Summary
微RNA起重要的调节作用，并正在成为关于各种人类疾病新的治疗目标。它已经显示，微RNA在高密度脂蛋白携带。我们已经开发出一种简化方法迅速隔离适用于从人血浆中的miRNA分析纯化HDL。
Protocol
1.采集血样
- 收集空腹外周静脉血样品到含有通过在肘窝的一个突出静脉标准静脉穿刺抗凝乙二胺四乙酸（EDTA）（其比其它抗凝剂有几个优点）在10毫升的塑料管中。
- 离心血液样品在1600×g离心20分钟，在4℃下在台式离心机，以获得自由的红血细胞和少量的RNA的等离子体。
- 依次离心上清在吊桶式转子3000克（4℃）10分钟，以除去白细胞和血小板，然后附加15分钟以分别除去残留的细胞碎片。
- 用在RT密度计根据生产指令测量等离子体的密度。
注：密度调节（D =1.023克/ ml）的0.9％生理盐水溶液可以去除外来的，但之前的密度梯度超速离心后是必需的。 2.从血浆中去除的外来体 - 删除循环外来体具有类似高密度脂蛋白的密度，代表的miRNA 3的定量显著来源。
- 通过加入252微升外切体沉淀溶液至1毫升血浆温育30分钟，在4℃下执行此操作。以沉淀出外来体，离心混合物30分钟，在4℃1500克。
- 以分离的HDL，将所得上清转移1ml至聚碳酸酯厚壁超速离心管，以便进一步处理用密度梯度超速离心（见下文）。
- 到单独的HDL使用采用具有一个固定角转子以448811×G下8℃，分别操作和地板超速离心机3步骤的过程。
- 准备了三种不同密度解决方案顺序和新鲜的每个隔离。
- 制备溶液A（VLDL的隔离峰，d = 1.006克/毫升）将11.4克NaCl（氯化钠：0.195摩尔）1000毫升高压灭菌蒸馏水，0.1g的EDTA2Na和1ml 1N NaOH中。然后添加一个额外的3毫升蒸压蒸水。
- 准备溶液B（LDL隔离，D =1.182克/毫升）加入25.2克溴化钠至100毫升溶液A（氯化钠0.195摩尔，溴化钠2.44摩尔）。
- 通过混合78.8克溴化钠用100毫升的溶液A（氯化钠0.195摩尔，溴化钠7.7摩尔）准备论文C（高密度脂蛋白的隔离，D =1.470克/毫升）。确认在室温下用密度适当的密度。保留所有的解决方案在4°C，直到进一步使用。
- 混合1毫升血浆（平均密度= 1.023克/毫升）和无核酸酶的200微升发红色7B的在6.5毫升聚碳酸酯厚壁超速离心管。
- 然后小心层上的混合物前5 ml溶液A的。如果需要，在求解的T顶部增加额外的脂肪红7B直径：平衡每个管的重量。离心2小时（加速度 - 5），（减速 - 7）。
注：在离心分离中，脂蛋白被累积作为它们的平衡密度区域的频带。 - 在运行的端部观察2层。除去1.5毫升代表在4℃的顶层和商店的VLDL级分。
- 最后，用移液管转移从管的含有低密度脂蛋白的底面4毫升，高密度脂蛋白，白蛋白和脂肪酸馏分为LDL隔离一个新的聚碳酸酯管。
- 混合溶液2ml B和100微升不含核酸酶的脂肪红7B的成含有LDL和HDL级分（第4部分）的管，分别。
- 然后离心进行3小时（加速9，减速7）。此后，除去1.5毫升代表顶层LDL部分的，并保持在4℃或储存在-80℃。最后，从管的含有高密度脂蛋白的底部转移4毫升部分，以一个新的聚碳酸酯管。
- 混合溶液2ml的C，100微升不含核酸酶的脂肪红7B和15微升98％β巯基乙醇的到含有HDL馏分分别在管。
- 离心3小时（加速9，减速7）。然后除去2-毫升HDL馏分表示顶层，要么保持在4℃或储存在-80℃。
- 以避免与随后的琼脂糖凝胶电泳和PCR的干扰，删除使用由制造商的说明用适当的分子量截留（3K管VLDL和10K管的LDL / HDL）的离心过滤装置密度梯度超速离心期间加入过量的盐。
- 简言之，加入2.5毫升冷的PBS（137 mM氯化钠，2.7毫KCL，8毫磷酸氢二钠，2毫KH 2 PO 4; pH 7.4）中后centrifu戈整个VLDL级分收集，在密度梯度超离心在4℃下使用吊桶式转子60分钟。
- 用10ml冰冷的PBS脱盐LDL部分两次，每次30分钟。接着，使用13毫升冰冷的PBS两次脱盐HDL级分。较高的PBS体积是必要改善与琼脂糖凝胶电泳迁移率。离心后，取出含有溶质脂蛋白，并保持在4℃或储存在-80℃。
- 亲热采用与制造商的说明稍作修改如下所述试剂盒脂蛋白琼脂糖凝胶电泳。
注：该步骤是只评估浓缩脂蛋白样品的质量和纯度。- 简言之，获得6微升脱盐脂蛋白馏分与密度梯度超速离心，并加载到预浇铸脂蛋白凝胶。使用人类lipoprotein标准VLDL，低密度脂蛋白和高密度脂蛋白的尺寸参考。进行电泳在RT在100V供使用Rep准备缓冲器60分钟。
- 干燥凝胶10分钟，然后染色在室温10分钟以脂肪红7B。脱色的甲醇 - 水75:25（体积/体积）和干燥的5分钟的混合物再次凝胶。
- 使用血清/血浆的miRNA分离和纯化试剂盒由纯化的人HDL亲热的miRNA的隔离。
- 简言之，加入1ml RNA裂解试剂200微升纯化的高密度脂蛋白，用涡旋混合，然后在室温下孵育5分钟以确保核蛋白复合物和RNA酶失活的完全分离。
- 然后穗3.5微升合成线虫的microRNA（CEL-的miR-39; 1.6×10 8个拷贝/微升）到混合物中。然后根据制造商的说明书进行RNA提取。
- 执行purificati上提取的体miRNA与洗脱旋转柱按照生产商的说明。测量的miRNA从与spectrophorometer纯化的高密度脂蛋白的浓度。
注意：从自旋列的miRNA的洗脱使用16微升的无RNase水。 - 隔离100ng的所述miRNA从HDL的掺有合成的miRNA（CEL-的miR-39），并在使用逆转录试剂盒，并根据制造商的说明20微升反应体积逆转录。
- 没有模板的miRNA（NTC）和无逆转录酶混合物（NRT）进行适当的控制。
- 2稀释的cDNA，10微升PCR混合物，2微升的通用引物，2微升的miRNA的引物和4微升不含RNA酶的水：在20微升用2微升1的总体积亲热实时PCR。
- 运行reacti对在95℃下15分钟，96孔板，随后为15秒和55℃30秒和在70℃的延伸相对于30 45个循环的94℃s.ec亲热一式三份所有反应。
- 接着，的miRNA Calcuate相对量通过使用2-ΔΔ的Ct方法正常化到合成持家基因按制造商的说明之后。
3.密度梯度超速离心（图1）。
4.隔离的VLDL
5.隔离的LDL
6.隔离的HDL
7.脱盐和脂蛋白成分浓度
8.琼脂糖凝胶电泳
9. RNA提取与纯化
10.反转录（RT-PCR）
11.实时PCR（定量RT-PCR）
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
高密度脂蛋白的分离外来体切除后
从高度纯化的HDL获得miRNA的有必要删除代表的miRNA污染7的来源的外来体。这是之前的密度梯度超速离心用市售的试剂盒进行。为了实用目的由商业公司开发的三步标准密度梯度超速离心协议被修改（ 图1）。此协议需要与140000 rpm的速度的固定角转子，其比用离心力常用协议基本上快高达54,000转3，8，9，和10离心。雇用一个广泛使用的T-1270的转子具有70000转的最大力量，离心最初是与未能抵抗离心力聚异试管中进行。为了避免管的崩溃，已成功应用于聚碳酸酯管。离心时间为脂蛋白的氧化和可能的miRNA降解11是至关重要的。因此，几个不同的离心时间，从一共有8至96小时的测试。分别基于离心时间和力量，在该离心分离进行另外温度调节。
高密度脂蛋白成分的纯度
分离的高密度脂蛋白馏分的纯度用琼脂糖凝胶电泳进行了检查。 图2.示出了用于由梯度超速离心分离出的高密度脂蛋白减法典型电泳结果。这清楚地表明，HDL是缺乏VLDL的任何污染，并呈现出典型的α-流动性。缺乏在VLDL和LDL馏分任何α-迁移脂蛋白的演示ultracent期间HDL完全恢复rifugation一步。将HDL组分，然而，也表现出β-流动性，一种已知的电泳带型的一些痕量由于与脂蛋白污染（脂蛋白（a））12。
从隔离HDL脂蛋白（a）消除
留学HDL携带的miRNA需要纯度最高的HDL的隔离。 Lp的干扰（a）用高密度脂蛋白可能有助于高密度脂蛋白的交叉污染，在低密度脂蛋白携带的miRNA。为了最大限度地减少的HDL的这种污染，β巯基乙醇10 15微升在最后离心步骤（ 图1）加到溶液C。 β巯基乙醇的加成已显示未改变的HDL密度属性10。如显示于图3，除了β巯基乙醇的导致在不存在具有非常有效地除去脂蛋白（a）的一致的任何B-迁移脂蛋白。
的miRNA纯化HDL
miRNA的分离最初尝试其通常用于从血液中的RNA的提取采用裂解试剂。虽然这种方法产生了非常好的RNA产量（91.45纳克/微升），但经过分光光度分析表明不尽人意RNA的纯度。通过除去苯酚的分离的RNA的额外纯化改善了纯度，但得到的RNA量现在显著低。接着，另一试剂盒测试其显示可接受的RNA的纯度（1.7 260/280纳米比），但的RNA产率26倍下与裂解试剂（3.45 与 91.45毫微克/微升）比较。为可接受的RNA的纯度以良好的产率的最佳结果与miRNeasy血清/血浆试剂盒获得（48.2毫微克/微升; 1.6 260/280纳米比），因此，该提取步骤，随后从所述分离的用于检测的miRNA HDL脂蛋白分数。
3的货物识别，并且显示出抑制高密度脂蛋白胆固醇摄取5。在图4A中 。显示扩增曲线的的miR-223 PCR反应和优化后的比较基准阈值和循环阈值的典型日志情节飙升，在CEL-MIR-39。该合成基因被用作内部对照，因为没有在等离子体对miRNA的已知归一化控制的报告。此外，几个潜在的确立的内源性管家基因像RNU6-2，RNU-48，HY3无法检测和SNORD95可以以纯化的HDL被检测到，但是，在的miR-223和SNORD95的Ct值的差小于五（数据未示出）。 如图5所示熔解曲线分析清楚地显示了一个不同的单一峰与在前述的PCR选择性的miRNA的扩增是一致的。如在图4B中。示出，这两个的miR-223和参考CEL-的mir-39可以一致地被在所有六个亲频带进行检测。观察了CEL-MIR-39的所有个体间差异相对较小用miR-223相比。这些发现支持高密度脂蛋白的分离高纯度允许其miRNA的货物的检测。
在纯化HDL的miR-223的检测
实时采用荧光定量PCR方法来量化双发夹结构的miRNA前体为单链的miRNA。此方法需要一个正向/反向基因特异性引物和热稳定的反转录酶与miRNA的发夹结构转换成cDNA。该cDNA随后被扩增，并使用实时定量PCR用SYBR绿检测的帮助下进行定量。从血清，血浆和纯化的HDL等离子体微RNA可以精确PROFIL采用ED miRNA的RT-PCR系统。
我们平均的miR-223基因表达的实验性产品纯化的HDL显示，30.9 Ct值及其相应的阴性对照上述截止35（NTC = 38.1 Ct值，NRT和NAC没有放大）。在这个实验中，我们将纯化的HDL样品中看到了引物-二聚体的形成具有低熔融温度（73℃中的miR-223和75.5℃的CEL-的miR-39）和比特定miRNA的测定更高（C T）值（ 表1）。 表1中的引物-二聚体可能发生，因为在溶液中的引物浓度高的。当引物分子30 PCR循环13日后彼此连接出现这种情况居多。这使他们能够退火到其它的引物分子，并在效果，成为线性迷你模板和它会导致更高的背景，并可能导致一个代（C T）值<40的NTC的（没有template控制）样品。
图1.高密度脂蛋白的分离过程的示意图 。高密度脂蛋白是在一系列的三个离心步骤来制备密度梯度超速离心。脂蛋白带和中间馏分中的密度梯度分布所示。 请点击此处查看该图的放大版本。
脂蛋白隔离没有β巯基乙醇的 图2. 琼脂糖凝胶电泳。VLDL，通过密度梯度超速离心分离LDL和HDL的级分不添加β巯基乙醇至溶液C demonst评价脂蛋白（a）中的高密度脂蛋白馏分的存在。泳道1,2，9和10分别表示大小标记;车道3/4，5/6和7/8分别代表VLDL，低密度脂蛋白和高密度脂蛋白。 请点击此处查看该图的放大版本。
HDL以β巯基乙醇隔离。最后离心步骤之前添加β巯基乙醇至溶液C 的 图3. 琼脂糖凝胶电泳导致从HDL级分中除去脂蛋白（a）的。泳道1,2，9和10分别表示大小标记;泳道3-8代表高密度脂蛋白。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4.两种不同的miRNA扩增曲线和CEL-的miR-39和miR-223的表达。 （A）实时定量PCR采用隔离的HDL描述进行。 PCR反应45个循环，该曲线相交的阈值是（C T） -数值点运行。数据显示的表达CEL-的miR-39（左面板）和miR-223（右面板），分别。水平线表示检测阈值。一个35人的循环数被设置为截止为阳性扩增。（B）从6个样品获得的分离的HDL代表实时PCR数据被示出。生平均Ct值示为CEL-的miR-39和miR-223，其表达水平变化中纯化的高密度脂蛋白的血浆级分6个样品，每个之间从不同的供体不足2 Ct值。使用PCR系统和人血清和等离子MIRN进行表达谱一个定量RT-PCR。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5.熔解曲线为CEL-的miR-39和miR-223。如图所示，一个单一的峰的存在，切尔的miR-39分别（右图）和miR-223（左面板），表示的特异性扩增。 请点击此处查看该图的放大版本。
合成CEL-的miR-39的阴性和阳性对照和miR-223，其特征在血清，血浆，cDNA和纯化的高密度脂蛋白馏分的表1中 。行（C T）值。 NTC（无template控制），NRT（无逆转录酶），NAC（无放大控制，只定量RT-PCR的水和试剂）。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
从血液新型生物标志物的鉴定将在各种疾病的临床诊断和预后提供帮助。微RNA已经已知具有生物标志物的所有品质，并在各种研究14-17都被显示。在这项研究中，我们已经证明快速，简便容易的方法从血浆HDL隔离的miRNA。 VLDL，LDL和HDL的隔离的常规密度梯度超离心方法取决于等离子体的精确采样，缓冲溶液的精确配制，密度和底部脂蛋白馏分8的定量转移的测量。有已经描述分离的HDL 8 -11的许多方法。这些方法往往不是很费力，或需要大量血浆和透析广泛用于脱盐分离的脂蛋白，不彻底清除外来体和脂蛋白作为的miRNA 3的来源。为了解决我们建立这个SI这些缺点mple和血浆HDL的miRNA隔离的快捷方法。
的主要目标和本研究的主要目的是，以分离和无红细胞通过超速离心分离的HDL-miRNA的络合物，血沉棕黄层，外来体，分泌囊泡，VLDL，LDL和脂蛋白（一）的干扰，然后分离从纯化的HDL的miRNA。任何这些组分与HDL的污染和干扰将改变预期的实验结果和miRNA分析数据。从血液的DNA，RNA和微RNA隔离是一个非常困难的任务，由于其复杂性。它一直提出用很多核酸（包括微RNA）提取和纯化相比细胞，组织和器官样品18的技术挑战。也有存在于循环血液细胞中相对较少的miRNA基因。血是外来体，分泌泡和配有免费循环miRNA的高密度脂蛋白一起，这是相对较少18已知载体。因此，大的血浆样品体积的安装需要的HDL-miRNA的复杂的处理和分离。此外，miRNA及其靶序列，短性质使得它更难以实现足够的特异性以标准的PCR寡核苷酸的技术。血液的细胞的组件总是知道分泌的miRNA和mRNA响应于外部环境包括温度，微生物和毒素或应力发生变化。此外核酸酶，RNA酶，蛋白质循环和其他酶血液中存在将影响这些miRNA的隔离。
同时采用实时定量RT-PCR的方法ΔΔCT循环miRNA的放大也缺乏行之有效的知名看家基因β一样，肌动蛋白或GAPDH数据正常化。这再次提出了从miRNA的血液循环血清或血浆19分析的主要障碍之一。常用的短期非编码52]形成和snRNAs在血液和该M很少表达在碟刹利用它们作为内部控制基因的进一步困难。解决52]形成和snRNAs的这些缺点，并避免我们使用血清/血浆合成穗以控制在测定作为内部对照基因作为根据制造商的协议遵循任何技术上的困难。它有助于在正常化为任何非特异性扩增和miRNA纯化和PCR反应18期间发生的变化。即使是在miRNA的退化或不存在任何特定的miRNA放大信号的情况下，在穗中控制在定量RT-PCR反应应扩增，并与合理恒定和均匀的Ct值给一个预期信号。基于三阴性对照和阳性对照沿控制放大秒杀，我们得到了的miR-223基因好最佳的数据验证。这证实了我们已经得到的miR-223的良好的收益率从这种简单的方法循环血浆高密度脂蛋白。
总之，我们已经建立了一个方法○˚F密度梯度超速离心（DGUC），增加β巯基乙醇的从血浆HDL的miRNA纯化。该方法具有几个优点：（a）VLDL，LDL和HDL由地板超速离心机的时间很短的时间内分离比较需要24的其它方法- 96小时8-11; （二）低密度脂蛋白和高密度脂蛋白透析，脱盐/浓缩，取1小时内发生与花24个小时以上8,9等方法进行了比较; （三）脂蛋白的污染是由HDL馏分β巯基乙醇除去，但并不意在LDL部分中使用; （四）所需要的样本量仅为1毫升所有逐步VLDL，低密度脂蛋白和高密度脂蛋白隔离与需要更多的样本量等方法进行比较; （五）隔离11中最小的氧化损伤HDL; （F）的12个样品可以在单一脂蛋白分离分析运行中进行分析; （G）提取HDL的250微升样本量足够分析米核糖核酸浓度/纯度，琼脂糖凝胶电泳，蛋白质浓度，微阵列和RT-qPCR的程序。我们的方法的局限性是，HDL-miRNA的小百分比可以在外来体沉淀步骤失去和所需的血浆样品的体积应超过200微升以分离的HDL-miRNA的。
最后，将等离子体微RNA不仅从损坏或叛徒血细胞中的循环，而且从健康正常的血细胞和从主体，其包括受体正在进行的健康状况的各种健康和患病的组织和器官的其他部分细胞的20.目前这个研究系统地从人血浆中分离的高密度脂蛋白纯化成熟miR-223。这项研究清楚地表明，高纯度的高密度脂蛋白血浆中成熟miR-223水平检测，稳定，重复性好，个人之间的一致的样本，从而大大促进了脂蛋白，李临床使用的未来性测试版本，心血管疾病等代谢综合征。令人惊奇的是，成熟miRNA，特别的miR-223从HDL等离子体可能是耐核酸酶消化等恶劣条件，可能解释在纯化的高密度脂蛋白的miR-223的稳定性。的miR-223的抗RNA酶的机制需要进一步研究。显然，在这些纯化的血浆HDL研究的miRNA表达谱将在研究各种弊端对未来的miRNA标志线索。等离子体中的这些高密度脂蛋白相关微RNA可以用作潜在的临床诊断的生物标志物和在将来个性化医疗。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者什么都没有透露。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic Vacutainer Lavender K2EDTA tubes | Becton, Dickinson and Company | 366643 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific, Sorvall Legend X1R | 75004261 | |
| Densito 30PX densitometer | Mettler Toledo | MT51324450 | |
| ExoQuick solution | Invitrogen | 4484451 | |
| Polycarbonate thick-walled ultracentrifuge tube | Thermo Scientific | O3237 | |
| Sorvall WX100 ultracentrifuge | Thermo Scientific | 46902 | |
| Fat Red 7B | Sigma-Aldrich | 201618 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | ||
| Amicon Ultra-15 Centrifugal filter devices 10K | Millipore | UFC901008 | |
| Amicon Ultra-centrifugal filter devices 3K | Millipore | UFC800308 | |
| QuickGel Lipo kit | Helena Laboratories | 3344,3544T | |
| Human lipoprotein standards for VLDL, LDL and HDL | LipoTrol; Helena Laboratories | 5069 | |
| Rep Prep buffer | Helena Laboratories | 3100 | |
| RNeasy MinElute spin columns | Qiagen | ||
| NanoDrop 1000 analyzer | Thermo Scientific | ||
| miScript II RT Kit | Qiagen | 218161 | |
| CFX96 Touch real-time PCR detection system | BioRad | ||
| miRNeasy Serum/Plasma Kit | QIAGEN | 217184 | |
| miScript Primer Assays | QIAGEN | 141078139 | |
| miScript SYBR Green PCR Kit | QIAGEN | 218073 | |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control | QIAGEN | 219610 | |
| NaOH | SIGMA-ALDRICH | 480878 | |
| 0.20 µM sterile syringe filter | SIGMA-ALDRICH | Z227536 |
References
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Arroyo, J. D., et al. Argonaute2 complexes carry a population of circulating microRNAs independent of vesicles in human plasma. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (12), 5003-5008 (2011).
- Vickers, K. C., et al. MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins. Nat Cell Biol. 13 (4), 423-433 (2011).
- Wagner, J., et al. Characterization of levels and cellular transfer of circulating lipoprotein-bound microRNAs. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33, 1392-1400 (2013).
- Wang, L., et al. MicroRNAs 185, 96, and 223 repress selective high-density lipoprotein cholesterol uptake through posttranscriptional inhibition. Mol Cell Biol. 33 (10), 1956-1964 (2013).
- Rayner, K. J., Moore, K. J. MicroRNA control of high-density lipoprotein metabolism and function. Circ Res. 114 (1), 183-192 (2014).
- Raposo, G. Exosomes: endosomal-derived vesicles shipping extracellular messages. Curr Opin Cell Biol. 16 (4), 415-421 (2004).
- Redgrave, T. G., Roberts, D. C., West, C. E. Separation of plasma lipoproteins by density-gradient ultracentrifugation. Anal Biochem. 65, 42-49 (1975).
- Foreman, J. R., et al. Fractionation of human serum lipoproteins by single-spin gradient ultracentrifugation: quantification of apolipoproteins B and A-1 and lipid components. J Lipid Res. 18, 759-767 (1977).
- Dong, J., et al. Serum LDL- and HDL-cholesterol determined by ultracentrifugation and HPLC. J Lipid Res. 52, 383-388 (2011).
- Tong, H., Knapp, H. R., VanRollings, A. low temperature flotation method to rapidly isolate lipoproteins from plasma. J Lipid Res. 39, 1696-1704 (1998).
- Fless, G. M., ZumMallen, M. E., Scanu, A. M. Physicochemical properties of apolipoprotein (a) and lipoprotein (a-) derived from the dissociation of human plasma lipoprotein (a). J Biol Chem. 261, 8712-8718 (1986).
- Brownie, J., et al. The elimination of primer-dimer accumulation in PCR. Nucleic Acids Res. 25, 3235-3241 (1997).
- Alton, E., Inyoul, L., Leroy, H., David, G., Kai, W. Extracellular microRNA: a new source of biomarkers. Mutat Res. 717 (1-2), 85-90 (2011).
- Stefanie, S. J. Cancer biomarker profiling with microRNAs. Nature Biotechnology. 26, 400-401 (2008).
- Prasun, J. M. MicroRNAs as promising biomarkers in cancer diagnostics. Biomarker Research. 2 (19), (2014).
- Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. Circulating microRNAs: novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease? Circ Res. 110, 483-495 (2012).
- Jonathan, S., Martin, S., Eric, L. miRNA profiling from blood -challenges and recommendations. , www.qiagen.com (2015).
- Francesco, M., Paola, D. C., Anna, T., Jesper, T., Sergio, A., Riccardo, L. R. Normalization of circulating microRNA expression data obtained by quantitative real-time RT-PCR. Brief Bioinform. 3, 1-9 (2015).
- Chen, Y., et al. Circulating microRNAs, novel biomarkers of acute myocardial infarction: a systemic review. World J Emerg Med. 3, 257-260 (2012).
