Summary
متماسك مكافحة ستوكس رامان نثر (CARS) المجهري بناء على الاهتزاز الأصيل من السندات جزيء يسمح التسمية خالية انتقائية كيميائيا تصوير الخلايا الحية. يعرض هذا العمل على تنفيذ تقنية المجهر التكميلية على multiphoton الليزر مجهر المسح المعياري بناء على الفيمتو ثانية تي: ليزر الياقوت والليزر OPO.
Abstract
أصبحت ليزر الياقوت والبصرية مذبذب حدودي (OPO) لتكرار خط ليزر متاحة للعلماء الأحياء: المجاهر ليزر المسح الجمع بين الفيمتو ثانية تي. تم تصميم هذه الأنظمة في المقام الأول لمتعدد القنوات ثنائي الفوتون مضان المجهر. ومع ذلك، من دون أي تعديل، مكملا المجهر الضوئي غير الخطية مثل ثاني التوافقي جيل (SHG) أو الجيل الثالث التوافقي (تي إتش جي) ويمكن أيضا أن يؤديها مع هذا الإعداد، مما يسمح التصوير التسمية خالية من جزيئات منظم أو متوسطة مائي واجهات الدهون. هذه التقنيات هي مناسبة تماما للمراقبة في الجسم الحي، لكنها محدودة في خصوصية الكيميائية. كيميائيا التصوير الانتقائي يمكن الحصول عليها من إشارات الاهتزاز الكامنة على أساس تشتت رامان. يوفر متحد البؤر رامان المجهر القرار المكانية 3D، ولكنه يتطلب متوسط القوة العالية واكتساب الوقت الطويل. للتغلب على هذه الصعوبات، قد سمحت التطورات الحديثة في تكنولوجيا الليزر جمعةاإلمنائية من غير الخطية المجهر الذبذبات الضوئية، ولا سيما متماسك مكافحة ستوكس رامان نثر (CARS). ولذلك فقد ظهرت سيارات المجهر كأداة قوية لتصوير الخلايا البيولوجية والحية، من خلال نسبة الدهون في رسم الخرائط كيميائيا (عن طريق الاهتزاز CH تمتد)، والمياه (عن طريق الاهتزازات تمتد OH)، البروتينات أو الحمض النووي. في هذا العمل، وصفنا تنفيذ تقنية السيارات على يقترن OPO القياسية multiphoton الليزر مجهر المسح. لأنه يقوم على التزامن في الوقت المناسب من خطوط الليزر اثنين عن طريق ضبط طول واحد من مسار شعاع الليزر. نقدم تنفيذ خطوة بخطوة من هذه التقنية على نظام multiphoton القائمة. خلفية أساسية في مجال البصريات التجريبية مفيدة ولا يتطلب نظام عرض المعدات التكميلية باهظة الثمن. نحن لتوضيح أيضا CARS تصوير الحصول على الأغماد المايلين العصب الوركي من القوارض، وتبين لنا أن هذا التصوير لا يمكن أن يؤديها في وقت واحد مع التصوير الضوئي غير الخطية الأخرى، مثل تي القياسيةالتعليم الجامعي الفوتون تقنية مضان وتوليد التوافقي الثاني.
Introduction
أصبح المجهر الضوئي تقنية كبيرة لرؤية تدميري من العمليات الحيوية في الكائنات النظم البيولوجية مع قرار التحت خلوية. مضان المجهر حاليا على النقيض التصوير الأكثر شعبية المستخدمة في الخلايا الحية نظرا لخصوصيته عالية وحساسية 1. وقد ظهرت لوحة كبيرة من تحقيقات الفلورسنت (الأصباغ الخارجية والبروتينات المشفرة وراثيا، النانوية أشباه الموصلات). وقد ازدهرت مختلف عينة الإضاءة التقنيات التي تعتمد الفلورسنت (مثل المجهر متحد البؤر أو اثنين الفوتون) لإجراء التصوير 3D وللحد من العيب الرئيسي لهذا الأسلوب الذي photobleaching من 2. وتشمل القيود الأخرى شرط وضع العلامات fluorophore لأن معظم الأنواع الجزيئية ليست الفلورسنت جوهريا، وبالتالي هذه fluorophores يتعين عرضه بشكل مصطنع في العينة المصورة. قد يكون هذا التلاعب الاصطناعي التخريبية خاصة بالنسبة للجزيئات صغيرة أو يحرض عاءential الصور سمية. هذه الأسباب تجعل مضان المجهر ليس مناسبة تماما لالمجراة في عمليات الرصد. وبالتالي، فإن استخدام تقنيات التصوير البصرية مع حساسية عالية والتناقضات الجزيئية محددة دون استخدام جزيئات الفلورسنت مرغوب فيه للغاية في العلوم الطبية الحيوية.
ظهرت عدة تقنيات التصوير البصرية اللاخطية دون وضع العلامات أو تلطيخ، بما في ذلك الجيل الثاني التوافقي (SHG) 3،4 والجيل الثالث التوافقي (THG) 5. وقد استخدمت مجموعات المساعدة الذاتية المجهر إلى الترتيبات الهيكلية صورة على مستوى supramolecular مثل الأنابيب الدقيقة أو الكولاجين 6. يتم إنشاء THG من التغاير البصرية مثل واجهة بين وسط مائي والدهون (7). وقد تجلى THG أيضا إلى صورة المايلين 8،9. وفي كلتا الطريقتين يمكن تنفيذها على مضان المجهر ثنائي الفوتون وتتطلب شعاع ليزر واحد فقط. ومع ذلك فإنها تتطلب كثافة الليزر عالية الطاقة (عادة 50ميغاواط في 860 نانومتر للمجموعات المساعدة الذاتية 10، 25 - 50 ميغاواط في 1180 نانومتر لTHG 9)، والتي هي ضارة في عينات المعيشة، وليس لتوفير خصوصية الكيميائية المطلوبة للا لبس فيه صورة الهياكل البيولوجية المحددة.
كيميائيا التصوير الانتقائي يمكن الحصول عليها من المتأصلة إشارات اهتزاز الجزيئية على أساس تشتت رامان. عندما شعاع من ضوء يضرب المسألة، الفوتونات يمكن استيعابها ومتناثرة من الذرات أو الجزيئات. ومعظم الفوتونات المنتشرة لها نفس الطاقة، أي تردد، كما الفوتونات الحادث. وتسمى هذه العملية نثر رايلي. ومع ذلك، سوف تكون مبعثرة عدد قليل من الفوتونات في تردد بصري يختلف عن تردد الفوتونات الحادث، أي مع عملية نثر غير مرن دعا رامان نثر. الفرق في الطاقة تأتي من الإثارة وسائط الذبذبات اعتمادا على التركيب الجزيئي والبيئة. لذلك، رامان عفوية نثر الأقليمايديس التصوير انتقائية كيميائيا كما الجزيئات المختلفة لها ترددات الذبذبات محددة. ومع ذلك فإنه محدود بسبب اشارة ضعيفة للغاية. وقد تم تطوير متحد البؤر رامان المجهري ويوفر القرار المكانية 3D، ولكنه يتطلب ارتفاع متوسط السلطة والاستحواذ وقت طويل لل11. للتغلب على هذه الصعوبات، وقد سمحت التطورات الحديثة في تكنولوجيا الليزر صعود غير الخطية المجهر الذبذبات الضوئية، ولا سيما متماسك نثر المضادة للستوكس رامان (CARS) 11،12،13.
السيارات هي ثالث ترتيب عملية البصرية اللاخطية. ثلاثة أشعة الليزر، ويتألف من شعاع مضخة في تردد ω P، وتركز شعاع ستوكس في تردد ω S وشعاع مسبار (وهي في معظم الأحيان مضخة) في عينة وتوليد شعاع مكافحة ستوكس في تردد ω AS = ( 2ω P - ω S) 14. إشارة المضادة للستوكس يمكن أن تتعزز بشكل كبير عندما يكون الفرق ترددبين المضخة وستوكس الحزم يتم ضبطها لرامان الجزيئي الاهتزاز Ω R = (ω ف - ω S). ويستند إشارة سيارات على تفاعل الفوتون متعددة. وبالتالي فإنه يولد أوامر إشارة متماسكة من حجم أقوى من تشتت رامان عفوية.
وقد تجلى CARS المجهر لأول مرة بشكل تجريبي من قبل دنكان وآخرون. 15. تسومبوش آخرون تحسين ثم هذه التقنية، وباستخدام اثنين تركز بالقرب من الأشعة تحت الحمراء أشعة الليزر الفيمتو ثانية مع عدسة الهدف من الفتحة العددية العالية، مما يتيح للمرحلة حالة مطابقة السيارات وتجنب ثنائي الفوتون غير الرنانة الخلفية 16. ولذلك فقد ظهرت سيارات المجهر كأداة قوية ليعيش الخلايا والأنسجة والتصوير، عن طريق الكشف كيميائيا جزيئات مثل الدهون (عن طريق الاهتزاز CH تمتد) 17،18 والمياه (عن طريق الاهتزازات تمتد OH)، والبروتينات، الحمض النووي في الخلايا الحية 19،20 ولكن أيضا بالديوتيريوم مركب كيميائيالصورة للصناعات الدوائية 21 وتطبيقات التجميل 22.
فإن القيود الرئيسية من المجهري غير الخطية تنبع من تعقيد وتكلفة من المصادر الضوئية. يتطلب نظام السيارتين الليزر الطول الموجي الانضباطي مع فترات نبض قصيرة ومع القطارات نبض متزامنة زمنيا ومكانيا. واستندت السيارات في وقت مبكر المجاهر على اثنين بيكو ثانية متزامنة تي: ليزر الياقوت 20. تم الحصول CARS التصوير أيضا من واحد الفيمتو ثانية تي: ليزر الياقوت توليد مصدر الضوء supercontinuum 23. في الآونة الأخيرة، ومصادر الليزر تتكون من واحد الفيمتو ثانية تي: لقد تم استخدام ليزر الياقوت ضخ مؤشرات التذبذب حدودي البصرية الانضباطي (OPO) للسيارات المجهر. هذا الإعداد يسمح جوهريا مزامنة مؤقتا الحزم مع فرق من التردد بين المضخة وشعاع ستوكس تغطي كامل طيف الذبذبات الجزيئي 24. وبالإضافة إلى ذلك، المجاهر المسح بالليزر على أساس turn-تتوفر الآن لعدم الفيزياء مفتاح ليزر خ م وOPO، وتستخدم في المقام الأول لمدة الفوتون مضان (مدفوعات نهاية الخدمة). إمكانات هذه مجموعة عمليات يمكن أن تتعزز بشكل كبير دون الحاجة إلى استثمارات تكميلية عن طريق دمج الآخرين التصوير الضوئي غير الخطية، لأن كل الخطية (NLO) التصوير طريقة حساسة للهياكل أو جزيئات محددة. لذا المتعدد الوسائط NLO التصوير تستفيد من إمكانات NLO المجهري لعينات بيولوجية معقدة 25. وقد سمح للاقتران من هذه التقنيات في تحقيق العديد من الأسئلة الحيوية، ولا سيما على ايض الدهون والجلد أو سرطان تطوير 26، والهيكل العظمي تنمية العضلات 27، آفات تصلب الشرايين 28. وعلاوة على ذلك، فإن تنفيذ شعاع الليزر المسح الضوئي مع CARS يعطي القدرة على التصوير ارتفاع معدل، أي أداة جذابة لدراسة العمليات الديناميكية في الجسم الحي.
والهدف من هذا العمل هو إظهار كل خطوة لتنفيذ رتقنية انه CARS على multiphoton الليزر مجهر المسح القياسية. ويستند المجهر على تي fsec: ليزر الياقوت وOPO (التي تضخها تي: ليزر الياقوت) التي تديرها برنامج لعلماء الأحياء. تم تنفيذ التكامل عن طريق ضبط طول واحد من مسار شعاع الليزر من أجل مزامنة في الوقت شعاعين. وصفنا تنفيذ خطوة بخطوة من هذا الأسلوب الذي يتطلب الخلفية الأساسية فقط في مجال البصريات التجريبية. نحن لتوضيح أيضا CARS التصوير الحصول على الأغماد المايلين العصب الوركي من القوارض، ونظهر هذا التصوير لا يمكن أن يؤديها في وقت واحد مع الآخرين التصوير الضوئي غير الخطية، مثل تقنية مضان ثنائي الفوتون القياسية والجيل الثاني التوافقي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
الشكل 1. عرض تخطيطي من العام انشاء ويشمل تي: الياقوت (680 - 1080 نانومتر) وOPO (1050 - 1300 نانومتر) ليزر، خط تأخير مع المرايا 4 (M 1 إلى M 4)، الذبذبات السريعة، والثنائي الضوئي واثنين من قزحية العين الثابتة أغشية I 1 و I 2. مرايا م 2 وM 3 يتم إصلاحها في مرحلة الترجمة الخطية مواتية لتغيير طول خط تأخير مع قرار ميكرومتر. 660 - كان وضعه 685 نانوميتر تمرير مرشح أمام أنبوب مضخم (PMT) المستخدمة للسيارات التصوير الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
1. بدء التشغيل من نظام ليزر
- تحقق من أن منظمة الشفافية الدولية: تم تعيين الطول الموجي الياقوت إلى 800 نانومتر أو تحديدهذا الطول الموجي على تي: الياقوت تحكم امدادات الطاقة. بدوره الرئيسي من الاستعداد ليوم للتبديل على تي: ليزر الياقوت.
- بدوره على الليزر OPO في الجزء الخلفي من وحدة تحكم OPO وفتح تي: مصراع الياقوت على تي: الياقوت تحكم امدادات الطاقة.
- التبديل على الكمبيوتر اللوحي إلى ضخ ما يصل OPO. انقر على الرموز OPO متصل ومتصلة عن بعد على اللوحة. انتظر 30-40 دقيقة لالاحماء.
- التبديل على جهاز الكمبيوتر المجهر وتشغيل مفاتيح "مجهر مكونات". بدء تشغيل البرنامج بالنقر المزدوج على أيقونة على سطح المكتب.
- في برنامج اكتساب التبويب، فتح أداة الليزر في إدارة الإعداد للعمل على حد سواء ليزر من البرنامج. اختر تي: ليزر الياقوت في والليزر OPO تشغيل. تحقق قيمة قوة الليزر الضوئية (القيم النموذجية من 3700 ميغاواط في 800 نانومتر و 700 ميغاواط في 1000 نانومتر).
- لتكوين مسار الشعاع والليزر،فتح أداة مسار الضوء في مجموعة أداة إدارة إعداد ومراجعة المربع أنبوب مضخم الأول (PMT).
- للتحقق من منظمة الشفافية الدولية: بقعة الليزر الياقوت في إخراج هذا الهدف، فتح أداة القنوات في مجموعة أداة اكتساب المعلمة. حدد تي: السلطة الياقوت في قيمة منخفضة (حوالي 1٪)، والحد من الربح إلى 0 (لا حاجة لصورة في هذه المرحلة) وانقر على زر المستمر لبدء إجراء المسح الضوئي لإطلاق شعاع الليزر من خلال الهدف المجهر. تحقق من وجود بقعة حمراء من خلال الملاحظة المباشرة عن طريق وضع بطاقة العرض يزر الأشعة تحت الحمراء في إخراج الهدف المجهر الهواء (10X).
- للتحقق من بقعة الليزر OPO، ووقف الفحص من منظمة الشفافية الدولية: الياقوت الليزر عن طريق النقر على زر إيقاف. حدد السلطة OPO في قيمة منخفضة في إطار القنوات وانقر على Cزر ontinuous.
2. إعدادات مجهر
- وضع يدويا المرآة مزدوج اللون مع طول موجة قطع في 760 نانومتر في شريط التمرير sideport في الفضاء لا نهاية فوق الأنفية الموضوعية لإطلاق ضوء ما يصل إلى 760 نانومتر من العينة إلى هذه الفرق في الكشف غير descanned وضع (NDD).
- ضبط عصابة ضيقة تمرير مرشح في 660-685 نانومتر في عاكس مكعب NDD أمام PMT1 لتسجيل فقط CARS إشارة في 670 نانومتر إلى إنتاج النتائج المعروضة في هذا العمل.
- وضع مرشح ضيقة النطاق تتراوح 500-550 نانومتر في المكعب عاكس NDD أمام PMT3 للمراقبة مضان من المايلين. وضع مرشح ضيقة النطاق تتراوح 565-610 نانومتر في المكعب عاكس أمام PMT4 للمراقبة مجموعات المساعدة الذاتية.
- لتحديد في البرنامج تسجيل إشارة على كاشف مع المخصص الفرقة تمرير مرشح، فتح أداة مسار الضوء في القائمة إدارة الإعداد علامة التبويب اكتساب. تفعيل PMT المطلوب (خانة الاختيار) واختر لونا لهذه القناة. في هذا العمل، وقد تم اختيار اللون الأخضر للسيارات والأحمر لمضان وأرجواني لمجموعات المساعدة الذاتية.
3. الزمني التزامن
ملاحظة: أشعة الليزر اثنين تنبع من نفس تي: تأخر ليزر الياقوت ولكن شعاع OPO عند إنشائه حتى لا تتم مزامنة شعاعين في الوقت المناسب عندما تصل المجهر. والهدف هنا هو تأخير واحد من شعاعين لإعادة مزامنة-منها في الوقت المناسب قبل ان تصل الى المجهر.
- التواصل مع الكابلات BNC قناة الإدخال CH1 من الذبذبات إلى الإخراج ليزر BNC الكهربائية (سينك. آوت). ربط مدخلات قناة CH2 من الذبذبات إلى الثنائي الضوئي واختيار القنوات CH1 كقناة الزناد عن طريق الضغط على MENU الزناد، ثم إلى القائمة الرئيسية زر المصدر ثم الزر الجانبية القائمة التي تتطابق مع القناة المختارة CH1.
- موقف وإصلاح يحتوي على مشاركات تصاعد البصرية والضوئي في طائرة الوصل من هدف المجهر الهواء (10X) أو في مسار الشعاع المجهر بعد إزالة الهدف. ملاحظة: إذا لزم الأمر، وإزالة المكثف والناقل لها.
- في أداة القنوات (مجموعة أداة اكتساب المعلمة)، تعريف منظمة الشفافية الدولية: الطول الموجي لليزر الياقوت في 830 نيوتن متر عند طاقة منخفضة (أي أقل من 1٪ من القوة الكاملة). في أداة الوضع اكتساب، والحد من منطقة المسح الضوئي إلى نقطة واحدة من أجل إلقاء الضوء على الثنائي الضوئي مع أصغر شعاع. التبديل على المسح الضوئي ليزر عن طريق النقر على زر المستمر.
- الصحافة AUTOSET على لوحة الذبذبات أمام يدويا ونقل موقف الضوئي للحصول على القطارات نبض على الشاشة. اضغط على زر تشغيل / إيقاف لتجميد الشاشة.
- لحفظ نسخة من العرض الذبذبات، اضافة الى وجود 3.5بوصة القرص المرن في محرك الأقراص المرنة أو ربط ميناء GPIB على اللوحة الخلفية للكمبيوتر. ثم اضغط SHIFT ورقيا القائمة، اضغط على شكل (الرئيسي) لتحديد شكل صورة TIFF وتحديد في القائمة ميناء قناة الانتاج. اضغط على زر ورقيا لتسجيل عرض الذبذبات القطارات نبض تي: ليزر الياقوت.
- إيقاف تي: المسح الضوئي ليزر الياقوت عن طريق النقر على زر إيقاف. بالنقر على القنوات أداة تحديد إشارة OPO في 1107 قوة نانومتر والمنخفضة. التبديل على المسح الضوئي ليزر OPO وتسجيل القطارات نبضة ليزر OPO على الذبذبات. إيقاف الفحص OPO الليزر.
- قارن التحول الزمني بين منظمة الشفافية الدولية: الياقوت وإشارات OPO.
ملاحظة: التحول التحول ر الزمني يعطي طول الخط تأخير DelayLine L التي لابد من تنفيذها بعد المعادلة: L delayLine = ج5؛ ر التحول حيث c هي سرعة الضوء. - اختيار واحد من خطوط الليزر.
ملاحظة: في هذا العمل، وتي: تم اختيار خط ليزر الياقوت لمساحة حرة كانت متاحة بالقرب من خط ليزر. وبالإضافة إلى ذلك، هذا الاختيار يسمح لتحقيق إعادة التنظيم من خط ليزر مع ضوء الليزر مرئية. - فتح خط ليزر عن طريق إزالة أنابيب واقية في موقف حيث سيتم تنفيذ خط تأخير.
الحذر! ارتداء نظارات السلامة المناسبة وإزالة الأساور سلسلة أو مشاهدة من المعصمين. - اختيار الطول الموجي في المدى المرئي من أجل أن تكون قادرة على مراقبة بسهولة شعاع الليزر (700 نانومتر على سبيل المثال، في انخفاض القوة في أداة القنوات من البرنامج). التبديل على المسح الضوئي ليزر.
- وضع ومع مجموعة المشاركات تصاعد البصرية اثنين القزحية أغشية على طول خط ليزر مفتوح. موقف قزحية العين في الخروج من خط تأخير وتضع القزحية أخرى عند مدخل منظار.
ملاحظة: المؤسسة العامةضوابط riscope من قبل اثنين من المرايا بمحركات يقودها البرامج زاوية مدخل شعاع الليزر في الرأس المسح الضوئي للمجهر المسح بالليزر. - تقليل قزحية الحجاب الحاجز الفتحة وتوفيق أوضاع الحجاب الحاجز لتتناسب مع مسار شعاع الليزر. اصلاحها على الطاولة البصرية. ضبط الوضع الرأسي للثالث غشاء القزحية المحمول، للتحقق من ارتفاع شعاع ليزر في حين تحديد المواقع تباعا المرايا أربعة من خط تأخير.
ملاحظة: هذه الأغشية القزحية بمثابة الرقابة لإجراء إعادة التنظيم التي تبين مسار لمتابعة. - وضع مرآة شنت M1 على مرآة الحركية المدمجة جبل عند مدخل خط تأخير (كما هو موضح في الشكل رقم 1)، وضبط موقفها وتوجهها للحفاظ على ارتفاع شعاع باستخدام قزحية الحجاب الحاجز المحمول. مكان المرايا (شنت أيضا على يتصاعد مرآة الحركية المدمجة) M2 و M3 على 90 درجة على مرحلة الترجمة التي سيتم وضعه في midcourse. الموقف منها لتتناسب مع طول خط تأخير وفقا لحسابات سابقا.
- ضبط اتجاه M2 و M3 مع استخدام قزحية الحجاب الحاجز المحمول. تعيين M4 (الثابتة أيضا على جبل المدمجة) عند مخرج خط تأخير (قبل قزحية I 1 كما هو موضح في الشكل رقم 1) وبعناية ضبط الموقف وزاوية لتتناسب مع مسار شعاع الليزر من خلال اثنين من أغشية قزحية الثابتة.
- ضع بطاقة عرض ليزر في إخراج الهدف المجهر والتحقق من ملف شعاع الليزر من خلال النقر على مستمر لتشغيل المسح الضوئي ليزر. مراقبة قرص مشرق موحد. إذا لزم الأمر، وضبط قليلا اتجاه M4.
- الموقف مرة أخرى الضوئي السريع تحت شعاع الليزر في التركيز طائرة عينة من المجهر. لاحظ التحول الزمني بين منظمة الشفافية الدولية: شعاع ليزر الياقوت وشعاع OPO على الذبذبات.
ملاحظة: إذا لزم الأمر، تغيير طول خط تأخير عن طريق تحريك النظام برمته M2، M3 التي شنت علىمرحلة الترجمة (من دون تغيير الترجمة مرحلة ضبط) لمزامنة كل من البقول. التغييرات من بضعة سنتيمترات يمكن أن يكون مطلوبا.
4. المكانية التداخل من الشعاع
ملاحظة: لإنتاج إشارة سيارات، مطلوب التداخل المكاني للأشعة الليزر اثنين. إضاءة بديلة لكل من الحزم على نفس الخرز الملون في جميع أنحاء مع اثنين من الأصباغ الفلورية مختلفة يمكن استخدامها للإشارة إلى التحول المكاني. يمكن تعديلات دقيقة من المواقف مرآة ثم التقليل من التحول.
- استخدام المجهرية الفلورسنت قبل تركيبه. أو جبل المجهرية في تعليق على الشرائح المجهر نظيفة كما هو موضح أدناه:
- قبل أخذ العينات، ومزيج (على خلاط القشرة أو sonicating) الحل الخرز للتأكد من أن حبات يتم تعليق موحد.
- تطبيق 5 ميكرولتر من تعليق حبة لسطح شريحة وانتشرت مع طرف ماصة. انتظر الحبرية لتجف ثم تطبيق 5 ميكرولتر من جبلجي المتوسطة، مثل الجلسرين والماء أو النفط الغمر على عينة الجافة من الخرز. تغطية عينة مع ساترة وختم ساترة مع الغراء سريع التجفيف أو البارافين ذاب.
- وضع الخرز البوليسترين الفلورسنت ثابتة على شريحة المجهر في إطار الهدف المياه 20X. إضافة بضع قطرات من الماء لغمر الهدف.
- لتحقيق التركيز على الخرز، وفتح علامة التبويب موقع في البرنامج للتبديل من وضع المسح بالليزر إلى الملاحظة المباشرة من العينة مع العين، عن طريق الضغط على زر على الانترنت. فتح أداة بصري لتحديد مرشح مخصصة والتبديل على مصابيح الهالوجين من خلال النقر على الرموز.
- يدويا إزالة مرآة مزدوج اللون في شريط التمرير sideport في الفضاء لا نهاية، واستخدام محرك تركيز المجهر لتركيز طائرة عينة من خلال مراقبة الخرز مع oculars. استبدال المرآة مزدوج اللون.
- في الحدد علامة التبويب، قم بالتبديل إلى وضع المسح بالليزر عن طريق الضغط على زر اتصال. انتقل إلى علامة التبويب اكتساب لتحديد معايير لمسح: تحديد حجم الإطار إلى 512 بكسل، وسرعة المسح الضوئي من 9، وهو المتوسط من 1، عمق قليلا من 8 بت و زيادة منطقة المسح الضوئي إلى أقصى حد.
- في أداة قنوات علامة التبويب اكتساب، إضافة المسار (المسار 1) لو لم يخلق بالفعل. تحديد الطول الموجي في 830 نانومتر، وانخفاض القوة لمنظمة الشفافية الدولية: شعاع ليزر الياقوت ضع علامة على اللون إلى اللون الأخضر في مربع المسار 1 من النافذة القنوات وفي PMT3 أو مربع PMT4 من نافذة مسار الضوء.
- في أداة قنوات علامة التبويب اكتساب، إضافة المسار الثاني (المسار 2). تحديد الطول الموجي في 1107 قوة نانومتر، وانخفاض لشعاع الليزر OPO. وضع علامة في اللون إلى الأحمر في المربع المسار 2 من نافذة القنوات وفي مربع PMT3 من
- ضبط كسب كلا المسارين إلى 600. ثم تطبيق بالتسلسل فحص شعاعين على العينة عن طريق النقر على مستمر.
- لاحظ الصورة في مساحة الشاشة في عرض 2D. في العرض عرض كتلة التحكم الخيار، وضبط كثافة العرض.
ملاحظة: إذا لزم الأمر، تحرك قليلا محرك نركز على العثور على طائرة التركيز من الخرز. ضبط المحاصيل وتكبير الصورة في حبة واحدة أو في مجموعة من الخرز المجاورة.- استخدام وحدة تحكم المنظار إلى تداخل الحزم في الطائرة س ص. في البرنامج، افتح علامة التبويب المحافظة. انقر على خيارات النظام وعرض إطار أداة بمحركات الناظور. استخدام التعديلات الخشنة وغرامة من المرايا منظار للتي: شعاع ليزر الياقوت لمزامنة في الفضاء كلتا الصورتين.
- للتلاعب المنظار، استخدام أشرطة التعديل الأول لرأسي وسكالثانية واحد للحركات الأفقي لشعاع الليزر. تحريك شعاع مع مرآة المدخلات حتى تكون الصورة واضحة قليلا، ثم تعويض عن كثافة الليزر مع مرآة إخراج منظار من خلال النقر على "المدخلات" و "المخرجات".
- من أجل تتداخل عموديا الحزم، في علامة التبويب المحافظة، فتح أداة تلسكوب الموازاة وضبط قيمة المسافة البؤرية للتي: شعاع ليزر الياقوت.
- تحرك بلطف موقف موضوعي العمودي للتحقق من الفرق من التركيز على كل الصور. أو، واتخاذ ض المكدس من العينة عن طريق فتح في علامة التبويب اكتساب الأداة Z-ستاك واختيار معلمات مختلفة (المدى، وعدد من شرائح). الصحافة أورثو في منطقة الشاشة صورة لرؤية الحزم في المقطع العرضي المحوري. تعظيم ض التداخل عن طريق القيام بنفس الإجراء عدة مرات.
5. التعديلات النهائية ومتماسكة لمكافحة ستوكس رامان نثر (CARS) إشارة مراقبة من زيت الزيتون الدكتورoplets
- وضع قطرات من زيت الزيتون على طبق من زجاج وتغطية ذلك من قبل الانزلاق غطاء زجاجي. إضافة بضع قطرات من الماء لغمر الهدف الغمر 20X المياه. التركيز على حافة الانزلاق الغطاء باستخدام oculars (كما هو موضح سابقا في 4.2).
- في أداة قنوات علامة التبويب اكتساب، حدد في المسار رقم 1 الطول الموجي 830 نانومتر لمنظمة الشفافية الدولية: شعاع ليزر الياقوت وفي 1107 نانومتر لOPO. وضع علامة على حد سواء ليزر في المسار رقم 1 للحصول على المسح الضوئي في وقت واحد في كل من الليزر. صلاحيات تعيين في قيمة منخفضة لبداية.
- في إطار مسار ضوء، حدد PMT1. التبديل على المسح الضوئي ليزر عن طريق النقر على زر المستمر. تحرك قليلا من التركيز على توفير ضوء الليزر في طبقة رقيقة النفط.
- إذا لزم الأمر، وزيادة الطاقة الضوئية من كلا الليزر. ضبط كثافة الشاشة في العرض عرض كتلة التحكم الخيار. تحرك ببطء مرحلة الترجمة من خط تأخير حتى تصبح إشارة SIGتعزيز nificantly.
- بعد التحالفات غرامة كاملة، والتحقق ما إذا كان هو حقا CARS إشارة: نقل قليلا مرحلة الترجمة؛ شدة إشارة يجب أن تصبح أضعف. و / أو إيقاف واحد من شعاع الليزر، إما تي: ليزر الياقوت أو OPO. مرة أخرى يجب أن يكون هناك تسوس قوي في شدة مقارنة إشارة سيارات.
- لتحقيق أقصى قدر من إشارة للسيارات، حدد الخيار على برنامج لتوفير قيمة يعني كثافة الصورة كاملة (في وجهة النظر HISTO من علامة التبويب مساحة الشاشة). ضبط الطول الموجي (نانومتر قليل)، ثم س، ص، ض مواقف للتركيز شعاع لتعظيم قيمة كثافة يعني.
6. الضميمة من مسار الضوء من خط تأخير
- منذ يكرس النظام النهائي لغير الفيزيائيين، أرفق مسار الضوء من خط تأخير مع أنابيب أو مربع الضميمة، لتجنب الوصول المباشر إلى غير مرئية ذروة عالية شعاع الليزر السلطة ضارة. الحرص على توفير الوصول إلى مرحلة الترجمةمقبض الباب.
7. الطول الموجي ضبط للسيارات
- استخدام المعادلة
لضبط موجات الليزر إلى الاهتزاز رامان المطلوب. إعادة إنشاء النتائج المعروضة في هذا العمل لCARS صورة إشارة من السندات CH جود تمتد الاهتزاز من 3015 سم -1، حدد λ تي: الياقوت = 830 نانومتر، وλ OPO = 1095 نانومتر.
ملاحظة: رامان ترددات الذبذبات المميزة لوحظ في العينات البيولوجية، مثل المياه، CH السندات يمكن العثور عليها في ايفانز وآخرون 13 أو في إليس وآخرون 29.. - استخدام المعادلة
لتحديد الطول الموجي انبعاث إشارة سيارات. لCH التصوير السندات من قبل السيارات، واختيار مرشح ضيقة النطاق في 670 نانومتر منذ CARS λ = 670 نانومتر مع موجات الليزر عرض 7.1.
ملاحظة: تطبيق الهاتف المحمول للمركباتailable لحساب CARS λ من λ P وλ S القيم (أنظر المرجع 30).
لضبط موجات الليزر إلى الاهتزاز رامان المطلوب. إعادة إنشاء النتائج المعروضة في هذا العمل لCARS صورة إشارة من السندات CH جود تمتد الاهتزاز من 3015 سم -1، حدد λ تي: الياقوت = 830 نانومتر، وλ OPO = 1095 نانومتر. 
لتحديد الطول الموجي انبعاث إشارة سيارات. لCH التصوير السندات من قبل السيارات، واختيار مرشح ضيقة النطاق في 670 نانومتر منذ CARS λ = 670 نانومتر مع موجات الليزر عرض 7.1. 8. مراقبة من السيارات الإشارة والمعشق المايلين من التخفيضات العصب الوركي
ملاحظة: تم إجراء جميع التجارب على الحيوانات وفقا للوائح المؤسسية.
- إعداد التخفيضات العصب الوركي المحورية والطولية على شريحة المجهر كما وردت في أوتشيليك وآخرون. 31.
- إعداد الحل تلطيخ الأحمر fluoromyelin عن طريق تمييع المخزون حل 300 مرات في برنامج تلفزيوني. الفيضانات التخفيضات العصبية مع الحل تلطيخ لمدة 20 دقيقة في RT. إزالة حل ويغسل 3 مرات لمدة 10 دقيقة مع برنامج تلفزيوني.
- ضع التخفيضات في إطار الهدف الغمر بالماء 20X. وضع ساترة. إضافة بضع قطرات من برنامج تلفزيوني لتزج الهدف وضبط بؤرة الهدف هو الحصول على صورة واضحة عن التخفيضات من خلال oculars (كما هو موضح سابقا في 4.2). <li> في المسار 1، حدد تي: الياقوت وOPO الليزر وتحديد الأطوال الموجية ل830 نانومتر و 1095 نانومتر، على التوالي. في إطار مسار ضوء، حدد PMT1 واللون الأخضر.
- في المسار 2، حدد OPO الليزر فقط (الطول الموجي في 1095 نانومتر). في إطار مسار ضوء، حدد PMT4 واللون الأحمر.
- لكل من أشعة الليزر، وتحديد الطاقة المنخفضة وتعيين الربح إلى 600 لبداية. التبديل على المسح بالليزر وضبط المعلمات التالية لتحسين CARS وإشارة مضان يتناقض: القيم السلطة، مرحلة الترجمة مقبض الباب (قليلا جدا)، موجات (قليل نانومتر)، وعرض كثافة.
- لتسجيل الصور النهائية في ارتفاع القرار، وتحديد في أداة الوضع اكتساب المعلمات التالية: حجم الإطار من 1024 بكسل، سرعة المسح الضوئي من 7، المتوسط 4. اضغط على زر المفاجئة لتسجيل صورة واحدة. حفظ الصورة في شكل الملكيةفي لتسجيل الصورة والمعلمات الاستحواذ الكامل.
9. مراقبة من السيارات وإشارات مجموعات المساعدة الذاتية من التخفيضات العصب الوركي
- إعداد العصب الوركي كما وردت في أوتشيليك وآخرون. 31.
- اتبع الإجراء كما هو موضح في جزء 8 للحصول على صورة من خلال oculars ولتحديد CARS المعلمة إشارة (المسار 1).
- في المسار 2، حدد OPO الليزر فقط (الطول الموجي في 1095 نانومتر). في إطار مسار ضوء، حدد PMT3 واللون الأرجواني.
- اتبع الإجراء كما هو موضح في جزء 8 للتبديل على المسح الضوئي ليزر وحفظ صور عالية الدقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تردد القطار نبض القياسية تي: ليزر الياقوت هو عادة حوالي 80 ميغاهرتز. وOPO له نفس تردد منذ يتم ضخها من قبل منظمة الشفافية الدولية: ليزر الياقوت. لذا مطلوب الذبذبات السريعة لللا يقل عن 200 ميغاهيرتز. والضوئي السريع في نطاق مطلوب أيضا 600 إلى 1100 نانومتر. يحدث التحول الزمني الأقصى عندما تي: يتم نقل الياقوت وإشارات OPO من 1 / (2 × 80 × 10 6) = 6.2 نانو ثانية. وهو يطابق إلى أقصى تحول مسار الشعاع من 1.9 متر ويبين الشكل 2 القطار نبض المسجلة من شعاع OPO الليزر (A) ومن منظمة الشفافية الدولية: شعاع ليزر الياقوت دون خط تأخير (ب) ومع خط تأخير المعدل (C ). وبالتالي مزامنة القطارات نبض تقريبا في الوقت المناسب مع خط تأخير تنفيذها كما هو مبين في الشكل 2A و 2C.
خريج "/>
تسجيلات الشكل 2. ليزر النبض قطار للتزامن الزمني تسجيل القطارات نبض في الطائرة عينة المجهر مع الهدف 10X شعاع OPO (A)، ومنظمة الشفافية الدولية: شعاع ليزر الياقوت دون (ب) ومع خط تأخير (C ). المنحنى العلوي من كل المؤامرات الرسم البياني للإشارة تسجل مباشرة من موصل BNC على الجزء الخلفي من تي: ليزر الياقوت (مزامنة خارج الموصل). يتم ضبط الزناد الذبذبات على هذه الإشارة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ويمكن الحصول على التداخل المكاني للشعاعين من التصور من الخرز البوليسترين الفلورسنت ثابتة على رأس شريحة المجهر (الشكل 3A). ويبين الشكل 3B صورة ثلاث حبات المجاورة التي قدمهاالليزر OPO في 1107 نانومتر (أحمر اللون كاذبة) ومن قبل منظمة الشفافية الدولية: الياقوت الليزر على 830 نانومتر (لون كاذبة الأخضر). وقد تم تعويض التحول المكاني بين كل من أشعة الليزر بعد إجراء التزامن المكاني هو موضح سابقا (الشكل 3C).
الشكل 3. التداخل المكاني من الحزم. منظر عام للالمجهرية الفلورسنت (A). الزوم على 3 المجهرية المجاورة. الإضاءة من الخرز في 830 و 1107 نانومتر يظهر التحول المكاني للصور حبة (ألوان كاذبة) (B). بعد س، ص، ض التعديلات، يتم دمج الصور حبة (C). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الاخيرخطوة لتحقيق التكيف الزمني الدقيق لتفعيل السيارات يمكن أن يتحقق بسهولة عن طريق التصوير قطرات زيت الزيتون (التي تحتوي على العديد من السندات CH 32) والتي تتحرك قليلا المرايا من خط تأخير لإتمام التزامن في الوقت المناسب لكلا القطارات نبضة ليزر الشكل 4 معارض الصور لقطرات زيت الزيتون تسليمها من منظمة الشفافية الدولية: الياقوت الليزر الإضاءة فقط (الشكل 4A) ومن الإضاءة OPO فقط (الشكل 4B). كل من الحزم تطبيق في وقت واحد لحث على تعزيز إشارة واضحة (الشكل 4C) في 670 نانومتر، والتي تتطابق مع CARS إشارة من الجوهري الكربون والهيدروجين (CH) تمتد الاهتزاز مع مجموعة الاهتزاز رامان حول 2800 - 3100 سم -1. يختفي CARS إشارة (C) عند تشغيل أحد الحزم يومين. منذ زيت الزيتون يحتوي fluorophores الطبيعية 33، ولا سيما جزيئات الكلوروفيل التي تنبعث منها في نطاق 650-670 نانومتر، وإشارة ضعيفة في الفقرة (أ) و (ب) هي MULعملية مضان tiphoton. شدة هذه الإشارات هي عدة أوامر من حجم أقل من إشارة سيارات. ولذلك، فإنه لا التشويش على قياس إشارة سيارات.
الشكل 4. النهائية التعديلات الزمنية الجميلة للسيارات إشارة تفشي المرض. قطرات زيت الزيتون يمكن أن تستخدم لضبط الوقت في كل من الحزم عن طريق ضبط طول خط تأخير مع مرحلة الترجمة الخطية مع محرك ميكرومتر. قطرات تحت (A) 830 نانومتر ضوء الليزر فقط وتحت (ب) 1107 ضوء نانومتر ليزر تظهر فقط إشارة ضعيفة. تحت إضاءة في وقت واحد (C)، لوحظ واضحا تعزيز إشارة، الموافق إشارة سيارات. الحانات هي مقياس 100 ميكرون. رامان الاهتزاز الذروة في 3015 سم -1. يرجى النقر لهاالبريد لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
غمد المايلين هو بنية البيولوجي التي تنتجها خلايا معينة أن اللفائف والمكثفات غشاء البلازما الخاصة بهم حول محاور الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي والمحيطي 34. هذا غمد وعالي التخصيب في الدهون المختلفة. كنا هنا الأغماد المايلين العصب الوركي على فأرة الحاسوب. تم ملطخة مستعرضة والعصب الوركي المقطع العرضي شرائح طولية لمدة الفوتون التصوير مضان المايلين في 1095 نانومتر كما هو مبين في الشكل 5B والشكل 5E، على التوالي. تم استخدام صبغة حمراء fluoromyelin، التي لديها الانتقائية للالمايلين 35. تم مضيئة هذه العينات في وقت واحد في 830 و في 1095 نانومتر ولوحظ إشارة سيارات (الشكل 5A) والشكل (5D). في الشكل 5A-C، الدوائر تتوافق مع الأغماد المايلين حول محاور (المساحة الفارغة فيجانب الحلقات) في قطع عرضي. كما هو مبين في الشكل 5C و5F، تم العثور على هيكل نفسه في حين تداخل السيارات والصور مضان. نخلص إلى أن مستوى مماثل من التفاصيل يمكن الحصول عليها مع السيارات، وبالتالي من دون استخدام العلامات الفلورية.
الرقم 5. السيارات وملطخة التصوير المايلين انقطاع العصب الوركي. (A) متقاطع و(D) خفض طولية من التسمية خالية سيارات التصوير من الأغماد المايلين. (ب) متقاطع و(E) تخفيضات طولية من نفس العينة ملطخة الصبغة الحمراء fluoromyelin تحت ثنائي الفوتون مضان الإضاءة في 1095 نانومتر. (C) متقاطع و(F) الطولي خفض التداخل في كلتا الصورتين. الحانات هي مقياس 10 ميكرون. وكانت القوى البصرية متوسط 5 ميغاواط في 830 نانومتر و 16ميغاواط في 1095 نانومتر للإشارة سيارات. بلغ متوسط الطاقة الضوئية 8 ميغاواط في 1095 نانومتر لمدة الفوتون التصوير مضان. رامان ذروة الاهتزاز في 2915 سم -1. يختفي CARS إشارة من خلال وقف فحص واحد ليزر أو عن طريق تحريك مرحلة الترجمة من الرنين رامان. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
بالإضافة إلى ذلك إلى CARS التصوير، ونظام المجهر متاح يسمح لتوليد في وقت واحد متناسق الثاني من ألياف الكولاجين على السطح الخارجي للالأعصاب الوركي. هذه الصورة إضافية يتطلب فقط استخدام كاشف مختلفة لتسجيل إشارة في 550 نانومتر (نصف الطول الموجي للOPO) منذ الضيق مرشح الفرقة تمرير في 670 نانومتر يستخدم لتسجيل إشارة CARS الشكل 6 يظهر النقيض من الصورة من الأغماد المايلين هو مبين في اللون الأخضر كاذبة (CARS إشارة علىلاي في الشكل 6A) وتحيط بها ألياف الكولاجين هو موضح في كاذبة اللون الأرجواني (مجموعات المساعدة الذاتية فقط في الشكل 6B). وقد تحقق إشارة CARS مع القوى البصرية متوسط من 4 ميغاواط في 830 نانومتر و 13 ميغاواط في 1095 نانومتر، في حين أنه مطلوب 50 ميغاواط في 1095 نانومتر للحصول على إشارة مجموعات المساعدة الذاتية. لذلك مطلوب أقل بكثير من الطاقة الضوئية للحصول على CARS إشارة بالمقارنة مع مجموعات المساعدة الذاتية أو تي إتش جي (لا يظهر) إشارات في العينات البيولوجية لدينا.
الشكل 6. سيارات ومجموعات المساعدة الذاتية التصوير من الماوس العصب الوركي. (A) السيارات التصوير، (ب) التصوير مجموعات المساعدة الذاتية و (C) تصور في وقت واحد المايلين التي كتبها CARS تصوير (في اللون كاذبة الأخضر) والكولاجين من خلال مجموعات المساعدة الذاتية التصوير (في أرجواني) على الماوس العصب الوركي. وكانت القوى البصرية متوسط 4 ميغاواط في 830 نانومتر و 13 ميغاواط في 1095 نانومتر للسيارات. بلغ متوسط الطاقة الضوئية 50 ميغاواط في 1095نانومتر لمجموعات المساعدة الذاتية. شريط النطاق هو 10 ميكرون. رامان الاهتزاز الذروة في 2915 سم -1. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أصعب جزء من هذا العمل هو التزامن الزمني للأشعة الليزر. فإنه يتطلب الضوئي السريع جنبا إلى جنب مع الذبذبات السريعة، ولكن فقط تداخل الخام في وقت لا يمكن أن يؤديها في البداية. ثم هناك حاجة إلى مزيد من التعديل من عدد قليل سم. وأخيرا، والتحركات ميكرومتر من مرحلة الترجمة الخطية تتيح أداء التسوية غرامة النهائي لطول خط تأخير من أجل تحريك إشارة سيارات. ويحتفظ هذا إشارة في نطاق ضيق من حوالي 20 ميكرومتر، كما لوحظ من قبل ضبط الترجمة محرك المرحلة ميكرون. وهو يطابق إلى ذروة التحول من أشعة ما يقرب من نصف مدة النبضة، أي 140 fsec. التداخل المكاني لاثنين من الحزم الذي هو مطلوب للإشارة سيارات مشابهة لمحاذاة شعاع العادية لهذا الليزر نظام المسح الضوئي المجهر.
لا يمكن أن يتحقق تنفيذ خط تأخير في الأسابيع القليلة قبل البيولوجيين وجود خلفية أساسية في التجربةآل البصريات أو بالتعاون مع علماء الفيزياء. رعاية خاصة يجب أن يؤخذ لاختيار من المرايا لتقليل الخسائر التفكير. إذا كانت غالبية المواد لبناء خط تأخير بأسعار معقولة، والذبذبات التي تتطلب ليست الذبذبات القياسية. وهكذا، منذ أيام قليلة هي كافية لإكمال الإجراء تزامن الزمني، والاقتراض الذبذبات من مختبر الفيزياء يبدو أن الخيار الأفضل. التداخل المكاني يمكن أن يكون مضيعة للوقت لأنه يطالب ضبط العديد من المرايا والعدسات (والتي يمكن بمحركات وفقا لنظام المسح الضوئي ليزر). في وقت سابق نظام CARS الليزر يعتمد على اثنين متزامنة إلكترونيا تي: كان الياقوت الليزر مشكلة مع طويلة المدى (عشرات من دقائق إلى ساعات) الزماني تداخل النبض. وقد تم حل هذه المشكلة تماما مع OPO ضخ مع مصدر الليزر فريدة من نوعها 20،21. مع مثل هذا النظام ليزر، واستخدام البصريات فرضت بقوة، لم يلاحظ أي الزمني المشي من بين المضخة وستوكس الحزم علىأشهر من العملية.
العيوب الرئيسية للتقنية السيارات هو أن إشارة CARS يمكن أن يحدث دون وجود جزيئات الرنانة (من المذيب أو عدسات) 11. هذه الخلفية غير الرنانة يمكن أن تحد من حساسية. وتشمل وسائل للحد من هذه الخلفية تكوين كشف (إلى الأمام أو الوراء كشف)، وخصائص ليزر (الفيمتو ثانية أو بيكو ثانية)، واختيار الحل تستخدم لتزج معالجة موضوعي أو صورة. وكشف المتخلف يسمح للحد من خلفية غير الرنانة 11 كما انه كان يستخدم في هذا العمل (الشكل 1). الفيمتو ثانية تي: توفر ليزر الياقوت شدة ذروة عالية من المرغوب فيه جدا لعمليات البصرية غير الخطية. ومع ذلك، في المجال الطيفي، عرض معظم خطوط رامان هو أصغر من عرض الطيفي للنبض الفيمتو ثانية في حين أنه يناسب العرض الطيفي لنبض بيكو ثانية. وبالتالي فإن استخدام الليزر بيكو ثانية يزيد من نسبة سإشارة الرنانة و لالخلفية غير الرنانة. بالنسبة للسندات CH في الدهون، بسبب كثافة عالية من السندات، الخلفية غير الرنانة لا يكاد يذكر ليزر الفيمتو ثانية. للحد من تأثير الخلفية، ويمكن أيضا أن تطبق على الطرح من صورة مرجع سجلت تحت خارج الرنانة (لم تفعل لهذا العمل).
وعلى الرغم من استخدام أشعة الليزر الأشعة تحت الحمراء القريبة يسمح تغلغل في عمق النسيج (200-300 ميكرون)، وكان عمق الاختراق العملي التي تم الحصول عليها في مجال التصوير العصبية حوالي 50 ميكرون مع التجارب التي أجريت في هذا العمل. لكن هذه المعلمة هي تعتمد اعتمادا كبيرا من الأنسجة البيولوجية تصويرها، ولأن كل الألياف العصبي تتماشى وتتركز في مساحة صغيرة، والأعصاب الطرفية ربما لا تشكل أفضل عينات لتقييم هذا اختراق الضوء. وبالإضافة إلى ذلك، هناك حاجة بضع ثوان لتسجيل صور عالية الدقة (1024 × 1024 بكسل)، والتي يمكن أن تحد من التصور في الجسم الحي
سيارات المجهر يسمح التصوير انتقائية محددة كيميائيا مع قرار قريبة من الحد الحيود. هذه التقنية لا تتطلب أي وضع العلامات، وبما أن منظمة الشفافية الدولية: الياقوت الليزر الانضباطي في الفترة من 700 إلى 1000 نانومتر، والليزر OPO من 1100 إلى 1300 نانومتر، وهو يغطي المنطقة طيف كامل من الاهتزازات الجزيئية في النظم البيولوجية (من 500 إلى 7000 سم -1). وبالتالي، فمن الواجب التطبيق والتمييزية للغاية لالحمض النووي والبروتينات، والدهون، أو الماء، في حين دعت إشارة أقوى من السندات تمتد الدهون CH. يتم تخفيض Photodamage أيضا بسبب انخفاض مستوى قوة الليزر المستخدمة لتوليد إشارة CARS مقارنة مع التصوير الجيل الثاني التوافقي. منذ CARS التصوير يمكن أن تتحقق مع قوة الليزر منخفضة ودون علامات الغازية، وبالتالي هو الأداة المفضلة للدراسات في الجسم الحي.
ليزر المجاهر المسح وايث وتي الفيمتو ثانية: مصدر ليزر الياقوت جنبا إلى جنب مع OPO قد تصبح متاحة إلى حد كبير عن اثنين من الفوتون المجهري في العديد من المختبرات البيولوجية. منذ يتم تنفيذ التزامن المكاني بالفعل في هذه الأنظمة، وإجراء التداخل الزمني لاثنين من الحزم وصفها في هذا العمل يجلب تقنية إضافية من المجهري دون معدات إضافية باهظة الثمن. وهكذا، فإن تعديل انشاء يسمح للتصوير في وقت واحد من الخلايا أو الأنسجة الحية مع الثاني أو الثالث متناسق الجيل (مجموعات المساعدة الذاتية، THG)، مضان ثنائي الفوتون والسيارات. وقد أثبتت سيارات تقنية إمكانات كبيرة للتصوير في الجسم الحي من الحيوانات الحية والسماح للدراسة العمليات الديناميكية (بدون بقع أو التلاعب الجيني). وتشمل التطبيقات الواعدة في الجسم الحي خالية من التسمية غير الغازية التصوير الدهون، وتستخدم على سبيل المثال للتصوير في الوقت الحقيقي من المايلين الخلايا العصبية في أنسجة الحبل الشوكي الحية 36، لدراسة الأمراض المرتبطة الدهون (السمنة، والمزيل وcardiovالأمراض ascular) 37، وآليات اختراق جلد الإنسان 22 أو اضطرابات الجلد 38. ونحن نعتقد أن إدخال تحسينات في المستقبل سوف تتعلق استخدام العدسات موضوعية خاصة، مثل غرين أهداف صغيرة أو الهدف مصغرة لتعزيز عمق الاختراق للإشارة سيارات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS 520D | 500 MHz |
| Photodetector | Thorlabs | DET08C/M, T4290 | 5 GHz InGaAs, 800 - 1,700 nm |
| Ti:Sapphire laser Chameleon Ultra Family II | Coherent | ||
| Optical parametric oscillator OPO Compact Family | APE Berlin | ||
| Axio Examiner microscope LSM 7 MP | Carl Zeiss | ||
| Motorized periscope | Newport | ||
| Objective W Plan-Apochromat 20X/1.0 | Carl Zeiss | ||
| Beam combiner | Carl Zeiss | ||
| Acousto-optic modulator | Carl Zeiss | ||
| OPO power attenuator | Carl Zeiss | ||
| Photomultiplier tube | Carl Zeiss | ||
| ZEN software | Carl Zeiss | ||
| Bandpass filters | Carl Zeiss | LSM BiG 1935-176 | 400 - 480 nm; 500 - 550 nm; 465 - 610 nm |
| Dichroic mirror | Carl Zeiss | Cutoff wavelength 760 nm | |
| Silver mirrors | Newport | 10D20ER.2 | λ/10, 480 - 20,000 nm, Quantity 4 |
| Single-axis translation stage with standard micrometer | Thorlabs | PT1/M | Quantity 1 |
| Aluminium breadboard | Thorlabs | MB1015/M | Quantity 1 |
| Mirror mount | Thorlabs | KMSS/M | Quantity 4 |
| Mirror holder for Ø1" Optics | Thorlabs | MH25 | Quantity 4 |
| Iris diaphragms | Thorlabs | ID8/M | Quantity 3 |
| Protective box | Thorlabs | TB4, XE25L900/M, T205-1.0, RM1S | Quantity 1 |
| Optical posts | Thorlabs | TR40/M, PH50/M, PH75/M, BA2/M | Quantity 8 (lengths depending on the set-up) |
| 661 - 690 nm bandpass filter | Semrock | 676/29 nm BrightLine® single-band bandpass filter | Quantity 1 |
| Fluorescent beads | ThermoFisher | TetraSpeck™ Fluorescent Microspheres Size Kit | |
| Laser viewing card | Thorlabs | IR laser viewing card | |
| Laser safety glass | Newport | LV-F22.P5L07 | |
| FluoroMyelin™ Red Fluorescent Myelin Stain | ThermoFisher | F34652 |
References
- Valeur, B., Berberan-Santos, M. N. Molecular Fluorescence: Principles and Applications. , 2nd Edition, Wiley-VCH Verlag GmbH. (2012).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Moreaux, L., Sandre, O., Mertz, J. Membrane imaging by second-harmonic generation microscopy. JOSA B. 17 (10), 1685-1694 (2000).
- Zoumi, A., Yeh, A., Tromberg, B. J. Imaging cells and extracellular matrix in vivo by using second-harmonic generation and two-photon excited fluorescence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (17), 11014-11019 (2002).
- Yelin, D., Silberberg, Y. Laser scanning third-harmonic-generation microscopy in biology. Opt. Express. 5 (8), 169-175 (1999).
- Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. Three-dimensional high-resolution Second-Harmonic Generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys. J. 81 (1), 493-508 (2002).
- Olivier, N., et al. Cell lineage reconstruction of early zebrafish embryos using label-free nonlinear microscopy. Science. 329 (5994), 967-971 (2010).
- Farrar, M. J., Wise, F. W., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. In vivo imaging of myelin in the vertebrate central nervous system using third harmonic generation microscopy. Biophys. J. 100 (5), 1362-1371 (2011).
- Lim, H., Sharoukhov, D., Kassim, L., Zhang, Y., Salzer, J. L., Melendez-Vasquez, C. V. Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (50), 18025-18030 (2014).
- Strupler, M., Pena, A. M., Hernest, M., Tharaux, P. L., Martin, J. L., Beaurepaire, E., Schanne-Klein, M. C. Second harmonic imaging and scoring of collagen in fibrotic tissues. Opt. Express. 15 (7), 4054-4065 (2007).
- Cheng, J. X., Xie, X. S. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: Instrumentation, theory, and applications. J. Phys. Chem. B. 108 (3), 827-840 (2004).
- Volkmer, A. Vibrational imaging and microspectroscopies based on coherent anti-Stokes scattering microscopy. J. Phys. D: Appl. Phys. 38, R59-R81 (2005).
- Evans, C. L., Xie, X. S. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: chemical imaging for biology and medicine. Annu. Rev. Anal. Chem. 1, 883-909 (2008).
- Mukamel, S. Principles of nonlinear optical spectroscopy. , Oxford University Press. New York. (1995).
- Duncan, M. D., Reintjes, J., Manuccia, T. J. Scanning coherent anti-Stokes Raman microscope. Opt. Lett. 7 (8), 350-352 (1982).
- Zumbusch, A., Holtom, G. R., Xie, X. S. Three-dimensional vibrational imaging by coherent anti-Stokes Raman scattering. Phys. Rev. Lett. 82 (20), 4142-4145 (1999).
- Folick, A., Min, W., Wang, M. C. Label-free imaging of lipid dynamics using Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) and Stimulated Raman Scattering (SRS) microscopy. Curr. Opin. Genet. Dev. 21 (5), 585-590 (2011).
- Wang, P., Liu, B., Zhang, D., Belew, M. Y., Tissenbaum, H. A., Cheng, J. X. Imaging lipid metabolism in live Caenorhabditis elegans using fingerprint vibrations. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 53 (44), 11787-11792 (2014).
- Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy. Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 507-530 (2011).
- Cheng, J. X., Jia, Y. K., Zheng, G., Xie, X. S. Laser-scanning coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy and applications to cell biology. Biophys J. 83 (1), 502-509 (2002).
- Chiu, W. S., Belsey, N. A. N., Garrett, L., Moger, J., Delgado-Charro, M. B., Guy, R. H. Molecular diffusion in the human nail measured by stimulated Raman scattering microscopy. Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, 7725-7730 (2015).
- Chen, X., Grégoire, S., Formanek, F., Galey, J. -B., Rigneault, H. Quantitative 3D molecular cutaneous absorption in human skin using label free nonlinear microscopy. J. of Control. Release. 200, 78-86 (2015).
- Kano, H., Hamaguchi, H. In vivo multi-nonlinear optical imaging of a living cell using a supercontinuum light source generated from a photonic crystal fiber. Opt. Express. 14 (7), 2798-2804 (2006).
- Brustlein, S., Ferrand, P., Walther, N., Brasselet, S., Billaudeau, C., Marguet, D., Rigneault, H. Optical parametric oscillator-based light source for coherent Raman scattering microscopy: practical overview. J. Biomed. Opt. 16 (2), 021106 (2011).
- Chen, H., et al. A multimodal platform for nonlinear optical microscopy and microspectroscopy. Opt. Express. 17 (3), 1282-1290 (2009).
- Yue, S., Slipchenko, M. N., Cheng, J. X.
- Sun, Q., Li, Y., He, S., Situ, C., Wu, Z., Qu, J. Y. Label-free multimodal nonlinear optical microscopy reveals fundamental insights of skeletal muscle development. Biomed Opt Express. 5 (1), 158-166 (2013).
- Le, T. T., Langohr, I. M., Locker, M. J., Sturek, M., Cheng, J. X. Label-free molecular imaging of atherosclerotic lesions using multimodal nonlinear optical microscopy. J. Biomed. Opt. 12 (5), 054007 (2007).
- Ellis, D. I., Cowcher, D. P., Ashton, L., O'Hagana, S., Goodacre, R. Illuminating disease and enlightening biomedicine: Raman spectroscopy as a diagnostic tool. Analyst. 138, 3871-3884 (2013).
- A•P•E Angewandte Physik & Elektronik GmbH. , Germany. Available from: http://www.ape-berlin.de/en/page/calculator (2015).
- Ozçelik, M., et al. Pals1 is a major regulator of the epithelial-like polarization and the extension of the myelin sheath in peripheral nerves. J Neurosci. 30 (11), 4120-4131 (2010).
- Heinrich, C., Hofer, A., Ritsch, A., Ciardi, C., Bernet, S., Ritsch-Marte, M. Selective imaging of saturated and unsaturated lipids by wide-field CARS-microscopy. Opt. Express. 16 (4), 2699-2708 (2008).
- Kyriakidis, N. B., Skarkalis, P. Fluorescence spectra measurement of olive oil and other vegetable oils. J. AOAC Int. 83 (6), 1435-1439 (2000).
- King, R.
- Monsma, P. C., Brown, A. FluoroMyelin Red is a bright, photostable and non-toxic fluorescent stain for live imaging of myelin. J. Neurosci. Methods. 209 (2), 344-350 (2012).
- Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. X. Coherent anti-stokes Raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal tissues. Biophys. J. 89 (1), 581-591 (2005).
- Wang, H. W., Fu, Y., Huff, T. B., Le, T. T., Wang, H., Cheng, J. X. Chasing lipids in health and diseases by coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. Vib. Spectrosc. 50 (1), 160-167 (2009).
- Jung, Y., Tam, J., Jalian, H. R., Anderson, R. R., Evans, C. L. Longitudinal, 3D in vivo imaging of sebaceous glands by coherent anti-stokes Raman scattering microscopy: normal function and response to cryotherapy. J. Invest. Dermatol. 135 (1), 39-44 (2015).
