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Biology

कोशिकाओं से Extrachromosomal परिपत्र डीएनए के जीनोम चौड़ा शोधन

Published: April 4, 2016 doi: 10.3791/54239
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 5, 1
1Department of Biology, University of Copenhagen, 2National Veterinary Institute, Technical University of Denmark, 3Group Health Research Institute, 4Lewis-Sigler Institute for Integrative Genomics, Princeton University, 5Calico Life Sciences LLC

Abstract

Extrachromosomal परिपत्र DNAs (eccDNAs) Saccharomyces cerevisiae में आम आनुवंशिक तत्व हैं और साथ ही साथ अन्य eukaryotes में रिपोर्ट कर रहे हैं। EccDNAs और बहुकोशिकीय जीवों में दैहिक कोशिकाओं के बीच कोशिकीय eukaryotes के विकास के लिए आनुवंशिक परिवर्तन करने के लिए योगदान करते हैं। eccDNA का पता लगाने के लिए संवेदनशील तरीकों को स्पष्ट करने के लिए कैसे इन तत्वों जीनोम स्थिरता और कैसे पर्यावरण और जैविक कारकों कोशिकाओं में अपने गठन को प्रेरित को प्रभावित जरूरत है। यह वीडियो एक संवेदनशील eccDNA-शुद्धि सर्किल Seq बुलाया विधि प्रस्तुत करता है। विधि परिपत्र डीएनए, शेष रेखीय गुणसूत्र डीएनए, eccDNA के रोलिंग सर्कल प्रवर्धन, गहरी अनुक्रमण, और मानचित्रण के हटाने के स्तंभ शुद्धि शामिल हैं। व्यापक exonuclease उपचार के लिए पर्याप्त रैखिक गुणसूत्र डीएनए के क्षरण के लिए आवश्यक था। द्वारा रोलिंग सर्कल प्रवर्धन कदमine से ऊंचाई:। सामान्य; "> φ 29 पोलीमर्स रैखिक डीएनए के ऊपर परिपत्र डीएनए के लिए समृद्ध 10 10 कोशिकाओं के तीन एस cerevisiae CEN.PK आबादी पर सर्किल Seq विधि के मान्यकरण आकारों में eccDNA प्रोफाइल के सैकड़ों 1 kilobase से बड़ा का पता चला । ASP3-1, COS111, CUP1, RSC30, HXT6, दोनों S288c और CEN.PK पता चलता है कि डीएनए circularization इन स्थलों पर प्रकारों के बीच संरक्षित है में परिपत्र डीएनए पर HXT7 जीनों। संक्षेप में दोहराया निष्कर्षों, सर्किल-Seq विधि व्यापक है eukaryotes में रूप में अच्छी तरह के रूप में विशिष्ट eccDNA प्रकार का पता लगाने के लिए eccDNA के लिए जीनोम पैमाने स्क्रीनिंग के लिए प्रयोज्यता।

Introduction

जल्दी या क्षणिक गुणसूत्र प्रवर्धन का पता लगाने मुश्किल है क्योंकि यह कोशिकाओं की बड़ी आबादी में एकल डीएनए अणु में परिवर्तन की पहचान करने की आवश्यकता है। गुणसूत्र कॉपी संख्या रूपों (CNVs) आम तौर पर उनकी स्थापना के बाद अच्छी तरह से पता चला रहे हैं, व्यवस्था है कि बदलाव 1,2 उत्पन्न के सबूत के रूप में केवल अंतिम CNV संरचना को छोड़कर। का पता लगाने और CNV गठन के पहले चरण में extrachromosomal परिपत्र डीएनए (eccDNA) जीनोमिक rearrangements में चल रही प्रक्रियाओं को स्पष्ट हो सकता है ठीक हो।

इससे पहले, नए सिरे से eccDNA की खोज इलेक्ट्रॉन micrographs 3, metaphase गुणसूत्रों 4, या दो आयामी जेल वैद्युतकणसंचलन 5 की Giemsa धुंधला द्वारा किया गया था। इन विधियों परिपत्र डीएनए के अनुक्रम के बारे में बहुत कम या कोई जानकारी प्रदान करते हैं। इस तरह के दक्षिणी सीटू hybridizatio में 6.7, उलटा पीसीआर 8 या प्रतिदीप्ति सोख्ता के रूप में लक्षित तकनीकn 9 केवल विशिष्ट eccDNA तत्वों के बारे में सबूत प्रदान करते हैं। इन तरीकों में से कोई भी एक सेल की आबादी में सभी मौजूदा eccDNA प्रकार के अनुक्रम प्रदान करते हैं।

कोशिकाओं का एक पूल में जीनोमिक विचलन जीनोम अनुक्रमण और / या खपरैल का छत सरणियों 10,11 के द्वारा होती जा सकता है। एक विलोपन या पारंपरिक डीएनए शुद्धि तरीकों से प्रवर्धन का पता लगाने के लिए जरूरी है कि आम तौर पर एक उत्परिवर्तित एलील सेल की आबादी 12,13 के कम से कम 0.1-1% प्रतिनिधित्व करते हैं। Acentric eccDNAs centromeres की कमी और नकल पर डीएनए संश्लेषण की क्षमता का अभाव होने के कारण एक सेल संस्कृति में और भी अधिक क्षणिक होने की उम्मीद कर रहे हैं। इस प्रकार, के बाद से सबसे eccDNAs शायद कम मात्रा में हैं और उनके दृश्यों जीनोम जैसे लगते हैं, वैकल्पिक डीएनए निष्कर्षण तरीकों eccDNAs पता लगाने के लिए आवश्यक हैं।

कई परिपत्र डीएनए शोधन तकनीक क्रोमोसोम और डीएनए परिपत्र के बीच मतभेद का फायदा उठाने के संरचनात्मक। उदाहरण के लिए, उच्च गति के लिए ultracentrifugसीज़ियम क्लोराइड ढ़ाल में व्यावहारिक मानव हेला कैंसर कोशिका लाइन 14 से 350-3000 basepairs (बीपी) बड़े eccDNAs को अलग-थलग करने के लिए प्रयोग किया जाता है। हालांकि, उच्च वेग supercoiled परिपत्र डीएनए संरचना की रीढ़ तोड़ने या निक सकते हैं, अवसादन वेग 15 और eccDNA उपज फेरबदल। दत्ता और सहकर्मियों नए सिरे से, माउस ऊतकों से और साथ ही मानव कोशिकाओं 16,17 चिकन की संस्कृतियों और से परिपत्र डीएनए के जीनोम पैमाने पहचान के लिए एक विधि विकसित की है। उनकी पद्धति सुक्रोज प्लाज्मिड शुद्धि और एंजाइमी प्रतिक्रियाओं और डीएनए एक्सट्रेक्शन के कई दौर के द्वारा पीछा ultracentrifugation द्वारा homogenized ऊतक से नाभिक की निकासी है। उनके प्रोटोकॉल मुख्य रूप से 200-400 बीपी eccDNAs, कहा जाता है microDNAs को पहचानती है। दत्ता और सहकर्मियों को भी Saccharomyces cerevisiae से microDNAs की शुद्धि का प्रयास किया लेकिन इस खमीर प्रजातियों 16 से microDNA रिकॉर्ड करने में असमर्थ थे।

हम के लिए एक उपन्यास तरीका विकसित किया हैखमीर से eccDNA की नए सिरे से पता लगाने के सर्किल Seq बुलाया। इस विधि को काफी बड़े पूरे जीन ले जाने के लिए और 86 kilobase (केबी) माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए (mtDNA) के रूप में के रूप में बड़े परिपत्र डीएनए अणु के लिए जीनोम पैमाने पर सर्वेक्षण के लिए सक्षम बनाता है। सर्किल-Seq विधि एक अच्छी तरह से स्थापित प्रोकार्योटिक प्लाज्मिड शोधन विधि 18,19 से विकसित किया गया था, यूकेरियोटिक खमीर कोशिकाओं के लिए अनुकूलित और गहरी अनुक्रमण के साथ संयुक्त। सर्किल-Seq दृष्टिकोण, 1756 विभिन्न eccDNAs, सभी से बड़ा 1 केबी का उपयोग करना, दस एस से पता चला रहे थे cerevisiae S288c 20 आबादी। एक आकार कट-ऑफ eccDNA कि काफी बड़ी पूरे जीन ले जाने के लिए थे पर ध्यान केंद्रित करने के लिए चुना गया था। सर्किल-Seq अत्यधिक संवेदनशील था; यह कोशिकाओं 20 के हजारों के भीतर एक ही eccDNA का पता चला। वर्तमान अध्ययन में, सर्किल Seq को अलग और एक और एस के तीन जैविक प्रतिकृति से 294 eccDNAs की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था cerevisiae खमीर तनाव, CEN.PK. आंकड़ों से पता चलता है कि eccDNA एक आम आनुवंशिक Eleme हैएस में एनटी cerevisiae उपभेदों।

Protocol

नोट: परिपत्र डीएनए शुद्धि और अनुक्रमण विधि (सर्किल seq) का अवलोकन चित्रा 1 में सचित्र है।

1. खेती, सेल हार्वेस्ट और प्लाज्मा झिल्ली विघटन

  1. खमीर peptone डेक्सट्रोज के 50 मिलीलीटर पूरा पोषक तत्व मध्यम (YPD) में एक हे / एन संस्कृति से खमीर कोशिकाओं (उदाहरण के लिए Saccharomyces cerevisiae) टीका लगाना। 1-3 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल के एक कम प्रारंभिक सेल घनत्व या लगभग 0.01 600 आयुध डिपो की एक ऑप्टिकल घनत्व पर टीका लगाना।
    1. प्रति मिनट (आरपीएम) 150 राउंड में आंदोलन के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं जब तक कोशिकाओं लगभग 24 से 48 घंटा या आयुध डिपो के 600> 10.0 पर एक ऑप्टिकल घनत्व के बाद, लगभग 1 एक्स 10 10 कोशिकाओं की अधिकतम सेल घनत्व तक पहुँचने।
      ध्यान दें: के रूप में कम सेल सांद्रता इस्तेमाल किया जा सकता खेती समय महत्वपूर्ण नहीं है।
  2. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब पार कर दी संस्कृति स्थानांतरण, पर centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं3 मिनट के लिए XG और सतह पर तैरनेवाला त्यागें 800।
  3. 25 मिलीलीटर 10 मिमी Tris-सीएल, 1 मिमी EDTA, 8.0 पीएच के बफर समाधान के साथ गोली धो लें, 3 मिनट के लिए 800 XG पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं को फिर से गोली और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  4. 1.2 मिलीलीटर मेजबान बफर एक प्लाज्मिड स्तंभ-शुद्धि किट से आपूर्ति में सेल गोली Resuspend।
  5. वैकल्पिक कदम: परिपत्र डीएनए तत्वों 20 की शुद्धि के लिए नियंत्रण के रूप में अत्यधिक पतला plasmids जोड़ें।
    नोट: वर्तमान डाटासेट में, एक 7.7 μl प्लाज्मिड मिश्रण 10 10 कोशिकाओं से युक्त प्रत्येक नमूना के लिए लागू किया गया था। प्लाज्मिड शेयर मिश्रण विभिन्न सांद्रता में तीन plasmids के शामिल हैं; 38 एनजी / नमूना पर pBR322, pUC19 0.5 एनजी / नमूना पर, और pUG72 0.01 एनजी / नमूना पर।
  6. कुल निलंबन की मात्रा का अनुपात 3: दो 2 मिलीलीटर सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब में सेल निलंबन स्थानांतरण, प्रत्येक एक 1 पर 0.5 मिमी ग्लास मनकों के साथ पूरक।
  7. प्लाज्मा सेल को बाधित करने के लिए 10 मिनट के लिए भंवर अधिकतम गति से प्रत्येक ट्यूबझिल्ली। 30 सेकंड के लिए 268 XG पर centrifugation द्वारा मोती गोली और 1.2 मिलीलीटर दो microcentrifuge ट्यूब से एक नया ट्यूब करने के लिए संयुक्त सतह पर तैरनेवाला हस्तांतरण।
    नोट: वैकल्पिक 1.6-1.7 कदम करने के लिए, 0.6 मिलीग्राम मेजबान बफर समाधान में कोशिकाओं को बाधित करने के zymolyase का उपयोग करें। Zymolyase की दस यूनिट 35 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 घंटे के भीतर 5 एक्स 10 7 कोशिकाओं को बाधित कर सकते हैं।

2. EccDNA संवर्धन कॉलम क्रोमैटोग्राफी द्वारा

  1. plasmids के स्तंभ शुद्धि के लिए एक किट से प्रोटोकॉल का पालन करें। संक्षेप में, 1.2 मिलीलीटर क्षारीय समाधान के साथ प्रत्येक नमूने का इलाज है, धीरे मिश्रण और आरटी पर 3 मिनट सेते हैं।
  2. 1.2 मिलीलीटर निराकरण बफर जोड़ें, 5 मिनट के लिए 9650 XG पर धीरे और सेंट्रीफ्यूज मिश्रण।
  3. एक कॉलम 1 मिलीलीटर संतुलन समाधान के साथ equilibrated पर समाधान लोड और तरल गंभीरता से कॉलम के माध्यम से प्रवाह के लिए अनुमति देते हैं।
  4. 4 मिलीलीटर धोने के समाधान के साथ स्तंभ धो लें। समाधान राल के माध्यम से पारित कर दिया गया है, ध्यान से 0.3 मिलीलीटर क्षालन इसलिए जोड़नेlution 0.35 मिलीलीटर स्तंभ शून्य मात्रा का सबसे बदलने के लिए।
  5. 1 मिलीलीटर क्षालन समाधान के साथ एक नया संग्रह ट्यूब में डीएनए Elute और 0.8 मिलीलीटर वर्षा मिश्रण जोड़कर डीएनए वेग। 10 मिनट के लिए 9650 XG पर अपकेंद्रित्र।
  6. 5 से 15 मिनट के लिए 5 मिनट, शुष्क हवा के लिए 9650 XG पर 0.5 मिलीलीटर 70% इथेनॉल, सेंट्रीफ्यूज के साथ डीएनए गोली धो लें और 25 μl बाँझ पानी में शुद्ध डीएनए भंग।
    नोट: पानी में डीएनए का केवल अल्पकालिक भंडारण की सिफारिश की है। रियायत के चरण 3 पर सीधे आगे बढ़ना।

रैखिक गुणसूत्र डीएनए शेष 3. पाचन

  1. वैकल्पिक कदम: exonuclease द्वारा रैखिक डीएनए के विशिष्ट पाचन की सुविधा के लिए, इस तरह के चना के रूप में एक दुर्लभ काटने endonuclease के साथ शुद्ध डीएनए का इलाज। 5 माइक्रोग्राम प्रति डीएनए के लिए, 50 μl की कुल मात्रा को 1 यूनिट चना, 5 μl 10x पाचन बफर और बाँझ पानी का उपयोग करें। 16 घंटा और गर्मी के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया सेते 5 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर endonuclease निष्क्रिय।
  2. 20 जोड़ेइकाइयों exonuclease (2 μl), 4 μl एटीपी (25 मिमी), 34 μl बाँझ पानी और 10 μl 10x प्रतिक्रिया 50 μl endonuclease-cleaved डीएनए के लिए सीधे बफर 100 μl की एक 1x प्रतिक्रिया मात्रा तक पहुँचने के लिए, एटीपी निर्भर exonuclease का उपयोग कर किट।
  3. 5 दिन या उससे अधिक के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रेखीय एकल असहाय और डबल असहाय डीएनए के हाइड्रोलिसिस प्रदर्शन करना। एक अतिरिक्त 4 μl एटीपी (25 मिमी), 0.6 μl 10x प्रतिक्रिया बफर और 20 इकाइयों हर 24 घंटा एक 1x प्रतिक्रिया मात्रा में एंजाइमी डीएनए पाचन जारी रखने के लिए exonuclease जोड़ें।
  4. रैखिक डीएनए को हटाने के बाद, exonuclease में इलाज के समाधान से नमूना 2 μl ऐसे actin जीन Act1 20 के रूप में मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qPCR), एक गुणसूत्र मार्कर का उपयोग करके गुणसूत्र रैखिक डीएनए के उन्मूलन की पुष्टि करें।
    1. प्रत्येक 20 μl qPCR प्रतिक्रिया मात्रा 2 μl exonuclease इलाज नमूना, 150 एनएम Act1 प्राइमरों 5'-TCCGTCTGGATTGGTGGTTCTA -3 'और 5'-TGGACCACTTTCGTC शामिलGTATTC -3 ', 2% (मात्रा / मात्रा) डाइमिथाइल sulfoxide, और 10 μl हरी फ्लोरोसेंट मास्टर मिश्रण।
    2. प्रतिक्रिया शर्त का उपयोग करें; 95 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट, 95 डिग्री सेल्सियस पर 15 सेकंड के 45 चक्र और 60 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड के द्वारा पीछा किया।
      नोट: Act1 रैखिक डीएनए के लिए एक विशेष रूप से उपयुक्त मार्कर के बाद से इस जीन में नकल संख्या रूपों हानिकारक 21-23 इसलिए eccDNA Act1 नहीं ले जाना चाहिए रहे है।
    3. qPCR द्वारा डीएनए पाचन के विश्लेषण के लिए विकल्प मानक पीसीआर (4.3) या propidium आयोडाइड धुंधला (4.4) कर रहे हैं।
      1. Act1 प्राइमरों 5'-TGGATTCTGGTATGTTCTAGC -3 'और 5'-GAACGACGTGAGTAACACC-3' के साथ पीसीआर टेम्पलेट के रूप में 2 μl exonuclease इलाज नमूना का प्रयोग करें। सकारात्मक Act1 नियंत्रण के रूप में, एनजी जीनोमिक एस 50-100 का उपयोग टेम्पलेट के रूप में cerevisiae डीएनए। पीसीआर प्रतिक्रिया की स्थिति; 95 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट, 95 डिग्री सेल्सियस, 56 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड और 72 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट पर 30 सेकंड के 35 चक्र द्वारा पीछा किया।
      2. भागो पीसीआर जेल electrophore द्वारा प्रतिक्रियाओं0.5 माइक्रोग्राम के साथ 1% agarose पर बहन / एमएल ethidium ब्रोमाइड। एक 0.8 केबी Act1 बैंड के लिए देखो।
    4. अभाव या रैखिक डीएनए की उपस्थिति भी पहले और डीएनए प्रवर्धन के बाद propidium आयोडाइड धुंधला द्वारा जांच की जा सकती है।
      1. 20 मिमी propidium आयोडाइड शेयर के 1000 एच 2 ओ-पतला समाधान एक 1: 1 के साथ मात्रा: एक 1 में प्रत्येक डीएनए नमूना मिक्स। आरटी पर 10-20 मिनट के लिए अंधेरे में समाधान छोड़ दो और 663-738 एनएम और 5 से 30 सेकंड के एक जोखिम-समय पर एक लाल रंग उत्तेजना प्रतिदीप्ति फिल्टर का उपयोग 100x बढ़ाई प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा डीएनए धुंधला विश्लेषण। डीएनए धुंधला नियंत्रण के रूप में उपयोग खमीर और / या ø29 प्रवर्धित प्लाज्मिड से जीनोमिक डीएनए ø29 प्रवर्धित।
  5. हीट 30 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर exonuclease समाधान निष्क्रिय।

4. डीएनए प्रवर्धन

  1. शुद्ध बढ़ाना और ø29 डीएनए पोलीमरेज़ 24-26 समझौते के साथ कदम 3.5) से eccDNA समृद्धपोलीमर्स निर्माता के प्रोटोकॉल के लिए हैैं।
    1. संक्षेप में, 5 μl विकृतीकरण बफर के साथ समृद्ध eccDNA 5 μl मिश्रण।
    2. आरटी पर 3 मिनट के बाद, 10 μl निराकरण बफर जोड़ें। धीरे मिक्स और 30 μl गुरु 29 μl प्रतिक्रिया बफर और 1 μl ø29 डीएनए पोलीमरेज़ युक्त मिश्रण जोड़ें। (72 घंटा तक) 16 घंटा या उससे अधिक के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया सेते हैं। हीट 3 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर ø29 डीएनए पोलीमरेज़ निष्क्रिय।

5. अनुक्रमण और डेटा विश्लेषण

  1. 300 बीपी के एक औसत लक्ष्य चोटी आकार के लिए एक केंद्रित ultrasonicator के साथ प्रवर्धित eccDNA कतरनी। एक 130 μl डीएनए नमूने लिए निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग करें: 450W शिखर तीव्रता बिजली, 60 सेकंड के उपचार, 30% कर्तव्य कारक, फट प्रति 200 चक्र, तापमान 7 डिग्री सेल्सियस।
  2. बारकोड सूचकांक लेबल और एडेप्टर को खंडित अनुक्रमण के लिए पुस्तकालयों के संश्लेषण के लिए पढ़ता है, पुस्तकालय तैयारी के लिए एक उपयुक्त विधि का उपयोग जोड़ें।
  3. गहरी अनुक्रमण रन, उदाहरण के लिए के रूप में 141-न्यूक्लियोटाइड एकल अंत एक उच्च throughput अनुक्रमण मंच पर पढ़ता है।
  4. मानचित्र जांच के तहत खमीर संदर्भ जीनोम को पढ़ता है और अनुमति देने के कई क्षेत्रों के लिए नक्शा करने के लिए पढ़ता है। उदाहरण के लिए, एक स्वतंत्र रूप से उपलब्ध कार्यप्रवाह प्रणाली 27,28 और छोटी-पढ़ने के लिए एलाइनर मानचित्रण सॉफ्टवेयर 29 का उपयोग करें।
  5. पहचानें अंतराल 20 बिना सटे पढ़ता है, उदाहरण के लिए, अधिक से अधिक सात सटे पढ़ता (> 1 केबी) का उपयोग ख्यात eccDNAs के क्षेत्रों से पढ़ता है।
    नोट: सॉफ्टवेयर उपलब्ध है मैप किया खोज के लिए 27,28 ब्याज की जीनोमिक क्षेत्रों में पढ़ता है।

Representative Results

सर्किल-Seq विधि, तीन एस मान्य करने के लिए बाद कोशिकाओं दस पीढ़ियों के लिए YPD में अलग से बड़े हो रहे थे 1 एक्स 10 10 कोशिकाओं के cerevisiae CEN.PK आबादी जांच की गई। के रूप में पहले से वर्णित 20 (डेटा) नहीं दिखाया गुणसूत्र डीएनए रेखीय उन्मूलन एक qPCR Act1 संकेत के अभाव के द्वारा पुष्टि की गई। शुद्ध और समृद्ध eccDNA 68 लाख तक की अनुक्रम था पढ़ता (141-न्यूक्लियोटाइड एकल अंत पढ़ता है) और CEN.PK113-7D संदर्भ जीनोम (संस्करण 19 जून 2012) के लिए मैप। सी 1, सी 2 और सी 4 नामित तीन नमूनों से ख्यात eccDNAs की रिकॉर्डिंग सन्निहित से मैप 1 केबी से अधिक समय पढ़ता जीनोमिक क्षेत्रों को सौंपा गया। 10,000 मोंटे कार्लो सिमुलेशन के आधार पर, प्रत्येक क्षेत्र के समीपस्थ से मैप के महत्व को पढ़ता है अब की तुलना में 1 केबी अनुमान लगाया गया था। से 79, 159 और 56 क्षेत्रों की संभावना eccDNA दृश्यों (पी <0.1, डेटासेट 1) के रूप में एनोटेट कर रहे थे। दर्ज contiguo की संख्याहमें पढ़ता> 1 केबी का सुझाव होगा कि और भी अधिक eccDNA तत्वों अगर नमूने आगे (चित्रा 2) अनुक्रम निर्धारण किया गया था दर्ज किया गया है अनुक्रम गहराई के एक समारोह के रूप में वृद्धि हुई है। जैसी कि उम्मीद थी, सर्किल-Seq विधि निकाली गुणसूत्र बारहवीं पर 2μ प्लाज्मिड सहित जाना जाता परिपत्र डीएनए तत्वों, mitochondrial डीएनए, आरएनए ribosomal जीनों के एक नंबर से कई पढ़ता है, और तीन आंतरिक नियंत्रण plasmids pBR322, pUC19 और pUG72 कि नमूने में नुकीला थे सिर्फ स्तंभ शुद्धि (चित्रा 3) से पहले।

वीडियो सन्निहित का एक उदाहरण पढ़ता है कि गुणसूत्र चतुर्थ पर HXT7 _ARS432_ HXT6 ठिकाना बना हुआ दिखाता है। इससे पहले, [HXT6 / 7 चक्र] दस S288c आबादी (1 एक्स 10 10 कोशिकाओं के साथ प्रत्येक) और परिपत्र डीएनए संरचना में सर्किल Seq द्वारा खोजा गया था उलटा पीसीआर विश्लेषण 20 से पुष्टि की गई। [HXT6 / 7 सीआईrcle] भी तीन CEN.PK आबादी (चित्रा 4 ए) में से प्रत्येक में दर्ज किया गया था। इसके अलावा, CEN.PK के दोहराने के नमूनों के बीच आम eccDNA जीन की सबसे S288c डेटासेट (चित्रा 4 बी) से eccDNA जीन छा।

परिपत्र डीएनए शुद्धि, दो नमूने, 30 माइक्रोग्राम जीनोमिक डीएनए के साथ प्रत्येक के लिए सर्किल Seq प्रोटोकॉल की विशिष्टता का परीक्षण करने के लिए, परीक्षण किया गया। एक नमूना 100 एनजी प्लास्मिड डीएनए और दोनों नमूने सर्किल Seq प्रोटोकॉल द्वारा शुद्ध किया गया से eccDNA के साथ पूरक किया गया था। स्तंभ जुदाई के बाद, डीएनए उपज प्लाज्मिड (जीडी) और प्लाज्मिड के साथ नमूना के लिए 1.60% (480 एनजी) (जी डी पी) के बिना नमूना के लिए 1.27% (380 एनजी) था। Exonuclease उपचार की दक्षता में 29 घंटा और 72 घंटा Act1 के खिलाफ पीसीआर उपयोग करने के बाद रैखिक डीएनए सामग्री के लिए परीक्षण किया गया था। कोई नमूने Act1 परिलक्षित समाहित (डेटा) नहीं दिखाया। प्रत्येक exonuclease इलाज के नमूने के एक अंश आगे एक थाø29 द्वारा mplified पोलीमर्स और enzymatic प्रतिक्रियाओं के उत्पादों propidium आयोडाइड धुंधला (चित्रा 5 ए-एफ) और agarose जेल वैद्युतकणसंचलन (चित्रा 5G) द्वारा विश्लेषण किया गया। Exonuclease उपचार के बाद नमूनों की न्यूनतम propidium आयोडीन दाग (चित्रा 5 ए-बी) से पता चला है। Ø29 - केवल जीनोमिक डीएनए के साथ परिलक्षित नमूना धागे की तरह संरचनाओं (चित्रा 5C) नियंत्रण नमूना (चित्रा 5E) के लिए इसी तरह का पता चला। Ø29 - प्रवर्धित नमूना है कि जोड़ा प्लाज्मिड था foci (चित्रा 5 डी) प्लाज्मिड नियंत्रण (चित्रा 5F) जैसी का पता चला। छवियों कि ø29 पोलीमर्स रैखिक डीएनए के ऊपर परिपत्र डीएनए के लिए समृद्ध संकेत दिया। अधिकांश रैखिक गुणसूत्र डीएनए 29 घंटा के exonuclease उपचार (चित्रा 5 ए-बी, जी) के बाद नमूनों से हटा दिया गया था। हालांकि, 100 से अधिक घंटे के लिए व्यापक exonuclease उपचार और का उपयोग कर 100 से अधिक इकाइयों था प्रवर्धित नमूने अभी भी 72 घंटा exonuclease उपचार (चित्रा 5C-डी) के बाद धागे की तरह संरचनाओं की एक पृष्ठभूमि से पता चला है - सभी गुणसूत्र डीएनए रेखीय दूर करने के लिए, के रूप में ø29 की जरूरत है।

आकृति 1
। 1) सेल संवर्धन, 2) शोधन और eccDNA के संवर्धन कॉलम क्रोमैटोग्राफी, 3) eluate अंश में शेष रेखीय गुणसूत्र डीएनए के पाचन, 4) के प्रवर्धन द्वारा: चित्रा 1. सर्किल Seq विधि की रूपरेखा प्रोटोकॉल 5 कदम है ø29 डीएनए पोलीमरेज़, और 5) अत्यधिक समृद्ध eccDNA का अनुक्रमण और मानचित्रण के द्वारा डीएनए एस को पढ़ता cerevisiae संदर्भ जीनोम। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 2. समीपस्थ से 1 एक्स 10 10 कोशिकाओं (मैप किया पढ़ता के लाखों में) अनुक्रम गहराई के एक समारोह के रूप में वृद्धि अनुक्रम गहराई के समारोह के रूप में पढ़ता> 1 केबी। EccDNA। दिखाया गया है: अगुणित CEN.PK एस से जैविक triplicates cerevisiae आबादी (सी 1, सी 2, सी 4) 10 10 कोशिका विभाजन से अलग कर दिया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. जाना जाता परिपत्र डीएनए तत्वों की जांच। (एबी) CEN.PK जैविक में plasmids के लिए (घनत्व पढ़ें) प्रतिशत में पढ़ें कवरेज के भूखंडों तितर बितर प्रतिकृति सी 1, सी 2 और सी 4। (ए) मैप अंतर्जात खमीर plasmids को पढ़ता थे: 2μ; [RDNA चक्र] (गुणसूत्र बारहवीं से ribosomal शाही सेना जीन); और mtDNA (mitochondrial डीएनए)। (बी) अनोखा plasmids को नियंत्रित करने के लिए मैप पढ़ता है। नियंत्रण plasmids स्तंभ शुद्धि से पहले नमूने में नुकीला कर रहे थे। सेल प्रति प्लाज्मिड अनुपातों थे: pBR322 (प्लस संकेत) 1: 1, pUC19 (हलकों) 1:50, और pUG72 (त्रिकोण) 1: 2,500।

चित्रा 4
चित्रा 4. CEN.PK और S288c में आम eccDNA तत्वों। (ए) वेन आरेख 476 के बीच ओवरलैप प्रदर्शित तीन CEN.PK नमूने (सी 1, सी 2, सी 4) में 294 eccDNA तत्वों पर जीनों। 16 आम ओवरलैपिंग eccDNA जीन / plasmids एनोटेट कर रहे हैं (सभी जीन नामों डेटासेट 1 में हैं)। (बी) के तीन CEN.PK नमूने (सी 1, सी 2, सी 4) से ख्यात eccDNAs पर सभी रिकॉर्ड जीन की वेन आरेख, 10 S288c नमूनों से ख्यात eccDNAs पर सभी रिकॉर्ड जीन की तुलना में: एस 1-एस 2, R1-R4, Z1-Z4 (संदर्भ 20 देखें)। दिखाया जीन / प्लास्मिड और ख्यात eccDNA क्षेत्रों है कि 2 तनाव पृष्ठभूमि में या तो 3 या उससे अधिक प्रयोगात्मक setups की एक न्यूनतम के साथ 13 छा जैविक प्रतिकृति (एस 1-एस 2, R1-R4, Z1-Z4, सी 1-सी 3) कर रहे हैं। सी नमूने, CEN.PK; आर और जेड के नमूने, S288c BY4741; एस के नमूने, S288c M3750। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा exonuclease के बाद डीएनए के नमूने की 5. दृश्य और ओ 2 9 उपचार। डीएनए के (वायुसेना) propidium आयोडाइड धुंधला। स्केल बार, 10 माइक्रोन। (ए, सी और ई) जीनोमिक डीएनए के साथ नमूने (जीडी); (बी और डी) जीडी प्लस प्लाज्मिड (जी डी पी) के साथ नमूने हैं। ( ओंग> एबी), 29 घंटा के exonuclease उपचार के बाद (EXO 29 h); (सीडी) 72 घंटा exonuclease ø29 पोलीमर्स प्रवर्धन के बाद इलाज के बाद (EXO 72 एच + ø29)। (ई) ई के बाद जीनोमिक डीएनए नियंत्रण: ø29 पोलीमर्स प्रवर्धन; (एफ) प्लाज्मिड नियंत्रण (5.5 केबी) के बाद 29 पोलीमर्स प्रवर्धन; (जी ओ) agarose जेल-eletrophoresis। बाएं से: एल, 1 केबी मार्कर; पी, प्लाज्मिड नियंत्रण (5.5 केबी) EXO 29 घंटे के बाद; जीडी, EXO 29 घंटे के बाद (ए में के रूप में नमूना); जीडी + P, EXO 29 घंटे के बाद (बी के रूप में नमूना); जीडी और जी.डी. + P, EXO के बाद 29 घंटा के + ø29; जीडी और जी.डी. + P, EXO के बाद 72 घंटा + ø29 (सीडी में के रूप में नमूना)। टेबल S1 देखें अतिरिक्त जानकारी के लिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Aset 1 "src =" / files / ftp_upload / 54239 / 54239dataset1.jpg "/>
डेटासेट 1. CEN.PK. में संभावित डीएनए circularization क्षेत्रों में इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
दिखाया गया हैं अनुक्रम डेटा और 348 क्षेत्रों के लिए विश्लेषण करती है। कॉलम विज्ञापन, eccDNA मानचित्रण कर रहे हैं। , नमूना एक (बाएं से पहले कॉलम) जिसमें से ख्यात eccDNA पहचान की थी; बी, गुणसूत्र; सीडी, शुरू और अंत ख्यात eccDNAs का समन्वय करता है। एह, eccDNA सामग्री। ई, स्वायत्त क्षेत्र में (एआरएस) के अनुक्रम नकल; एफ, इस क्षेत्र में पूरा जीन; जी, इस क्षेत्र में शामिल जीन का हिस्सा; एच, BLASTN-पहचान जीन। कब, EccDNA कवरेज और पी मूल्यों। मैं, बी.पी. में एक विशिष्ट एनोटेट दृश्य के साथ लंबे समय तक क्षेत्र; जम्मू, सभी की संख्या मैप किया पढ़ता है; कश्मीर, सभी मैप किया की कवरेज के लिए एक लाख मैप किया पढ़ता (FPKM) से केबी प्रति टुकड़े से पढ़ता है; एल, मोंटे कार्लो सिमुलेशन से संयोग से घटना की तुलना में ख्यात eccDNA के लिए पी मूल्य; एम, संयुक्त राष्ट्र की संख्याiquely पढ़ता मैप किया; नहीं; कश्मीर और एल केवल विशिष्ट रूप से मैप किया गया का उपयोग कर के रूप में पढ़ता (UFPKM)। के मानचित्रण के लिए पैरामीटर पढ़ता है और वर्णित के रूप में 20 मोंटे कार्लो सिमुलेशन थे।

Discussion

सर्किल-Seq विधि अनुक्रम स्तर के संकल्प के साथ खमीर कोशिकाओं से eccDNA के जीनोम पैमाने का पता लगाने के लिए अनुमति देता है। विधि एक हल्के eccDNA शुद्धि कि गहन भंवर या pipetting की आवश्यकता नहीं है और eccDNA टूटना है कि बाद के चरण में exonuclease पाचन के लिए नेतृत्व करेंगे सीमित करने गंभीरता से स्तंभ जुदाई का उपयोग करता है। विधि के इन सुविधाओं बड़े eccDNAs कि जीन दृश्यों को शामिल पता लगाने के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है। सर्किल-Seq पूर्ण जीन (डेटासेट 1) सहित कई eccDNAs का पता चला। यह भी 86 केबी खमीर mitochondrial डीएनए का पता चला। इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल बड़े परिपत्र डीएनए तत्वों की शुद्धि की सुविधा। एक न्यूनतम करने के लिए डीएनए निष्कर्षण कदम की संख्या को ध्यान में रखते eccDNA नुकसान के जोखिम को कम कर देता है और उपज अधिकतम हो। नियंत्रण के लिए परिणामों के आधार पर नुकीला में plasmids, सर्किल-Seq अत्यधिक संवेदनशील है, 2500 कोशिकाओं से एक परिपत्र डीएनए का पता लगाने। इसके अलावा, इस तरह के 2μ के रूप में प्रचुर मात्रा में अंतर्जात plasmids हटाने; प्लाज्मिड या mitochondrial डीएनए में काफी संवेदनशीलता को बढ़ाने सकता है। खमीर संस्कृतियों से 2μ का इलाज 30 में वर्णित किया गया है। वैकल्पिक रूप से, 2μ और mitochondrial डीएनए हटाने ऐसे स्वाई के रूप में एक दुर्लभ काटने endonuclease, साथ प्राप्त किया जा सकता है। हालांकि, प्रतिबंध एंजाइम कदम हित के अन्य eccDNAs को निशाना बनाने और कुल eccDNA उपज सीमा सकता है।

eccDNA का पता लगाने के लिए महत्वपूर्ण कदम के लिए एक उचित गहराई तक रैखिक डीएनए (चरण 3) और डीएनए अनुक्रमण (चरण 5) को हटाने के थे। एक सेल की आबादी से eccDNAs के बहुमत को रिकॉर्ड करने के लिए, गहरी अनुक्रमण 20 आवश्यक हो सकता है। बनती अंत अनुक्रमण, eccDNA का पता लगाने की भी अधिक से अधिक आत्मविश्वास प्रदान करना चाहिए के रूप में परिपत्र डीएनए जंक्शनों बनती अंत उपज की उम्मीद कर रहे हैं कि बेसुरेपन नक्शा पढ़ता है। इन विसंगतियों परिपत्र डीएनए संरचना की खोज का समर्थन और संभवतः एक अतिरिक्त eccDNA का पता लगाने फिल्टर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

सर्किल-seक्यू विधि तीन स्वतंत्र एस का उपयोग कर मान्य किया गया था cerevisiae CEN.PK आबादी। पता चला दृश्यों पहले eccDNAs, अंतर्जात plasmids सूचना दी और नुकीला में प्लास्मिड और ख्यात eccDNAs (डेटासेट 1) के सैकड़ों शामिल थे। इन निष्कर्षों एस से पिछले सर्किल Seq डेटासेट का समर्थन cerevisiae S288c 20। आम कई eccDNAs CEN.PK और S288c आबादी के लिए की खोज इंगित करता है कि इन लोकी एक प्रवृत्ति के रूप में परिपत्र तत्वों (चित्रा 4) के लिए मौजूद है। हम पहले से पता चला है कि [GAP1 चक्र], CEN.PK पृष्ठभूमि 8 में नाइट्रोजन सीमित शर्तों के तहत समृद्ध है, हालांकि [GAP1 चक्र] अन्य तनाव की पृष्ठभूमि में की सबूत नहीं पाया गया है। CUP1-1 RSC30, ASP3-1, COS111, और HXT6 HXT7 लोकी दोनों S288c और CEN.PK में से eccDNA के निष्कर्ष बताते हैं कि डीएनए circularization के लिए एक गड़बड़ी चोर हैखमीर उपभेदों के बीच में कार्य किया। यह अपने अस्तित्व मात्र की उच्च दर का एक प्रभाव है अगर [HXT6 / 7 चक्र], [ASP3-1 चक्र], [COS111 चक्र] और [CUP1-1 RSC30 चक्र] कोशिकाओं को या यदि चयनात्मक लाभ प्रदान दिखाए जाना बना रहता है डीएनए circularization।

साथ में ले ली, परिणामों से संकेत मिलता है कि सर्किल Seq अच्छी तरह kilobase आकार eccDNAs का पता लगाने के लिए अनुकूल है और पूरा जीन के साथ eccDNAs की पहचान के लिए फायदे हैं। सर्किल-Seq एक बेहद संवेदनशील तरीका है कि खमीर से eccDNAs के पूरे जीनोम पैमाने पर स्क्रीन के लिए सक्षम बनाता है। सर्किल-Seq विधि जीन विलोपन और amplifications पैदा करने में eccDNA की भूमिका elucidating के उद्देश्य से अनुसंधान का एक नया क्षेत्र खोल सकता है। यह देखते हुए कि डीएनए वास्तुकला और संरचना काफी हद तक उच्च eukaryotes को यूकेरियोटिक खमीर से संरक्षित कर रहे हैं, सर्किल-Seq विधि चाहिए, सिद्धांत रूप में, applicabl होसभी कोशिकाओं को ई, मामूली संशोधनों के साथ। वर्तमान में, विधि, किसी भी सीमाएं हैं, हालांकि megabase आकार eccDNAs को शुद्ध करने की क्षमता अभी तक दिखाया जा चुका है प्रकट नहीं होता है। इसके अलावा, ø29 डीएनए पोलीमरेज़, जो एक रोलिंग सर्कल प्रवर्धन विधि का उपयोग करता है 31 के उपयोग, छोटे eccDNA मात्रा का ठहराव और अधिक कठिन बना eccDNAs की दिशा में एक पूर्वाग्रह पैदा करता है। सर्किल-Seq काफी बड़े पूर्ण जीन ले जाने के लिए eccDNAs का पता लगाता है, यह मानव दैहिक कोशिकाओं से डबल मिनट परिपत्र डीएनए पर अध्ययन के लिए उपयुक्त बना रही है। जब आद्य-ओंकोजीन इन तत्वों को 32-37 पर परिलक्षित कर रहे हैं डबल मिनट कैंसर के लिए योगदान कर सकते हैं। germline कोशिकाओं में eccDNAs का अध्ययन germline उत्परिवर्तन दर को मापने और शुक्राणु की गुणवत्ता का आकलन, पशुधन में उदाहरण के लिए करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस प्रकार, सर्किल Seq दर है जिस पर आनुवंशिक परिवर्तन प्रतिलिपि संख्या भिन्नता के रूप में उठता में अंतर्दृष्टि उपज के लिए, और रोगों के एक उपन्यास समझ है कि जीन copy- को शामिल करने के लिए नेतृत्व क्षमता हैनंबर भिन्नता 38-40।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacto peptone BD Difco 211677 Alternative product can be used.
Brilliant III SYBR Green PCR Master Mix  Agilent Technologies 600882 For qPCR analysis. Alternative product can be used.
Dextrose (D-glucose) Carl Roth HN06.4 Alternative product can be used.
Disruptor Beads, 0.5 mm Scientific Industries, Inc. SI-BG05 Glass beads to disrupt plasma cell membranes. Alternative product can be used.
Ethidium bromide Carl Roth 2218.2 Agarose gel stain for detecting DNA/RNA.
GeneJet plasmid miniprep kit Thermo Fisher K0502 Plasmid purifcation from bacteria. Alternative product can be used.
NotI, FastDigest Life Technologies -  Thermo Fisher Scientific, USA FD0594 Endonuclease. Alternative product can be used. 
Plasmid Mini AX kit  A&A Biotechnology, Poland 010-50 Plasmid purifcation kit used to purify eccDNA.  
Plasmid-Safe ATP-dependent DNase kit Epicentre, USA E3105K ATP-dependent exonuclease kit. Alternative product can be used.
Propidium iodide  Sigma-Aldrich, USA 81845 Alternative product can be used.
pUG6 plasmid EUROSCARF, Germany P30114 Marker gene: loxP-PAgTEF1-kanMX-TAgTEF1-loxP.
QIAGEN genomic-tip 100/G  Qiagen, USA 13343 Genomic DNA purifcation from yeast. Alternative product can be used.
REPLI-g Mini Kit protocol  Qiagen, USA 150023 Amplification of eccDNA by the phi29 polymerase.
Yeast extract BD Difco 210929 Alternative product can be used.
Zymolyase 100T (Lyticase, Yeast Lytic Enzyme) Nordic BioSite, Sweden Z1004-3 Alternative product can be used.
Data access to sequence files European Nucleotide Archive  EccDNA dataset from Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D. Study accession number PRJEB9684. 2nd accession number is ERP010820. Locus tag prefix is BN2032. 
Name Company Catalog Number Comments
Strains
Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D Genotype MATa MAL2-8c SUC2
Saccharomyces cerevisiae yeast deletion library pool EUROSCARF, Germany S288c BY4741 pool of 4400 viable single-gene deletion mutants disrubted by KanMX module. Genotypes MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 genexxx::KanMX.
Name Company Catalog Number Comments
Equipments
DNA Spectrophotometer  NanoDrop 1000 Spectrophotometer, Thermo Fisher Measuring DNA concentration. Alternative product can be used.
Fluorescence microscopy Nikon Optronics Magnafire. Red excitation fluorescence filter, 663-738 nm. Alternative product can be used.
Robotic library-build system Apollo 324, IntegenX Inc. DNA library preparation. Alternative product can be used.
Sequencing platform Illumina HiSeq 2000 platform, Illumina Inc. DNA sequencing. Alternative product can be used.
Ultrasonicator Covaris LE220, microTUBE AFA Fiber tubes Alternative product can be used.
Name Company Catalog Number Comments
Methods
2% YPD media  Mix 10 g Dextrose, 10 g Yeast extract, 20 g Bacto peptone and add H2O to a total volume of 1000 ml and autoclave.
Circle-Seq test on genomic DNA Genomic DNA was purified (Qiagen) from a pool of the yeast deletion library (Euroscarf). The DNA concentration was measured by nanodrop and 30 µg genomic DNA was pipetted into two micro centrifuge tubes. One micro centrifuge tube was supplemented with 100 nanogram plasmid (pUG6). The DNA samples were purified by Circle-Seq, omitting the protocol steps 1.1-1.3 and 1.5-1.7. The eluted DNA concentrations were measured by nanodrop and the entire DNA yield from sample GD and GD+P was treated with exonuclease for a period of 29 hours. A 10% fraction was collected for phi29-amplification and PCR analysis, while the remaining DNA was subjected to 72 hour exonuclease treatment. The samples were analyzed for linear DNA content by PCR, using the ACT1 gene as chromosomal marker. A 5% fraction of each of the exonuclease treated samples was amplified by the phi29 DNA polymerase for 16 hours (Qiagen). The presence of DNA in each sample was examined by loading an equal amount (7 µl) in wells on an 0.5 µg/ml ethidium-bromide 0.9% agarose gel after running gel-electrophoresis. 
Mapping software Bowtie2 aligner, John Hopkins University Ultrafast short read alignment. Reference: 29.
Propidium iodide stain Images of propidium iodine stained DNA were captured by fluorescence microscopy at 100x magnification (100x/1.30 oil, Nikon) in the RFP channel (red excitation fluorescence filter, 663-738 nm) using identical exposition time (5 seconds). 
Workflow bioinformatic system Galaxy, Open source. A free web-based platform for data intensive biomedical research. References: 27-28.

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कोशिकाओं से Extrachromosomal परिपत्र डीएनए के जीनोम चौड़ा शोधन
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Møller, H. D., Bojsen, R. K., Tachibana, C., Parsons, L., Botstein, D., Regenberg, B. Genome-wide Purification of Extrachromosomal Circular DNA from Eukaryotic Cells. J. Vis. Exp. (110), e54239, doi:10.3791/54239 (2016).

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