 50 ग्राम / एल) एक निचले स्तर पर शुरू कमजोर पड़ने दर 0.01 ~ मानव संसाधन -1 मात्रा (शुरू में थोक व्यापारी + 60 ग्राम / एल सिलोज़ + 20 ग्राम / एल इथेनॉल) धारण करने के लिए 100 मिलीलीटर। समय के साथ, 50 ग्राम / एल की ओर फ़ीड में इथेनॉल बढ़ा। ग्लिसरॉल शेयरों में उन्नत आबादी पर कब्जा।
    नोट: कम कमजोर पड़ने दर को बनाए रखने के लिए एक उच्च पर्याप्त सेल एकाग्रता ऑक्सीजन की उपलब्धता और समर्थन किण्वन को कम करने के गठन की अनुमति देता है।
  8. वैकल्पिक रूप से, अल्ट्रा वायलेट (यूवी) लागू irradiatआयन मासिक निरंतर संस्कृतियों reinoculate करने के लिए इस्तेमाल शेयर आबादी ग्लिसरॉल करने के लिए।
    1. 60 ग्राम / एल सिलोज़, और एक एकल बाँझ फ्लास्क में सभी शेयरों पूल के साथ थोक व्यापारी के 10 मिलीलीटर में ग्लिसरॉल स्टॉक धारियाँ से Resuspend कालोनियों (precultures के रूप में)। ~ 5 एक्स 10 8 व्यवहार्य कोशिकाओं / एमएल पर जमा सेल निलंबन लागू सिर्फ 6 मिलीग्राम / थाली के साथ 4-5 पेट्री प्लेटों के नीचे से कवर करने के लिए। एक मानक प्रयोज्य पेट्री प्लेट के 6 मिलीलीटर कवरेज प्राप्त करने के लिए, सतह तनाव दूर करने के लिए 15 मिलीलीटर बांटना, और फिर 9 मिलीलीटर को हटा दें।
    2. एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में प्रकाश स्रोत से यूवी करने के लिए प्रत्येक खुली संस्कृति की थाली को बेनकाब। वांछित मार डालो दर> 90% प्राप्त करने के लिए यूवी जोखिम समय या दूरी समायोजित करें। इधर, स्रोत से लगभग 56 सेमी पर 45 मिनट के लिए बेनकाब।
    3. पहले और विकिरण के बाद प्लेट सेल निलंबन पतला। अनुमान को मार डालो दर कॉलोनी बनाने इकाइयों पर आधारित है। एस के लिए उदाहरण के stipitis, मार दर ~ 97% थी।
    4. एक पन्नी-cov के लिए यूवी उजागर संस्कृतियों (24-30 मिलीलीटर) स्थानांतरण50 मिलीलीटर कुप्पी जुटी है, और 25 डिग्री सेल्सियस और 24 घंटे के लिए 150 rpm पर सेते व्यवहार्य कोशिकाओं के छोटे प्रतिशत ~ 1 एक्स 10 8 व्यवहार्य एस को फिर से आबाद करने के लिए अनुमति देने के लिए कोशिकाओं / एमएल stipitis। तस्वीर reactivations से रोकने, पन्नी कवर म्यूटेशन को बरकरार रखता है, जबकि संस्कृतियों incubated हैं।
    5. ~ 1 10 x 7 व्यवहार्य कोशिकाओं / एमएल के लिए निरंतर संस्कृतियों टीका लगाना repopulated mutagenized संस्कृति का प्रयोग करें। इथेनॉल समृद्ध ODM + 60 ग्राम / एल सिलोज़ मध्यम फ़ीड को पुनरारंभ चयन की प्रक्रिया जारी है।

6. ग्लिसरॉल स्टॉक आबादी का मूल्यांकन करें और इथेनॉल की उपस्थिति में सुधार सिलोज़ किण्वन के साथ उन की पहचान

  1. स्ट्रीक इथेनॉल की उपस्थिति में अच्छी वृद्धि और सिलोज़ के किण्वन के लिए स्क्रीन में पहले कदम के रूप YM अगर करने के लिए ग्लिसरॉल शेयर संस्कृतियों का चयन किया।
  2. प्रत्येक विकसित जनसंख्या स्थानांतरण 150 ग्राम / एल ग्लूकोज के साथ थोक में 75 मिलीलीटर precultures करने के लिए अगर धारियाँ से जांच की जानी है, और 125 मिलीलीटर बोतल 96 में सेतेमानव संसाधन से पहले परीक्षण संस्कृतियों के लिए inocula के रूप में उपयोग करने के लिए। बड़े ग्लूकोज देसी आबादी सिलोज़ उपयोग के लिए एंजाइमों की प्रेरण की आवश्यकता होगी।
    1. प्रेरण का परीक्षण करने के लिए, प्रत्येक संस्कृति फसल, 30 मिलीलीटर कोशिकाओं को निलंबित, ODM में प्रारंभिक 40 वर्ष की एक 620 60 जी / एल सिलोज़ + 30-45 छ / एल इथेनॉल, और 25 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं, 150 आरपीएम (1 "की कक्षा) सिलिकॉन स्पंज closures के साथ 50 मिलीलीटर बोतल में। नमूनों में दो बार एचपीएलसी विश्लेषण द्वारा सिलोज़ तेज की निगरानी के लिए दैनिक ड्रा।
  3. वैकल्पिक रूप से, Slininger में वर्णित के रूप एट अल।, 18 सिलोज़ पर विकास इथेनॉल की उपस्थिति में, आकलन 125 मिलीलीटर बोतल में 150 ग्राम / एल सिलोज़ के साथ थोक व्यापारी के 75 मिलीलीटर के लिए लूप हस्तांतरण द्वारा प्रत्येक विकसित आबादी का precultures तैयार करते हैं, और 96 सेते 25 डिग्री सेल्सियस, 150 आरपीएम (1 "की कक्षा) में मानव संसाधन। 125 मिलीलीटर बोतल में थोक व्यापारी + 60 ग्राम / एल सिलोज़ + 30-45 छ / एल इथेनॉल के 25 मिलीलीटर में 0.1 की एक कम प्रारंभिक ए 620 के लिए परीक्षण संस्कृतियों टीका लगाना। सेते 25 डिग्री सेल्सियस पर बोतल, 300 आरपीएम, 1 "की कक्षा और नमूना।

  1. चरण 6 के परिणामों के आधार पर, ग्लिसरॉल शेयर बेहतर पर आगे बढ़ने और इथेनॉल की उपस्थिति में सिलोज़ विक्षोभ करने की क्षमता दिखा आबादी का चयन करें। लकीर प्लेटों के लिए इन का प्रयोग करें। लकीर प्लेटें एक 620 = 5. तो सेल निलंबन एक 620 = 0.5 के लिए 96 गहरी अच्छी तरह प्लेटों में precultures टीका लगाना करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं के घने, बफर सेल निलंबन तैयार करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। 1 ODM + 50 जी / एल सिलोज़ (कोई इथेनॉल) के साथ: PSGHL पर 1 मिलीलीटर precultures मिलाया 1 टीका लगाना। खाली कुओं से 96 अच्छी तरह से, निकाल कम वाष्पीकरण के साथ गहरे अच्छी तरह प्लेटें 25 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटा, 400 आरपीएम, 1 "कक्षा के लिए शामिल किया गया है। अलग अलग ग्लिसरॉल स्टॉक आबादी में precultures सेते हैं।
  2. प्रत्येक preculture का प्रयोग, टीका लगाना सोलह 1 मिलीलीटर दोहराने संस्कृतियों प्रारंभिक ए 1 में 620 ~ 0.5: 1 PSGHL: ODM + 50 ग्राम 20 के साथ / एल सिलोज़, 30, या 40 जी / एल सहिष्णु colonists संतुष्ट करने के लिए इथेनॉल। संवर्धन cultu सेतेprecultures को इसी तरह से रेस।
  3. प्रत्येक अलग ग्लिसरॉल स्टॉक के लिए, फसल उच्चतम इथेनॉल एकाग्रता के विकास और सिलोज़ उपयोग की अनुमति के साथ संस्कृति कुओं। YM अगर करने के लिए प्रत्येक कोशिका लाइन प्लेट प्रचलित एकल कालोनियों प्राप्त करने के लिए ग्लिसरॉल में संरक्षित करने के लिए। ग्लिसरॉल स्टॉक तैयार करने के लिए एक YM अगर प्लेट को सेल लाइन और लकीर प्रत्येक प्रति दस कालोनियों उठाओ।

8. इसके अलावा, PSGHL पर सीरियल स्थानांतरण के दौरान मजबूत विकसित खींच समृद्ध AFEX CSH के लिए के रूप में

  1. NRRL वाई-7124 (माता-पिता) के पूर्व संस्कृतियों को तैयार है, AFEX CSH-सहिष्णु को अलग विकसित किया है, और निरंतर संस्कृति इथेनॉल की उपस्थिति में सिलोज़ का उपयोग करने की क्षमता के साथ बढ़ाया आबादी विकसित हुआ। के रूप में AFEX CSH हायड्रोलायसेट अनुकूलन की प्रक्रिया के लिए (2.1 कदम) ऊपर वर्णित ग्लिसरॉल स्टॉक धारियाँ से पाश से थोक व्यापारी + 150 ग्राम / एल सिलोज़ के 75 मिलीलीटर टीका लगाना।
  2. पानी के साथ पतला PSGHL बढ़ती सांद्रता की एक श्रृंखला प्रदान करते हैं। प्रत्येक का उपयोग करके तीन सेल लाइनों में से प्रत्येक के लिए एक 96 अच्छी तरह से सूक्ष्म थाली तैयारPSGHL कमजोर पड़ने 50 μl के साथ 8 कुओं को भरने के लिए। प्रारंभिक ए 620 ~ 0.1-0.5 कमजोर पड़ने श्रृंखला में से प्रत्येक के 50 μl सूक्ष्म संस्कृति टीका लगाना preculture का प्रयोग करें।
    1. AFEX CSH हायड्रोलायसेट ऊपर (चरण 2) विस्तृत अनुकूलन के रूप में एक ही प्रक्रिया का उपयोग कर जब तक संस्कृतियों ΔA 620 की एक स्थिर 14-डी औसत अनुपात Δtime के अनुसार कम से पूरी ताकत हायड्रोलायसेट में विकसित करने के लिए सक्षम हैं बढ़ रही PSGHL की ताकत में खमीर का विकास जारी धारावाहिक स्थानान्तरण एक अतिरिक्त चार महीने जारी कर रहे हैं।

9. अलग एकल सेल कालोनियों के साथ या इथेनॉल चुनौती के बिना PSGHL ढ़ाल का उपयोग

  1. प्राप्त एकल कोशिका YM अगर करने के लिए कमजोर पड़ने चढ़ाना द्वारा पूरी ताकत PSGHL अंतिम अनुकूलन प्लेटों से सीधे आइसोलेट्स। के रूप में पहले (3.2 कदम) में वर्णित ग्लिसरॉल शेयरों तैयार करने के लिए तीन सेल लाइनों और YM प्लेटों के लिए बार लकीर से प्रत्येक के लिए दस बड़े कालोनियों उठाओ।
  2. वैकल्पिक रूप से, पहले के समय में अंक का पता लगानेतीन सेल लाइनों की संग्रहीत ग्लिसरॉल शेयरों से अलग से विकास की प्रक्रिया।
    1. ग्लिसरॉल स्टॉक धारियाँ से पाश से प्रत्येक कोशिका लाइन के लिए एक preculture टीका लगाना और (50 मिलीलीटर बोतल, 25 डिग्री सेल्सियस, 150 आरपीएम) 30 मिलीलीटर ODM + 50 जी / एल सिलोज़ पर 24 घंटा सेते हैं।
    2. एक प्रारंभिक एक 620 ~ 0.2 microplate कुओं में 50% PSGHL के 50 μl inoculating और स्थिर रुप से 48 घंटा incubating द्वारा हायड्रोलायसेट में वृद्धि करने के precultures से चैलेंज कोशिकाओं।
    3. PSGHL ढाल अगर से 0 से 50% ताकत हायड्रोलायसेट (पहुंचाने ~ 300-400 प्रति प्लेट व्यवहार्य कोशिकाओं) लेकर प्लेटों पर प्रत्येक समृद्ध संस्कृति के 0.1 मिलीलीटर बिखरा हुआ है, और ढाल के उच्चतम संभव हायड्रोलायसेट एकाग्रता क्षेत्र से सेल लाइन प्रति 10 एकल कालोनियों लेने । 21 स्ट्रीक 3.2 कदम के रूप में ग्लिसरॉल स्टॉक तैयार करने के लिए YM कालोनियों उठाया।
    4. एक विकल्प के 9.2.3 कदम, बजाय ढाल अगर प्लेट inoculating के रूप में, 96 अच्छी तरह से सूक्ष्म प्लेटों के कुओं टीका लगाना प्रारंभिक ए 620 ~ 0.2 whe,पुन कुओं में 10 से 40 ग्राम / एल के लिए 50 से 100% ताकत और इथेनॉल से हायड्रोलायसेट सांद्रता का एक सीमा को रोकने के लिए तैयार कर रहे हैं। इस मामले में, सूक्ष्म प्लेटों 72-96 मानव संसाधन विकसित करने और अन्यथा 2.3 कदम के रूप में। सख्त से सख्त हायड्रोलायसेट इथेनॉल कमजोर पड़ने चढ़ाना के माध्यम से विकास दिखा संयोजन के कुओं से दस एकल कालोनियों को अलग, और 3.2 कदम के रूप में ग्लिसरॉल शेयरों तैयार करते हैं।

10. एक प्राथमिक स्क्रीन में, दो पोषक तत्व शर्तों पर तुलना और PSGHL पर प्रदर्शन रैंकिंग द्वारा अवर आइसोलेट्स हटा दें

  1. स्क्रीन करने के लिए PSGHL प्रदर्शन का एक उच्च throughput गहरी अच्छी तरह से थाली स्क्रीन लागू तीस के पांच सेट NRRL वाई-7124 माता पिता और AFEX CSH-सहिष्णु अलग (चित्रा 1 विकास उदाहरण के कालोनी 5 के अनुरूप) के साथ-साथ आइसोलेट्स नियंत्रण छह शीर्ष उपभेदों का चयन करने के रूप में प्रत्येक सेट से (20%) माध्यमिक स्क्रीनिंग स्तर (12 कदम) को पारित करने के लिए।
  2. गहरी अच्छी तरह से अच्छी तरह से प्रति 1 मिलीलीटर भरा और वाई कवर प्लेट में स्क्रीन बाहर लेकाले सिलिकॉन कम बाष्पीकरणीय जवानों के साथ वें स्टेनलेस स्टील पलकों। इनक्यूबेटर / शेखर बोर्ड के लिए सभी प्लेटों दबाना और 25 डिग्री सेल्सियस और 400 आरपीएम (1 "प्रकार के बरतन कक्षा) में कार्य करते हैं। डिजाइन सभी गहरी अच्छी तरह से पैटर्न भरने खुले कुओं से अलग वियोजन की जुदाई की अनुमति देने के लिए थाली।
  3. खेती शुरू करने के लिए, 30 से तैयार ग्लिसरॉल धारियाँ से कोशिकाओं का मनका लेने से ऊपर के रूप में प्राप्त आइसोलेट्स ODM + 50 जी / एल सिलोज़ के कुओं नकली और 48 घंटा सेते (चरण 3, 7, और 9 में)।
  4. थोक व्यापारी + 10 जी / एल ग्लूकोज + 50 जी / एल सिलोज़ के साथ 1: वियोजन preculturing के लिए एक चुनौती के रूप में मध्यम, 1 मिश्रण PSGHL से 50% PSGHL तैयार करते हैं। 30 वियोजन और दो नियंत्रण में तनाव, 16 वियोजन में से प्रत्येक के प्रति 2 कुओं के साथ 2 प्लेटें स्क्रीनिंग के लिए भर रहे हैं, विभिन्न वियोजन के बीच खाली कुओं को छोड़कर।
  5. चुनौती संस्कृतियों, स्थानांतरण के लिए, वियोजन से प्रत्येक के लिए दो 50% PSGHL चुनौती संस्कृति कुओं में से प्रत्येक के लिए थोक व्यापारी और पूर्व संस्कृतियों की एक 50 μl मात्रा (ए 620 ~ 10) और एक initi प्राप्त करने के लिए नियंत्रित करता हैअल एक 620 ~ 0.5 और 72 घंटा सेते हैं।
  6. विभिन्न पोषक तत्वों की समृद्धि के दो परीक्षण मीडिया का उपयोग स्क्रीनिंग आइसोलेट्स के लिए: 60% PSGHL + थोक व्यापारी और पोषक तत्वों; और 75% PSGHL + थोक व्यापारी + YM पोषक तत्वों। मानक के रूप में शक्ति के आधे पर थोक व्यापारी और पोषक तत्वों (शर्करा को छोड़कर) जोड़ें थोक व्यापारी और 50 ग्राम / एल चीनी (1.3 चरण) के साथ उपयोग करने के लिए। के रूप में नामित, 3 जी / एल खमीर निकालने, 3 जी / एल माल्ट निकालने, 5 ग्राम / एल peptone के मानक शक्ति के आधे पर YM पोषक तत्वों (शर्करा को छोड़कर) जोड़ें।
  7. दो परीक्षण मीडिया से प्रत्येक के लिए प्रारंभिक करने के लिए एक 620 ~ पाँच गहरे कुओं में 0.5 1,000 μl टीका लगाना 72 घंटा 50% PSGHL चुनौती पूर्व संस्कृतियों के 50 μl स्थानांतरित द्वारा परीक्षण संस्कृतियों टीका लगाना।
  8. प्रत्येक दैनिक को अलग नमूना। इथेनॉल, ग्लूकोज और सिलोज़ उच्च throughput विश्लेषण के लिए supernate प्राप्त करने के लिए एक microfuge ट्यूब और सेंट्रीफ्यूज (5533 XG, 15 मिनट) के लिए एक अच्छी तरह की सामग्री को पिपेट। एक में 620 96 अच्छी तरह से सूक्ष्म प्लेट (200 μl / अच्छी तरह से) एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ के रूप में बायोमास उपाय।
  9. भीतर 30 के प्रत्येक सेट हैolates परीक्षण (एस stipitis NRRL वाई-7124 के लिए 5 सेट विकसित उपभेदों), रिश्तेदार प्रदर्शन अनुक्रमित (आरपीआई) के नीचे 11 कदम में वर्णित के रूप में गणना और इथेनॉल उपज (अधिकतम इथेनॉल की आपूर्ति की प्रारंभिक चीनी प्रति संचित) के आधार पर प्रत्येक तनाव पद के लिए उपयोग करें और सिलोज़ तेज दर दोनों परीक्षण मीडिया पर (सिलोज़ एकाग्रता प्रारंभिक 96 घंटा के प्रति खपत)।

11. रैंक प्राथमिक PSGHL स्क्रीन में आइसोलेट्स रिश्तेदार प्रदर्शन सूचकांक (आरपीआई) का उपयोग करना

  1. प्राथमिक जांच के बाद, आदेश पद के लिए 30 पांच अलग-अलग प्रयोगों में से प्रत्येक में अलग कर स्क्रीन प्रयोग के प्रति दो अलग पोषक तत्व योगों, यानी, 60% और 75% PSGHL PSGHL साथ PSGHL पर आइसोलेट्स करने में आयामरहित रिश्तेदार प्रदर्शन सूचकांक (आरपीआई) की गणना।
  2. एफ = (XX औसत) / एस: एक भी प्रयोग में परीक्षण किया वियोजन के एक समूह के भीतर अलग प्रदर्शन रैंकिंग में उपयोग के लिए सांख्यिकीय पैरामीटर एफ गणना। इधर, एक्स प्रदर्शन पैरामीटर, इस तरह के रूप में उपज है (वाई)या दर (आर), प्रत्येक व्यक्ति को अलग करने के लिए मनाया, जबकि एक्स औसत और एस, औसत और मानक विचलन हैं क्रमशः, के एक्स मनाया सब एक दिया प्रयोग के भीतर अलग कर लिए। सामान्य वितरण के लिए, -2 <एफ <2।
  3. प्रत्येक एक प्रयोग में अलग-थलग लिए, × 100/4 रिश्तेदार प्रदर्शन दर के आधार पर, आरपीआई आर = (2 + F आर) की गणना, और इसी तरह उपज पर आधारित रिश्तेदार प्रदर्शन की गणना, आरपीआई वाई = (2 + F वाई) × 100/4 । आरपीआई के मूल्य (सबसे कम उच्चतम करने के लिए) ~ 0 से 100 पर्सेंटाइल के बीच है। फिर आरपीआई का औसत प्रत्येक एक दिया हायड्रोलायसेट प्रयोग के भीतर अलग-थलग करने के लिए इस प्रकार के रूप में गणना: आरपीआई औसत = (आरपीआई Y + आरपीआई आर) / 2, जहां उपज और दर योगदान इस आवेदन में बराबर भार दिया जाता है।
    ध्यान दें कि सामान्य रूप में, उपज और दर मानकों को यदि महत्व में असमान समझा भारित जा सकता है।
  4. समग्र आरपीआई: आरपीआई कंप्यूट समग्र परीक्षण किया hydrolyzates के एन प्रकार भर में मैं = 1, एन [(आरपीआई Y + आरपीआई आर) / 2] मैं / एन। प्रत्येक 30 वियोजन और 2 नियंत्रण की एक प्रयोगात्मक सेट में अलग-थलग पर विचार करें। ~ 150 एकल कॉलोनी के प्राथमिक रैंकिंग के दौरान सिलोज़ अमीर PSGHL के लिए अनुकूलित आइसोलेट्स, आरपीआई कुल मिलाकर, दरों में और दो PSGHL योगों भर पैदावार स्क्रीन में लागू करने के लिए गणना की है यानी, 60% और 75% PSGHL PSGHL, जहाँ n = 2।
  5. कुल मिलाकर एक प्रयोग के भीतर आरपीआई के आधार पर, माध्यमिक स्क्रीन करने के लिए पारित करने के लिए वियोजन के शीर्ष प्रतिशत चुनें। इस उदाहरण में, तनाव के शीर्ष 20% के माध्यम से (यानी, 150 के 30 परीक्षण) पारित करने के लिए चुना जाता है।

12. एक माध्यमिक स्क्रीन में, कई पूरा Hydrolyzates (> 100 ग्राम / एल मिश्रित शुगर्स) पर शीर्ष प्राथमिक स्क्रीन कलाकारों की तुलना प्रकट करने के लिए उच्चतम कार्य मजबूत खींच

  1. 6% पर शीर्ष PSGHL कलाकारों की तुलना Glucan AFEX CSH और SGH नाइट्रोजन, SGH-एन 1 और SGH-एन 2 (रचना के दो स्तर के साथ में संशोधनअंतिम रैंकिंग के लिए तालिका 1) के रूप में एस। 30 वियोजन कि PSGHL के प्राथमिक गहरी अच्छी तरह से थाली स्क्रीन में शीर्ष कलाकारों थे स्क्रीन (कदम 10 और 11) और दो नियंत्रण (माता पिता के तनाव NRRL वाई-7124 और AFEX CSH-सहिष्णु अलग (कालोनी 5, चित्रा 1 उदाहरण के अनुरूप )।
  2. पहले के रूप में 1 मिलीलीटर ODM + 50 जी / एल सिलोज़ के गहरे कुओं नकली और गहरी अच्छी तरह से थाली सिस्टम (कदम 10.2) में 48 घंटा सेते ग्लिसरॉल धारियाँ से कोशिकाओं का मनका उठा द्वारा खेती शुरू करो। फिर ~ 10 पर एक 620 प्राप्त करने के लिए 72 घंटे के लिए 50% SGH चुनौती संस्कृतियों के लिए थोक व्यापारी precultures के 50 μl हस्तांतरण, और गहरी अच्छी तरह से थाली सिस्टम में सेते हैं)। 1 बिना चीनी थोक व्यापारी + 50 जी / एल सिलोज़ (पीएच 5.6) के साथ: 1 मिश्रण SGH से 50% SGH तैयार करें।
  3. वियोजन में से प्रत्येक के लिए, प्रारंभिक परीक्षा संस्कृति एक 620 ~ 2.0 उपज के लिए चुनौती संस्कृति के तीन कुओं से सेल गोली (15 मिनट, 2,711 XG) के साथ SGH-एन 1 या SGH-एन 2 के एक 16 मिलीलीटर विभाज्य टीका लगाना। 25 & # पर परीक्षण संस्कृतियों सेते176;। सी, 180 आरपीएम सिलिकॉन स्पंज closures के साथ 25 मिलीलीटर बोतल में (1 "की कक्षा) नमूना बोतल दैनिक और PSGHL स्क्रीन प्रति विश्लेषण।
  4. इसी तरह, स्क्रीन कदम 12.2 और 12.3 के रूप में अलग कर, लेकिन इस बार चुनौती संस्कृति के माध्यम से और परीक्षण संस्कृति के माध्यम से तैयार करने में इस्तेमाल के लिए पीएच 5.2 पर स्थानापन्न SGH-एन 1 और SGH-एन 2 6% Glucan AFEX CSH के साथ। 50% ताकत चुनौती संस्कृतियों के लिए, 6% AFEX CSH 1 पतला उपयोग करें: पानी के साथ 1 के बाद से यह नाइट्रोजन के लिए पर्याप्त है संशोधन के बिना।
  5. दोहराएँ कदम 12.1-12.4 परिणाम नकल करने के लिए।

13. रैंक माध्यमिक स्क्रीन में आइसोलेट्स का प्रदर्शन कुल मिलाकर एकाधिक पूरा Hydrolyzates की दर का उपयोग करने के लिए आरपीआई का प्रयोग

  1. आदेश वियोजन के ऊपर 20% से प्रत्येक पद के लिए में रिश्तेदार प्रदर्शन सूचकांक (आरपीआई) की गणना (~ 30 150 में से) प्राथमिक स्क्रीन है कि एंजाइम पर माध्यमिक स्क्रीन में परीक्षण किया गया है से पोषक तत्वों की समृद्धि बदलती के हायड्रोलायसेट योगों saccharified।
  2. स्कोर प्रत्येकसिलोज़ तेज दर और इथेनॉल उपज तीन एंजाइम saccharified pretreated हायड्रोलायसेट योगों पर प्रदर्शन के आधार पर माध्यमिक स्क्रीन में परीक्षण को अलग दो प्रतियों में चलाने के लिए, AFEX CSH (i = 1 और 2), SGH-एन 1 (i = 3 और 4) और SGH सहित -N2 (i = 5 और 6)।
  3. प्रत्येक को अलग-थलग करने के लिए समग्र आरपीआई की गणना करें, और आगे बेहतर वियोजन की सूची फटकना इस रैंकिंग पैरामीटर लागू होते हैं: आरपीआई समग्र = Σ मैं = 1, एन [(आरपीआई Y + आरपीआई आर) / 2] मैं / n, जहाँ n = 6 ।
    नोट: Slininger एट अल में प्रक्रियाओं का पालन करते हुए कुप्पी संस्कृतियों में SGH-एन 2 hydrolyzates में बेहतर वियोजन के कैनेटीक्स प्रदर्शित करता है 18।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

एस stipitis तीन चयन संस्कृतियों, जो AFEX CSH, PSGHL, और इथेनॉल को चुनौती दी सिलोज़ खिलाया निरंतर संस्कृति शामिल के संयोजन का उपयोग कर विकसित किया गया था। चित्रा 1 से पता चलता वियोजन के साथ प्रदर्शन किया विकास प्रयोगों के योजनाबद्ध आरेख या तो सबसे अधिक प्रभावी ढंग से प्रदर्शन करने के लिए मिला कुल मिलाकर, या सबसे hydrolyzates का परीक्षण में से एक पर प्रभावी ढंग से। तालिका 3 इन बेहतर वियोजन की NRRL परिग्रहण संख्या पता चलता है और समृद्ध आबादी जिसमें से प्रत्येक तनाव पृथक किया गया प्राप्त करने की प्रक्रिया में लागू अनुकूलन तनाव का सार। कुछ वियोजन एक या दो हायड्रोलायसेट प्रकार पर बेहतर प्रदर्शन किया है रिश्तेदार को देखा गया था, लेकिन 11 में से 7 वियोजन हायड्रोलायसेट प्रकार के सभी पर अच्छा प्रदर्शन किया है, भले ही इनमें से अधिकांश संपर्क में है और विकास के दौरान केवल एक ही प्रकार से चुनौती दी थी। विभिन्न विकास की सफलता यहाँ लिया दृष्टिकोण आंकड़े 2 में प्रदर्शन कर रहे हैं -7 और तालिका 4।

चित्रा 2 अलग सुधार अनुकूलन के पहले चरण में जो तनाव NRRL वाई-7124 के मजबूत डेरिवेटिव AFEX CSH (चरण 2) की सांद्रता में वृद्धि करने के लिए धारावाहिक स्थानांतरण के दौरान समृद्ध थे के बाद देखा दर्शाया गया है। 6% Glucan AFEX CSH पर बढ़ती संस्कृतियों में, विकसित आबादी अधिक तेजी से संचय और माता पिता के तनाव से इथेनॉल के उच्च अंतिम titers को दर्शाता है। अधिक तेजी से ग्लूकोज उपयोग भी अधिक तेजी से सिलोज़ तेज तुरंत ग्लूकोज की कमी के बाद साथ-साथ देखा जाता है। इसके अतिरिक्त चित्रा 3 में, बदल जनसंख्या की स्थिरता सुविधाओं 87 जी / एल ग्लूकोज और 66 जी / एल सिलोज़ का एक मिश्रण के साथ सिंथेटिक मध्यम ODM में प्रदर्शन किया है। इस मामले में, दोनों समृद्ध आबादी (चित्रा 3 बी) और अलग कालोनियों (1 कॉलोनी और कॉलोनी 5, चित्रा -3 सी और 3 डी, Respectively) और अधिक कुशलता से सिलोज़ का उपयोग कर अधिक तेजी से इथेनॉल बनाने के लिए, कम से कम 4 दिनों से इथेनॉल चोटी के समय को कम करने से माता पिता के तनाव को मात करने में सक्षम हैं। गौरतलब है कि उच्च सांद्रता इथेनॉल माता पिता (40-45 ग्राम / एल) की तुलना में थोक व्यापारी पर विकसित उपभेदों (55-60 ग्राम / एल) द्वारा जमा किए गए थे। म्यूटेशन, जो ग्लूकोज सिलोज़ संक्रमण और अधिक कुशल सिलोज़ किण्वन के दौरान कम diauxy की एक स्थिर phenotype के लिए नेतृत्व किया, उठी रूप में खमीर जनसंख्या AFEX CSH में विकसित हुआ।

कालोनी 5 के लिए आगे सुधार के लिए 50 ग्राम / एल अप इथेनॉल के स्तर में वृद्धि की उपस्थिति में सिलोज़ खिलाया निरंतर संस्कृति में प्राकृतिक चयन करने के लिए इसे प्रस्तुत करने से पीछा कर रहे थे। इस शर्त के तहत, खमीर निरंतर संस्कृति में बनाए रखा जनसंख्या यह एक स्थिर कमजोर पड़ने के बावजूद एक दर काफी उच्च fermentor आबाद करने के लिए कम से विकसित करने के लिए सक्षम होने के लिए आदेश में एकमात्र कार्बन स्रोत के रूप में उपयोग के लिए सिलोज़ एंजाइमों के लिए प्रेरित करने में सक्षम होना चाहिएमूल्यांकन करें। माता पिता के तनाव में, सिलोज़ एंजाइमों की प्रेरण इथेनॉल सांद्रता में हिचकते जा करने के लिए के रूप में कम 15-20 के रूप में जी / एल शुरू होता है। कॉलोनी 5 से 8 संजात निरंतर संस्कृति के आपरेशन के जल्दी और देर समय बिंदुओं पर ग्लिसरॉल शेयरों में कब्जा कर लिया गया, और चित्रा 4 NRRL वाई-7124 माता-पिता और प्रारंभिक कालोनी 5 प्रक्रिया के लिए टीका के साथ तुलना में 40 ग्राम / एल इथेनॉल कालोनी 5 विकसित डेरिवेटिव में मनाया की उपस्थिति में सिलोज़ उपयोग करने में सफल सुधार दर्शाता है।

चित्रा 1 के अनुकूलन योजना के सभी चरणों से उत्पन्न होने वाली वियोजन PSGHL में जांच की गई सिलोज़ विक्षोभ के लिए (चरण 10.1) बेहतर करने की क्षमता के साथ उन लोगों की पहचान करने के लिए। चित्रा 5 में दिखाया वियोजन और नीचे के रूप में वर्णित ~ 150 इस प्राथमिक स्क्रीन में स्थान से बाहर PSGHL पर सबसे अच्छा में कलाकारों के बीच प्रदर्शन के सभी माध्यमिक स्क्रीन में हैं। विकसित वियोजन के सुधार का संकेत करने के लिएउनके माता पिता के सापेक्ष, प्रत्येक को अलग से प्रदर्शन माता पिता के तनाव के लिए अलग की गतिज पैरामीटर मूल्यों के अनुपात के रूप में व्यक्त की गई थी। के अनुपात मूल्यों "एक" हुआ है, तो अलग प्रदर्शन माता-पिता के बराबर था। 5a आंकड़े और संक्षेप में 5 ब शीर्ष 60% और 75% थोक व्यापारी या ODM + YM पोषक तत्वों की खुराक के साथ PSGHL की ताकत पर प्रदर्शन को अलग। जैसा कि हायड्रोलायसेट एकाग्रता और कठोरता बढ़ गया था, प्रदर्शन अनुपात में कमी आई है। 60% ताकत PSGHL में, सात शीर्ष के पांच PSGHL चयन करने के लिए दबाव NRRL वाई-7124 की तुलना में बेहतर कई बार (अलग-थलग 1) उजागर आइसोलेट्स प्रदर्शन किया। चार वियोजन कालोनी 5 (अलग-थलग 33) है, जो AFEX CSH को प्रदर्शन के दौरान विकसित किया था लेकिन PSGHL करने के लिए कोई पिछले चयनात्मक प्रदर्शन किया था की तुलना में बेहतर प्रदर्शन किया। हालांकि, PSGHL के 75% शक्ति में केवल 3 काफी दोनों माता पिता और कॉलोनी 5 (अलग-थलग 33) जोड़ा पोषक तत्वों के बावजूद पार आइसोलेट्स। इनमें से बेहतर आइसोलेट्स 15 और 16 थे previously एक चयन दबाव विकास मार्गदर्शक के रूप में PSGHL की सांद्रता में वृद्धि के साथ चुनौती दी। 15 आइसोलेट्स, 14 और 3 ही, PSGHL से अवगत कराया गया है, जबकि 11, 13 और 16 कई जोखिम था। 3 आइसोलेट्स, 11, और 13 PSGHL पर विकास के दौरान पहले के समय बिंदुओं से थे और इसलिए 14, 15 और 16 की तुलना में सहिष्णुता का विकास करने के लिए कुछ हद तक कम अवसर था जबकि यह चित्रा 5 में स्पष्ट है PSGHL की ताकत बढ़ाने के लिए सीरियल हस्तांतरण सेवा की है कि इसकी निरोधात्मक पर्यावरण के लिए मजबूत उपभेदों विकसित करने के लिए है, यह भी स्पष्ट है कि अकेले माता-पिता तनाव AFEX CSH को NRRL वाई-7124 के प्रदर्शन के संभावित PSGHL पार सहिष्णुता के साथ इस तरह कॉलोनी के रूप में 5 (33) वियोजन उत्पन्न कर सकता है। इस प्रकार, यह संकेत दिया गया था मजबूत कई hydrolyzates में प्रदर्शन करने में सक्षम उपभेदों एक हायड्रोलायसेट किसी अन्य रूप में प्रदर्शन स्क्रीनिंग के द्वारा पीछा में सहिष्णुता के संवर्धन के द्वारा पाया जा सकता है। सिलोज़ खिलाया निरंतर संस्कृति से प्राप्त वियोजन भी PSGHL के साथ 60% और 75% ताकत पर जांच की गईआदेश में इथेनॉल चुनौती को बनाए रखने और ग्लूकोज उपयोग निम्न सिलोज़ पर diauxic अंतराल का परीक्षण करने में पोषक तत्वों और कम से 75 ग्राम / एल को भी जोड़ा ग्लूकोज। आइसोलेट्स जबकि 27, 28 और 30 अनुकूलन के इस चरण से दूसरों से बेहतर थे, दोनों की उपज और सिलोज़ तेज दर प्रदर्शन अनुपात जोड़ा ODM और YM पोषक तत्वों के साथ 75% PSGHL पर माता पिता, जो जरूरी आश्चर्य की बात में है कि कोई भी नहीं पड़ा है के समान थे इस हायड्रोलायसेट करने के लिए पिछले जोखिम (यहां संस्कृतियों के लिए नहीं दिखाया अतिरिक्त डेटा के लिए यह भी देखना Slininger एट अल। 18 75 ग्राम / एल ग्लूकोज प्रदान की)।

सिलोज़ अमीर PSGHL पर प्राथमिक स्क्रीन से चयनित सबसे अच्छा उपभेदों बाद में तीन पूरा hydrolyzates पर जांच की गई। ये hydrolyzates (तालिका 1) AFEX CSH और पतला एसिड pretreated एसजी वाणिज्यिक cellulases के साथ इलाज किया और दो अलग अलग नाइट्रोजन का स्तर (SGH-एन 1 और SGH-एन 2) में पूरक शामिल सबसे बहुमुखी आईएसओ की पहचान करने के लिएअवरोध और पोषण के माहौल में बदलाव के संबंध में lates। रिश्तेदार प्रदर्शन सूचकांक (RPIs) प्रत्येक हायड्रोलायसेट (चित्रा 6A) के भीतर अलग-थलग प्रत्येक के किण्वन के लिए गणना की गई। चित्रा 6B चलता संयुक्त समग्र प्रदर्शन से प्रत्येक के लिए गणना की सूचकांकों अलग। पांच वियोजन (3, 14, 27, 28, 33) 60 से ऊपर समग्र आरपीआई था, जो हायड्रोलायसेट की विविधताओं और पोषक तत्व की स्थिति संयुक्त के सभी के लिए सबसे मजबूत के रूप में उन्हें स्थान पर रहीं। 3 टेबल की समीक्षा करते हुए दोनों को अलग कर 3 और 14 PSGHL में विकसित किया गया था, जबकि 27, 28, और 33 AFEX CSH या AFEX CSH और इथेनॉल को चुनौती दी सिलोज़ पर निरंतर संस्कृति में विकसित किया गया। उपभेदों बेहतर कई हायड्रोलायसेट उपयोग प्रदर्शन में से कोई भी एक से अधिक हायड्रोलायसेट पर विकसित किया गया था।

कुछ उपभेदों थे "विशेषज्ञों" या तो SGH-एन 1/2 या AFEX CSH पर बेहतर प्रदर्शन। उन वियोजन SGH पर विशेषज्ञों के रूप में सबसे अच्छा प्रदर्शनhydrolyzates (11, 16 और 9) अंतिम या केवल चुनौती के रूप में PSGHL पर विकास द्वारा प्राप्त किया गया। 11 आइसोलेट्स और 16 है, जो शुरू में AFEX CSH चुनौती बढ़ रही है के माध्यम से समृद्ध थे के लिए, कुशलता AFEX CSH उपयोग करने की क्षमता को सक्रिय रूप से PSGHL में लंबा अंतिम संवर्धन के दौरान चयनित नहीं किया गया था, और महत्वपूर्ण आनुवंशिक इसके उपयोग का समर्थन करने वाले कारकों जाहिर खो गए थे। इसके विपरीत, आइसोलेट्स 14, 25, 27, 30 और 33 AFEX CSH पर बेहतर प्रदर्शन करने और सभी को छोड़कर अलग के साथ 14 या इथेनॉल चुनौती के बिना AFEX CSH पर विकसित किए गए थे। तो उम्मीद के रूप में, AFEX CSH पर विकास का निर्देशन या PSGHL खमीर अच्छी तरह से चयन हायड्रोलायसेट के लिए अनुकूलित के लिए चयन करने के लिए जाती थी। इस संबंध में एक अपवाद को अलग अलग 14. 14 PSGHL से उत्पन्न केवल चुनौती और अंतिम PSGHL संवर्धन संस्कृति की YM अगर कमजोर पड़ने चढ़ाना से पृथक किया गया था। Slininger एट अल। 18 इस को अलग से पता चला है की उपस्थिति में ग्लूकोज विकसित कोशिकाओं में सिलोज़ एंजाइम प्रेरण की बेहतर क्षमता है5-15 छ / एल एसिटिक एसिड और diauxic अंतराल ग्लूकोज सिलोज़ संक्रमण बिंदु से पहले होने वाली है, 75 ग्राम / एल ग्लूकोज और सिलोज़ से प्रत्येक के साथ थोक व्यापारी पर कम> 30 ग्राम / एल इथेनॉल के बावजूद।

विकसित उपभेदों के बेहतर कैनेटीक्स माता पिता के तनाव एस के सापेक्ष के रूप में तालिका 4 में दिखाया गया stipitis NRRL वाई-7124 का प्रदर्शन किया गया, निम्न स्तर वातन कुप्पी एक 620 8.4 ± 2.5 75 मिलीलीटर SGH-एन 2 प्रारंभिक टीका संस्कृतियों के परिणाम (6.2 पीएच) 25 में सिलिकॉन स्पंज टोपी के साथ 125 मिलीलीटर बोतल में incubated का प्रतिनिधित्व डिग्री सेल्सियस, 150 आरपीएम (1 "की कक्षा), और चित्रा 7, मध्यम वातन कुप्पी एक 50 मिलीलीटर प्रति 620 मिलीलीटर 0.5 23 में SGH-एन 2 कुप्पी प्रारंभिक टीका संस्कृतियों का प्रतिनिधित्व करने में। 18 इन शर्तों के लिये सुझाव ऑपरेशन के दो अलग अलग प्रकार का प्रतिनिधित्व एस stipitis द्वारा संभावित व्यावसायिक रूप से इथेनॉल उत्पादन के लिए होनहार होने के रूप में साहित्य। 8,22 एफआइआर मेंनिम्न स्तर वातन के टी उदाहरण के लिए, उच्च घनत्व सेल तेजी से किण्वन तुरंत शुरू करने के लिए प्रदान करता है। दूसरा उदाहरण में जबकि, कम सेल घनत्व और लघुगणक विकास के लिए उच्च स्तर वातन नेतृत्व आबादी का निर्माण और इथेनॉल के लिए विकास से जुड़े चीनी रूपांतरण तेजी लाने के। इन आंकड़ों को विकसित उपभेदों माता पिता के तनाव से अधिक महत्वपूर्ण गतिज फायदे हैं का प्रदर्शन: और अधिक तेजी से ग्लूकोज तेज दर (तालिका 4), और अधिक तेजी विशिष्ट सिलोज़ तेज दर (तालिका 4), और अधिक तेजी से इथेनॉल उत्पादकता दोनों ग्लूकोज और सिलोज़ और समग्र पर (तालिका 4), छोटे अंतराल विकास पूर्ववर्ती (चित्रा 7), और कम diauxic ग्लूकोज संक्रमणकालीन अंतराल सिलोज़ करने के लिए। इन सुधारों इथेनॉल से अधिक 40 ग्राम / एल और पीक करने के लिए दिन पहले (चित्रा 7) से माता-पिता NRRL वाई-7124 के लिए देखा गया था करने के लिए जमा करने के लिए अनुमति दी। उच्च कुल इथेनॉल उत्पादकता (तालिका 4) 5 समय 1.5 पर हासिल की थीमाता पिता का तनाव (तालिका 4), के विकसित तनाव के आधार पर है।

आकृति 1
चित्रा 1:। Scheffersomyces stipitis अनुकूलन प्रवाह चार्ट आरेख दिखाए अनुकूलन प्रक्रिया के दौरान लागू तनाव के आदेश और बेहतर वियोजन (कोष्ठक में संख्या) की वसूली के अंक इंगित करता है। यह भी देखें तनाव पहचान के लिए संदर्भ के रूप में 3 टेबल अलग कुंजी। समय उन्मुखीकरण प्रदान करने के लिए, लाल रंग में संख्या अनुकूलन के प्रत्येक चरण में दिनों की संख्या से संकेत मिलता है। AFEX CSH और सिलोज़ अमीर PSGHL में सीरियल हस्तांतरण चरणों के लिए, अनुकूलन के प्रत्येक दिन लगभग 2-4 पीढ़ियों का प्रतिनिधित्व करता है। निरंतर संस्कृति चरण (205 दिनों की कुल) के लिए, कमजोर पड़ने दर डी में ~ 0-0.1 मानव संसाधन चर रहा था -1 के दौरान पीएच-actuated खिलाने के साथ आपरेशन के 125 घ। अगले80 दिन, आपरेशन एक पीढ़ी समय (एल.एन. 2) / 58 घंटा, या स्थिर अवस्था में प्रति 2.4 डी 1 पीढ़ी की (डी) उपलब्ध कराने 0.012 मानव संसाधन -1 डी के साथ एक सतत प्रवाह में किया गया था। अगले 205 दिन निरंतर संस्कृति से अनुकूलित आबादी का एक नमूना यूवी प्रकाश के साथ mutagenized और 0.012 मानव संसाधन -1 डी के साथ संचालित एक सतत संस्कृति को टीका दिया गया था। (Slininger एट अल। 18 से reproduced) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। 6% Glucan AFEX CSH की बेहतर बैच किण्वन Scheffersomyces stipitis NRRL वाई-7124 माता पिता के तनाव किण्वन का 6% Glucan AFEX CSH (ए) के साथ तुलना की जाती है 5 6% Glucan AFEX-pretreated मकई पशुओं का चारा घंटा की कालोनी किण्वन अनुकूलितydrolyzate (बी)। प्रतीकों बायोमास (लाल चौक), ग्लूकोज (धराशायी लाइन के साथ काले वृत्त), सिलोज़ (ठोस लाइन के साथ नीले वृत्त), इथेनॉल (हरा त्रिकोण), और xylitol (बैंगनी डायमंड) को नामित। (Slininger एट अल। 18 से reproduced) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: माता-पिता तनाव एस के लिए मिश्रित शर्करा के साथ परिभाषित माध्यम में diauxic अंतराल कम किण्वन प्रदर्शन ODM में तुलना कर रहे हैं 66 जी / एल ग्लूकोज और 87 जी / एल सिलोज़ के साथ। stipitis NRRL वाई-7124 (ए), AFEX CSH वाई-7124 (बी) से व्युत्पन्न आबादी, एकल कोशिका कॉलोनी 1 अनुकूलित एस से अलग अनुकूलित stipitis आबादी (सी), एकल कोशिका Coloएनवाई 5 अनुकूलित आबादी (डी) से अलग किया। प्रतीकों बायोमास (लाल चौक), ग्लूकोज (धराशायी लाइन के साथ काले वृत्त), सिलोज़ (ठोस लाइन के साथ नीले वृत्त), इथेनॉल (हरा त्रिकोण), xylitol (बैंगनी हीरा), और adonitol (काला बढ़त के साथ सोने की हीरे की) नामित। (Slininger एट अल। 18 से reproduced) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: इथेनॉल कालोनी 5. हायड्रोलायसेट सहिष्णु कालोनी 5 की प्रतिरोधी डेरिवेटिव आगे एकमात्र कार्बन स्रोत और इथेनॉल के उच्च स्तर के रूप में सिलोज़ युक्त ODM पर निरंतर संस्कृति सेलेक्शन विकसित किया गया था। दो व्युत्पन्न ग्लिसरॉल स्टॉक आबादी चयन प्रक्रिया (2A.1.53R, नारंगी त्रिकोण और धराशायी लाइन) में जल्दी प्राप्त की और एकनिरंतर संस्कृति inocula (2A.1.30R.2, बैंगनी चक्र और धराशायी लाइन) के fter पराबैंगनी विकिरण NRRL वाई-7124 माता पिता के तनाव (ठोस लाइन के साथ हरे रंग चक्र) और AFEX CSH सहिष्णु कालोनी 5 (काला त्रिकोण के साथ साथ तुलना में दिखाया जाता है ठोस रेखा)। सिलोज़ तेज घने 40 ग्राम / एल इथेनॉल के साथ ODM में ग्लूकोज देसी खमीर की आबादी (ए 620 = 50) ने संकेत दिया है कि सभी अनुकूलित उपभेदों सिलोज़ चयापचय के लिए प्रेरित करने की क्षमता में unadapted माता पिता के पार। (Slininger एट अल। 18 से reproduced) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5:। माता-पिता की तुलना में सहिष्णु को अलग से प्रदर्शन में सुधार के अनुपात बेहतर सहिष्णु वियोजन के प्रदर्शन के सापेक्ष संक्षेप हैंनियंत्रण माता पिता के तनाव PSGHL में से प्रत्येक के निर्माण (ए, बी) के लिए NRRL वाई-7124। प्रदर्शन सिलोज़ तेज दर के मामले में मूल्यांकन किया गया (नीले सलाखों के माता पिता के लिए अलग से अनुपात में प्रतिनिधित्व) और आपूर्ति की चीनी प्रति इथेनॉल उपज (हरी माता पिता के लिए अलग से अनुपात में प्रतिनिधित्व करने वाले सलाखों)। (Slininger एट अल। 18 से reproduced) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6: पृथक आरपीआई के आधार पर रैंकिंग। रिश्तेदार प्रदर्शन सूचकांक (आरपीआई) अवधारणा आदेश 33 पद के लिए में माध्यमिक स्क्रीन के प्रदर्शन के परिणामों के लिए लागू किया गया था प्रत्येक हायड्रोलायसेट सिलोज़ तेज दर और आपूर्ति की चीनी प्रति इथेनॉल उपज पर आधारित प्रकार के भीतर आइसोलेट्स। (ए) के सापेक्ष भागाकिसी भी अलग से राजा हायड्रोलायसेट प्रकार पर निर्भर करता था (पी <0.001): SGH-एन 1 (नीले सलाखों), SGH-एन 2 (लाल बार) और AFEX CSH (हरे रंग की सलाखों)। (बी) कुल मिलाकर आरपीआई सभी हायड्रोलायसेट प्रकार भर में गणना (हल्के नीले रंग की सलाखों) विभिन्न हायड्रोलायसेट शर्तों भर में सबसे मजबूत प्रदर्शन के साथ बेहतर उपभेदों संकेत दिया। (Slininger एट अल। 18 से reproduced) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
चित्रा 7: एस के बेहतर अनुकूलित वियोजन का तुलनात्मक SGH fermentations stipitis। सुपीरियर वियोजन अनुकूलित और उनके माता पिता के तनाव NRRL वाई-7124 कम प्रारंभिक में 25 डिग्री सेल्सियस पर तनु अम्ल-pretreated switchgrass (20% ठोस लोडिंग) के enzymatic hydrolyzates fermenting और प्रारंभिक पीएच 6.2 तुलना कर रहे हैं सेल घनत्व। बायोमास के समय पाठ्यक्रम (लाल वर्गों), ग्लूकोज (काले घेरे और धराशायी लाइन), सिलोज़ (नीले हलकों और ठोस लाइन), और इथेनॉल (हरा त्रिकोण) दिखाए जाते हैं। त्रुटि सलाखों मतलब मूल्य प्रतीकों द्वारा चिह्नित के बारे में सीमा प्रतिनिधित्व करते हैं। (Slininger एट अल। 18 से reproduced) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 1:। खेती में इस्तेमाल hydrolyzates की रचनाओं (। Slininger एट अल 18 से reproduced) इस तालिका डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 2: Scheffersomyces stipitis NRRL वाई-7124 7 के लिए इष्टतम परिभाषित माध्यमटीपीएस: //www.jove.com/files/ftp_upload/54227/54227table2.xlsx "> कृपया यहाँ इस तालिका डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें।

तालिका 3:। बायोमास संयंत्र की hydrolyzates के किण्वन के लिए बेहतर सहिष्णु Scheffersomyces stipitis उपभेदों का सारांश (। Slininger एट अल 18 से reproduced) इस तालिका डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

सारणी 4: पर switchgrass हायड्रोलायसेट SGH-एन 2 वियोजन का तुलनात्मक कैनेटीक्स प्रारंभिक टीका एक 620 = 8.4 ± 2.5 दरें ग्लूकोज या सिलोज़ खपत के दौरान इकाई absorbance के प्रति सामान्यीकृत दरों रहे हैं।। (Slininger एट अल से Reproduced। 18) इस टा डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करेंble।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

कई कदम विकास की प्रक्रिया की सफलता के लिए महत्वपूर्ण थे। सबसे पहले, यह वांछित phenotypes कि सफल आवेदन के लिए आवश्यक हैं की ओर जनसंख्या विकास ड्राइव करने के लिए उचित चयन के दबाव का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है। निम्नलिखित चयनात्मक तनाव एस के लिए चुने गए विकास stipitis और उचित समय पर लागू किया वांछित phenotypes के लिए मार्गदर्शन करने के संवर्धन: 12% Glucan AFEX CSH (जो एसिटिक एसिड और furan एल्डीहाइड और अन्य अवरोधकों के निम्न स्तर की उपस्थिति में वृद्धि और विविध शर्करा के किण्वन बलों) की बढ़ती ताकत; सिलोज़ इथेनॉल एकाग्रता (जो मजबूर करता है सिलोज़ एंजाइम प्रेरण diauxic अंतराल को कम करने के लिए) में वृद्धि के साथ निरंतर संस्कृतियों से तंग आ गया; और बढ़ती 20% ठोस लोड हो रहा है PSGHL (जो उच्च एसिटिक एसिड, furans, और अन्य अवरोधकों की उपस्थिति में वृद्धि और सिलोज़ के किण्वन बलों) की ताकत। दूसरा, यह ठंड ग्लिसरॉल द्वारा विकसित हो रहा खमीर आबादी की रक्षा के लिए महत्वपूर्ण हैजनसंख्या के नमूने के रूप में tocks संवर्धन प्रक्रिया प्रगति। जनसंख्या के इस तरह के स्नैपशॉट विकास प्रगति करने के लिए दस्तावेज़ और वांछित के रूप में बाद में isolations अनुमति देने के लिए, या एक अंतराल के बाद विकास प्रक्रियाओं को पुनः आरंभ करने के लिए समय-समय पर कार्यात्मक परीक्षण के लिए भंडारित किया जा सकता है। विकास प्रक्रिया में एक तीसरा महत्वपूर्ण कदम (जैसे कि अगर या एक तनाव ढाल हायड्रोलायसेट और / या इथेनॉल सांद्रता की एक श्रृंखला पेश करने वाले सूक्ष्म प्लेटों के रूप में) एक सुविधाजनक चयनात्मक मीडिया पर चयन संस्कृति आबादी या ग्लिसरॉल रखता आबादी को समृद्ध बनाने के द्वारा असाधारण वियोजन ठीक करने के लिए था । फिर जीवित रहने का सबसे तनावपूर्ण स्थिति के तहत बढ़ रही कालोनियों बाद में लक्षण वर्णन के लिए संरक्षित करने के लिए उठाया जा सकता है। इन तीन बुनियादी कदम एक एकल चक्र अगर उचित में प्रत्येक अतिरिक्त वांछित phenotype के चयन के दबाव का पीछा करने के लिए दोहराया जा सकता है, या, वैकल्पिक रूप से, कई दबावों। मूल निवासी माता पिता खमीर जनसंख्या विभिन्न तनावों से अवगत कराया जाता है, आनुवंशिक विविधता वें उठता है की उम्मीद है किसी न किसी प्राकृतिक या प्रेरित म्यूटेशन, और जारी रखा जोखिम प्राकृतिक चयन के लिए सबसे अधिक लाभकारी प्रतिस्पर्धी अस्तित्व समर्थन परिवर्तन के साथ व्यक्तियों के लिए संतुष्ट करने के लिए अनुमति देगा। यह उम्मीद है कि चयनित फेनोटाइप कई आनुवंशिक परिवर्तन का एक परिणाम के रूप में हो जाएगा। ऊपर प्रोटोकॉल में, म्यूटेशन यूवी इलाज के दौरान या संभावित hydrolyzates करने के लिए खमीर के प्रदर्शन के दौरान प्रेरित किया जा सकता है। Hydrolyzates सूक्ष्मजीवों के लिए हानिकारक यौगिकों के तीन वर्गों को शामिल करने के लिए जाना जाता है। कार्बोक्जिलिक एसिड होता है, एल्डीहाइड और phenolics ऐसे furfural और 5 hydroxymethylfurfural, कोशिकाओं को नुकसान पहुंचा और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों की ऊंचाई (आरओएस), में आम तौर पर उत्पन्न पैदा कर सकता है के रूप में 22 रिएक्टिव एल्डीहाइड, माइटोकॉन्ड्रिया। आरओएस अच्छी तरह से बढ़ावा देने और एल्डीहाइड और mutagenic आरओएस के mutagenic प्रभाव तालमेल कायम कर सकते हैं, कोशिकाओं में डीएनए उत्परिवर्तन पैदा करने के लिए जाना जाता है। 23,24 phenolics hydrolyzates में मौजूद है, हालांकि पहले से genotoxic होना करने के लिए नहीं जाना जाता है। 25

jove_content "> उत्तरोत्तर चुनौतीपूर्ण वातावरण की चरणबद्ध रणनीति phenotype सुधार की एक श्रृंखला के साथ विकसित उपभेदों का निर्माण करने की उम्मीद है, दोनों को निशाना बनाया और भी गैर निशाना बनाया। यह कुछ गैर लक्षित phenotypes पैदा हो सकता है कि उस अवांछनीय या अस्थिर कर रहे हैं संभव है। आदेश में सबसे उच्च कामकाज और मजबूत उपभेदों पर कब्जा करने के लिए, एक अतिरिक्त महत्वपूर्ण कदम है कि लिया जाना चाहिए मूल्यांकन और व्यावसायिक रूप से प्रासंगिक लक्षण के लिए चयनित किया वियोजन तुलना करने के लिए, दोनों लक्षित और गैर लक्षित phenotypes के लिए पहुँच रहा है। ऐसा करने के लिए, अलग-थलग प्रदर्शन में तुलना की जानी चाहिए आवेदन उन्मुख तनाव की स्थिति है, इस तरह अलग-अलग अवरोध चुनौतियों और पोषक तत्व योगों, सबसे अच्छा समग्र उपभेदों कि स्थिर और व्यापक औद्योगिक lignocellulosic सब्सट्रेट भिन्नता को मजबूत कर रहे हैं के चयन की अनुमति के साथ hydrolyzates में के रूप में की एक किस्म है। इसके अतिरिक्त, एक तनाव स्थिरता चुनौती में शामिल किया जा सकता है के रूप में preculturing कदम involv शामिल करके उदाहरण में किया गया था स्क्रीनदो गैर-चयनित मीडिया, कई एक अतिरिक्त 6-7 पीढ़ियों के लिए 50 ग्राम / एल सिलोज़ के साथ सिंथेटिक थोक व्यापारी द्वारा पीछा किया पीढ़ियों के लिए YM अग्रवाल, में प्रदर्शन करने की चुनौती के लिए जोखिम से पहले वांछित संस्कृति लक्षण की अस्थिरता के लिए अवसर देने पर प्रारंभिक खमीर विकास आईएनजी हायड्रोलायसेट। ऐसे इथेनॉल उपज और सिलोज़ तेज दर के रूप में महत्वपूर्ण प्रदर्शन सुविधाओं, के आधार पर, वियोजन तो प्रत्येक अलग तनाव हालत में, इस तरह का परीक्षण प्रत्येक हायड्रोलायसेट वातावरण है, जो अलग के संवर्धन संस्कृति के माध्यम से अलग हो सकता है के रूप में स्थान दिया है। आयामरहित आरपीआई औसत समग्र रिश्तेदार प्रदर्शन और वियोजन के पद तुलना की जा रही गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एक आयामरहित कारक hydrolyzates के विभिन्न प्रकारों में रिश्तेदार प्रदर्शन और इस तरह की पैदावार दरों बनाम के रूप में अलग अलग प्रदर्शन के मूल्यांकन के आधार पर प्रतिबिंबित करने के लिए उपयुक्त है। यह रैंकिंग प्रक्रिया उपभेदों कि प्रदर्शन लगातार अच्छा भर में विकास की स्थिति और hydr में व्यापक बदलाव के पहचानतीolyzates और दोनों मजबूत और आनुवंशिक रूप से स्थिर हो उपयुक्त हैं।

विभिन्न पुनरावृत्तियों और इन बुनियादी कदम के संशोधनों किसी भी माइक्रोबियल lignocellulosic hydrolyzates या हित के अन्य substrates पर विशेष या अद्वितीय प्रदर्शन सुविधाओं के लिए सक्षम तनाव के विकास को समायोजित करने के लिए आवश्यक हो सकता है। एस में उदाहरण के stipitis, यह महत्वपूर्ण है कि पोषक तत्वों की पूरकता, कम लागत वाणिज्यिक स्रोतों सहित उच्च ठोस लोडिंग पर तैयार hydrolyzates के लिए, नोट करने के लिए गया था स्क्रीनिंग के दौरान सांख्यिकीय जुदाई में सुधार के लिए अलग प्रदर्शन के गतिशील रेंज को नियंत्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है। केंद्रित निरोधात्मक hydrolyzates के सफल किण्वन के लिए पोषक तत्वों के महत्व को भी पहले से सूचित कर दिया गया है और अमीनो एसिड और अन्य तरह के तनाव की स्थिति का एक परिणाम के रूप में सेल रखरखाव, redox संतुलन, और मरम्मत के लिए आवश्यक पोषक तत्वों के लिए एक ऊंचा आवश्यकता के कारण माना जाता है, विशेष रूप से सिलोज़ उपयोग के दौरान। 9,26,27इसके अलावा, यदि पोषक तत्वों भी विरल या बहुत विपुल हैं, अलग प्रदर्शन में मतभेद कठिन सांख्यिकीय रूप से पता लगाने के लिए किया जा सकता है कारण सभी वियोजन बेहद खराब कर रही है, या सभी बेहद अच्छी तरह से कर रही है, क्रमशः। प्रदर्शन में अच्छी तरह के तहत विभिन्न परिस्थितियों विश्वसनीय, या औद्योगिक शर्तों में बदलाव करने के लिए मजबूत होने की उम्मीद कर रहे हैं करने में सक्षम आइसोलेट्स।

इस प्रोटोकॉल का मुख्य सीमा यह है कि अनुकूली विकास और स्क्रीनिंग परिणाम में बहुत शाब्दिक हैं, में है कि "एक के बाद एक समृद्ध करती है और स्क्रीन के लिए क्या मिल जाएगा" है। इस प्रकार, संवर्धन और स्क्रीन की स्थिति बढ़ाना और phenotypes में क्रमश व्यक्तियों की पहचान, वांछनीय परिवर्तन के साथ, जबकि अभी भी वांछनीय पूर्व मौजूदा लक्षण को बनाए रखने के लिए तैयार किया जा करने की जरूरत है। विकास को प्रभावित कर सकता लक्षण है कि औद्योगिक प्रदर्शन (जैसे, वृद्धि कारक आवश्यकताओं) के लिए महत्वपूर्ण हैं के लिए गैर का चयन किया। इस कारण से, एक विशेषता के लिए जनसंख्या संवर्धन प्रगति पर नजर रखने के लिए समय समय पर होने की जरूरत हैअवांछनीय परिवर्तनों के लिए समस्या निवारण की एक विधि के रूप में अन्य लक्षण के लिए एड। उदाहरण के लिए, एस के अद्वितीय तत्वों में से एक के लिए stipitis अपने मूल पर आगे बढ़ने और सिलोज़ विक्षोभ की क्षमता है। सभी संवर्धन और स्क्रीनिंग substrates अवरोधकों की उपस्थिति में एकमात्र या कुंजी योगदान कार्बन स्रोत के रूप में सिलोज़ शामिल थे। नतीजतन, इस उदाहरण में संवर्धन संस्कृतियों के सभी की एक आम विशेषता यह है कि वे सीधे और अधिक तेजी से सिलोज़ के उपयोग में तनाव, जिसका आबादी क्योंकि वे बेहतर प्रतियोगियों थे धारावाहिक या निरंतर संवर्धन में अधिक से अधिक समृद्ध बन गया है के लिए चुना गया था। एक उद्देश्य परिणाम के रूप में, सुधार उपभेदों सभी को और अधिक तेजी से सिलोज़ तेज करने में सक्षम थे, लेकिन इथेनॉल उपज के लिए सुधार बहुत कम सिलोज़ तेज दर में सुधार की तुलना में नाटकीय थे। उत्तरार्द्ध प्रवृत्ति होने की संभावना के बारे में आया था के बाद से इथेनॉल उपज माता पिता के तनाव से अपेक्षाकृत अधिक थी पर चारों ओर 0.3 ग्राम / जी, या सैद्धांतिक का 60% (0.51 g / छ), के रूप में सेल के विकास hydrolyzates में स्थिर हो गया है, के लिए कम कमरे में जासुधार की। संस्कृतियों में, उच्च इथेनॉल पैदावार संभवतः के खिलाफ है क्योंकि इथेनॉल वृद्धि अवरोध है, जो इस विशेषता के लिए विकसित किया गया आबादी के प्रदर्शन की निगरानी जरूरी है का चयन किया जा सकता है। इथेनॉल सांद्रता विकास निषेध के लिए स्तर के नीचे रखा एक चयन कारक के रूप में यह बेअसर करने के लिए करते हैं जाएगा। एस के लिए जबकि 64 जी / एल विकास पूरी तरह से रोकता है stipitis NRRL वाई-7124, 40 ग्राम / एल इथेनॉल हिस्सों विशिष्ट वृद्धि दर। 28 इथेनॉल में चुनौती दी निरंतर संस्कृतियों तंग आ सिलोज़, वेंटिलेशन कम रखा गया था और कमजोर पड़ने की दर भी करने के लिए उपस्थित पर्याप्त सिलोज़ के साथ काफी कम रखा गया था पालक किण्वन के बजाय इथेनॉल के श्वसन और एक अवांछित इथेनॉल उपयोग की संपत्ति के लिए संवर्धन रोकने के। इसके अतिरिक्त, प्रदर्शन स्क्रीन में इस्तेमाल hydrolyzates करने के लिए पोषक तत्वों की खुराक सोच समझकर इतनी के रूप में इस तरह के खमीर निकालने के रूप में एक महंगा अमीर पोषक तत्वों की आपूर्ति की आवश्यकता होगी, तनाव, के लिए चयन से बचने के लिए डिजाइन किए गए थे। की खुराक हमेशा सबसे कम लागत वाणिज्यिक स्रोतों शामिल उपलब्ध नहीऐसे सोया आटा और यूरिया के रूप में ई, हालांकि इस तरह के YM में के रूप में अमीर घटकों जैसे कि 60% और 75% PSGHL जो सामान्य रूप से नाइट्रोजन की ख़ाली कर रहे हैं के योगों में के रूप में तुलनात्मक परीक्षण, के लिए मिलकर संस्कृतियों में लागू किया गया। थोक व्यापारी और सिंथेटिक मध्यम, preculture और प्रदर्शन संस्कृति स्क्रीन में इस्तेमाल किया, मूल रूप से माता पिता के तनाव एस के अनुकूलतम प्रदर्शन के लिए डिजाइन किया गया था stipitis NRRL वाई-7124 संस्कृति के माध्यम से अनुकूलन दिनचर्या व्यापारी प्रोटीन 20 जो विटामिन, खनिज, purines और pyrimidines, और एमिनो एसिड सूत्रों लागत प्रभावी औद्योगिक पैमाने पर अप का उपयोग कर के साथ संगत पोषक तत्वों की आपूर्ति सहित परिभाषित सामग्री, की सिफारिश द्वारा वर्णित के अनुसार 7 वाणिज्यिक स्रोतों। प्रासंगिक उपभेदों डिजाइन में एक अंतिम सिफारिश की उम्मीद औद्योगिक प्रक्रिया की स्थिति के लिए संभव के रूप में के रूप में प्रासंगिक संवर्धन और स्क्रीन की स्थिति के डिजाइन रखने के लिए है।

लागत प्रतियोगी अक्षय इथेनॉल लंबे आर करने के लिए अपनाई गई हैजीवाश्म ईंधन पर निर्भरता निष्कर्ष निकालना। एस की क्षमता में सुधार करने के लिए stipitis NRRL वाई-7124, बर्दाश्त बढ़ने और lignocellulose की निरोधात्मक hydrolyzates विक्षोभ के लिए, कई शोधकर्ताओं अधिक LiMing detoxify करने lignocellulosic बायोमास की तनु अम्ल-pretreatment से उत्पन्न सिलोज़ अमीर शराब में दोहराव संवर्धन। 13,14,16,17 का इस्तेमाल किया है अवरोधकों अभी भी दृढ़ लकड़ी और गेहूं के भूसे pretreatment शराब पर जल्दी अनुकूलित स्ट्रेन के प्रदर्शन का एक उचित स्तर की अनुमति की जरूरत थी। यूवी mutagenesis और जीनोम फेरबदल की 13,14 एकाधिक बार-बार चक्कर लगाने एस के डेरिवेटिव विकसित करने के लिए लागू किया गया है में सुधार अवरोध सहिष्णुता और दृढ़ में वृद्धि के साथ stipitis NRRL वाई-7124 sulfite शराब (HWSSL) खर्च किए। 16,17 हालांकि, इथेनॉल सांद्रता HWSSL में इन उपभेदों द्वारा उत्पादित 10 जी / 6 से 7 दिनों के बाद एल के अधीन थे। तकनीक दिखाया गया है और यहाँ वर्णित है, एस के नए विकसित उपभेदों का उपयोग stipitis NRRL वाई-7124 phenoty पूरा करने के लिए विकसित किए गए5-6 पीएच ऐसी है, जो महंगा अपशिष्ट निपटान के लिए होता है-Liming के ऊपर के रूप में पूर्व विषहरण उपायों के बिना पर hydrolyzates के किण्वन;: पीई लक्ष्यों को किफायती वाणिज्यिक उपयोग के लिए आवश्यक बहुत विकास और diauxic lags कम हो; इथेनॉल राशि वाणिज्यिक आसवन (> 40 ग्राम / एल इथेनॉल) के लिए पर्याप्त उच्च; अधिक तेजी से विकास और इथेनॉल उत्पादकता पहले से undetoxified hydrolyzates fermenting मूल निवासी खमीर उपभेदों के लिए सूचना से; और उच्च ठोस लोड हो रहा है पर विविध hydrolyzates, उचित रूप से सोया नाइट्रोजन पूरक SGH और unsupplemented AFEX CSH (जो अन्यथा नाइट्रोजन गरीब है) सहित प्रदर्शन। उपन्यास विकास ऊपर संक्षेप महत्वपूर्ण कदम में सन्निहित के रूप में करने के लिए आक्रामक दृष्टिकोण का उपयोग कर विकसित में सुधार तनाव, परिचालन लागत, पूंजी की लागत, और ऊर्जा और पानी आदानों को कम से कृषि बायोमास से इथेनॉल उत्पादन के अर्थशास्त्र को लाभ की उम्मीद है। यह पहली तनाव विकास योजना एस के लिए अनुकूलित उपभेदों उपज की सूचना दी है stipitundetoxified hydrolyzates पर आर्थिक रूप से वसूली इथेनॉल उत्पादन का प्रदर्शन है।

एस के उपन्यास उपभेदों विकास प्रक्रिया (चित्रा 1) के प्रत्येक चरण से उत्पन्न होने वाली stipitis भविष्य के अध्ययन के लिए उम्मीदवारों के चयन के विशिष्ट लागू किया दबावों और तंत्र इस तरह के अवरोध सहिष्णुता और कम diauxic अंतराल के रूप में हायड्रोलायसेट किण्वन में सुधार की अंतर्निहित प्रमुख विशेषताओं के साथ जुड़े आनुवंशिक परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए कर रहे हैं। ऐसी बहुमूल्य नए ज्ञान जैव ईंधन और अन्य उत्पादों के लिए lignocellulose के रूपांतरण के लिए अगली पीढ़ी के खमीर biocatalysts और प्रक्रियाओं के इंजीनियरिंग सहायता करेगा। के रूप में नए उपभेदों प्राप्त कर रहे हैं, यह संभावना एक बार फिर तनाव विकास आदेश hydrolyzates में वाणिज्यिक उपयोग के लिए सबसे उपयोगी transformants का चयन करने में यहाँ वर्णित है कि इसी तरह के प्रोटोकॉल के माध्यम से व्युत्पन्न आबादी पारित करने के लिए फायदेमंद होगा। इसी तरह, एक बनाने के लिए के रूप में नए सूक्ष्म जीवाणु उपभेदों क्षमता के साथ खोज कर रहे हैं मेरेअक्षय बायोमास से उपयोगी नए उत्पादों के रियाड, विकास की प्रक्रिया आगे तनाव मजबूती और hydrolyzates में उत्पादकता में सुधार करने के लिए, संभावित इजाजत दी उपन्यास जैव उत्प्रेरक प्रक्रियाओं और उत्पादों को उपलब्ध किए जाने के लिए लागू किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cellic Ctec, Contains Xylanase (endo-1,4-) Novozymes No product number www.novozymes.com, 1-919-494-3000
Cellic Htec, Contains Cellulase and Xyalanase Novozymes No product number www.novozymes.com, 1-919-494-3000
Toasted Nutrisoy Flour Archer Daniels Midland Co. (ADM) 63160 ADM, 4666 Faries Parkway, Decatur, IL  1800-37-5843
Pluronic F-68 (Surfactant) Sigma-Aldrich P1300 Sigma-Aldrich
Difco Vitamin Assay Casamino Acids Becton Dickinson and Company 228830 multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
D,L-tryptophan  Sigma-Aldrich T3300 multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
L-cysteine  Sigma-Aldrich C7352 multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, Sigma-Aldrich
Bacto Agar Becton Dickinson and Company 214010 multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Bacto Malt Extract Becton Dickinson and Company 218630 multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Bacto Yeast Extract Becton Dickinson and Company 212750 multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Peptone Type IV from soybean Fluka P0521-500g multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Adenine, >99% powder Sigma-Aldrich A8626 CAS 73-24-5. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Cytosine, >99% Sigma-Aldrich C3506 CAS 71-30-7. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Guanine, SigmaUltra Sigma-Aldrich G6779 CAS 73-40-5. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Thymine, 99% Sigma-Aldrich T0376 CAS 65-71-4. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Uracil, 99% Sigma-Aldrich U0750 CAS 66-22-8. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Dextrose (D-Glucose), Anhydrous, Certified ACS Fisher Chemical D16-500 CAS 50-99-7. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich
D-Xylose, assay >99% Sigma-Aldrich X1500 CAS 58-86-6. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich
96-well, flat bottom plates Becton Dickinson Falcon 351172 multiple suppliers: e.g., Thermo-Fisher, VWR, Daigger
Wypall L40 Wiper Kimberly-Clark towel in microplate boxes to absorb water for humidification; multiple suppliers e.g., Thermo-Fisher, uline, Daigger
Corning graduated pyrex flask, 125 ml, narrow opening (stopper #5) Corning Life Science Glass 4980-125 multiple suppliers: e.g., Thermo-Fisher, VWR, Daigger
Innova 42R shaker/incubator, 2.5 cm (1") rotation New Brunswick Scientific (1-800-631-5417) M1335-0016 multiple suppliers: e.g., Eppendorf, Thermo-Fisher. Other shaker/incubators with a 2.5 cm (1") throw could be used.
Duetz Cover clamp for 4 deep well MTP plates Applikon Biotechnology Z365001700 applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Duetz System sandwich cover for 96 deep well plates Applikon Biotechnology Z365001296 applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Duetz System silicone seal (0.8 mm black low evap) for 96 deep well plate cover Applikon Biotechnology V0W1040027 applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Blue microfiber layer for Duetz system sandwich cover Applikon Biotechnology V0W1040001 applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
96 well, 2 ml square well pyramid bottom plates, natural popypropylene Applikon Biotechnology ZC3DXP0240 applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Bellco 32 mm silicon sponge plug closures, pk of 25 for 125 ml flasks Bellco 1924-00032 Thomas Scientific, their Catalog number is 1203K27
Bellco Spinner Flask, 1968-Glass Dome, Sealable Flange Type, 100 ml working volume. This design no longer manufactured. Bellco 1968-00100 (original Cat. No.) Jacketed vessels have lower inlet & upper outlet ports for temp. control with circulating water bath. Vessels are 75 mm in outer diam and 200 mm in height. There are four side ports at ~45° angles and one top port. Port openings appropriate size for size 0 neoprene stoppers (21-22 mm inner diameters on ports).
Mathis Labomat IR Dryer Oven MathisAg Typ-Nbr BFA12 215307 Werner Mathis U.S.A. Inc. usa@mathisag.com, 704-786-6157
Dual Channel Biochemistry Analyzer YSI Life Sciences 2900D-UP www.ysi.com, robotic system for rapid sugars assay in 96-well microplate format
PowerWave XS Microplate Spectrophotometer Bio-Tek Instruments, Inc MQX200R www.biotek.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Perlack, R. D., Stokes, B. J. US Department of Energy. Billion-Ton Update: Biomass Supply for a Bioenergy and Bioproducts Industry. Department of Energy. Oak Ridge National Laboratory, Oak Ridge, TN. (2011).
  2. Prior, B. A., Kilian, S. G., duPreez, J. C. Fermentation of D-xylose by the yeasts Candida shehatae and Pichia stipitis. Process Biochem. 24, (1), 21-32 (1989).
  3. Kurtzman, C. P., Suzuki, M. Phylogenetic analysis of ascomycete yeasts that form coenzyme Q-9 and the proposal of the new genera Babjeviella, Meyerozyma, Millerozyma, Priceomyces and Scheffersomyces. Mcoscience. 51, (1), 2-14 (2010).
  4. Slininger, P. J., Bothast, R. J., Okos, M. R., Ladisch, M. R. Comparative evaluation of ethanol production by xylose-fermenting yeasts presented high xylose concentrations. Biotechnol. Lett. 7, (6), 431-436 (1985).
  5. Slininger, P. J., Bothast, R. J., Ladisch, M. R., Okos, M. R. Optimum pH and temperature conditions for xylose fermentation by Pichia stipitis. Biotechnol. Bioeng. 35, (7), 727-731 (1990).
  6. Slininger, P. J., et al. Stoichiometry and kinetics of xylose fermentation by Pichia stipitis. Annals NY Acad. Sci. 589, 25-40 (1990).
  7. Slininger, P. J., Dien, B. S., Gorsich, S. W., Liu, Z. L. Nitrogen source and mineral optimization enhance D-xylose conversion to ethanol by the yeast Pichia stipitis NRRL Y-7124. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72, (6), 1285-1296 (2006).
  8. Slininger, P. J., Thompson, S. R., Weber, S., Liu, Z. L. Repression of xylose-specific enzymes by ethanol in Scheffersomyces (Pichia) stipitis and utility of repitching xylose-grown populations to eliminat diauxic lag. Biotechnol. Bioeng. 108, (8), 1801-1815 (2011).
  9. Slininger, P. J., Gorsich, S. W., Liu, Z. L. Culture nutrition and physiology impact inhibitor tolerance of the yeast Pichia stipitis NRRL Y-7124. Biotechnol. Bioeng. 102, (3), 778-790 (2009).
  10. Agbogbo, F. K., Coward-Kelly, G. Cellulosic ethanol production using the naturally occurring xylose-fermenting yeast, Pichia stipitis. Biotechnol. Lett. 30, (9), 1515-1524 (2008).
  11. Balan, V., Bals, B., Chundawat, S., Marshall, D., Dale, B. E. Lignocellulosic pretreatment using AFEX. Biofuels: Methods and protocols, Methods in Molecular Biology. 581, Humana Press, a part of Springer Science+Business Media, LLC. 61-77 (2009).
  12. Jin, M., Gunawan, C., Uppugundla, N., Balan, V., Dale, B. E. A novel integrated biological process for cellulosic ethanol production featuring high ethanol productivity, enzyme recycling, and yeast cells reuse. Energ. Environ. Sci. 5, (5), 7168-7175 (2012).
  13. Nigam, J. N. Development of xylose-fermenting yeast Pichia stipitis for ethanol production through adaptation on hardwood hemicellulose acid prehydrolysate. J. Appl. Microbiol. 90, (2), 208-215 (2001).
  14. Nigam, J. N. Ethanol production from wheat straw hemicellulose hydrolysate by Pichia stipitis. J. Biotechnol. 87, (1), 17-27 (2001).
  15. Hughes, S. R., et al. Random UV-C mutagenesis of Scheffersomyces (formerly Pichia) stipitis NRRL Y-7124 to improve anaerobic growth on lignocellulosic sugars. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 39, (1), 163-173 (2012).
  16. Bajwa, P. K., et al. Mutants of the pentose-fermenting yeast Pichia stipitis with improved tolerance to inhibitors in hardwood spent sulfite liquor. Biotechnol. Bioeng. 104, (5), 892-900 (2009).
  17. Bajwa, P. K., Pinel, D., Martin, V. J. J., Trevors, J. T., Lee, H. Strain improvement of the pentose-fermenting yeast Pichia stipitis by genome shuffling. J. Microbiol. Methods. 81, (2), 179-186 (2010).
  18. Slininger, P. J., et al. Evolved strains of Scheffersomyces stipitis achieving high ethanol productivity on acid- and base-pretreated biomass hydrolyzate at high solids loading. Biotechnol. Biofuels. 8:60, 1-27 (2015).
  19. Jeffries, T. W., et al. Genome sequence of the lignocellulosic-bioconverting and xylose-fermenting yeast Pichia stipitis. Nature Biotechnol. 25, (3), 319-326 (2007).
  20. Zabriski, D. W., Armiger, W. B., Phillips, D. H., Albano, P. A. Fermentation media formulation. Trader's Guide to Fermentation Media Formulation. 1-39 (1980).
  21. Syzbalski, W., Bryson, Y. Genetic studies on microbial cross resistance to toxic agents. I. Cross resistance of Escherichia coli to fifteen antibiotics. J. Biotechnol. 64, (4), 489-499 (1952).
  22. Klinke, H. B., Thomsen, A. B., Ahring, B. K. Inhibition of ethanol-producing yeast and bacteria by degradation products produced during pre-treatment of biomass. Appl. Microbiol. Biotechnol. 66, 10-26 (2004).
  23. Almeida, J. R. M., Bertilsson, M., Gorwa-Grauslund, M. F., Gorsich, S., Liden, G. Metabolic effects of furaldehydes and impacts on biotechnological processes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 82, 625-638 (2009).
  24. Allen, S. A., et al. Furfural induces reactive oxygen species accumulation and cellular damage in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol. Biofuels. 3, (2010).
  25. Weisburger, J. H. Mutagenic, carcinogenic, and chemopreventive effects of phenols and catechols: the underlying mechanisms. ACS Symposium Series. 507, 35-47 (2009).
  26. Slininger, P. J., Dien, B. S., Lomont, J. M., Bothast, R. J., Ladisch, M. R. Evaluation of a kinetic model for computer simulation of growth and fermentation by Scheffersomyces (Pichia) stipitis fed D-xylose. Biotechnol. Bioeng. 111, (8), 1532-1540 (2014).
  27. Wang, X., et al. Comparative metabolic profiling revealed limitations in xylose-fermenting yeast during co-fermentation of glucose and xylose in the presence of inhibitors. Biotechnol. Bioeng. 111, (1), 152-164 (2014).
  28. Slininger, P. J., Branstrator, L. E., Bothast, R. J., Okos, M. R., Ladisch, M. R. Growth, death, and oxygen uptake kinetics of Pichia stipitis on xylose. Biotechnol. Bioeng. 37, (10), 973-980 (1991).
इथेनॉल के लिए Lignocellulose की bioconversion के लिए मजबूत pentose-fermenting खमीर के विकास के लिए तकनीक
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Slininger, P. J., Shea-Andersh, M. A., Thompson, S. R., Dien, B. S., Kurtzman, C. P., Sousa, L. D. C., Balan, V. Techniques for the Evolution of Robust Pentose-fermenting Yeast for Bioconversion of Lignocellulose to Ethanol. J. Vis. Exp. (116), e54227, doi:10.3791/54227 (2016).More

Slininger, P. J., Shea-Andersh, M. A., Thompson, S. R., Dien, B. S., Kurtzman, C. P., Sousa, L. D. C., Balan, V. Techniques for the Evolution of Robust Pentose-fermenting Yeast for Bioconversion of Lignocellulose to Ethanol. J. Vis. Exp. (116), e54227, doi:10.3791/54227 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter