Summary
מייקרו RNA לשחק תפקיד רגולטורים חשוב והם מתעוררים כמו מטרות טיפוליות חדשניות למחלות אנושיות שונות. הוכח כי miRNAs נישאים ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה. פיתחנו שיטה פשוטה לבודד HDL מטוהרים במהירות מתאים לניתוח מירנה מפלסמה אנושית.
Protocol
1. איסוף של דגימות דם
- אסוף בצום דגימות דם ורידי היקפי ל -10 צינורות מ"ל פלסטיק המכילים חומצה Ethylenediaminetetraacetic קרישה (EDTA) (שבה יש מספר יתרונות על פני תרופות נגד קרישת דם אחרים) על ידי venipuncture רמת וריד בולט fossa antecubital.
- צנטריפוגה דגימות דם 1,600 XG במשך 20 דקות ב 4 ° C בצנטריפוגה השולחן להשיג פלזמה חינם של כדוריות דם אדומות וכמויות קטנות של RNA.
- ברצף בצנטריפוגה supernatant ב -3,000 גרם (4 ° C) ב הרוטור דלי מתנדנד במשך 10 דקות כדי להסיר WBC & טסיות ולאחר מכן עוד 15 דקות כדי להסיר פסולת התא הנותרים בהתאמה.
- מדוד את הצפיפות של הפלזמה באמצעות densitometer ב RT לפי הוראות ייצור.
הערה: התאמת צפיפות (ד = 1.023 גרם / מ"ל) עם תמיסת מלח 0.9% עשויה להידרש לאחר הסרת exosomes אבל לפני ultracentrifugation שיפוע צפיפות. הסרת 2. Exosome מ פלזמה - הסר את exosomes במחזור כי יש צפיפות דומה HDL ולייצג מקור משמעותי כמותית של מירנה 3.
- עושים זאת על ידי הוספת פתרון ממטרים 252 μl exosome עד 1 מ"ל פלזמה ואחריו הדגירה במשך 30 דקות ב 4 ° C. כדי גלול את exosomes, צנטריפוגות את התערובת במשך 30 דקות ב 1500 גרם ב 4 מעלות צלזיוס.
- כדי לבודד HDL, להעביר 1 מ"ל של supernatant וכתוצאה לצינור ultracentrifuge פוליקרבונט עבה חומה לעיבוד נוסף עם ultracentrifugation שיפוע צפיפות (ראה להלן).
- כדי להפריד HDL משתמשים בתהליך 3 שלבים העסקת ultracentrifuge הרצפה עם רוטור קבוע זווית הפעלה ב 448,811 x G ו -8 מעלות צלזיוס, בהתאמה.
- כן שלושה ברצף פתרונות צפיפות שונים ורענן לכל בידוד.
- הכן פתרון A (בידוד של VLDL, ד = 1.006 גרם / מ"ל) על ידי המסת 11.4 גרם NaCl (NaCl: 0.195 mol), EDTA2Na 0.1 גרם ו 1 מ"ל 1N NaOH ב 1,000 מ"ל מים autoclaved מזוקקים. ואז להוסיף 3 מ"ל נוספים של מים autoclaved מזוקקים.
- הכן פתרון B (בידוד של LDL, ד = 1.182 גרם / מ"ל) על ידי הוספת NaBr 25.2 גרם ל -100 מ"ל פתרון (NaCl 0.195 mol, NaBr 2.44 mol).
- הכן פתרון C (בידוד של HDL, ד = 1.470 גרם / מ"ל) על ידי ערבוב NaBr 78.8 גרם עם 100 מ"ל של פתרון (mol 0.195 NaCl, NaBr 7.7 mol). אשר את הצפיפות המתאימה ב RT באמצעות densitometer. שמור את כל הפתרונות על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.
- מערבבים 1 מ"ל של פלזמה (הצפיפות הממוצעת = 1.023 גרם / מ"ל) ו nuclease חינם 200 μl של שומן האדום 7B בתוך שפופרת ultracentrifuge 6.5 מ"ל פוליקרבונט עבה חומה.
- אז בזהירות שכבה 5 מ"ל של פתרון העליון של התערובת. במידת הצורך, להוסיף 7B האדום שומן נוסף על גבי t פתרוןo לאזן את המשקל של כל צינור. צנטריפוגה במשך שעה 2 (האצת - 5), (האטה - 7).
הערה: במהלך צנטריפוגה, ליפופרוטאינים נצברים כלהקה לאזורי צפיפות שיווי המשקל שלהם. - בסוף בטווח להתבונן 2 שכבות. סור 1.5 מיליליטר של שבריר VLDL המייצג את השכבה ולאחסן העליון על 4 מעלות צלזיוס.
- לבסוף, באמצעות העברת פיפטה 4 מ"ל מתחתית הצינור המכיל את ה- LDL, HDL, אלבומין שברים חומצות שומן אל צינור פוליקרבונט חדש לבידוד LDL.
- מערבבים 2 מ"ל של B פתרון ו 100 μl nuclease חינם 7B האדום שומן לתוך שפופרת המכילה את החלק היחסי LDL ו- HDL (סעיף 4), בהתאמה.
- ואז צנטריפוגות החוצה עבור 3 שעות (האצה 9, האטה 7). לאחר מכן, להסיר 1.5 מ"ל של שבריר LDL המייצג את השכבה העליונה ולשמור על 4 מעלות צלזיוס או לאחסן ב -80 ° C. לבסוף, להעביר 4 מ"ל מתחתית הצינור המכיל את HDLחלק לצינור פוליקרבונט חדש.
- מערבבים 2 מ"ל של C פתרון, 100 7B חינם μl nuclease שומן האדום 15 μl של 98% β-mercaptoethanol לתוך שפופרת המכילה את החלק היחסי HDL, בהתאמה.
- צנטריפוגה במשך 3 שעות (אצה 9, האטה 7). לאחר מכן להסיר 2 מ"ל של שבריר HDL המייצג את השכבה העליונה גם לשמור על 4 מעלות צלזיוס או לאחסן ב -80 ° C.
- כדי למנוע הפרעה עם ג'ל אלקטרופורזה לאחר agarose ו- PCR, להסיר מלח מופרז הוסיף במהלך ultracentrifugation שיפוע צפיפות באמצעות התקנים מסננים צנטריפוגלי עם הפסקת המשקל המולקולרית המתאימה (שפופרת 3K עבור VLDL צינור 10K עבור LDL / HDL) כפי שתואר על ידי הוראות היצרן.
- בקצרה, לאחר הוספת 2.5 מ"ל קר PBS (137 mM NaCl, 2.7 מ"מ KCL, 8 מ"מ Na2HPO4, 2 מ"מ KH2PO4; pH 7.4) centrifuge השבר VLDL שנגבה-במהלך ultracentrifugation שיפוע צפיפות ב 4 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות באמצעות הרוטור דלי מתנדנד.
- Desalt השבר LDL פעמיים עם 10 מ"ל קרח קר PBS במשך 30 דקות כל אחד. לאחר מכן, השתמש 13 מ"ל קרח קר PBS פעמיים עבור Desalting השבר HDL. היקף PBS הגבוה יש צורך לשפר את ניידות עם ג'ל אלקטרופורזה agarose. לאחר צנטריפוגה, להסיר את המומסים ליפופרוטאין המכילים ולשמור על 4 מעלות צלזיוס או לאחסן ב -80 מעלות צלזיוס.
- Perfrom ג'ל אלקטרופורזה agarose ליפופרוטאין העסקה בערכה עם שינויים קלים של הוראות היצרן כדלקמן.
הערה: שלב זה הוא רק כדי להעריך את האיכות וטוהר של דגימות ליפופרוטאין מרוכזות.- בקצרה, לקבל 6 μl של שבריר ליפופרוטאין desalted עם ultracentrifugation שיפוע צפיפות ולטעון על ג'ל ליפופרוטאין מראש יצוק. השתמש lipop אדםסטנדרטי rotein עבור VLDL, LDL ו- HDL כהפנית גודל. לבצע אלקטרופורזה ב RT ב -100 V עבור 60 דקות באמצעות חיץ הכנת הנציג.
- יבש את הג'ל למשך 10 דקות ולאחר מכן להכתים במשך 10 דקות ב RT עם שומן האדום 7B. Destain הג'ל בתערובת של מים מתנול 75:25 (v / v) ויבש שוב במשך 5 דקות.
- Perfrom הבידוד של מירנה ידי HDL האדם מטוהרים באמצעות ערכת בידוד מירנה בסרום / פלזמה וטיהור.
- בקצרה, להוסיף 1 מ"ל של ריאגנט תמוגה RNA 200 μl של HDL מטוהרים, לערבב עם vortexer ואז וטופחו במשך 5 דקות ב RT על מנת להבטיח ניתוק מוחלט של מתחמי nucleoprotein ו איון של RNases.
- ואז ספייק 3.5 μl של סינתטי Caenorhabditis elegans microRNA (cel-miR-39; 1.6 x 10 8 עותקים / μl) לתוך התערובת. ואז לבצע מיצוי RNA על פי הוראות היצרן.
- בצע purificatiעל של מירנה חילוץ עם עמודות ספין elute לפי הוראות היצרן. למדוד את הריכוז של מירנה מה- HDL מטוהר עם spectrophorometer.
הערה: Elution של מירנה מטורי הספין מועסק 16 μl של RNase ללא מים. - לבודד 100 ננוגרם של מירנה מה- HDL ומשובץ מירנה סינטטי (cel-miR-39) ו הפוך עבד בנפח תגובת 20 μl העסיק בערכת השעתוק לאחור ועל פי הוראות היצרן.
- בצע בקרה נאותה ללא תבנית מירנה (NTC) וללא תמהיל אנזים transcriptase הפוך (NRT).
- Perfrom PCR בזמן אמת בהיקף כולל של 20 μl עם 2 μl של דילול 1: 2 של cDNA, 10 μl PCR לערבב, 2 פריימר אוניברסלי μl, 2 μl של פריימרים מירנה ו -4 μl מים RNase חינם.
- הפעל את Reactiעל ב 96-גם צלחות על 95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ואחריו 45 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות ו 55 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות לבין שלב הארכה על 70 מעלות צלזיוס למשך 30 s.ec Perfrom כל תגובות triplicates .
- לאחר מכן, כמויות יחסית Calcuate של מירנה באמצעות 2 שיטת Ct -ΔΔ לאחר נורמליזציה אל גן משק סינתטי לפי הוראות היצרן.
3. צפיפות Gradient ultracentrifugation (איור 1).
בידוד 4. של VLDL
בידוד 5. של LDL
בידוד 6. של HDL
7. Desalting וריכוז של שברי Lipoprotein
8. ג'ל אלקטרופורזה agarose
הפקת RNA 9. וטיהור
10. הפוך תמלול (RT-PCR)
11. בזמן אמת PCR (qRT-PCR)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בידוד של ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה לאחר הסרת Exosomes
כדי להשיג מירנה מה- HDL הנקי במיוחד יש צורך להסיר exosomes המייצג מקור מירנה זיהום 7. הדבר נעשה לפני ultracentrifugation שיפוע צפיפות עם ערכה זמינה מסחרי. למטרות מעשיות פרוטוקול ultracentrifugation שיפוע צפיפות התקן דן בשלוש צעד שפותחה על ידי חברה מסחרית שונה (איור 1). פרוטוקול זה דורש צנטריפוגה עם רוטור קבוע זווית במהירות של 140,000 סל"ד שהוא מהיר יותר באופן משמעותי מאשר פרוטוקולים נפוצים עם כוחות צנטריפוגה עד 54,000 סל"ד 3, 8, 9, ו -10. העסקת הרוטור T-1270 זמין נרחב עם כוח מקסימאלי של 70,000 סל"ד, צנטריפוגה בתחילה בוצעה עם צינורות polyallomer אשר נכשלו להתנגד לכוחות צנטריפוגה. כדי למנוע קריסה של צינורות,צינורות פוליקרבונט שימשו בהצלחה. זמן צנטריפוגה הוא קריטי עבור חמצון ליפופרוטאין ושפלת מירנה פוטנציאלית 11. לכן מספר פעמים צנטריפוגה שונות, הנעות בין סך של 8 עד 96 שעות נבדקו. יתר על כן טמפרטורה שבה צנטריפוגה בוצעה הותאמה על בסיס זמן צנטריפוגה וכוח, בהתאמה.
טוהר של הצפיפות הגבוהה שברי Lipoprotein
טוהר שברים ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה מבודד נבדקו עם ג'ל אלקטרופורזה agarose. איור 2. ממחיש מכך אלקטרופורזה טיפוסי עבור חיסור HDL מבודד על ידי ultracentrifugation שיפוע. זה הראה בבירור כי ה- HDL היה נטול כל זיהום של VLDL ותערוכות-ניידות α טיפוסית. עדר כל ליפופרוטאינים נודדים-α את שברי VLDL ו- LDL מדגים את ההתאוששות המלאה מה- HDL במהלך ultracent צעד rifugation. השבר HDL, לעומת זאת, גם הראה כמה עקבות של ניידות β, דפוס פסים electrophoretic ידוע עקב זיהום עם ליפופרוטאינים (Lp (a)) 12.
ביעור Lp (a) מה- HDL מבודד
לימוד miRNAs נשא HDL דורש בידוד של HDL של הטוהר הגבוה ביותר. התערבות של Lp (a) עם HDL תורמת פוטנציאל זיהום צולב של HDL עם miRNAs נשא LDL. כדי למזער זיהום זה של HDL, 15 μl של β-mercaptoethanol 10 התווסף C פתרון במהלך השלב צנטריפוגה האחרון (איור 1). תוספת של β-mercaptoethanol הוכחה שלא לשנות את מאפייני צפיפות HDL 10. כמובא באיור 3., תוספת של β-mercaptoethanol הביאה בהיעדר ליפופרוטאינים נודד-ב בקנה אחד עם הסרה מאוד יעילה של Lp (a).
FO: keep-together.within-page = "1"> טיהור של מירנה מה- HDL
בידוד של מירנה היה ניסיון בתחילה מגיב תמוגה העסקת אשר משמש בדרך להפקת RNA מהדם. אמנם שיטה זו הניבה תשואה RNA טוב מאוד (91.45 ng / μl) אבל אחרי ניתוח spectrophotometric הראה טוהר RNA משביעת רצון. טיהור נוספת של RNA הבודד על ידי הסרת פנול שפרה את הטוהר אבל תשואת RNA הייתה עכשיו נמוכה משמעותי. לאחר מכן, עוד ערכה נבדקת שהראתה טוהר RNA מקובל (260/280 יחס ננומטר של 1.7) אבל תשואת RNA הייתה 26-לקפל לעומת התחתון עם מגיב תמוגה (3.45 לעומת 91.45 ng / μl). את התוצאות הטובות ביותר עבור טוהר RNA מקובל עם תשואה טובה התקבלו עם ערכת בסרום / פלזמה miRNeasy (48.2 ng / μl; 260/280 יחס ננומטר של 1.6) ולכן הליך החילוץ הזה ובהמשך הועסק לצורך זיהוי של מירנה מן מבודד חלק ליפופרוטאין HDL.
יפ-together.within-page = "1"> כדי להוכיח את ההיתכנות לכמת miRNAs נשא HDL האדם מטוהרים בשיטה זו, בחרנו להגביר miR-223. מירנה זו נבחרה משום miR-223 זוהו מטען של HDL 3 ו הוצגו להדחיק ספיגת 5 כולסטרול HDL. 4 א האיור. מציג עלילה יומן אופייני עקומות הגברה עריכת השוואות ערכי מחזור סף סף הבסיס לאחר אופטימיזציה של תגובת PCR עבור מיר-223 ואת ממוסמר-ב Cel-mir-39. גן סינטטי זה שמש בקרה פנימית כפי שיש לא דווח על שליטת נורמליזציה ידועה מירנה בפלזמה. בנוסף, מספר גני משק אנדוגני פוטנציאל הוקמו כמו RNU6-2, RNU-48, HY3 לא ניתן היה לזהות ו SNORD95 ניתן היה לזהות HDL המטוהר, אבל, הבדל ערכי ה- CT של miR-223 ו SNORD95 הוא פחות מחמישה ( מידע לא מוצג). ניתוח עקום התכה באיור 5. מראה בבירור ברור יחידשיא בקנה אחד עם הגברה של מירנה סלקטיבית שקדם PCR. כפי שמודגם באיור 4 ב., הן miR-223 ואת ההתייחסות Cel-mir-39 ניתן היה לזהות באופן עקבי בכל שש להקות פרו. יחסית וריאציות קטנות בין כל האנשים נצפו Cel-mir-39 לעומת miR-223. ממצאים אלה תומכים בידוד של HDL ב טוהר גבוה כדי לאפשר זיהוי של המטענים מירנה שלה.
איתור של miR-223 מטוהרים HDL
שיטה כמותית בזמן אמת PCR שימש לכמת מבשרי מירנה סיכת ראש-מבנה כפול מירנה גדיל בודד. שיטה זו זקוקה קדימה / לאחור פריימרים גן ספציפי וכן transcriptase ההפוכה thermostable להסבת מבנה סיכת הראש של מירנה כדי cDNA. CDNA היה מוגבר לאחר מכן לכמת באמצעות qPCR בזמן אמת בעזרת זיהוי ירוק SYBR. MicroRNA מן בסרום, פלזמה פלזמה HDL מטוהרים יכול להיות מדויק profiled באמצעות מערכת PCR RT מירנה.
המוצר הניסיוני שלנו של ביטוי גני miR-223 ממוצע הראה ערך CT של 30.9 ב- HDL המטוהרים השולטים שלילי המקביל שלה היו מעל חתוכים 35 (NTC = 38.1 ערך ה- CT, NRT ו NAC לא מוגבר). בניסוי זה, ראינו בדגימות HDL מטוהרים היווצרות של פריימר-דימר עם טמפרטורת התכה נמוכה (73 מעלות צלזיוס miR-223 ו 75.5 מעלות צלזיוס Cel-miR-39) וערך t צלזיוס מעל מבחני מירנה ספציפיים (טבלה 1). פריימר-הדימרים בטבלה 1. להתרחש כנראה בגלל ריכוז גבוה של פריימרים בתמיסה. זו מתרחשת בעיקר כאשר מולקולות פריימר לצרף אחד את השני אחרי 30 מחזורים PCR 13. זה מאפשר להם לחשל למולקולות פריימר אחרים ולמעשה, להיות ליניארי מיני תבניות וזה יגרום רקע גבוה ועלול להוביל דור של ערך t C <40 עבור NTC (אין templatדגימות דואר מלאה).
באיור 1. ייצוג סכמטי של הליך בידוד HDL. HDL הוכן על ידי ultracentrifugation שיפוע צפיפות בסדרה של שלושה צעדים צנטריפוגה. הפצה של להקות ליפופרוטאין ושברי ביניים שיפוע הצפיפות מומחשת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. Agarose ג'ל אלקטרופורזה של ליפופרוטאינים המבודדים ללא β-mercaptoethanol. VLDL, שברי LDL ו- HDL מבודדים על ידי ultracentrifugation שיפוע צפיפות מבלי להוסיף -mercaptoethanol β כדי demonst פתרון C לדרג בנוכחות Lp (a) בשבריר HDL. Lanes 1, 2, 9, ו -10 בכל מייצגים את סמן הגודל; Lanes 3/4, 5/6 ו 7/8 מייצג VLDL, LDL ו- HDL בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. Agarose ג'ל אלקטרופורזה של HDL מבודד עם β-mercaptoethanol. הוספת -mercaptoethanol β ל- C פתרון לפני צעד צנטריפוגה האחרון הביאה להסרה של Lp (a) מ שבר HDL. Lanes 1, 2, 9 ו -10 בכל מייצג את סמן הגודל; Lanes 3-8 מייצג HDL. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
ge = "1"> 
מגרש הגברת איור 4. שני miRNAs השונה וביטוי של Cel-miR-39 ומיר-223. (א) PCR בזמן אמת כמוני העסקת HDL המבודד בוצע כמתואר. ה- PCR היה לרוץ 45 מחזורים ואת הנקודה שבה העקומה חותכת את הסף הוא C T -Value. בפרסום מובאים נתונים על ביטוי Cel-miR-39 (פאנל משמאל) ומיר-223 (פאנל מימין), בהתאמה. הקו האופקי מייצג את סף זיהוי. מספר מחזור של 35 נקבע ליום הפסקת הגברה חיובית. (ב) נציגי נתונים בזמן אמת PCR מה- HDL המבודד המתקבל 6 דגימות מוצגות. גלם מתכוון ערכי ה- CT מוצגים עבור Cel-miR-39 ומיר-223, רמות שביטויים להשתנות פחות מ -2 הערך Ct בשבריר פלזמה HDL מטוהרים בין 6 דגימות, כל מתורם אחר. פרופיל ביטוי בוצע באמצעות מערכת ה- PCR ואת סרום האדם & פלזמת miRNQRT-PCR. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. עקומות התכה עבור Cel-miR-39 ומיר-223. כפי שמודגם, בנוכחות שיא יחיד מציין הגברה ספציפי של Cel-miR-39 (פאנל מימין) ומיר-223 (פאנל משמאל), בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
טבלת 1. בטור ג ערך t של פקד שלילי וחיובי של סינתטי Cel-miR-39 ומיר-223 מאופיין בסרום, פלזמה, cDNA, שברי HDL מטוהרים. NTC (אין templatדואר מלא), NRT (אין אנזים שעתוק לאחור), NAC (אין מים ריאגנטים מלאי הגברה, רק של qRT-PCR).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
זיהוי סמנים ביולוגיים רומן מדם יסייע לקביעת האבחנה הקלינית ופרוגנוזה של מחלות שונות. מיקרו-רנ"א הינם ידוע כבעל כל התכונות של סמנים ביולוגיים הוכחו במחקרים שונים 14-17. במחקר זה אנו הוכחנו שיטה קלה מהירה ופשוטה לבודדים מירנה מה- HDL בפלזמה. שיטת שיפוע אולטרה צנטריפוגה צפיפות קונבנציונלית בידוד של VLDL, LDL ו- HDL תלוי דגימה מדויקת של פלזמה, הכנה מדויקת של תמיסת הבופר, מדידת הצפיפות והעברת כמותי של שברים ליפופרוטאין תחתונים 8. ישנן שיטות רבות תוארו לבודד HDL 8 -11. שיטות אלה הן בדרך כלל גם מאוד מייגעות או דורשות כמויות גדולות של פלזמת דיאליזה נרחבת עבור ליפופרוטאינים מבודד desalting ואל תסירו לחלוטין exosomes ו ליפופרוטאינים כמקור miRNAs 3. כדי לטפל החסרונות האלה הקמנו סי זהmple ושיטה מהר בידוד של מירנה מה- HDL בפלזמה.
מטרת מפתח המטרה העיקרית של המחקר הנוכחי הייתה להפריד ולבודד מורכבים HDL-מירנה ידי ultracentrifugation ללא RBCs, מעיל באפי, exosomes, שלפוחית הפרשה, VLDL, LDL ו- ליפופרוטאינים (א) הפרעה, ואז לבודד miRNAs מה- HDL מטוהרים. זיהום והפרעה של כל אחד מהמרכיבים הללו עם HDL ישנו את תוצאות הניסוי הצפויות ונתוני פרופיל מירנה. בידוד של DNA, RNA miRNAs מדם הוא משימה קשה מאוד בשל האופי המורכב שלה. זה תמיד הוצג עם הרבה אתגרים טכניים כדי חומצות גרעין (כולל miRNAs) מיצוי וטיהור לעומת תאים, רקמות ודגימות איבר 18. כמו כן ישנם יחסית פחות גני מירנה נוכחים תאי דם. דם הוא נשאית ידועה exosomes, הפרשת שלפוחיות HDLs יחד עם miRNAs במחזור חינם, שהן יחסית פחות 18. לכן, גדולהר של נפח הדם מדגם פלזמה נדרש לעיבוד ובידוד של מורכבות HDL-מירנה. בנוסף, האופי הקצר של miRNAs רצפי היעד שלהם, עושה את זה אפילו קשה להשיג סגולי מספיק עם טכנולוגיות oligonucleotide PCR סטנדרטיות. הרכיבים הסלולר של דם הם תמיד יודעים להפריש מירנה mRNA בתגובה לשינויים בסביבה חיצונית כולל הטמפרטורה, מיקרואורגניזמים ורעלנים או מתח. גם נוכחות של nucleases, RNases, חלבונים במחזור ואנזימים אחרים בדם תשפיע בידוד מירנה אלה.
הגברת מירנה במחזור גם חסר גני משק ידועים ומבוסס כמו β-תקטין או GAPDH לנורמליזצית נתונים תוך שימוש בשיטת ΔΔCt של qRT-PCR. זה שוב מציב אחד משוכה גדולה עבור מירנה פרופיל מ במחזור בסרום דם או פלסמה 19. בשימוש נפוץ snoRNAs קידוד הלא קצר snRNAs לעתים רחוקות באים לידי ביטוי בדם מ זהakes אותו עוד יותר קשה במיצוי אותם גני בקרה פנימיים. כדי לפתור והחסרונות הללו snoRNAs ו snRNAs וכדי למנוע כל קשיים טכניים השתמשנו מלאות ספייק-אין סינתטי סרום / פלזמה ב המבחנים כמו גן בקרה פנימי כפי שהופעל על פי הפרוטוקול של היצרן. זה עוזר נורמליזציה לכל הגברה ספציפית ושינויים שחלו במהלך טיהור מירנה PCR תגובת 18. אפילו במקרה של שפלה של מירנה או בהעדר אותות הגברת מירנה ספציפי, ספייק-בשליטה צריכה להגביר בתגובות qRT-PCR ולתת אות צפויה עם ערך Ct סביר קבוע ואחיד. בהתבסס על העלייה החדה הגברה מלאה יחד עם שלוש שולטת שלילית ובקרות חיוביות קבלנו אימות נתונים אופטימלית טובה גן miR-223. זה אישר כי יש לנו תשואה טובה של miR-223 מ במחזור HDL פלסמה זו שיטה פשוטה.
לסיכום, הקמנו o השיטהultracentrifugation שיפוע צפיפות f (DGUC) בתוספת β-mercaptoethanol לטיהור מירנה מה- HDL בפלסמה. לשיטה מספר יתרונות: (א) VLDL, LDL ו- HDL מופרדים בתוך פרק זמן קצר על ידי ultracentrifuge הרצפה להשוות לשיטות אחרות שצריכה 24 - 96 שעות 8-11; (ב) דיאליזה LDL ו- HDL, desalting / להתרכז, מתרחשים בתוך 1 hr להשוות עם שיטות אחרות לקח 24 שעות או יותר 8,9; (ג) זיהום של ליפופרוטאינים הוסר על ידי β-mercaptoethanol בשבריר HDL, אך אינו מיועד לשמש בשבריר LDL; (ד) היקף המדגם הנדרש הוא רק 1 מ"ל לכל בשלבים VLDL, LDL ו- HDL הבידודים להשוות עם שיטות אחרות שצריכה נפח הדגימה יותר; (ה) זה ממוזער נזק חמצוני HDL במהלך הבידוד 11; (ו) לכל היותר 12 דגימות יכולה להיות מנותח ריצת אנליטיים הפרדה ליפופרוטאין יחידה; (ז) נפח דגימה 250 μl של HDL חילוץ מספיק כדי לנתח מטרריכוז אירנ"א / טוהר, ג'ל אלקטרופורזה agarose, ריכוז החלבון, microarray ונהלים RT-qPCR. המגבלות של השיטה שלנו היא כי אחוז קטן של HDL-מירנה עלול לאבד במהלך השלב המשקעים exosome ואת נפח דגימה פלזמה הנדרש צריך להיות יותר מ -200 μl לבודד HDL-מירנה.
לבסוף, מיקרו-רנ"א פלזמה אינם נגזרים רק מתאי דם פגום או עריק במחזור אלא גם מתאי ותאי דם נורמלי בריא מחלקים אחרים של הגוף הכולל איברים ורקמות בריאים וחולים שונים מושפע מצב בריאות מתמשך של הגוף 20. במחקר נוכחי זה מטוהר באופן שיטתי בוגרת miR-223 מה- HDL המבודד של מפלזמה אנושית. מחקר זה מראה בבירור כי הרמות של בוגרת miR-223 בפלזמת HDL הנקיה במיוחד ניתנות לזיהוי, יציבים, לשחזור ועקבי בקרב מדגם יחיד, ובכך לעודד שימוש קליני מאוד של בדיקות אל עתיד עבור ליפופרוטאינים, liVer, לב וכלי דם תסמונת המטבולית אחרת. באופן מפתיע, miRNAs הבוגרת, במיוחד miR-223 מפלזמת HDL הן כנראה עמידה nuclease עיכול ותנאים קשים אחרים אשר באופן פוטנציאלי להסביר את היציבות של miR-223 HDL המטוהרים. המנגנון של ההתנגדות של miR-223 כדי RNases דורש מחקר נוסף. ברור, בחן אותי בפרופיל ביטוי מירנה בפלזמת HDL מטוהר אלה עשויים לשפוך אור על סמני מירנה בעתיד בלימוד מחלות שונות. מיקרו-רנ"א HDL הקשורים אלה בפלסמה יכול לשמש סמנים ביולוגיים אבחון קליני פוטנציאליים רפואה מותאמת אישית בעתיד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים אין לי מה לחשוף.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic Vacutainer Lavender K2EDTA tubes | Becton, Dickinson and Company | 366643 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific, Sorvall Legend X1R | 75004261 | |
| Densito 30PX densitometer | Mettler Toledo | MT51324450 | |
| ExoQuick solution | Invitrogen | 4484451 | |
| Polycarbonate thick-walled ultracentrifuge tube | Thermo Scientific | O3237 | |
| Sorvall WX100 ultracentrifuge | Thermo Scientific | 46902 | |
| Fat Red 7B | Sigma-Aldrich | 201618 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | ||
| Amicon Ultra-15 Centrifugal filter devices 10K | Millipore | UFC901008 | |
| Amicon Ultra-centrifugal filter devices 3K | Millipore | UFC800308 | |
| QuickGel Lipo kit | Helena Laboratories | 3344,3544T | |
| Human lipoprotein standards for VLDL, LDL and HDL | LipoTrol; Helena Laboratories | 5069 | |
| Rep Prep buffer | Helena Laboratories | 3100 | |
| RNeasy MinElute spin columns | Qiagen | ||
| NanoDrop 1000 analyzer | Thermo Scientific | ||
| miScript II RT Kit | Qiagen | 218161 | |
| CFX96 Touch real-time PCR detection system | BioRad | ||
| miRNeasy Serum/Plasma Kit | QIAGEN | 217184 | |
| miScript Primer Assays | QIAGEN | 141078139 | |
| miScript SYBR Green PCR Kit | QIAGEN | 218073 | |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control | QIAGEN | 219610 | |
| NaOH | SIGMA-ALDRICH | 480878 | |
| 0.20 µM sterile syringe filter | SIGMA-ALDRICH | Z227536 |
References
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Arroyo, J. D., et al. Argonaute2 complexes carry a population of circulating microRNAs independent of vesicles in human plasma. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (12), 5003-5008 (2011).
- Vickers, K. C., et al. MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins. Nat Cell Biol. 13 (4), 423-433 (2011).
- Wagner, J., et al. Characterization of levels and cellular transfer of circulating lipoprotein-bound microRNAs. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33, 1392-1400 (2013).
- Wang, L., et al. MicroRNAs 185, 96, and 223 repress selective high-density lipoprotein cholesterol uptake through posttranscriptional inhibition. Mol Cell Biol. 33 (10), 1956-1964 (2013).
- Rayner, K. J., Moore, K. J. MicroRNA control of high-density lipoprotein metabolism and function. Circ Res. 114 (1), 183-192 (2014).
- Raposo, G. Exosomes: endosomal-derived vesicles shipping extracellular messages. Curr Opin Cell Biol. 16 (4), 415-421 (2004).
- Redgrave, T. G., Roberts, D. C., West, C. E. Separation of plasma lipoproteins by density-gradient ultracentrifugation. Anal Biochem. 65, 42-49 (1975).
- Foreman, J. R., et al. Fractionation of human serum lipoproteins by single-spin gradient ultracentrifugation: quantification of apolipoproteins B and A-1 and lipid components. J Lipid Res. 18, 759-767 (1977).
- Dong, J., et al. Serum LDL- and HDL-cholesterol determined by ultracentrifugation and HPLC. J Lipid Res. 52, 383-388 (2011).
- Tong, H., Knapp, H. R., VanRollings, A. low temperature flotation method to rapidly isolate lipoproteins from plasma. J Lipid Res. 39, 1696-1704 (1998).
- Fless, G. M., ZumMallen, M. E., Scanu, A. M. Physicochemical properties of apolipoprotein (a) and lipoprotein (a-) derived from the dissociation of human plasma lipoprotein (a). J Biol Chem. 261, 8712-8718 (1986).
- Brownie, J., et al. The elimination of primer-dimer accumulation in PCR. Nucleic Acids Res. 25, 3235-3241 (1997).
- Alton, E., Inyoul, L., Leroy, H., David, G., Kai, W. Extracellular microRNA: a new source of biomarkers. Mutat Res. 717 (1-2), 85-90 (2011).
- Stefanie, S. J. Cancer biomarker profiling with microRNAs. Nature Biotechnology. 26, 400-401 (2008).
- Prasun, J. M. MicroRNAs as promising biomarkers in cancer diagnostics. Biomarker Research. 2 (19), (2014).
- Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. Circulating microRNAs: novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease? Circ Res. 110, 483-495 (2012).
- Jonathan, S., Martin, S., Eric, L. miRNA profiling from blood -challenges and recommendations. , www.qiagen.com (2015).
- Francesco, M., Paola, D. C., Anna, T., Jesper, T., Sergio, A., Riccardo, L. R. Normalization of circulating microRNA expression data obtained by quantitative real-time RT-PCR. Brief Bioinform. 3, 1-9 (2015).
- Chen, Y., et al. Circulating microRNAs, novel biomarkers of acute myocardial infarction: a systemic review. World J Emerg Med. 3, 257-260 (2012).
