Abstract
Extrakromosomala cirkulära DNA (eccDNAs) är vanliga genetiska element i Saccharomyces cerevisiae och redovisas i andra eukaryoter också. EccDNAs bidra till genetisk variation bland somatiska celler i flercelliga organismer och utvecklingen av encelliga eukaryoter. Känsliga metoder för att detektera eccDNA behövs för att klargöra hur dessa faktorer påverkar genomet stabilitet och hur miljömässiga och biologiska faktorer inducerar deras bildning i eukaryota celler. Denna video presenterar en känslig eccDNA-reningsmetod kallad Circle-Seq. Metoden omfattar kolonnrening av cirkulärt DNA, avlägsnande av återstående linjär kromosomalt DNA, rullande-cirkel förstärkning av eccDNA, djup sekvensering och kartläggning. Omfattande exonukleasbehandling krävdes för tillräcklig linjär kromosomalt DNA nedbrytning. Den rullande cirkel förstärkning stegINE-height:. normal; "> φ 29 polymeras berikat för cirkulärt DNA över linjär DNA Validering av Circle-Seq metod på tre S. cerevisiae CEN.PK populationer av 10 10 celler detekterades hundratals eccDNA profiler i storlekar större än 1 kb . Upprepade resultaten av ASP3-1, COS111, CUP1, RSC30, HXT6, HXT7 gener på cirkulärt DNA i både S288C och CEN.PK tyder på att DNA cirkel är bevarad mellan stammar vid dessa loci. Sammanfattningsvis har Circle-Seq metod bred tillämpbarhet för genomet skala screening för eccDNA i eukaryoter samt för att detektera specifika eccDNA typer.
Introduction
Upptäcka tidigt eller övergående kromosom förstärkning är svårt eftersom det kräver att identifiera förändringar i enstaka DNA-molekyler i stora populationer av celler. Kromosom kopietal variationer (CNVs) i allmänhet upptäcks långt efter deras etablering, vilket innebär att endast den sista CNV struktur som ett bevis på den mekanism som genererade variationen 1,2. Upptäcka och återvinna extrakromosomalt cirkulärt DNA (eccDNA) i tidigare stadier av CNV bildning kan belysa pågående processer i iska omflyttningar.
Tidigare, de novo upptäckten av eccDNA skedde genom elektronmikrofotografier 3, Giemsa-färgning av metafaskromosomer 4, eller två-dimensionell gelelektrofores 5. Dessa metoder ger lite eller ingen information om sekvensen för den cirkulära DNA. Riktade tekniker såsom Southern blotting 6,7, omvänd PCR 8, eller fluorescens in situ hybridization 9 bevisa bara om specifika eccDNA element. Ingen av dessa metoder ger den sekvens av alla befintliga eccDNA typer i en cellpopulation.
Genomisk divergens i en pool av celler kan karakteriseras av genomet sekvensering och / eller kakel matriser 10,11. Detektering av en deletion eller förstärkning av konventionella DNA reningsmetoder kräver oftast att en muterad allel representerar minst 0,1-1% av cellpopulationen 12,13. Acentrisk eccDNAs förväntas bli ännu mer övergående i en cellkultur på grund av deras brist på centromerer och potentiella frånvaro av DNA-syntes vid replikering. Således, eftersom de flesta eccDNAs förmodligen är i små mängder och deras sekvenser likna genomet, är alternativa DNA extraktionsmetoder som behövs för att upptäcka eccDNAs.
Flera cirkulära DNA reningstekniker utnyttjar de strukturella skillnaderna mellan kromosomer och cirkulärt DNA. Till exempel, höghastighets ultracentrifugation i cesium-klorid gradienter används för att isolera 350-3000 baspar (bp) stora eccDNAs från den humana HeLa cancercell linjen 14. Däremot kan hög hastighet sönder eller nick ryggraden i supertvinnade cirkulära DNA-strukturer, ändra sedimenteringshastighet 15 och eccDNA avkastning. Dutta och medarbetare utvecklat en metod för de novo, genomet skala identifiering av cirkulärt DNA från mus vävnader samt från kulturer av kyckling och mänskliga celler 16,17. Deras metod är extraktion av kärnor från homogeniserad vävnad från sackaros ultracentrifugering följt av plasmid rening och flera omgångar av enzymatiska reaktioner och DNA-extraktioner. Deras protokoll identifierar främst 200-400 bp eccDNAs, kallas microDNAs. Dutta och medarbetare försökte också rening av microDNAs från Saccharomyces cerevisiae men kunde inte spela microDNA från denna jästarter 16.
Vi har utvecklat en ny metod förde novo detektering av eccDNA från jäst kallas Circle-Seq. Denna metod gör det möjligt genom omfattande undersökningar för cirkulära DNA-molekyler som är tillräckligt stora för att bära hela gener och så stora som 86 kb (kb) mitokondrie-DNA (mtDNA). Cirkeln-Seq metoden utvecklades från en väletablerad prokaryot plasmid reningsmetod 18,19, optimerad för eukaryota jästceller och i kombination med djup sekvensering. Använda Circle-Seq tillvägagångssätt, 1756 olika eccDNAs, allt större än en kb, upptäcktes från tio S. cerevisiae S288C Populationer 20. En storlek cut-off har valt att fokusera på eccDNA som var tillräckligt stor för att bära hela gener. Circle-Seq var mycket känsliga; det upptäckt ett enda eccDNA inom tusentals celler 20. I den aktuella studien var Circle-Seq användas för att isolera och identifiera 294 eccDNAs från tre biologiska replikat av en annan S. cerevisiae jäststam, CEN.PK. Datan visar att eccDNA är en vanlig genetisk element i S. cerevisiae-stammar.
Protocol
ANMÄRKNING: En översikt av den cirkulära DNA-rening och sekvenseringsmetod (Circle-Seq) illustreras i Figur 1.
1. Odling, Cell Harvest och plasmamembran Störningar
- Ympa jästceller (t ex Saccharomyces cerevisiae) från en O / N-kulturen i 50 ml komplett näringsmedium av jäst pepton dextros (YPD). Inokulera vid en låg initial celldensitet av 1-3 x 10 5 celler / ml eller en optisk täthet av ca 0,01 OD 600.
- Inkubera cellerna vid 30 ° C under omröring vid 150 varv per min (rpm) tills cellerna når maximal celldensitet av cirka 1 x 10 10 celler, approximativt efter 24 till 48 h eller en optisk densitet vid OD 600> 10,0.
OBS: Odlingstiden är inte avgörande eftersom lägre cellkoncentrationer kan användas.
- Inkubera cellerna vid 30 ° C under omröring vid 150 varv per min (rpm) tills cellerna når maximal celldensitet av cirka 1 x 10 10 celler, approximativt efter 24 till 48 h eller en optisk densitet vid OD 600> 10,0.
- Överföra vuxit ur kulturen till en 50 ml koniskt rör, pellets cellerna genom centrifugering vid800 xg under 3 min och kassera supernatanten.
- Tvätta pelleten med 25 ml buffertlösning av 10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 8,0, återpelletera cellerna genom centrifugering vid 800 xg i 3 min och kasta bort supernatanten.
- Resuspendera cellpelleten i 1,2 ml resuspensionsbuffert tillförs från en plasmid kolonn-reningskit.
- Valfritt steg: Lägg mycket utspädda plasmider som kontroller för rening av cirkulära DNA-element 20.
OBS: I den nuvarande datamängden var 7,7 pl plasmid blandning tillämpas för varje prov som innehöll 10 10 celler. Plasmiden lager blandning bestod av tre plasmider i olika koncentrationer; pBR322 vid 38 ng / prov, pUC19 vid 0,5 ng / prov, och pUG72 vid 0,01 ng / prov. - Överför cellsuspensionen i två 2 ml mikro-centrifugrör, vardera kompletterad med 0,5 mm glaspärlor vid en 1: 3-förhållande av den totala suspensionsvolymen.
- Vortex varje rör vid maximal hastighet under 10 min för att störa plasmacellmembran. Pelletera pärlorna genom centrifugering vid 268 x g under 30 sek och överföra 1,2 ml kombinerade supernatanten från de två mikrocentrifugrör till ett nytt rör.
OBS: Alternativ till steg 1,6-1,7, använd zymolyas att störa cellerna i 0,6 ml resuspension buffertlösning. Tio enheter av zymolyas kan störa 5 x 10 7 celler i 1,5 h vid 35 ° C.
2. EccDNA Anrikning genom kolonnkromatografi
- Följ protokollet från ett kit för kolonnrening av plasmider. I korthet, behandla varje prov med 1,2 ml alkalisk lösning, blanda försiktigt och inkubera 3 min vid RT.
- Tillsätt 1,2 ml neutraliseringsbuffert, blanda försiktigt och centrifugera vid 9650 xg under 5 min.
- Ladda lösningen på en kolonn jämviktad med 1 ml jämviktslösning och tillåta vätskan att strömma genom kolonnen genom tyngdkraften.
- Tvätta kolonnen med fyra ml tvättlösning. När lösningen har passerat genom hartset, tillsätt försiktigt 0,3 ml eluering sålution att ersätta de flesta av 0,35 ml kolonn hålrumsvolym.
- Eluera DNA i en ny kollektion rör med 1 ml elueringslösning och fälla ut DNA genom att tillsätta 0,8 ml fällningsblandningen. Centrifugera vid 9650 xg under 10 minuter.
- Tvätta DNA-pelleten med 0,5 ml 70% etanol, centrifugera vid 9650 xg under 5 min, lufttorka i 5 till 15 min och upplösa det renade DNA: t i 25 fil sterilt vatten.
OBS: Endast kortvarig lagring av DNA i vatten rekommenderas. Företrädesvis, gå direkt till steg 3.
3. Nedbrytning av återstående linjär Kromosomalt DNA
- Valfritt steg: att underlätta specifik nedbrytning av linjärt DNA genom exonukleas, behandla det renade DNA med en sällsynt skär endonukleas såsom Notl. För 5 pg DNA, använda en enhet NotI, 5 pl 10 x nedbrytningsbuffert och sterilt vatten till en total volym av 50 | il. Inkubera reaktionen vid 37 ° C under 16 h och värmeinaktivering av endonukleas vid 80 ° C under 5 min.
- tillsätt 20enheter exonukleas (2 | il), 4 | j, l ATP (25 mM), 34 | il sterilt vatten och 10 ul 10x reaktionsbuffert direkt till 50 | j, l endonukleas-klyvd DNA för att nå en 1x reaktionsvolym av 100 | j, l, med användning av den ATP-beroende exonukleas utrustning.
- Utföra hydrolys av linjär enkelsträngad och dubbel-strängat DNA vid 37 ° C under 5 dagar eller mer. Tillsätt ytterligare 4 pl ATP (25 mM), 0,6 pl 10 x reaktionsbuffert och 20 enheter exonukleas varje 24 timmar för att fortsätta den enzymatiska DNA-nedbrytning på en 1x reaktionsvolym.
- Efter avlägsnande av linjärt DNA, till provet 2 pl från exonukleas behandlade lösningen bekräfta elimineringen av kromosomalt linjärt DNA genom kvantitativ polymeraskedjereaktion (qPCR), med användning av en kromosomal markör såsom den aktingenen ÄRV1 20.
- Varje 20 | il qPCR reaktionsvolymen innehåller 2 | j, l exonukleas-behandlat prov, 150 nM ÄRV1 primrar 5'-TCCGTCTGGATTGGTGGTTCTA-3 'och 5'-TGGACCACTTTCGTCGTATTC-3 ', 2% (volym / volym) dimetylsulfoxid, och 10 | il grönfluorescerande masterblandning.
- Använda reaktionsbetingelserna; 3 minuter vid 95 ° C, följt av 45 cykler av 15 sek vid 95 ° C och 30 sek vid 60 ° C.
OBS: ÄRV1 är en särskilt lämplig markör för linjär DNA eftersom kopietal variationer i denna gen är skadliga 21-23 så eccDNA bör inte bära ÄRV1. - Alternativ till analys av DNA nedbrytning av qPCR är standard PCR (4,3) eller propidiumjodid färgning (4,4).
- Använda 2 jil exonukleas-behandlat prov som PCR-mall med ÄRV1 primrar 5'-TGGATTCTGGTATGTTCTAGC-3 'och 5'-GAACGACGTGAGTAACACC-3'. Som positiv ÄRV1 kontroll, använd 50-100 ng genomisk S. cerevisiae-DNA som mall. PCR-reaktionsbetingelser; 3 minuter vid 95 ° C, följt av 35 cykler av 30 sek vid 95 ° C, 30 sekunder vid 56 ° C och 1 min vid 72 ° C.
- Kör PCR-reaktioner av gel electrophoresis på 1% agaros med 0,5 mikrogram / ml etidiumbromid. Leta efter en 0,8 kb ÄRV1 band.
- Frånvaro eller närvaro av linjärt DNA kan också undersökas genom propidiumjodidfärgning före och efter DNA-amplifiering.
- Blanda varje DNA-prov i en 1: 1 volym med en 1: 1000 H2O-utspädd lösning av 20 mM propidiumjodid lager. Lämna lösning i mörker under 10-20 min vid RT och analysera DNA-färgning genom fluorescensmikroskopi vid 100x förstoring med användning av ett rött excitation fluorescens filter vid 663-738 nm och en exponeringstid-tid av 5 till 30 sek. Som DNA-färgning kontroll, användning Ø29-amplifierat genom-DNA från jäst och / eller Ø29-amplifierade plasmid.
- Värmeinaktivering av exonukleas-lösning vid 70 ° C under 30 min.
4. DNA Amplifiering
- Förstärk det renade och berikat eccDNA från steg 3,5) med Ø29 DNA-polymeras 24-26 Accordende till protokollet av polymeras tillverkaren.
- I korthet, blanda 5 pl berikade eccDNA med 5 l denaturering buffert.
- Efter 3 min vid RT, tillsätt 10 l neutralisering buffert. Blanda försiktigt och tillsätt 30 l huvudblandning innehållande 29 pl reaktionsbuffert och 1 pl Ø29 DNA-polymeras. Inkubera reaktionen vid 30 ° C under 16 h eller mer (upp till 72 h). Värme inaktivera Ø29 DNA-polymeras vid 65 ° C under 3 min.
5. sekvensering och dataanalys
- Skeva den förstärkta eccDNA med en fokuserad ultraljud till ett genomsnittligt mål topp storlek på 300 bp. Använd följande inställningar för en 130 ul DNA-prov: 450W toppintensitet makt, 60 sek behandling, 30% arbetsfaktor, 200 cykler per skur, temperatur 7 ° C.
- Lägg streckkodsindex etiketter och adaptrar för att den splittrade läser för syntes av bibliotek för sekvensering, med hjälp av en lämplig metod för biblioteks beredning.
- Kör djup sekvensering, till exempel som 141-nukleotid enda änden läser på en hög genomströmning sekvense plattform.
- Karta läser till jästreferens genomet under utredning och låta läser att kartlägga till flera regioner. Till exempel använda en fritt tillgänglig arbetsflödessystem 27,28 och kortavläsnings Aligner kartprogram 29.
- Identifiera läser från regioner av förmodade eccDNAs använder sammanhängande läser, till exempel, läser mer än sju sammanhängande (> 1 kb) utan luckor 20.
OBS: Programvaran är tillgänglig 27,28 för att utforska mappas läser på genomregioner av intresse.
Representative Results
Att validera Circle-Seq-metoden, tre S. cerevisiae CEN.PK populationer av 1 x 10 10 celler screenades efter celler odlades separat i YPD i tio generationer. Kromosomalt linjära DNA eliminering bekräftades genom frånvaron av en qPCR ÄRV1 signal såsom beskrivits tidigare 20 (data ej visade). Renat och berikat eccDNA sekvenserades upp till 68 miljoner lyder (141-nukleotid enda änden läser) och mappas till CEN.PK113-7D referens genomet (version 19 juni, 2012). Inspelningar av förmodade eccDNAs från de tre proven som heter C1, C2 och C4 tilldelades genomregioner kartlagts av angränsande läser längre än 1 kb. Baserat på 10.000 Monte Carlo-simuleringar, betydelsen av varje region avbildas av angränsande läser längre än en kb uppskattades. Från dessa 79, 159 och 56 regioner kommenterad som troliga eccDNA sekvenser (p <0,1, Dataset 1). Antalet inspelade contiguooss läser> 1 kb ökade som en funktion av sekvens djup vilket tyder på att ännu fler eccDNA element skulle ha redovisats om proverna hade sekvenserats ytterligare (Figur 2). Som väntat, cirkeln-Seq metod utvinns många läser från ett antal kända cirkulära DNA-element, inklusive 2μ plasmid, mitokondrie-DNA, ribosomala RNA-gener på kromosom XII, och de tre interna kontroll plasmider pBR322, pUC19 och pUG72 som spikades i prover strax före kolonnrening (Figur 3).
Videon visar ett exempel på sammanhängande läsningar som mappas till HXT7 _ARS432_ HXT6 locus på kromosom IV. Tidigare var [HXT6 / 7 cirkel] detekteras av Circle-Seq i tio S288C populationer (med vardera 1 x 10 10 celler) och den cirkulära DNA-strukturen bekräftades genom omvänd PCR-analys 20. Den [HXT6 / 7 circle] spelades också in i var och en av de tre CEN.PK populationer (figur 4A). Dessutom är de flesta av de vanliga eccDNA generna bland replikatprover av CEN.PK lappade eccDNA gener från de S288C datauppsättningar (Figur 4B).
För att testa specificiteten av Circle-Seq protokoll för cirkulär DNA-rening, två prover, var och en med 30 mikrogram genomiskt DNA, testades. Ett prov kompletterades med 100 ng plasmid-DNA och eccDNA från båda proverna renades genom cirkeln-Seq protokoll. Efter kolonnseparation, DNA utbytet var 1,27% (380 ng) för provet utan plasmiden (GD) och 1,60% (480 ng) för provet med plasmid (GD + P). Effektiviteten för exonukleasbehandling testades med avseende på linjära DNA-innehåll efter 29 h och 72 h med användning av PCR mot ÄRV1. Inga prover innehöll amplifierad ÄRV1 (data ej visade). En fraktion av varje exonukleas-behandlat prov var ytterligare enmplified av Ø29 polymeras och produkterna av enzymatiska reaktioner analyserades genom propidiumjodidfärgning (figur 5A-F) och agarosgelelektrofores (figur 5G). Prover efter exonukleasbehandling visade minimal propidium jod-färgning (figur 5A-B). Den Ø29 - förstärkta provet med endast genomisk DNA avslöjade trådliknande strukturer (Figur 5C) liknar kontrollprovet (Figur 5E). Den Ø29 - förstärkt prov som hade lagt plasmid avslöjade foci (figur 5D) liknar plasmid kontroll (figur 5F). Bilderna indikerade att Ø29 polymeras anrikat för cirkulärt DNA över linjärt DNA. Mest linjär kromosomalt DNA avlägsnades från prover efter 29 timmar exonukleasbehandling (figur 5A-B, G). Men omfattande exonukleas behandling i mer än 100 timmar och använder mer än 100 enheter var som behövs för att ta bort alla kromosomalt linjär DNA, som O29 - förstärkta proverna visade fortfarande en bakgrund av trådliknande strukturer efter 72 timmar exonukleasbehandling (Figur 5C-D).
. Figur 1. Översikt över Circle-Seq metod har Protokollet 5 steg: 1) cellodling, 2) rening och anrikning av eccDNA genom kolonnkromatografi, 3) nedbrytning av återstående linjär kromosomalt DNA i eluatfraktion, 4) förstärkning av DNA genom Ø29 DNA-polymeras, och 5) sekvensering av höganrikat eccDNA och kartläggning av läser till S. cerevisiae referens genomet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
p_upload / 54239 / 54239fig2.jpg "/>
Figur 2. Angränsande läser> 1 kb som funktion av sekvensdjupet. EccDNA från 1 x 10 10 celler ökar som en funktion av sekvensdjupet (i miljoner mappade läsningar). Visas: biologiska triplikat från haploid CEN.PK S. cerevisiae populationer (C1, C2, C4) separerade med 10 10 celldelningar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Detektering av kända cirkulär DNA-element. (AB) Scatter tomter av läs täckning (läs densitet) i procent för plasmider i CEN.PK biologiska replikerar C1, C2 och C4. (A) Mapped läser de endogena jäst plasmider var: 2μ; [RDNA cirkel] (ribosomalt RNA-gener från kromosomen XII); och mtDNA (mitokondrie-DNA). (B) Unik läser mappas att styra plasmider. Kontroll plasmider spetsade i prover före kolonnrening. Plasmid förhållanden per cell var: pBR322 (plustecken) 1: 1, pUC19 (cirklar) 01:50, och pUG72 (trianglar) 1: 2500.
Figur 4. Gemensam eccDNA element i CEN.PK och S288C. (A) Venndiagram som visar överlappningen mellan de 476 gener på 294 eccDNA element i de tre CEN.PK proverna (C1, C2, C4). De 16 vanligaste lappande eccDNA gener / plasmider kommenterad (alla gen namn är i Dataset 1). (B) Venn diagram över alla inspelade gener på förmodade eccDNAs från de tre CEN.PK proverna (C1, C2, C4), jämfört med alla inspelade gener på förmodade eccDNAs från 10 S288C prover: S1-S2, R1-R4, Z1-Z4 (se referens 20). Visas är 13 biologiska replikat (S1-S2, R1-R4, Z1-Z4, C1-C3) med gener / plasmider och förmodade eccDNA regioner som överlappade ett minimum av 2 stam bakgrunder och antingen 3 eller fler experimentella uppställningar. C prover, CEN.PK; R och Z-prover, S288C BY4741; S prover, S288C M3750. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Visualisering av DNA-prover efter exonukleas och ø 2 9-behandling. (AF) Propidiumjodid-färgning av DNA. Skalstock, 10 | j, m. (A, C och E) Prov med genomiskt DNA (GD); (B och D) prover med GD plus plasmid (GD + P). (
AStäll ett "src =" / filer / ftp_upload / 54239 / 54239dataset1.jpg "/>
Dataset 1. Potentiella DNA cirkel regioner i CEN.PK. Klicka här för att ladda ner filen.
Här visas sekvensdata och analyser för 348 regioner. Kolumner är AD, eccDNA kartläggning. A (första kolumnen från vänster), prov som förmodade eccDNA identifierades; B, kromosom; CD, start och slut koordinater av förmodade eccDNAs. EH, eccDNA innehåll. E, autonomt replikerande sekvens (ARS) i regionen; F, fullständiga genen i regionen; G, en del av genen som ingår i regionen; H, BLASTN-identifierade genen. IO, EccDNA täckning och p-värden. I längsta region med en unik kommenterad sekvens i bp; J, antal alla mappade läser; K, täckning av alla kartläggas läser av fragment per kb från en miljon mappas läser (FPKM); L, p-värde för förmodade eccDNA jämfört med förekomsten av en slump från Monte Carlo-simuleringar; M, antalet uniquely mappas läser; NEJ; som K och L med enbart unikt mappas läser (UFPKM). Parametrar för kartläggning av läser och Monte Carlo-simuleringar var såsom beskrivits 20.
Discussion
Cirkeln-Seq metod tillåter genomet skala detektering av eccDNA från jästceller med sekvens nivå upplösning. Metoden är en mild eccDNA rening som inte kräver intensiv virvel eller pipettering och använder kolonnseparation av tyngdkraften för att begränsa eccDNA brott som skulle leda till exonukleasdigestion i det efterföljande steget. Dessa särdrag hos förfarandet kan vara avgörande för att detektera stora eccDNAs som innehåller gensekvenser. Circle-Seq upptäckt många eccDNAs inklusive fullständiga gener (Dataset 1). Det upptäcks också 86-kb jäst mitokondrie-DNA. Således underlättar detta protokoll rening av stora cirkulära DNA-element. Att hålla antalet DNA-extraktionssteg till ett minimum minskar risken för eccDNA förlust och maximerar utbyte. Baserat på resultat kontroll spetsade in plasmider, är Circle-Seq mycket känslig, upptäcka en enda cirkulär DNA från 2500 celler. Dessutom, ta bort överflödande endogena plasmider såsom 2μ; plasmid eller mitokondrie-DNA kan avsevärt förbättra känsligheten. Härdning av 2μ från jästkulturer har beskrivits 30. Alternativt kan 2μ och mitokondrie-DNA avlägsnande åstadkommas med en sällsynt skär endonukleas, såsom Swal. Emellertid kan restriktionsenzymsteget rikta andra eccDNAs av intresse och begränsa den totala eccDNA avkastning.
Kritiska steg för eccDNA detektion var avlägsnande av linjärt DNA (steg 3) och DNA-sekvensering (steg 5) till ett lämpligt djup. För att spela in de flesta eccDNAs från en cellpopulation kan djupa sekvense krävas 20. Parade slut sekvensering bör ge ännu större förtroende eccDNA upptäckt, som cirkulära DNA-korsningar förväntas ge parade slut läser den kartan discordantly. Dessa skillnader stödjer upptäckten av cirkulära DNA-strukturer och kan potentiellt användas som ett extra eccDNA detekteringsfilter.
Cirkeln-Seq metod validerades med tre oberoende S. cerevisiae CEN.PK populationer. Upptäckta sekvenser ingår tidigare rapporterat eccDNAs, endogena plasmider och spetsade in plasmider och hundratals förmodade eccDNAs (Dataset 1). Dessa resultat stöder tidigare Circle-Seq datamängder från S. cerevisiae S288C 20. Upptäckten av flera eccDNAs gemensamma CEN.PK och S288C populationer tyder på att dessa loci har en benägenhet att existera som cirkulära element (Figur 4). Vi har tidigare visat att [GAP1 cirkel] berikas under kväve begränsade förhållanden i CEN.PK bakgrunden 8, även om tecken på [GAP1 cirkel] i annan stam bakgrunder inte har hittats. Konstaterande av eccDNA från CUP1-1 RSC30, ASP3-1, COS111 och HXT6 HXT7 loci i både S288C och CEN.PK tyder på att ett anlag för DNA circularization är conserveras mellan jäststammarna. Det återstår att visa om [HXT6 / 7 cirkel], [ASP3-1 cirkel], [COS111 cirkel] och [CUP1-1 RSC30 cirkel] ger selektiva fördelar till celler eller om deras existens är bara en effekt av höga DNA cirkularisering.
Sammantaget tyder resultaten på att Circle-Seq är väl lämpad för att detektera kilostora eccDNAs och har fördelar för att identifiera eccDNAs med kompletta gener. Circle-Seq är en mycket känslig metod som möjliggör hela genomet skala skärmar eccDNAs från jäst. Cirkeln-Seq metod kan öppna ett nytt fält av forskning som syftar till att belysa den roll som eccDNA att generera gen deletioner och förstärkningar. Med tanke på att DNA-arkitektur och struktur är i stort sett bevarad från eukaryot jäst till högre eukaryoter, cirkeln-Seq metod bör i princip vara applicable till alla eukaryota celler, med smärre ändringar. För närvarande innebär metoden inte verkar ha några begränsningar, även om dess förmåga att rena megabas stora eccDNAs har ännu inte visas. Dessutom kan användningen av Ø29 DNA-polymeras, som använder en rullande-cirkel amplifieringsmetoden 31, skapar en bias mot mindre eccDNAs gör eccDNA kvantifiering svårare. Circle-Seq upptäcker eccDNAs stora nog att bära hela gener, vilket gör den lämplig för studier av dubbla minuter-cirkulära DNA från humana somatiska celler. Dubbla minuter kan bidra till cancer när proto-onkogener förstärks på dessa element 32-37. Studier av eccDNAs i nedärvda celler kunde användas för att mäta nedärvda mutationshastigheter och bedöma spermakvaliteten, exempelvis i boskap. Sålunda har Circle-Seq potential att ge insikter i den hastighet med vilken genetisk variation uppstår i form av kopietalet variation, och leda till en ny förståelse av sjukdomar som involverar gen upphovsrättnummer variation 38-40.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto peptone | BD Difco | 211677 | Alternative product can be used. |
| Brilliant III SYBR Green PCR Master Mix | Agilent Technologies | 600882 | For qPCR analysis. Alternative product can be used. |
| Dextrose (D-glucose) | Carl Roth | HN06.4 | Alternative product can be used. |
| Disruptor Beads, 0.5 mm | Scientific Industries, Inc. | SI-BG05 | Glass beads to disrupt plasma cell membranes. Alternative product can be used. |
| Ethidium bromide | Carl Roth | 2218.2 | Agarose gel stain for detecting DNA/RNA. |
| GeneJet plasmid miniprep kit | Thermo Fisher | K0502 | Plasmid purifcation from bacteria. Alternative product can be used. |
| NotI, FastDigest | Life Technologies - Thermo Fisher Scientific, USA | FD0594 | Endonuclease. Alternative product can be used. |
| Plasmid Mini AX kit | A&A Biotechnology, Poland | 010-50 | Plasmid purifcation kit used to purify eccDNA. |
| Plasmid-Safe ATP-dependent DNase kit | Epicentre, USA | E3105K | ATP-dependent exonuclease kit. Alternative product can be used. |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich, USA | 81845 | Alternative product can be used. |
| pUG6 plasmid | EUROSCARF, Germany | P30114 | Marker gene: loxP-PAgTEF1-kanMX-TAgTEF1-loxP. |
| QIAGEN genomic-tip 100/G | Qiagen, USA | 13343 | Genomic DNA purifcation from yeast. Alternative product can be used. |
| REPLI-g Mini Kit protocol | Qiagen, USA | 150023 | Amplification of eccDNA by the phi29 polymerase. |
| Yeast extract | BD Difco | 210929 | Alternative product can be used. |
| Zymolyase 100T (Lyticase, Yeast Lytic Enzyme) | Nordic BioSite, Sweden | Z1004-3 | Alternative product can be used. |
| Data access to sequence files | European Nucleotide Archive | EccDNA dataset from Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D. Study accession number PRJEB9684. 2nd accession number is ERP010820. Locus tag prefix is BN2032. | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Strains | |||
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D | Genotype MATa MAL2-8c SUC2 | ||
| Saccharomyces cerevisiae yeast deletion library pool | EUROSCARF, Germany | S288c BY4741 pool of 4400 viable single-gene deletion mutants disrubted by KanMX module. Genotypes MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 genexxx::KanMX. | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| DNA Spectrophotometer | NanoDrop 1000 Spectrophotometer, Thermo Fisher | Measuring DNA concentration. Alternative product can be used. | |
| Fluorescence microscopy | Nikon Optronics Magnafire. Red excitation fluorescence filter, 663-738 nm. | Alternative product can be used. | |
| Robotic library-build system | Apollo 324, IntegenX Inc. | DNA library preparation. Alternative product can be used. | |
| Sequencing platform | Illumina HiSeq 2000 platform, Illumina Inc. | DNA sequencing. Alternative product can be used. | |
| Ultrasonicator | Covaris LE220, microTUBE AFA Fiber tubes | Alternative product can be used. | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methods | |||
| 2% YPD media | Mix 10 g Dextrose, 10 g Yeast extract, 20 g Bacto peptone and add H2O to a total volume of 1000 ml and autoclave. | ||
| Circle-Seq test on genomic DNA | Genomic DNA was purified (Qiagen) from a pool of the yeast deletion library (Euroscarf). The DNA concentration was measured by nanodrop and 30 µg genomic DNA was pipetted into two micro centrifuge tubes. One micro centrifuge tube was supplemented with 100 nanogram plasmid (pUG6). The DNA samples were purified by Circle-Seq, omitting the protocol steps 1.1-1.3 and 1.5-1.7. The eluted DNA concentrations were measured by nanodrop and the entire DNA yield from sample GD and GD+P was treated with exonuclease for a period of 29 hours. A 10% fraction was collected for phi29-amplification and PCR analysis, while the remaining DNA was subjected to 72 hour exonuclease treatment. The samples were analyzed for linear DNA content by PCR, using the ACT1 gene as chromosomal marker. A 5% fraction of each of the exonuclease treated samples was amplified by the phi29 DNA polymerase for 16 hours (Qiagen). The presence of DNA in each sample was examined by loading an equal amount (7 µl) in wells on an 0.5 µg/ml ethidium-bromide 0.9% agarose gel after running gel-electrophoresis. | ||
| Mapping software | Bowtie2 aligner, John Hopkins University | Ultrafast short read alignment. Reference: 29. | |
| Propidium iodide stain | Images of propidium iodine stained DNA were captured by fluorescence microscopy at 100x magnification (100x/1.30 oil, Nikon) in the RFP channel (red excitation fluorescence filter, 663-738 nm) using identical exposition time (5 seconds). | ||
| Workflow bioinformatic system | Galaxy, Open source. | A free web-based platform for data intensive biomedical research. References: 27-28. |
References
- Kugelberg, E., Kofoid, E., et al. The Tandem Inversion Duplication in Salmonella enterica.: Selection Drives Unstable Precursors to Final Mutation Types. Genetics. 185 (1), 65-80 (2010).
- Reams, A. B., Kofoid, E., Savageau, M., Roth, J. R. Duplication Frequency in a Population of Salmonella enterica. Rapidly Approaches Steady State With or Without Recombination. Genetics. 184 (4), 1077-1094 (2010).
- Smith, C. A., Vinograd, J. Small polydisperse circular DNA of HeLa cells. Journal of Molecular Biology. 69 (2), 163-178 (1972).
- Carroll, S. M., DeRose, M. L., et al. Double Minute Chromosomes Can Be Produced from Precursors Derived from a Chromosomal Deletion. Molecular and cellular biology. 8 (4), 1525-1533 (1988).
- Cohen, S., Yacobi, K., Segal, D. Extrachromosomal Circular DNA of Tandemly Repeated Genomic Sequences in Drosophila. Genome research. 13 (6A), 1133-1145 (2003).
- Horowitz, H., Haber, J. E. Identification of Autonomously Replicating Circular Subtelomeric Y' Elements in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and cellular biology. 5 (9), 2369-2380 (1985).
- Moore, I. K., Martin, M. P., Dorsey, M. J., Paquin, C. E. Formation of Circular Amplifications in Saccharomyces cerevisiae by a Breakage-Fusion-Bridge Mechanism. Environmental and molecular mutagenesis. 36 (2), 113-120 (2000).
- Gresham, D., Usaite, R., Germann, S. M., Lisby, M., Botstein, D., Regenberg, B. Adaptation to diverse nitrogen-limited environments by deletion or extrachromosomal element formation of the GAP1 locus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (43), 18551-18556 (2010).
- Windle, B., Draper, B. W., Yin, Y. X., O'Gorman, S., Wahl, G. M. A central role for chromosome breakage in gene amplification, deletion formation, and amplicon integration. Genes & development. 5 (2), 160-174 (1991).
- Gresham, D., Ruderfer, D. M., et al. Genome-Wide Detection of Polymorphisms at Nucleotide Resolution with a Single DNA Microarray. Science. 311 (5769), 1932-1936 (2006).
- Kidd, J. M., Cooper, G. M., et al. Mapping and sequencing of structural variation from eight human genomes. Nature. 453 (7191), 56-64 (2008).
- Gresham, D., Desai, M. M., Botstein, D., Dunham, M. J. The Repertoire and Dynamics of Evolutionary Adaptations to Controlled Nutrient-Limited Environments in Yeast. PLoS Genetics. 4 (12), 1-19 (2008).
- Lang, G. I., Botstein, D., Desai, M. M. Genetic Variation and the Fate of Beneficial Mutations in Asexual Populations. Genetics. 188 (3), 647-661 (2011).
- van Loon, N., Miller, D., Murnane, J. P. Formation of extrachromosomal circular DNA in HeLa cells by nonhomologous recombination. Nucleic Acids Research. 22 (13), 2447-2452 (1994).
- Vinograd, J., Lebowitz, J. Physical and Topological Properties of Circular Dna. Journal of General Physiology. 49 (6P2), 103 (1966).
- Shibata, Y., Kumar, P., et al. Extrachromosomal MicroDNAs and Chromosomal Microdeletions in Normal Tissues. Science. 336 (6077), 82-86 (2012).
- Dillon, L. W., Kumar, P., et al. Production of Extrachromosomal MicroDNAs Is Linked to Mismatch Repair Pathways and Transcriptional Activity. Cell Reports. 11 (11), 1749-1759 (2015).
- Li, L. L., Norman, A., Hansen, L. H., Sørensen, S. J. Metamobilomics - our knowledge on the pool of plasmid encoded traits in natural environments using high-throughput sequencing. Clinical microbiology and infection : the official publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 18, 5-7 (2012).
- Brown Kav, A., Sasson, G., Jami, E., Doron-Faigenboim, A., Benhar, I., Mizrahi, I. Insights into the bovine rumen plasmidome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (14), 5452-5457 (2012).
- Møller, H. D., Parsons, L., Jørgensen, T. S., Botstein, D., Regenberg, B. Extrachromosomal circular DNA is common in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 201508825 (2015).
- Drubin, D. G., Miller, K. G., Botstein, D. Yeast Actin-Binding Proteins - Evidence for a Role in Morphogenesis. The Journal of cell biology. 107 (6), 2551-2561 (1988).
- Magdolen, V., Drubin, D. G., Mages, G., Bandlow, W. High levels of profilin suppress the lethality caused by overproduction of actin in yeast cells. FEBS letters. 316 (1), 41-47 (1993).
- Sandrock, T. M., Brower, S. M., Toenjes, K. A., Adams, A. Suppressor analysis of fimbrin (Sac6p) overexpression in yeast. Genetics. 151 (4), 1287-1297 (1999).
- Blanco, L., Bernad, A., Lázaro, J. M., Martìn, G., Garmendia, C., Salas, M. Highly Efficient DNA Synthesis by the Phage ø29 DNA Polymerase. The Journal of biological chemistry. 264 (15), 8935-8940 (1989).
- Dean, F. B. Rapid Amplification of Plasmid and Phage DNA Using Phi29 DNA Polymerase and Multiply-Primed Rolling Circle Amplification. Genome research. 11 (6), 1095-1099 (2001).
- Hutchison, C. A., Smith, H. O., Pfannkoch, C., Venter, J. C. Cell-free cloning using ø29 DNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (48), 17332-17336 (2005).
- Goecks, J., Nekrutenko, A., Taylor, J., Galaxy Team, T. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biology. 11 (8), 86 (2010).
- Giardine, B., Riemer, C., et al. Galaxy: A platform for interactive large-scale genome analysis. Genome research. 15 (10), 1451-1455 (2005).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357 (2012).
- Tsalik, E. L., Gartenberg, M. R. Curing Saccharomyces cerevisiae of the 2 micron plasmid by targeted DNA damage. Yeast. 14 (9), Chichester, England 847-852 (1998).
- Norman, A., Riber, L., Luo, W., Li, L. L., Hansen, L. H., Sørensen, S. J. An Improved Method for Including Upper Size Range Plasmids in Metamobilomes. PLoS ONE. 9 (8), e104405 (2014).
- Storlazzi, C. T., Lonoce, A., et al. Gene amplification as double minutes or homogeneously staining regions in solid tumors: Origin and structure. Genome research. 20 (9), 1198-1206 (2010).
- Von Hoff, D. D., Needham-VanDevanter, D. R., Yucel, J., Windle, B. E., Wahl, G. M. Amplified human MYC localized to replicating submicroscopic circular DNA molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (13), 4804-4808 (1988).
- Raymond, E., Faivre, S., et al. Effects of hydroxyurea on extrachromosomal DNA in patients with advanced ovarian carcinomas. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 7 (5), 1171-1180 (2001).
- Shimizu, N. Extrachromosomal Double Minutes and Chromosomal Homogeneously Staining Regions as Probes for Chromosome Research. Cytogenetic and genome research. 124 (3-4), 3-4 (2009).
- Eckhardt, S. G., Dai, A., Davidson, K. K., Forseth, B. J., Wahl, G. M., Von Hoff, D. D. Induction of differentiation in HL60 cells by the reduction of extrachromosomally amplified c-myc. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (14), 6674-6678 (1994).
- Vogt, N., Lefèvre, S. -H., et al. Molecular structure of double-minute chromosomes bearing amplified copies of the epidermal growth factor receptor gene in gliomas. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (31), 11368-11373 (2004).
- Ahn, K., Gotay, N., et al. High rate of disease-related copy number variations in childhood onset schizophrenia. Molecular psychiatry. 19 (5), 568-572 (2013).
- Girirajan, S., Johnson, R. L., et al. Global increases in both common and rare copy number load associated with autism. Human molecular genetics. 22 (14), 2870-2880 (2013).
- Vogt, N., Gibaud, A., Lemoine, F., de la Grange, P., Debatisse, M., Malfoy, B. Amplicon rearrangements during the extrachromosomal and intrachromosomal amplification process in a glioma. Nucleic Acids Research. , (2014).
