Summary
MicroRNAs spielen eine wichtige regulatorische Rolle und werden als neue therapeutische Targets für verschiedene menschliche Krankheiten entstehen. Es hat sich gezeigt, dass miRNAs in Lipoproteinen hoher Dichte durchgeführt werden. Wir haben ein vereinfachtes Verfahren entwickelt, um schnell gereinigter HDL für miRNA-Analyse von Humanplasma geeignet isolieren.
Protocol
1. Entnahme von Blutproben
- Sammeln peripheren Fasten Blutproben in einem 10 ml-Plastikröhrchen mit Antikoagulans (EDTA) durch Standard venipuncture einer prominenten Vene in der Ellenbeuge (die mehrere Vorteile gegenüber anderen Antikoagulantien hat).
- Zentrifugieren der Blutproben bei 1.600 xg für 20 min bei 4 ° C in einer Tischzentrifuge Plasma frei von roten Blutkörperchen und geringe Mengen an RNA zu erhalten.
- zentrifugieren sequentielles der Überstand bei 3.000 g (4 ° C) in einem Schwingbecher-Rotor für 10 min zu entfernen WBC & Platelets und dann weitere 15 min jeweils verbleibenden Zelltrümmer zu entfernen.
- Messen der Dichte des Plasmas mit einem Densitometer bei RT unter Verwendung gemäss Herstellungsanweisungen.
HINWEIS: Die Einstellung der Dichte (d = 1,023 g / ml) mit 0,9% Kochsalzlösung kann nach der Entfernung von Exosomen erforderlich sein, jedoch vor der Dichtegradient Ultrazentrifugation. 2. exosome Entfernen von Plasma - Entfernen Sie die zirkulierenden Exosomen , die eine ähnliche Dichte wie HDL und eine quantitativ signifikante Quelle von miRNA 3 darstellen.
- Dies geschieht durch Zugabe von 252 & mgr; l exosome Fällungslösung zu 1 ml Plasma, gefolgt von Inkubation für 30 min bei 4 ° C. Um die Exosomen Pellet aus Zentrifugation der Mischung für 30 min bei 1500 g bei 4 ° C.
- Zur Isolierung HDL, je 1 ml des resultierenden Überstand auf eine Polycarbonat-dickwandigen Ultrazentrifugenröhrchen für die weitere Verarbeitung mit Dichte-Ultrazentrifugation (siehe unten).
- Separater HDL verwenden, um ein 3-Stufen-Prozess einen Boden mit einem Ultrafestwinkelrotor, der bei 448.811 x G und 8 ° C, jeweils eingesetzt wird.
- Bereiten Sie drei unterschiedliche Dichte Lösungen nacheinander und frisch für jede Isolation.
- Bereiten Lösung A (Isolation von VLDL, d = 1,006 g / ml) durch Auflösen von 11,4 g NaCl (NaCl: 0,195 mol), 0,1 g EDTA2Na und 1 ml 1N NaOH in 1000 ml autoklaviertem destilliertem Wasser. Dann fügen Sie eine zusätzliche 3 ml autoklaviert-destilliertes Wasser.
- Vorbereitung der Lösung B (Isolierung von LDL, d = 1,182 g / ml) durch Zugabe von 25,2 g NaBr 100 ml Lösung A (NaCl 0,195 mol, NaBr 2,44 mol).
- Bereiten Lösung C (Isolierung von HDL, d = 1,470 g / ml) durch Mischen von 78,8 g NaBr mit 100 ml Lösung A (NaCl 0,195 mol, NaBr 7,7 mol). Bestätigen Sie die entsprechende Dichte bei RT unter Verwendung eines Densitometers. Halten Sie alle Lösungen bei 4 ° C bis zur weiteren Verwendung.
- Mischen Sie 1 ml Plasma (durchschnittliche Dichte = 1,023 g / ml) und nukleasefreiem 200 ul Fat Red 7B in einem 6,5 ml Polycarbonat dickwandigen Ultrazentrifugenröhrchen.
- Dann Schicht vorsichtig 5 ml der Lösung A auf die Oberseite des Gemisches. Falls erforderlich, fügen Sie zusätzliche Fat Red 7B auf der Lösung A to das Gewicht jedes Rohr balancieren. Zentrifuge für 2 h (Beschleunigung - 5), (Verzögerung - 7).
HINWEIS: Während der Zentrifugation werden die Lipoproteine als Band auf ihre Gleichgewichtsdichte Regionen akkumuliert. - Am Ende der Lauf beobachten 2 Schichten. Entfernen Sie 1,5 ml der VLDL-Fraktion, die die obere Schicht und lagern bei 4 ° C.
- Schließlich mit einer Pipette Übertragungs 4 ml vom Boden des Röhrchens das LDL enthält, HDL, Albumin und Fettsäure-Fraktion zu einem neuen Polycarbonatrohr für LDL Isolation.
- Mix 2 ml Lösung B und 100 ul nukleasefreiem Fat Red 7B in das Röhrchen mit dem LDL und HDL-Fraktion (Abschnitt 4) sind.
- Zentrifuge Dann aus 3 h (Beschleunigung 9, Verzögerung 7). Danach entfernen 1,5 ml der LDL-Fraktion die oberste Schicht darstellt und halten bei 4 ° C oder bei -80 ° C. Schließlich übertragen 4 ml vom Boden des Röhrchens das HDL enthaltendeFraktion auf eine neue Polycarbonatrohr.
- Mix 2 ml Lösung C, 100 & mgr; l Nuklease frei Fat Red 7B und 15 ul 98% β-Mercaptoethanol in das Rohr die HDL-Fraktion enthält, respectively.
- Zentrifuge für 3 h (Beschleunigung 9, Verzögerung 7). Danach 2 ml der HDL-Fraktion zu entfernen die oberste Schicht darstellt und entweder halten bei 4 ° C oder bei -80 ° C.
- Um Interferenzen mit anschließender Agarose-Gelelektrophorese und PCR zu vermeiden, entfernen übermäßige Salz während Dichtegradient Ultrazentrifugation hinzugefügt unter Verwendung von Zentrifugal-Filtervorrichtungen mit dem geeigneten Molekulargewichtsgrenze (3K Rohr für VLDL und 10K Rohr für LDL / HDL), wie durch die Anweisungen des Herstellers beschrieben ist.
- Kurz gesagt, nach 2,5 ml kaltem PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4) Zugabe centrifuge der gesamte VLDL-Fraktion gesammelt während Dichtegradient Ultrazentrifugation bei 4 ° C für 60 min eine Schwingbecherrotor verwendet wird.
- Desalt die LDL-Fraktion zweimal mit 10 ml eiskaltem PBS für jeweils 30 min. Verwenden Weiter wurden 13 ml eiskaltem PBS zweimal für Entsalzen der HDL-Fraktion. Je höher PBS Volumen ist notwendig, die Mobilität mit Agarose-Gelelektrophorese zu verbessern. Nach der Zentrifugation entfernen bei 4 ° C oder bei -80 ° C gelagert, die Lipoprotein enthält, gelöste Stoffe und zu halten.
- Perfrom Lipoprotein Agarosegelelektrophorese das Kit mit kleineren Modifikationen von den Anweisungen des Herstellers verwendet wird, wie folgt.
HINWEIS: Dieser Schritt ist nur die Qualität und Reinheit der konzentrierten Lipoprotein Proben zu bewerten ist.- Kurz gesagt, erhalten 6 ul des entsalzten Lipoprotein-Fraktion mit Ultrazentrifugation Dichte und laden auf einen vorgegossenen Lipoprotein-Gel. Verwenden menschlichen lipoprotein Standards für VLDL, LDL und HDL als Größenreferenz. Führen Sie die Elektrophorese bei RT bei 100 V für 60 min unter Verwendung von Rep Prep-Puffer.
- Trocknen des Gels für 10 min und dann Färbung für 10 min bei RT mit Fat Red 7B. Entfärben des Gels in einem Gemisch aus Methanol-Wasser 75:25 (v / v) und trockenem erneut 5 min.
- Perfrom Isolierung von miRNA durch gereinigtes humanes HDL mit dem Serum / Plasma-miRNA Isolierung und Reinigung Kit.
- Kurz gesagt, 1 ml RNA Lysereagenz bis 200 & mgr; l gereinigtem HDL, mit einem Vortexer mischen und dann für 5 min bei RT inkubiert, um die vollständige Dissoziation der Nucleoprotein-Komplexe und Inaktivierung von RNasen gewährleisten.
- Dann Spike 3,5 ul synthetischer Caenorhabditis elegans microRNA (cel-miR-39, 1,6 x 10 8 Kopien / ul) in die Mischung. Führen Sie dann nach RNA-Extraktion aus den Anweisungen des Herstellers.
- Führen Sie purificatiauf der extrahierten-miRNA mit elute Spin-Säulen gemäß den Anweisungen des Herstellers. Messen Sie die Konzentration von miRNA aus gereinigtem HDL mit einem spectrophorometer.
HINWEIS: Die Elution von miRNA aus den Spin-Säulen verwendet 16 & mgr; l RNase-freiem Wasser. - Isolieren 100 ng des miRNA aus HDL gespikt mit synthetischen miRNA (cel-miR-39) und revers transkribiert in einem 20 ul Reaktionsvolumen der reversen Transkription unter Verwendung von Kits und gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Führen Sie entsprechende Kontrollen ohne Vorlage miRNA (NTC) und ohne reverse Transkriptase-Enzym-Mix (NRT).
- Perfrom PCR in Echtzeit in einem Gesamtvolumen von 20 & mgr; l mit 2 & mgr; l einer 1: 2 Verdünnung der cDNA, 10 & mgr; l PCR-Mix, 2 & mgr; l Universal-Primer, 2 & mgr; l miRNA Primern und 4 & mgr; l RNase-freiem Wasser.
- Führen Sie die Reaction in 96-Well-Platten bei 95 ° C für 15 min, von 45 Zyklen von 94 ° C für 15 sec und 55 ° C für 30 s und eine Verlängerungsphase bei 70 ° C für 30 s.ec alle Reaktionen in Triplikaten perfrom .
- Als nächstes calcuate relativen Mengen von miRNA durch die 2 -ΔΔ Ct Methode nach der Normalisierung auf das synthetische Housekeeping - Gen unter Verwendung gemäß den Anweisungen des Herstellers.
3. Dichte-Ultrazentrifugation (Abbildung 1).
4. Isolierung von VLDL
5. Isolierung von LDL
6. Isolierung von HDL
7. Die Entsalzung und Konzentration von Lipoprotein-Fraktionen
8. Agarose-Gelelektrophorese
9. RNA Extraktion und Reinigung
10. Reverse Transkription (RT-PCR)
11. Real-time PCR (qRT-PCR)
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Representative Results
Isolierung von High Density Lipoprotein Nach Entfernen von Exosomen
MiRNA aus hochgereinigtem HDL zu erhalten , ist es notwendig , Exosomen zu entfernen , die eine Quelle der Verschmutzung miRNA 7 darstellen. Dies wurde vor der Dichtegradient Ultrazentrifugation mit einem im Handel erhältlichen Kits durchgeführt. Für praktische Zwecke ein Drei - Stufen - Standarddichte - Ultrazentrifugation Protokoll , das von kommerziellen Unternehmen entwickelt wurde modifiziert (Abbildung 1). Dieses Protokoll erfordert Zentrifugation mit einem Festwinkelrotor mit einer Geschwindigkeit von 140.000 Umdrehungen pro Minute , die bis zu 54.000 Umdrehungen pro Minute 3, 8, 9 und 10. Unter Verwendung eines allgemein verfügbaren T-1270 Rotor mit einem im wesentlichen schneller als die üblicherweise verwendeten Protokolle mit Zentrifugalkräften ist Maximalkraft von 70.000 Umdrehungen pro Minute, wurde Zentrifugation zunächst mit Polyallomer- Röhren durchgeführt, die es versäumt haben, die Zentrifugalkräften zu widerstehen. Um zu vermeiden, Zusammenbruch von Rohren,Polycarbonat-Röhrchen wurden erfolgreich eingesetzt. Zentrifugierung Zeit ist von entscheidender Bedeutung für die Oxidation von Lipoproteinen und potenziell Abbau miRNA 11. Daher mehrere verschiedene Zentrifugationszeiten von einem insgesamt 8 bis 96 Stunden getestet wurden, reichen. Des Weiteren Temperatur, bei der wurde durch Zentrifugation basierend auf Zentrifugation Zeit und Kraft eingestellt sind.
Die Reinheit der High - Density - Lipoprotein - Fraktionen
Reinheit der isolierten High Density Lipoprotein - Fraktionen wurden mit Agarose - Gelelektrophorese überprüft. Figur 2 veranschaulicht ein typisches Elektrophorese Ergebnis für die HDL Subtraktion durch Ultrazentrifugation isoliert. Es zeigte sich deutlich, dass HDL frei von jeglicher Kontamination von VLDL war und zeigt typische α-Mobilität. Das Fehlen von α-Migration Lipoproteine in den VLDL und LDL-Fraktionen zeigt die vollständige Rückgewinnung von HDL während der ultracentrifugation Schritt. Die HDL - Fraktion zeigte jedoch auch eine gewisse Spur von β-mobility, einem bekannten elektrophoretischen Bandenmuster aufgrund einer Kontamination mit Lipoproteinen (Lp (a)) 12.
Eliminierung von Lp (a) Isolierte HDL
miRNAs erfolgt in HDL Studium erfordert die Isolierung von HDL von höchster Reinheit. Interferenz von Lp (a) mit HDL trägt möglicherweise zu einer Kreuzkontamination von HDL mit durch miRNAs in LDL. Um diese Kontamination von HDL zu minimieren, 15 ul β-mercaptoethanol 10 wurde während der letzten Zentrifugationsschritt (Abbildung 1) , um Lösung C zugegeben. Die Zugabe von β-Mercaptoethanol wurde nicht zu ändern Dichte Eigenschaften HDL 10 gezeigt. Wie in Figur 3 dargestellt, die Zugabe von β-Mercaptoethanol ergab die Abwesenheit von B-Migration Lipoproteine im Einklang mit sehr effektive Entfernung von Lp (a).
Reinigung von miRNA von HDL
Die Isolierung von miRNA wurde ursprünglich unter Verwendung von Lysereagenz versucht, die üblicherweise für die RNA-Extraktion aus Blut verwendet wird. Obwohl dieses Verfahren in einer sehr guten Ausbeute RNA ergab (91,45 ng / & mgr; l), aber nach spektrophotometrische Analyse zeigte unbefriedigend RNA Reinheit. Weitere Reinigung der isolierten RNA durch Phenol Entfernen verbessert die Reinheit aber die RNA-Ausbeute betrug jetzt signifikant niedrig. Als nächstes wurde ein weiteres Kit getestet , die eine akzeptable RNA Reinheit (260/280 nm - Verhältnis von 1,7) , aber die RNA - Ausbeute 26-fach niedriger mit dem Lysereagenz (3,45 vs. 91,45 ng / ul) verglichen wurde , zeigte. (; 260/280 nm-Verhältnis von 1,6 48,2 ng / ul), und daher ist diese Extraktionsverfahren wurde für den Nachweis von miRNA aus dem isolierten anschließend eingesetzt, um die besten Ergebnisse für eine annehmbare RNA Reinheit mit einer guten Ausbeute wurden mit dem miRNeasy Serum / Plasma-Kit erhalten HDL-Lipoprotein-Fraktion.
3 in der Fracht von HDL identifiziert wurde und HDL - Cholesterin - Aufnahme 5 unter gezeigt. Die 4A. zeigt eine typische Kurvendarstellung Amplifikationskurven Basislinien-Schwelle und Schwellenzykluswerte nach der Optimierung der PCR-Reaktion für die miR-223 und die gespickt-in Cel-mir-39 zu vergleichen. Dieses synthetische Gen wurde als interne Kontrolle verwendet, da es keine Berichte über bekannte Normalisierungskontrolle für miRNA in Plasma sind. Zusätzlich könnte endogene mehrere potentielle etablierten Housekeeping-Genen wie RNU6-2, RNU-48, HY3 nicht erkannt werden konnte, und SNORD95 in gereinigtem HDL detektiert werden, jedoch ist der Unterschied in Ct-Werte von miR-223 und SNORD95 weniger als fünf ( Daten nicht gezeigt). Schmelzkurvenanalyse in Abbildung 5 dargestellt zeigt deutlich eine deutliche EinzelSpitze im Einklang mit Verstärkung eines selektiven miRNA im vorangegangenen PCR. Wie 4B in Fig., Die beide miR-223 und der Referenz Cel-mir-39 konnte konsequent in allen sechs pro Banden nachgewiesen werden. Relativ kleine Variationen bei allen Personen wurden für Cel-mir-39 im Vergleich mit miR-223 beobachtet. Diese Ergebnisse unterstützen die Isolierung von HDL bei hoher Reinheit Nachweis seiner miRNA Ladung zu ermöglichen.
Der Nachweis von miR-223 in gereinigtem HDL
Echtzeit wurde quantitative PCR-Methode verwendet, um Doppelhaarnadel Struktur miRNA Vorläufer Einzelstrang miRNA quantifizieren. Diese Methode benötigt ein Vorwärts / Rückwärts-Gen-spezifische Primer und eine thermostabile reverse Transkriptase die Hairpin-Struktur der miRNA in cDNA zu konvertieren. Die cDNA wurde anschließend amplifiziert und quantifiziert unter Verwendung von Echtzeit-qPCR mit Hilfe von SYBR green Detektion. MicroRNA aus Serum, Plasma und gereinigtes HDL Plasma genau sein profiled die miRNA RT-PCR-System.
Unsere experimentellen Produkt der mittleren miR-223 Genexpression einen Ct-Wert von 30,9 in gereinigtem HDL zeigte und seine entsprechenden negativen Kontrollen waren über Cut-off 35 (NTC = 38,1 Ct-Wert, NRT und NAC wurden verstärkt nicht). Bei diesem Experiment haben wir gesehen , in den gereinigten HDL - Proben , die Bildung von Primer-Dimer mit niedriger Schmelztemperatur (73 ° C in miR-223 und 75,5 ° C in Cel-miR-39) und höhere C t Wert als den spezifischen miRNA - Assays (Tabelle 1). Die Primer-Dimere in Tabelle 1 auftreten , wahrscheinlich wegen der hohen Konzentration an Primern in der Lösung. Dies geschieht meist , wenn Primermoleküle miteinander nach 30 PCR - Zyklen befestigen 13. Auf diese Weise können sie an andere Primermoleküle anlagern und in der Tat, lineare Mini-Vorlagen werden und es wird höher Hintergrund verursachen und zu einer Generation von C t - Wert <40 für NTC (No templat führen kanne-Kontrolle) Proben.
Abbildung 1. Schematische Darstellung der HDL - Isolierungsverfahren. HDL wurde durch Dichtegradienten-Ultrazentrifugation in einer Reihe von drei Zentrifugationsschritten hergestellt. Aufteilung der Lipoproteinbanden und Zwischenfraktionen im Dichtegradienten dargestellt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Agarose - Gelelektrophorese von Lipoproteinen Isolierte Ohne β-Mercaptoethanol. VLDL, LDL und HDL getrennt Fraktionen durch Dichtegradienten - Ultrazentrifugation , ohne Zugabe von β - Mercaptoethanol zu Lösung C demonstBewerten des Vorhandenseins von Lp (a) in der HDL-Fraktion. Die Bahnen 1, 2, 9 und 10 stellen jeweils die Größe Marker; Die Spuren 3/4, 5/6 und 7/8 repräsentieren VLDL, LDL und HDL sind. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Agarose Gelelektrophorese von HDL Isolierte mit β-Mercaptoethanol. Β - Mercaptoethanol zu Lösung C vor dem letzten Zentrifugationsschritt Hinzufügen resultierte in der Entfernung von Lp (a) von der HDL - Fraktion. Die Bahnen 1, 2, 9 und 10, die jeweils die Größe Marker darstellen; Die Spuren 3-8 repräsentieren HDL. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Amplification Plot von zwei unterschiedlichen miRNAs und Expression von Cel-miR-39 und miR-223. (A) quantitative Echtzeit - PCR isoliert HDL verwendet , wurde wie beschrieben durchgeführt. Die PCR wurde für 45 Zyklen und dem Punkt laufen , in dem sich die Kurve der Schwellenwert schneidet , ist der C T -Wert. Die Daten zeigen die Expression von Cel-miR-39 (links) und miR-223 (rechts) sind. Die horizontale Linie stellt die Detektionsschwelle. Ein Zyklus von 35 wurde als Cutoff für positive Verstärkung eingestellt. (B) Repräsentative Echtzeit - PCR - Daten aus isolierten HDL von 6 Proben erhalten werden , gezeigt. Raw bedeuten Ct-Werte werden für Cel-miR-39 und miR-223, deren Expression gezeigt Stufen variieren von weniger als 2 Ct-Wert in gereinigtem HDL Plasmafraktion zwischen 6 Proben, die jeweils von einem anderen Spender. Expression Profilierung wurde mit der PCR-System und dem humanen Serum und Plasma miRN durchgeführtEin qRT-PCR. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Schmelzkurven für Cel-miR-39 und miR-223. Wie dargestellt ist , das Vorhandensein eines einzelnen Peak zeigt eine spezifische Amplifikation von Cel-miR-39 (rechts) und miR-223 (links) sind. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Tabelle 1. Zeile C t Wert von negativen und positiven Kontrolle von synthetischen Cel-miR-39 und miR-223 , dadurch gekennzeichnet, Serum, Plasma, cDNA und gereinigtes HDL - Fraktion. NTC (No template-Steuerung), NRT (No Reverse Transkription-Enzym), NAC (keine Verstärkungsregelung, nur Wasser und Reagenzien von qRT-PCR).
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Discussion
Identifizierung neuer Biomarker aus Blut werden in der klinischen Diagnose und Prognose von verschiedenen Krankheiten unterstützen. MicroRNAs sind bekannt , alle Qualitäten von Biomarkern zu besitzen und haben in verschiedenen Studien 14-17 gezeigt. In dieser Studie haben wir eine schnelle und einfache einfache Methode zur Isolierung miRNA aus Plasma-HDL demonstriert. Herkömmliche Dichtegradient Ultrazentrifugation Verfahren zur Isolierung von VLDL, LDL und HDL , hängt von genauen Abtastung von Plasma, präzise Vorbereitung der Pufferlösung, die Messung der Dichte und quantitative Übertragung von Boden Lipoproteinfraktionen 8. Es gibt zahlreiche Methoden , die beschrieben wurden HDL 8 -11 zu isolieren. Diese Methoden sind oft entweder sehr aufwendig oder erfordern große Volumen an Plasma und umfangreiche Dialyse für die Lipoproteine Entsalzung isoliert und nicht vollständig Exosomen und Lipoproteine als Quelle von miRNAs 3 zu entfernen. Um diese Mängel zu adressieren wir diese si festgestellt haben,mple und schnelle Methode zur Isolierung von miRNA aus Plasma-HDL.
Das Hauptziel und primäre Ziel dieser Studie zu trennen war und HDL-miRNA-Komplex durch Ultrazentrifugation ohne RBCs, Leukozytenmanschette, Exosomen, Sekretvesikel, VLDL isolieren, LDL und Lipoproteine (a) Störungen, dann isolieren miRNAs aus gereinigtem HDL. Verunreinigungen und Störungen von jeder dieser Komponenten mit HDL wird die erwarteten experimentellen Ergebnisse und miRNA-Daten ändern. Isolierung von DNA, RNA und miRNAs aus Blut ist eine sehr schwierige Aufgabe aufgrund seiner Komplexität. Es hat sich immer viele technische Herausforderungen, Nukleinsäuren (einschließlich miRNAs) Extraktion und Reinigung im Vergleich zu Zellen, Gewebe und Organproben 18 gestellt worden. Auch gibt es relativ weniger miRNA Gene in Blutzellen zirkulieren. Blut ist ein bekannter Träger für Exosomen, Sekretvesikel und HDLs zusammen mit freiem zirkulierenden miRNAs, die relativ weniger 18. Daher größer einBerg Plasma Probenvolumen Blut wird für die Verarbeitung und Isolierung von HDL-miRNA-Komplex erforderlich. Darüber hinaus ist die kurze Natur der miRNAs und deren Zielsequenzen, macht es auch schwierig, eine ausreichende Spezifität mit Standard-PCR-Oligonukleotid-Technologien zu erreichen. Die zellulären Bestandteile des Bluts sind immer wissen, miRNA und mRNA in Reaktion auf sezernieren in externen Umgebung einschließlich der Temperatur, Mikroorganismen und Toxine oder Stress zu ändern. Auch Anwesenheit von Nukleasen, RNasen, zirkulierende Proteine und andere Enzyme im Blut wird diese miRNA Isolation beeinflussen.
Die zirkulierende miRNA Verstärkung fehlt auch eine gut etablierte bekannt Housekeeping-Gene wie β-Actin oder GAPDH für die Datennormalisierung, während die ΔΔCt Methode der qRT-PCR. Dies stellt wiederum eine der Haupthürde für miRNA aus Profilierungs 19 Blutserum oder Plasma zirkuliert. kurze, nicht kodierende snoRNAs und snRNAs sind selten im Blut und diese m ausgedrückt Häufig verwendeteakes es schwierig, weiter in sie als interne Kontrollgene verwendet. Um diese Nachteile der snoRNAs und snRNAs lösen und technische Probleme zu vermeiden, verwendeten wir Serum / Plasma synthetische Spike-In Kontrolle in den Tests als interne Kontrollgens als nach Herstellerangaben Protokoll. Es hilft bei der Normalisierung für jede unspezifische Amplifikation und Veränderungen traten bei miRNA Reinigung und PCR - Reaktion 18. Selbst im Falle einer Verschlechterung der miRNA oder Fehlen von bestimmten miRNA Verstärkung Signale, die Spike-Kontrolle sollte in qRT-PCR-Reaktionen und geben ein erwartetes Signal mit einer einigermaßen konstant und gleichmäßig Ct Wert verstärken. Basierend auf der Spitze in den Regelverstärkung zusammen mit drei negativen Kontrollen und Positivkontrollen haben wir gute Validierung optimale Daten für miR-223-Gen. Dies bestätigt, dass wir eine gute Ausbeute von miR-223 erhalten haben von Plasma-HDL aus dieser einfachen Methode zirkulieren.
Abschließend haben wir eine Methode o etabliertf Dichtegradienten-Ultrazentrifugation (DGUC) unter Zusatz von β-Mercaptoethanol zur Reinigung von miRNA aus Plasma HDL. Das Verfahren hat mehrere Vorteile: (a) VLDL, LDL und HDL von Boden innerhalb einer kurzen Zeitspanne getrennt sind Ultra Vergleich zu anderen Methoden , die 24 benötigt - 96 Stunden 11.08; (b) LDL und HDL Dialyse, entsalzt / konzentriert, erfolgt innerhalb von 1 Stunde mit anderen Methoden vergleichen , die 24 oder mehr Stunden dauerte 8,9; (C) Eine Verunreinigung von Lipoproteinen durch β-Mercaptoethanol in HDL-Fraktion entfernt, jedoch ist nicht beabsichtigt, in der LDL-Fraktion zu verwenden ist; (D) Das Probenvolumen erforderlich ist nur 1 ml für alle schrittweise VLDL, LDL und HDL-Isolationen Vergleich mit den anderen Methoden, die mehr Probenvolumen benötigt; (e) Es minimiert oxidative Schäden an HDL während der Isolierung 11; (F) Es können maximal 12 Proben in einem einzigen Lipoprotein Trennung Analysenlauf analysiert werden; (G) Die 250 & mgr; l Probenvolumen von extrahierten HDL ist genug m zu analysiereniRNA Konzentration / Reinheit, Agarose-Gelelektrophorese, Proteinkonzentration, Mikroarray und RT-qPCR-Verfahren. Die Grenzen unserer Methode ist, dass kleiner Prozentsatz der HDL-miRNA während der exosome Fällungsschritt verlieren kann und die erforderliche Plasmaprobenvolumen sollte mehr als 200 & mgr; l sein HDL-miRNA zu isolieren.
Schließlich werden die Plasma microRNAs nicht nur von beschädigten oder Renegat Blutzellen im Blutkreislauf abgeleitet, sondern auch von gesunden normalen Blutzellen und Zellen, die aus anderen Teilen des Körpers, die durch die laufenden Gesundheitsstatus des Körpers betroffen verschiedenen gesunden und kranken Geweben und Organen umfasst 20. Die vorliegende Studie hat systematisch reifen miR-223 aus isolierten HDL von menschlichem Plasma gereinigt. Diese Studie zeigt deutlich, dass das Niveau der reifen miR-223 in der hochgereinigten HDL Plasma nachweisbar sind, stabile, reproduzierbare und konsistente zwischen Individuen Probe, dadurch stark klinische Anwendung von Futurity Tests für Lipoproteine, li erleichternver, Herz-Kreislauf- und anderen metabolischen Syndromen. Überraschenderweise reifen miRNAs, insbesondere miR-223 von HDL-Plasma sind wahrscheinlich resistent Verdauung und anderen harten Bedingungen Nuclease, die möglicherweise die Stabilität von miR-223 in gereinigter HDL erklären. Der Mechanismus der Resistenz von miR-223 bis RNasen erfordert weitere Untersuchungen. Offensichtlich Ausdruck miRNA Studium Profile in dieser gereinigten HDL-Plasma würde Aufschluss über zukünftige miRNA-Marker in verschiedenen Krankheiten zu studieren. Diese HDL microRNAs im Plasma kann als potenzielle klinische diagnostische Biomarker und personalisierte Medizin in der Zukunft verwendet werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic Vacutainer Lavender K2EDTA tubes | Becton, Dickinson and Company | 366643 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific, Sorvall Legend X1R | 75004261 | |
| Densito 30PX densitometer | Mettler Toledo | MT51324450 | |
| ExoQuick solution | Invitrogen | 4484451 | |
| Polycarbonate thick-walled ultracentrifuge tube | Thermo Scientific | O3237 | |
| Sorvall WX100 ultracentrifuge | Thermo Scientific | 46902 | |
| Fat Red 7B | Sigma-Aldrich | 201618 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | ||
| Amicon Ultra-15 Centrifugal filter devices 10K | Millipore | UFC901008 | |
| Amicon Ultra-centrifugal filter devices 3K | Millipore | UFC800308 | |
| QuickGel Lipo kit | Helena Laboratories | 3344,3544T | |
| Human lipoprotein standards for VLDL, LDL and HDL | LipoTrol; Helena Laboratories | 5069 | |
| Rep Prep buffer | Helena Laboratories | 3100 | |
| RNeasy MinElute spin columns | Qiagen | ||
| NanoDrop 1000 analyzer | Thermo Scientific | ||
| miScript II RT Kit | Qiagen | 218161 | |
| CFX96 Touch real-time PCR detection system | BioRad | ||
| miRNeasy Serum/Plasma Kit | QIAGEN | 217184 | |
| miScript Primer Assays | QIAGEN | 141078139 | |
| miScript SYBR Green PCR Kit | QIAGEN | 218073 | |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control | QIAGEN | 219610 | |
| NaOH | SIGMA-ALDRICH | 480878 | |
| 0.20 µM sterile syringe filter | SIGMA-ALDRICH | Z227536 |
References
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Arroyo, J. D., et al. Argonaute2 complexes carry a population of circulating microRNAs independent of vesicles in human plasma. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (12), 5003-5008 (2011).
- Vickers, K. C., et al. MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins. Nat Cell Biol. 13 (4), 423-433 (2011).
- Wagner, J., et al. Characterization of levels and cellular transfer of circulating lipoprotein-bound microRNAs. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33, 1392-1400 (2013).
- Wang, L., et al. MicroRNAs 185, 96, and 223 repress selective high-density lipoprotein cholesterol uptake through posttranscriptional inhibition. Mol Cell Biol. 33 (10), 1956-1964 (2013).
- Rayner, K. J., Moore, K. J. MicroRNA control of high-density lipoprotein metabolism and function. Circ Res. 114 (1), 183-192 (2014).
- Raposo, G. Exosomes: endosomal-derived vesicles shipping extracellular messages. Curr Opin Cell Biol. 16 (4), 415-421 (2004).
- Redgrave, T. G., Roberts, D. C., West, C. E. Separation of plasma lipoproteins by density-gradient ultracentrifugation. Anal Biochem. 65, 42-49 (1975).
- Foreman, J. R., et al. Fractionation of human serum lipoproteins by single-spin gradient ultracentrifugation: quantification of apolipoproteins B and A-1 and lipid components. J Lipid Res. 18, 759-767 (1977).
- Dong, J., et al. Serum LDL- and HDL-cholesterol determined by ultracentrifugation and HPLC. J Lipid Res. 52, 383-388 (2011).
- Tong, H., Knapp, H. R., VanRollings, A. low temperature flotation method to rapidly isolate lipoproteins from plasma. J Lipid Res. 39, 1696-1704 (1998).
- Fless, G. M., ZumMallen, M. E., Scanu, A. M. Physicochemical properties of apolipoprotein (a) and lipoprotein (a-) derived from the dissociation of human plasma lipoprotein (a). J Biol Chem. 261, 8712-8718 (1986).
- Brownie, J., et al. The elimination of primer-dimer accumulation in PCR. Nucleic Acids Res. 25, 3235-3241 (1997).
- Alton, E., Inyoul, L., Leroy, H., David, G., Kai, W. Extracellular microRNA: a new source of biomarkers. Mutat Res. 717 (1-2), 85-90 (2011).
- Stefanie, S. J. Cancer biomarker profiling with microRNAs. Nature Biotechnology. 26, 400-401 (2008).
- Prasun, J. M. MicroRNAs as promising biomarkers in cancer diagnostics. Biomarker Research. 2 (19), (2014).
- Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. Circulating microRNAs: novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease? Circ Res. 110, 483-495 (2012).
- Jonathan, S., Martin, S., Eric, L. miRNA profiling from blood -challenges and recommendations. , www.qiagen.com (2015).
- Francesco, M., Paola, D. C., Anna, T., Jesper, T., Sergio, A., Riccardo, L. R. Normalization of circulating microRNA expression data obtained by quantitative real-time RT-PCR. Brief Bioinform. 3, 1-9 (2015).
- Chen, Y., et al. Circulating microRNAs, novel biomarkers of acute myocardial infarction: a systemic review. World J Emerg Med. 3, 257-260 (2012).
