Summary
MikroRNA'lar önemli bir düzenleyici rol oynar ve çeşitli insan hastalıkları için yeni bir terapötik hedef olarak ortaya çıkmaktadır. MiRNA'ların yüksek yoğunluklu lipoprotein taşınmaktadır gösterilmiştir. Hızla insan plazmasından MiRNA analizi için uygun, saflaştırılmış HDL izole edilmesi için basit bir yöntem geliştirdik.
Protocol
Kan Örneklerinin 1. Koleksiyonu
- Antekübital fossa önemli bir ven standart olarak damar delinerek (diğer pıhtılaşma önleyiciler göre birçok avantajı vardır) pıhtılaşma önleyici etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ihtiva eden 10 ml'lik plastik tüplere periferal venöz kan örnekleri açlık toplayın.
- kırmızı kan hücreleri ve RNA az miktarda serbest plazma elde etmek için bir masaüstü santrifüj 4 ° C'de 20 dakika boyunca 1600 x g'de, kan örnekleri santrifüj.
- Sıralı, sırasıyla, kalan hücre debrisini uzaklaştırmak için WBC ve Trombositler ve 15 dakika daha sonra ilave çıkarmak için 10 dakika boyunca bir sallanan kepçeli rotor içinde 3.000 g (4 ° C) süpernatant santrifüj.
- üretim talimatlarına göre oda sıcaklığında bir dansitometresi kullanılarak plazma yoğunluğunu ölçün.
Not: yoğunluk ayarı (d = 1.023 g / ml),% 0.9 tuzlu su çözeltisi ile eksozomlann çıkarılması ancak önceden yoğunluk gradyan ultrasantrifüjü sonrası gerekebilir. Plazma 2. Exosome Kaldırma - HDL benzer bir yoğunluğa sahip dolaşan eksozomlar çıkarın ve miRNA 3 sayısal olarak önemli bir kaynağını temsil etmektedir.
- 4 ° C'de 30 dakika boyunca kuluçkalandı ve ardından 1 mL plazmaya 252 ul eksozom çökelme çözeltisi ekleyerek bu fazlası. eksozomlar üzerinden pelet için 4 ° C sıcaklıkta 1500 g'de 30 dakika boyunca karışımın santrifüjlenir.
- HDL, yoğunluk gradyanlı ultrasantrifüjleme ile daha fazla işlenmek üzere bir polikarbonat kalın duvarlı bir ultra santrifüj tüpüne elde edilen süpernatan transferi 1 mi izole etmek için (aşağı bakınız).
- HDL sabit açılı rotor 448.811 x G çalışan ve 8 ° C, sırasıyla bir kat ultrasantrifüjdeki kullanan bir 3 aşamalı bir süreci kullanmak ayırmak için.
- Üç farklı yoğunluk çözeltileri, sırasıyla, her izolasyonu için taze hazırlayın.
- Çözelti A Hazırlama (VLDL izolasyonu, d = 1.006 g / ml) 11.4 gr NaCI (NaCI: 0.195 mol) eritilmesi ile otoklava damıtılmış su 1000 ml, 0.1 g EDTA * 2Na, 1 ml 1 N NaOH. Daha sonra otoklav damıtılmış su ilave 3 ilave edin.
- 100 mi A çözeltisi (NaCI 0.195 mol, NaBr 2.44 mol), 25.2 gr, NaBr ekleyerek Çözelti B hazırlanması (LDL izolasyonu, d = 1.182 g / ml).
- Çözelti A, 100 ml (NaCI 0.195 mol, NaBr 7.7 mol) 78.8 g, NaBr karıştırılarak (d = 1.470 g / ml HDL izolasyonunu) Çözüm C hazırlayın. Bir dansitometresi kullanılarak oda sıcaklığında uygun yoğunluğu onaylayın. sonraki kullanıma kadar 4 ° C 'de, tüm çözümler tutun.
- Plazma 1 ml (ortalama yoğunluğu = 1.023 g / ml), 6.5 mi polikarbonat kalın duvarlı bir ultra santrifüj tüpüne Yağ Kırmızı 7B ve nükleaz bilgilerini 200 ul karıştırın.
- Sonra dikkatlice karışımın üstüne çözelti A 5 ml katman. Gerekirse, çözüm A t üstünde ek Yağ Kırmızı 7B ekleyino Her tüpün ağırlığını dengeleyecek. - 2 saat (5 hızlanma) için santrifüj (yavaşlama - 7).
Not: Santrifüj sırasında, lipoproteinler kendi denge yoğunluk bölgelerinde bir bant olarak biriktirilir. - çalışma sonunda 2 kat gözlemlemek. 4 ° C 'de üst tabaka ve mağaza temsil VLDL fraksiyonunun 1.5 mL çıkarın.
- Son olarak, LDL içeren tüpün tabanından bir pipet aktarım işlemlerinin 4 ml kullanılarak, HDL, LDL izolasyonu için yeni bir polikarbonat tüpüne albumin ve yağ asidi fraksiyonu.
- sırasıyla LDL ve HDL fraksiyonu (bölüm 4) ihtiva eden bir tüpe B çözeltisi ve 100 ul nükleaz serbest yağlı kırmızı 7B 2 ml karıştırın.
- Ardından 3 saat (hızlanma 9, yavaşlama 7) için dışarı santrifüj. Daha sonra, üst tabaka temsil LDL fraksiyonu 1.5 mL çıkarın ve -80 ° C 'de 4 ° C ya da mağaza tutun. Son olarak, HDL içeren tüpün tabanından 4 ml aktarmakYeni bir polikarbonat tüp kısmı.
- 2 solüsyonu C ml, 100 ul nükleaz serbest yağ Kırmızı 7B sırasıyla, HDL fraksiyonu ihtiva eden bir tüpe% 98 β-merkaptoetanol 15 ul karıştırın.
- 3 saat (hızlanma 9, yavaşlama 7) için santrifüj. Bundan sonra üst tabaka temsil HDL fraksiyonu 2 ml çıkarın ve -80 ° C 'de 4 ° C' de devam veya mağaza ya da.
- sonraki agaroz jel elektroforezi ve PCR ile bir girişimi engellemek için, üreticinin talimatlarında belirtildiği şekilde (LDL / HDL için VLDL ve 10K tüp 3K tüp) uygun molekül ağırlığı kesme ile santrifüj filtre cihazları kullanılarak yoğunluk gradyan Ultrasantrifügasyon sırasında eklenen aşırı tuz kaldırmak.
- Kısaca, soğuk bir PBS (137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4) içinde 2.5 ml eklenmesinden sonra SantrifüjGE tüm VLDL fraksiyon toplandı-sırasında yoğunluk gradyanlı ultrasantrifüjleme 4 ° C'de bir sallanma kepçe rotor kullanılarak 60 dakika boyunca.
- 30 dakika her biri için 10 ml buz gibi soğuk PBS ile iki kez, LDL fraksiyonu desalt. Daha sonra, HDL fraksiyonu tuzdan arındırma iki kez 13 ml buz gibi soğuk PBS kullanın. yüksek PBS hacmi agaroz jel elektroforezi ile mobiliteyi geliştirmek için gereklidir. Santrifüj işleminden sonra, lipoprotein içeren çözünmüş çıkarın ve 4 ° C'de tutun veya -80 ° C'de saklanır.
- şu şekilde üreticinin talimatlarına küçük değişikliklerle kiti kullanılarak lipoprotein agaroz jel elektroforezi perfrom.
NOT: Bu adım konsantre lipoprotein örneklerinin kalite ve saflık değerlendirmek için sadece budur.- Kısaca, yoğunluk gradyanlı ultrasantrifüjleme ile tuzdan arındırılmış lipoprotein fraksiyonu 6 ul elde edilir ve bir ön dökme lipoprotein jel üzerine yüklenir. İnsan lipop kullanınboyutu, referans olarak VLDL, LDL ve HDL için rotein standartları. Rep Hazırlık tampon kullanarak 60 dakika boyunca 100 V oda sıcaklığında elektroforez yürütmek.
- 10 dakika için jel Kuru ve yağlı kırmızı 7B ile oda sıcaklığında 10 dakika süre ile boyanır. 5 dakika boyunca tekrar metanol-su 75:25 (v / v) ve kuru bir karışımı içinde jel destain.
- Serum / plazma MiRNA izolasyon ve saflaştırma kiti kullanılarak saflaştırılmış insan HDL ile miRNA'nın izole perfrom.
- Kısaca, bir vortexer ile karıştırın ve daha sonra nükleoprotein kompleksleri ve RNases inaktivasyonu tam ayrılmasını sağlamak üzere, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca kuluçkaya yatırılır, saflaştırılmış HDL 200 ul RNA liziz reaktifi 1 ml.
- (1.6 x 10 8 kopya / ml cel-miR-39) karışım içine daha sonra sentetik Caenorhabditis elegans microRNA 3.5 ul başak. Daha sonra, üreticinin talimatlarına uygun olarak bir RNA özütleme gerçekleştirmek.
- cevap verecek gerçekleştirinüreticinin talimatlarına göre uzaklaştırma spin kolonların ile ekstre-miRNA üzerinde. Bir spectrophorometer ile saflaştırılmış HDL gelen miRNA konsantrasyonu ölçün.
NOT: Spin sütunlarından miRNA sıyrılması RNaz içermeyen su 16 ul kullandı. - HDL'den miRNA'nın 100 ng izole sentetik miRNA (Cel-miR-39) ve ters transkripsiyon kiti kullanılarak ve imalatçının talimatlarına göre bir 20 ul reaksiyon hacmi içinde, ters kopyalanmış ile arttı.
- Şablon miRNA (NTC) olmadan ve ters transkriptaz enzim karışımı (NRT) olmadan uygun kontroller gerçekleştirin.
- cDNA 2 seyreltme, 10 ul PCR karışımı, 2 ul genel primer 2 MiRNA primerler ul 4 ul RNaz içermeyen su bir 1: 2 ul 20 ul bir toplam hacim içinde gerçek-zamanlı PCR perfrom.
- Reacti çalıştırın15 saniye ve 30 saniye boyunca 55 ° C ve 30, 70 ° C de uzatma aşaması 94 ° C'de 45 döngü, 15 dakika boyunca 95 ° C'de 96 oyuklu plakalar, içeri üç kez tüm reaksiyonlar perfrom s.ec .
- Sonraki üreticinin talimatlarına göre sentetik temizlik gene normale döndükten sonra 2 -ΔΔ Ct yöntemini kullanarak miRNA calcuate göreceli miktarları.
3. Yoğunluk Gradient Ultrasantrifügasyon (Şekil 1).
VLDL 4. İzolasyonu
LDL 5. İzolasyon
HDL'nin 6. İzolasyonu
7. Tuzdan arındırma ve Lipoprotein Fraksiyonlarının Konsantrasyon
8. Agaroz Jel Elektroforez
9. RNA Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması
10. Ters Transkripsiyon (RT-PCR)
11. Real-time PCR (QRT-PCR)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eksozomlann Cerrahisi Sonrası Yüksek Yoğunluklu Lipoprotein İzolasyonu
Yüksek derecede saflaştırılmış HDL gelen miRNA edinmek için miRNA kontaminasyon 7 kaynağı temsil eksozomlar kaldırmak için gereklidir. Bu ticari olarak temin edilebilir kit ile yoğunluk gradyan ultrasantrifüjü önce yapıldı. Pratik amaçlar için ticari şirket tarafından geliştirilen bir üç adım standart yoğunluk degrade Ultrasantrifügasyon protokolü (Şekil 1) modifiye edildi. Bu protokol, 54,000 rpm'de 3, 8, 9 ve 10'a kadar santrifüj kuvvetleri ile yaygın olarak kullanılan protokoller büyük ölçüde daha hızlıdır 140,000 rpm bir hızda bir sabit açılı rotor santrifüj gerektirir. Bir olan yaygın olarak kullanılan T 1270 bir rotor 70.000 rpm maksimum kuvvet, santrifüj ilk santrifüj kuvvetlerine direnmek için başarısız polyallomer tüpleri ile gerçekleştirilmiştir. tüplerin çöküşü önlemek için,polikarbonat borular başarıyla kullanılmıştır. Santrifüj süresi lipoprotein oksidasyonu ve potansiyel miRNA bozulması 11 için kritik öneme sahiptir. 8 ila 96 saatlik bir toplam kadar nedenle çeşitli santrifüj kez test edilmiştir. Santrifüj gerçekleştirildiği hangi Ayrıca temperatürünün, sırası ile santrifüj zaman ve kuvvet, göre ayarlanmıştır.
Yüksek Yoğunluklu Lipoprotein Kesirler saflığı
İzole yüksek yoğunluklu lipoprotein fraksiyonları saflığı agaroz jel elektroforezi ile kontrol edildi. 2. gradyan ultra santrifüj yoluyla izole HDL çıkarma için tipik bir elektroforez sonuçlarını gösterir Şekil. Açıkça HDL, VLDL herhangi kontaminasyon yoksun olduğunu gösterdi ve tipik α-hareketlilik sergiliyor. VLDL ve LDL fraksiyonları herhangi α-göç lipoproteinlerin yokluğu ultracent sırasında HDL gelen tam iyileşme gösteriyorrifugation adım. HDL fraksiyonu, ancak, aynı zamanda bağlı lipoproteinler ile kontaminasyon (Lp (a)) 12 β-hareketlilik, bilinen bir elektroforetik bantlama desenli bir iz göstermiştir.
İzole HDL adlı Lp (a) Eleme
HDL taşınan miRNA'lar incelenmesi yüksek saflıkta HDL izole edilmesini gerektirmektedir. Lp Girişim (a) HDL ile potansiyel LDL taşınan miRNA'ların ile HDL'nin çapraz kontaminasyon katkıda bulunur. HDL'nin bu kirlenme en aza indirmek için, β-merkaptoetanol, 10 15 ul Son santrifüj aşamasından (Şekil 1) çözeltisi C ilave edildi. Β-merkaptoetanol eklenmesi HDL yoğunluğu özellikleri 10 değiştirmek için gösterilmiştir. Şekil 3'te de gösterildiği gibi, β-merkaptoetanol eklenmesi Lp (a) çok etkili bir şekilde çıkarılması ile tutarlı bir B-göç lipoproteinlerin olmaması ile sonuçlandı.
miRNA Arıtma HDL dan
miRNA'nın izolasyonu ilk yaygın kandan RNA ekstraksiyonu için kullanılır kullanılarak parçalama reaktifi denendi. Bu yöntem çok iyi bir RNA verimi (91,45 ng / ul) ama sonra sonuçlandı rağmen spektrofotometrik analiz yetersiz RNA saflık gösterdi. fenol kaldırarak izole RNA'nın ek arıtma saflığını gelişmiş ama RNA verimi artık anlamlı olarak düşüktü. Daha sonra, bir kit olarak kabul edilebilir bir RNA saflık (1.7 260/280 nm oranı), fakat RNA verimi 26 kat daha düşük liziz reaktifi (3.45 genel 91,45 ng / ul) ile karşılaştırılmıştır gösterdi test edilmiştir. (1.6 260/280 nm oranı 48.2 ng / | il) ve bu nedenle, bu ekstraksiyon prosedürü, daha sonra izole edilmiş Mirna saptanması için kullanılan bir verimle olarak kabul edilebilir bir RNA saflığı en iyi sonuçlar miRNeasy serum / plazma kit ile elde edilmiştir HDL lipoprotein fraksiyonu.
3 kargo tespit edilmiştir ve HDL kolesterol alımını 5 bastırmak gösterilmiştir çünkü bu miRNA seçildi. Şekil 4A. PCR miR-223 için tepki ve optimizasyonu sonrası bazal eşik ve eşik döngüsü değerlerini karşılaştırarak amplifikasyon eğrileri tipik bir günlük grafiğini göstermektedir çivili-Cel-mir-39. Plazmadaki miRNA bilinen normalizasyon kontrol hiçbir çalışma vardır, bu sentetik gen, iç kontrol olarak kullanıldı. Buna ek olarak, RNU6-2, RNU-48 gibi pek çok olası endojen hazırlık geninin, HY3 tespit edilememiştir ve SNORD95 saflaştınlmış HDL tespit edilebilir, ancak, miR-223 ve SNORD95 Ct değerleri arasındaki fark (en az beş veri gösterilemiyor). Şekil 5'de gösterilen Erime eğrisi analizi açıkça tek bir belirgin gösterirYukarıdaki PCR seçici bir miRNA amplifikasyonu ile tutarlı en yüksek. Şekil 4B. Gösterildiği gibi, miR-223 ve referans hem Cel-Mir-39 sürekli olarak altı Pro bantlar tespit edilebilir. Tüm bireyler arasında nispeten küçük varyasyonları miR-223 ile karşılaştırıldığında Cel-mir-39 gözlenmiştir. Bu bulgular, MiRNA yük algılama sağlamak için, yüksek saflıkta HDL izole destekler.
Saf HDL miR-223 Algılama
Gerçek zamanlı kantitatif PCR yöntemi tek iplikli miRNA çift saç tokası yapısı miRNA öncüleri ölçmek için kullanıldı. Bu yöntem, bir ileri / geri gene özgü primerleri ve cDNA'ya miRNA'nın saç tokası yapısını dönüştürmek için ısıya dayanıklı bir ters transkriptazı gerekmektedir. cDNA daha sonra yükseltilir ve SYBR Green algılama yardımıyla gerçek zamanlı QPCR kullanılarak ölçüldü. serum, plazma ve arıtılmış, HDL plazma mikroRNA profile doğru olabilirEd MiRNA RT-PCR Sistemi kullanılarak.
Ortalama miR-223 gen ifadesinin deneysel ürünü saflaştırılmış HDL 30.9 bir Ct değeri gösterdi ve karşılık gelen negatif kontroller kesme 35 üzerindedir (NTC = 38.1 Ct değeri, NRT ve NAC amplifiye değil). Bu deneyde, düşük erime sıcaklığına sahip saflaştınlmış HDL örneklerinde primer-dimer oluşumunu testere (Mir-223 73 ° C ve 75.5 ° C Cel-miR-39) ve spesifik MiRNA deneyleri daha yüksek CT değeri (Tablo 1). Tablo 1 'de primer-dimerler için çözelti içinde primerler yüksek konsantrasyonu, muhtemelen ortaya çıkar. Astar moleküller 30 PCR döngüsü 13 sonra birbirlerine taktığınızda Bu çoğunlukla oluşur. Bu onları yok templat (diğer astar moleküllere ve yürürlükte tavlama doğrusal mini şablonlar olmak ve daha yüksek arka plan neden olur ve C t değeri <NTC için 40 kuşağının yol açabilir sağlare kontrolü) örnekleri.
Şekil 1. HDL İzolasyon Prosedürü şematik gösterimi. HDL, üç santrifüj adımları bir dizi yoğunluk gradyan ultrasantrifüjü ile elde edilmiştir. Yoğunluk gradyanı lipoprotein bantları ve orta kısımların dağılımı gösterilmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Β-merkaptoetanol içermeyen İzole Lipoproteinler Şekil 2. Agaroz jel elektroforez. VLDL, yoğunluk gradyan ultrasantrifüjü ile izole LDL ve HDL kısımlarındaki Çözelti Cı demonst için β merkaptoetanol eklemedenHDL fraksiyonu, Lp (a) 'nın varlığını değerlendirmek. Geçitler 1, 2, 9 ve 10, her boyut işaretleyici temsil eder; Şerit 3/4, 5/6 ve 7/8 sırasıyla VLDL, LDL ve HDL temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Β-merkaptoetanol ile yalıtılmıştır. Son santrifüj aşamasından önce çözelti C β merkaptoetanol ekleme HDL Şekil 3. Agaroz jel elektroforezi HDL fraksiyonuna (a) Lp kaldırıldı. Her bir boyut işaretleyici temsil 9 ve 10, sütun 1, 2; Şerit 3-8 HDL temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4. Amplifikasyon İki Farklı miRNA'ların Arsa ve Cel-miR-39 ve miR-223 ifadesi. Tarif edildiği gibi (A) Gerçek zamanlı kantitatif PCR izole HDL kullanılarak gerçekleştirilmiştir. PCR 45 döngü ve eğri eşiği C T -Değer olduğu kesiştiği noktaya çalıştırılmıştır. Veri ekspresyonunu göstermektedir Cel-miR-39 (sol panel) ve miR-223 (sağ panel), sırasıyla. Yatay çizgi algılama eşiği temsil etmektedir. 35 kişilik bir döngü sayısı pozitif yükseltilmesi için kesim olarak belirlenmiştir. 6 örneklerden elde edilen izole HDL (B) Temsilcisi real-time PCR veri gösterilir. Ham Ct değerleri olan ekspresyon düzeyleri, farklı bir donörden 6 numuneler, her biri arasında saflaştırılmış HDL plazma fraksiyonunda az 2 Ct değeri değişir Cel-miR-39 ve miR-223 için gösterilmiştir anlamına gelir. İfade profilleme PCR Sistemi ve İnsan Serum & Plazma mirn kullanılarak gerçekleştirildiBir Mah-PCR. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Cel-miR-39 ve miR-223 için Şekil 5. Erime eğrileri. Gösterildiği gibi, tek bir tepe noktası varlığı. Cel-miR-39 (sağ panel) ve miR-223 (sol panel), sırasıyla, belirli bir amplifikasyon gösterir lütfen Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Negatif ve pozitif sentetik Cel-miR-39 kontrol ve miR-223 serum, plazma, cDNA özelliği ve saflaştırılmış HDL fraksiyonu Tablo 1. Sıra CT değeri. NTC (No template kontrolü), NRT (No ters transkripsiyon enzim), NAC (Mah-PCR yok amplifikasyon kontrolü, sadece su ve reaktif).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
kandan yeni biyomarkerlerin tanımlanması çeşitli hastalıkların klinik tanı ve prognoz yardımcı olacaktır. MikroRNA'lar biyomarkerların tüm niteliklere sahip olduğu bilinen ve çeşitli çalışmalarla 14-17 de gösterilmiştir. Bu çalışmada, plazma HDL Mirna izole etmek için hızlı ve basit bir kolay bir yöntem gösterilmiştir. VLDL, LDL ve HDL izolasyonu geleneksel yoğunluk gradyanı, ultra-santrifüj yöntemi plazma doğru örnekleme, tampon çözeltisi tam bir şekilde hazırlanması, yoğunluk ve taban lipoprotein fraksiyonları, 8 kantitatif transfer ölçümü bağlıdır. HDL 8 -11 izole etmek için tarif edilmiş bir çok yöntem vardır. Bu yöntemler genellikle çok zahmetli olan veya tuzsuzlaştırma izole lipoproteinler için plazma ve geniş diyaliz büyük hacimli gerektiren ve tamamen miRNA'lar 3 kaynağı olarak eksozomlar ve lipoproteinler çıkarmayın. Bu si kurduk biz bu eksiklikleri gidermek içinmple ve plazma HDL gelen miRNA izolasyon hızlı bir yöntemdir.
temel amacı ve bu çalışmanın temel amacı ayırmak ve eritrosit olmadan Ultrasantrifügasyon HDL-miRNA kompleksi izole etmek oldu, ince beyaz tabaka, ekzozomlar, salgı vezikülleri, VLDL, LDL ve Lipoproteinler (a) girişim, daha sonra arıtılmış HDL gelen miRNA'lar izole. HDL ile bu bileşenlerin herhangi kirlenmesi ve parazit beklenen deneysel sonuçlar ve miRNA profilleme verileri değiştirecektir. Kandan DNA RNA ve miRNA'lar izolasyonu nedeniyle karmaşık yapısından çok zor bir iştir. Her zaman hücreler, dokular ve organ örnekleri 18 göre ekstraksiyon ve saflaştırma (miRNA'ların dahil) Nucleic Acids teknik zorluklar çok teşkil edilmiştir. Ayrıca kan hücrelerinin dolaşımdaki mevcut görece daha az miRNA genler vardır. Kan 18 görece daha az olan Eksozomlann, salgı veziküller ve ücretsiz dolaşan miRNA'lar ile birlikte HDL, bilinen bir taşıyıcısıdır. Bu nedenle, daha büyük bir birkan plazma numune hacminin bağlama HDL-MiRNA kompleks işleme ve izolasyon için gereklidir. Buna ek olarak, miRNA'ların ve hedef dizilerin kısa doğal bile zordur standart PCR oligonükleotid teknolojileri ile yeterli bir özgüllük elde etmeyi mümkün kılar. Kanın hücresel bileşenleri her zaman sıcaklık, mikroorganizma ve toksinler veya stres gibi dış ortamda değiştirmek için yanıt olarak miRNA ve mRNA salgılamaya bilirler. Kanda nükleazlar, RNaslar, dolaşımdaki proteinlerin ve diğer enzimlerin varlığı, bu MiRNA izolasyonu etkileyecektir.
Mah-PCR ΔΔCt yöntemini kullanırken dolaşan miRNA amplifikasyon aynı zamanda veri normalleşmesi için β-aktin veya GAPDH gibi köklü bilinen temizlik genleri yoksundur. Bu da yine kan serum veya plazma 19 dolaşan profil miRNA için önemli engel bir teşkil etmektedir. Yaygın kısa olmayan kodlama snoRNAs kullanılan ve snRNAs nadiren kan ve bu m cinsinden ifade edilmiştiriç kontrol genler olarak kullanılmasında daha da zor akes. snoRNAs ve snRNAs bu dezavantajları çözmek ve üretici protokolüne göre takip gibi iç kontrol geni olarak tahlillerde Serum / Plazma sentetik Spike-In kontrolü kullanılan herhangi bir teknik zorluklar önlemek için. Herhangi bir spesifik olmayan amplifikasyonu için normalleşme yardımcı olur ve değişiklikler miRNA arıtma ve PCR reaksiyonu 18 sırasında meydana geldi. Hatta miRNA'nın bozulması veya herhangi bir özel MiRNA amplifikasyon sinyalleri yokluğunda, başak in QRT-PCR reaksiyonlarında yükseltmek ve oldukça sabit ve muntazam bir Ct değerine sahip bir beklenen sinyal verecektir kontrol. Üç negatif kontroller ve pozitif kontroller ile birlikte kontrol amplifikasyon başak dayanarak, miR-223 gen için iyi optimum veri doğrulama var. Biz bu basit yöntemle plazma HDL dolaşan miR-223 iyi verim var olduğunu doğruladı.
Sonuç olarak, bir yöntem o kurdukPlazma HDL'den miRNA'nın saflaştırılması için β-merkaptoetanol ilavesiyle F yoğunluk gradyan ultrasantrifüjleme (DGUC). Yöntem, bir çok avantaja sahiptir: (a) VLDL, LDL ve HDL 24 gereken diğer yöntemlere karşılaştırın kat ultrasantrifüjdeki tarafından kısa bir süre içinde ayrılır - 96 saat 8-11; (b) LDL ve HDL, diyaliz, tuz giderme / konsantre, 24 veya daha fazla saat 8,9 aldı diğer yöntemler ile karşılaştırın 1 saat içinde yer alır; Lipoproteinler (c) kontaminasyonu HDL fraksiyonu β-merkaptoetanol ile ayrılmış, ancak LDL fraksiyonu kullanılmak üzere tasarlanmamıştır; (D) Gerekli örnek hacmi, tüm aşamalı VLDL, LDL için sadece 1 ml ve HDL izolasyonların daha örnek hacmini gereken diğer yöntemlerle karşılaştırılması; (e) izolasyon sırasında 11 HDL oksidatif hasarı minimize; (F) 12 numune maksimum tek lipoprotein ayırma analitik vadede analiz edilebilir; (G) çıkarılan HDL 250 ul numune hacmi m analiz etmek yeterliIRNA konsantrasyon / saflığı agaroz jel elektroforezi, protein konsantrasyonu, mikrodizi RT-qPCR işlemleri. Bizim yönteminin sınırlamaları HDL-miRNA'nın küçük bir yüzdesi, eksozom çöktürme aşaması esnasında kaybedebilir ve gereken plazma numunesi hacminin HDL-miRNA izole etmek için birden fazla 200 ul olmasıdır.
Son olarak, plazma mikroRNAlar sadece dolaşımdaki bozuk veya dönek kan hücrelerinden değil, aynı zamanda sağlıklı, normal kan hücreleri ve vücudun sürekli sağlık durumunun etkilenen çeşitli sağlıklı ve hastalıklı doku ve organların yer aldığı diğer bölgelerinden gelen hücrelerden türetilmiş değildir 20. Bu mevcut çalışma sistematik insan plazmasından izole HDL olgun miR-223 saf olan. Bu çalışma açıkça, oldukça saflaştırılmış HDL plazmada olgun miR-223 seviyeleri böylece büyük ölçüde lipoproteinler, li için futurity testlerinin klinik kullanımının kolaylaştırılması, saptanabilir istikrarlı, tekrarlanabilir ve bireylerin örnek arasında tutarlı olduğunu gösterirver, kardiyovasküler ve diğer metabolik sendromlar. Şaşırtıcı bir şekilde, HDL plazma, özellikle miR-223, olgun miRNA'lar muhtemelen potansiyel saflaştırılmış HDL miR-223 stabilitesini açıklar sindirim ve diğer sert koşullarına nükleaz dirençlidir. RNases için miR-223 direnç mekanizması daha fazla çalışma gerektirmektedir. Açıkçası, bu arıtılmış HDL plazmada miRNA ifade profillerini inceleyerek çeşitli hastalıkların tedavi okuyan geleceğin miRNA belirteçleri üzerine ışık tutacağını. plazmadaki Bu HDL ilişkili mikroRNAlar bir potansiyel klinik tanı biyomarkerların olarak kullanılan ve gelecekte tıp kişiselleştirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic Vacutainer Lavender K2EDTA tubes | Becton, Dickinson and Company | 366643 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific, Sorvall Legend X1R | 75004261 | |
| Densito 30PX densitometer | Mettler Toledo | MT51324450 | |
| ExoQuick solution | Invitrogen | 4484451 | |
| Polycarbonate thick-walled ultracentrifuge tube | Thermo Scientific | O3237 | |
| Sorvall WX100 ultracentrifuge | Thermo Scientific | 46902 | |
| Fat Red 7B | Sigma-Aldrich | 201618 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | ||
| Amicon Ultra-15 Centrifugal filter devices 10K | Millipore | UFC901008 | |
| Amicon Ultra-centrifugal filter devices 3K | Millipore | UFC800308 | |
| QuickGel Lipo kit | Helena Laboratories | 3344,3544T | |
| Human lipoprotein standards for VLDL, LDL and HDL | LipoTrol; Helena Laboratories | 5069 | |
| Rep Prep buffer | Helena Laboratories | 3100 | |
| RNeasy MinElute spin columns | Qiagen | ||
| NanoDrop 1000 analyzer | Thermo Scientific | ||
| miScript II RT Kit | Qiagen | 218161 | |
| CFX96 Touch real-time PCR detection system | BioRad | ||
| miRNeasy Serum/Plasma Kit | QIAGEN | 217184 | |
| miScript Primer Assays | QIAGEN | 141078139 | |
| miScript SYBR Green PCR Kit | QIAGEN | 218073 | |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control | QIAGEN | 219610 | |
| NaOH | SIGMA-ALDRICH | 480878 | |
| 0.20 µM sterile syringe filter | SIGMA-ALDRICH | Z227536 |
References
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Arroyo, J. D., et al. Argonaute2 complexes carry a population of circulating microRNAs independent of vesicles in human plasma. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (12), 5003-5008 (2011).
- Vickers, K. C., et al. MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins. Nat Cell Biol. 13 (4), 423-433 (2011).
- Wagner, J., et al. Characterization of levels and cellular transfer of circulating lipoprotein-bound microRNAs. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33, 1392-1400 (2013).
- Wang, L., et al. MicroRNAs 185, 96, and 223 repress selective high-density lipoprotein cholesterol uptake through posttranscriptional inhibition. Mol Cell Biol. 33 (10), 1956-1964 (2013).
- Rayner, K. J., Moore, K. J. MicroRNA control of high-density lipoprotein metabolism and function. Circ Res. 114 (1), 183-192 (2014).
- Raposo, G. Exosomes: endosomal-derived vesicles shipping extracellular messages. Curr Opin Cell Biol. 16 (4), 415-421 (2004).
- Redgrave, T. G., Roberts, D. C., West, C. E. Separation of plasma lipoproteins by density-gradient ultracentrifugation. Anal Biochem. 65, 42-49 (1975).
- Foreman, J. R., et al. Fractionation of human serum lipoproteins by single-spin gradient ultracentrifugation: quantification of apolipoproteins B and A-1 and lipid components. J Lipid Res. 18, 759-767 (1977).
- Dong, J., et al. Serum LDL- and HDL-cholesterol determined by ultracentrifugation and HPLC. J Lipid Res. 52, 383-388 (2011).
- Tong, H., Knapp, H. R., VanRollings, A. low temperature flotation method to rapidly isolate lipoproteins from plasma. J Lipid Res. 39, 1696-1704 (1998).
- Fless, G. M., ZumMallen, M. E., Scanu, A. M. Physicochemical properties of apolipoprotein (a) and lipoprotein (a-) derived from the dissociation of human plasma lipoprotein (a). J Biol Chem. 261, 8712-8718 (1986).
- Brownie, J., et al. The elimination of primer-dimer accumulation in PCR. Nucleic Acids Res. 25, 3235-3241 (1997).
- Alton, E., Inyoul, L., Leroy, H., David, G., Kai, W. Extracellular microRNA: a new source of biomarkers. Mutat Res. 717 (1-2), 85-90 (2011).
- Stefanie, S. J. Cancer biomarker profiling with microRNAs. Nature Biotechnology. 26, 400-401 (2008).
- Prasun, J. M. MicroRNAs as promising biomarkers in cancer diagnostics. Biomarker Research. 2 (19), (2014).
- Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. Circulating microRNAs: novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease? Circ Res. 110, 483-495 (2012).
- Jonathan, S., Martin, S., Eric, L. miRNA profiling from blood -challenges and recommendations. , www.qiagen.com (2015).
- Francesco, M., Paola, D. C., Anna, T., Jesper, T., Sergio, A., Riccardo, L. R. Normalization of circulating microRNA expression data obtained by quantitative real-time RT-PCR. Brief Bioinform. 3, 1-9 (2015).
- Chen, Y., et al. Circulating microRNAs, novel biomarkers of acute myocardial infarction: a systemic review. World J Emerg Med. 3, 257-260 (2012).
