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Implementazione di un sistema coerente anti-Stokes Raman Scattering (CARS) su un Ti: zaffiro e OPO laser basata su standard Laser Scanning Microscope

Published: July 17, 2016 doi: 10.3791/54262
Automatic Translation
*1, *2,3, 1,5, 4, 1
1INSERM U1051, Institut des Neurosciences de Montpellier (INM), Université de Montpellier, 2Université de Nîmes, 3CNRS, IES, UMR 5214, 4Aix-Marseille Université, CNRS, École Centrale Marseille, Institut Fresnel, UMR 7249, 5Montpellier RIO Imaging (MRI)
* These authors contributed equally

Summary

Coherent dispersione anti-Stokes Raman (CARS) microscopia a base di vibrazione intrinseca di obbligazioni molecola permette chimicamente selettivo imaging cellulare dal vivo senza etichetta. Questo lavoro presenta l'implementazione di una tecnica di microscopia complementare su un microscopio a scansione laser multifotone standard basato su un femtosecondi laser Ti: zaffiro ed un laser OPO.

Abstract

La scansione laser microscopi conciliano un femtosecondi laser Ti: zaffiro e un ottica oscillatore parametrico (OPO) per duplicare la linea laser si sono resi disponibili per i biologi. Questi sistemi sono progettati principalmente per microscopia di fluorescenza a due fotoni multicanale. Tuttavia, senza alcuna modifica, complementare microscopia ottica non lineare come seconda armonica generazione (SHG) o terza generazione armonica (THG) può essere eseguita anche con questo set-up, permettendo l'imaging libera-label di molecole strutturate o medio acquosa interfacce di lipidi. Queste tecniche sono adatti per l'osservazione in vivo, ma sono limitate in specificità chimica. Chimicamente immagini selettiva può essere ottenuta da segnali di vibrazione intrinseche basate su Raman. Confocale microscopia Raman fornisce una risoluzione spaziale in 3D, ma richiede elevata potenza media e tempo di acquisizione a lungo. Per superare queste difficoltà, i recenti progressi nella tecnologia laser hanno permesso lo sviluppo della microscopia vibrazionale ottica non lineare, in particolare coerente anti-Stokes scattering Raman (CARS). CARS microscopia ha quindi emerso come un potente strumento per l'imaging cellulare biologica e dal vivo, da lipidi chimicamente mappatura (attraverso la vibrazione CH tratto), acqua (attraverso OH tratto vibrazioni), proteine ​​o DNA. In questo lavoro, si descrive l'applicazione della tecnica di automobili su un microscopio a scansione laser multifotonica OPO-accoppiato di serie. Essa si basa sulla sincronizzazione nel tempo delle due linee laser regolando la lunghezza di uno dei percorso del raggio laser. Presentiamo un'implementazione passo-passo di questa tecnica su un sistema multiphoton esistente. Un fondo di base ottica sperimentale è disponibile e il sistema presentato non richiede attrezzature supplementari costose. Illustriamo anche CARS di imaging ottenuti su guaine mieliniche del nervo sciatico di roditori, e dimostriamo che questa immagini può essere eseguito simultaneamente con altri imaging ottico non lineare, come ad esempio t di seriewo-photon tecnica a fluorescenza e la generazione di seconda armonica.

Introduction

La microscopia ottica è diventata una tecnica importante per la visualizzazione non distruttiva dei processi dinamici nei sistemi biologici viventi con una risoluzione sub-cellulare. Microscopia a fluorescenza è attualmente il contrasto delle immagini più popolare usato in cellule vive per la sua elevata specificità e sensibilità 1. Una grande tavolozza di sonde fluorescenti è emerso (coloranti esogeni, proteine ​​geneticamente codificate, nanoparticelle di semiconduttori). Varie tecniche fluorescenti a base di illuminazione del campione sono fiorite (ad esempio la microscopia confocale o due fotoni) per eseguire l'imaging 3D e ridurre un inconveniente principale di questa tecnica che viene photobleaching 2. Altre limitazioni includono il requisito di etichettatura fluoroforo perché la maggior parte delle specie molecolari non sono intrinsecamente fluorescenti e quindi questi fluorofori essere introdotto artificialmente nel campione esaminato. Questa manipolazione artificiale può essere dirompente soprattutto per le piccole molecole o induce pentolaziale foto-tossicità. Queste ragioni rendono la fluorescenza non microscopia adatto per vivo in-osservazioni. Quindi, l'uso di tecniche di imaging ottico con elevata sensibilità e contrasto molecolari specifici senza l'uso di molecole fluorescenti è altamente auspicabile nella scienza biomedica.

Diverse tecniche di imaging ottici non lineari senza etichettatura o colorazione sono emersi, tra seconda armonica generazione (SHG) 3,4 e la generazione di terza armonica (THG) 5. SHG microscopio è stato utilizzato per dispositivi strutturali immagine a livello sopramolecolare quali microtubuli o collagene 6. THG è generato dalla eterogeneità ottici quali interfaccia tra un mezzo acquoso e lipidi 7. THG è stato dimostrato anche per l'immagine mielina 8,9. Entrambe le tecniche possono essere implementate su un microscopio a fluorescenza a due fotoni e richiedono solo raggio laser. Tuttavia essi richiedono intensità del laser ad alta potenza (tipicamente 50mW a 860 nm per SHG 10, 25 - 50 mW a 1.180 nm per THG 9), che è deleterio in campioni di vita, e non forniscono la specificità chimico che è necessario per inequivocabilmente immagine strutture biologiche specifiche.

Chimicamente immagini selettiva può essere ottenuta da segnali di vibrazione molecolari intrinseche basate su Raman. Quando un fascio di luce colpisce la materia, i fotoni possono essere assorbiti e dispersi da atomi o molecole. La maggior parte dei fotoni sparsi avranno la stessa energia, cioè, la frequenza, come i fotoni incidenti. Questo processo è chiamato scattering di Rayleigh. Tuttavia, un piccolo numero di fotoni saranno disperse ad una frequenza ottica diversa dalla frequenza dei fotoni incidenti, cioè un processo di scattering anelastico chiamato Raman. La differenza di energia proviene dalla eccitazione di modi vibrazionali seconda struttura molecolare e ambiente. Pertanto, Raman spontanea dispersione providi di imaging chimicamente selettivo come molecole diverse hanno specifiche frequenze vibrazionali. Tuttavia è limitato a causa del suo segnale estremamente debole. Confocal microscopia Raman è stato sviluppato e fornisce risoluzione spaziale 3D, ma richiede media alta potenza ed acquisizione lungo 11. Per superare queste difficoltà, i recenti progressi nella tecnologia laser hanno permesso la nascita della microscopia vibrazionale ottica non lineare, in particolare coerente dispersione anti-Stokes Raman (CARS) 11,12,13.

Cars è un processo ottico non lineare del terzo ordine. Tre raggi laser, composto da un fascio di pompa a ω frequenza P, un fascio Stokes alla frequenza ω S e un fascio sonda (più spesso riconducibile pompa) sono focalizzati in un campione e generano un fascio di anti-Stokes a frequenza ω AS = ( 2ω P - ω S) 14. Il segnale anti-Stokes può essere notevolmente migliorata quando la differenza di frequenzatra la pompa ed il Stokes travi è sintonizzata una Raman molecolare vibrazioni Ω R = (ω P - ω S). segnale CARS si basa sull'interazione multipla fotone. Esso genera pertanto un coerente ordini di grandezza più forte di Scattering Raman spontanea di segnale.

AUTO microscopio è stato dimostrato sperimentalmente da Duncan et al. 15. Zumbusch et al. Migliorato poi la tecnica, utilizzando due fasci laser focalizzati femtosecondi vicino infrarosso con una lente obiettivo di alta apertura numerica, permettendo la condizione di accordo di fase di autoveicoli e evitando i due fotoni sfondo non risonante 16. CARS microscopia ha quindi emerso come un potente strumento per l'imaging cellulare e dei tessuti dal vivo, rilevando chimicamente molecole come lipidi (tramite vibrazioni CH tratto) 17,18, acqua (attraverso OH tratto vibrazioni), proteine, DNA nelle cellule vive 19,20 ma anche deuterato composto chimicos per farmaceutiche 21 e applicazioni cosmetiche 22.

La maggiore limitazione della microscopia non lineare deriva dalla complessità e il costo delle sorgenti ottiche. Un sistema AUTO richiede due laser sintonizzabili lunghezza d'onda con durate di impulso breve e con treni di impulsi temporalmente e spazialmente sincronizzati. Automobili in anticipo microscopi erano basati su due picosecondo sincronizzato Ti: zaffiro laser 20. AUTOMOBILI di imaging è stato ottenuto anche da un singolo femtosecondi laser Ti: zaffiro generare una fonte di luce supercontinuo 23. Recentemente, sorgenti laser composti da un unico femtosecondi laser Ti: zaffiro pompare un sintonizzabile ottici oscillatori parametrici (OPO) sono stati utilizzati per la microscopia AUTOMOBILI. Questa configurazione permette intrinsecamente temporalmente sincronizzato travi con una differenza di frequenza tra la pompa e il fascio Stokes copre l'intero spettro vibrazionale molecolare 24. Inoltre, microscopi a scansione laser basata su un fatturatoKEY Laser FS e un OPO, utilizzato principalmente per due fotoni di fluorescenza (TPF) sono ora disponibili per i non-fisici. Il potenziale di questi set-up può essere notevolmente migliorata senza richiedere investimenti supplementari per l'incorporazione di altri imaging ottico non lineare, dal momento che ogni non lineare (NLO) modalità di imaging è sensibile alle strutture o molecole specifiche. L'imaging multimodale NLO sfrutta quindi il potenziale di NLO microscopia per i campioni biologici complessi 25. L'accoppiamento di queste tecniche ha permesso l'indagine di molte questioni biologiche, in particolare sul metabolismo lipidico, pelle o cancro di sviluppo 26, lo sviluppo muscolare scheletrico 27, 28 lesioni aterosclerotiche. Inoltre, l'implementazione di scansione a raggio laser con CARS dà la possibilità di imaging ad alta frequenza, cioè, uno strumento attraente per studiare processi dinamici in vivo.

Lo scopo di questo lavoro è quello di mostrare ogni passo per implementare ttecnica che CARS su un microscopio a scansione laser multifotonica standard. Il microscopio è basato su Ti fsec: laser zaffiro ed un OPO (pompato dal Ti: zaffiro laser) azionato da un software per biologi. L'integrazione è stata effettuata regolando la lunghezza di uno dei percorso del raggio laser per sincronizzare nel tempo i due fasci. Descriviamo l'implementazione passo-passo di questa tecnica, che richiede soltanto background basic in ottica sperimentali. Illustriamo anche CARS Imaging ottenuti su guaine mieliniche del nervo sciatico di roditori, e mostriamo questo l'imaging può essere eseguito simultaneamente con altri imaging ottico non lineare, come ad esempio la tecnica della fluorescenza a due fotoni di serie e di seconda armonica generazione.

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Protocol

Figura 1
Figura 1. Rappresentazione schematica del set-up generale Include il Ti:. Zaffiro (680 - 1.080 nm) e la OPO (1.050 - 1.300 nm) laser, la linea di ritardo con i 4 specchi (M 1 a M 4), l'oscilloscopio veloce, il fotodiodo e due diaframma fisso diaframmi I 1 e I 2. Specchi M 2 e M 3 sono fissati su un palco traslazione lineare permette di modificare la lunghezza della linea di ritardo con risoluzione micrometrica. A 660 -. Filtro passa banda nm 685 è stato posizionato davanti al tubo fotomoltiplicatore (PMT) utilizzato per l'imaging AUTOMOBILI prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

1. Avvio del sistema laser

  1. Verificare che il Ti: zaffiro lunghezza d'onda è impostato su 800 nm o definirequesta lunghezza d'onda sulla Ti: zaffiro controllore di alimentazione. Girare la chiave da Standby a On per accendere il Ti: zaffiro laser.
  2. Accendere il laser OPO sul retro del controller OPO e aprire la Ti: zaffiro otturatore sul Ti: zaffiro controllore di alimentazione.
  3. Accendere il computer tablet per pompare il OPO. Clicca sulle icone OPO collegati e remoto collegato sul tablet. Attendere 30 - 40 minuti per il riscaldamento.
  4. Accendere il computer microscopio e accendere gli interruttori "Microscopio componenti". Avviare il software facendo doppio clic sull'icona sul desktop.
  5. Nella scheda di acquisizione del software, aprire lo strumento laser nel Setup Manager per operare entrambi i laser dal software. Selezionare laser Ti: zaffiro On e laser OPO On. Controllare il valore della potenza laser ottico (valori tipici di 3,700 mW a 800 nm e 700 mW a 1000 nm).
  6. Per configurare il percorso del raggio laser e,aprire lo strumento Path luce nel gruppo di strumenti Gestione guidata installazione e casella di controllo il primo tubo fotomoltiplicatore (PMT).
  7. Per controllare il Ti: zaffiro spot laser in uscita dell'obiettivo, aprire lo strumento di Canali nel gruppo di strumenti di acquisizione dei parametri. Selezionare il Ti: potere zaffiro al valore basso (circa 1%), ridurre il guadagno a 0 (nessuna immagine è necessaria in questa fase) e cliccare sul pulsante Continua per avviare la procedura di scansione per lanciare il raggio laser attraverso l'obiettivo microscopio. Controllare la presenza di una macchia rossa mediante osservazione diretta posizionando la scheda di visualizzazione laser IR all'uscita della obiettivo microscopio dell'aria (10X).
  8. Per controllare il punto laser OPO, fermare la scansione del laser Ti: zaffiro facendo clic sul pulsante Stop. Selezionare la potenza OPO a basso valore nella finestra dei canali e fare clic sul CPulsante ontinuous.

2. Impostazioni microscopio

  1. posizionare manualmente lo specchio dicroico con una lunghezza d'onda di taglio a 760 nm nel cursore sideport nello spazio infinito sopra la torretta portaobiettivi per lanciare la luce fino a 760 nm dal campione in PMT nella rilevazione non descanned modalità (NDD).
  2. Impostare il filtro passa banda stretta a 660-685 nm nel riflettore cubo NDD davanti PMT1 per registrare solo le auto segnale a 670 nm di riprodurre i risultati presentati in questo lavoro.
  3. Collocare un filtro a banda stretta da 500 a 550 nm nel riflettore cubo NDD davanti PMT3 per l'osservazione di fluorescenza della mielina. Mettere un filtro a banda stretta che vanno 565-610 nm nel cubo riflettore davanti PMT4 per l'osservazione SHG.
  4. Per selezionare nel software la registrazione del segnale sul rivelatore con il filtro passa banda ad hoc, aprire lo strumento Path Luce nel menu Setup Manager scheda di acquisizione. Attivare la (casella di controllo) PMT desiderata e selezionare un colore per questo canale. In questo lavoro, il verde è stato scelto per le automobili, in rosso per la fluorescenza e magenta per SHG.

3. La sincronizzazione temporale

Nota: I due raggi laser derivano dallo stesso laser Ti: zaffiro ma il fascio OPO sono ritardati quando viene generato in modo che i due raggi non sono sincronizzati in tempo quando raggiungono il microscopio. L'obiettivo è quello di ritardare uno dei due fasci di ri-sincronizzazione in tempo prima che raggiungano il microscopio.

  1. Connettiti con cavi BNC il canale di ingresso CH1 dell'oscilloscopio al elettrica BNC uscita del laser (Sync. Out). Collegare il canale di ingresso CH2 dell'oscilloscopio al fotodiodo e scegliere il canale CH1 come canale trigger premendo MENU TRIGGER, quindi il menu principale tasto Source e quindi il pulsante menu laterale corrispondente al canale selezionato CH1.
  2. Posizionare e fissare con perni di montaggio ottica fotodiodo nel piano focale di un obiettivo microscopio dell'aria (10X) o nel percorso ottico del microscopio dopo aver rimosso l'obiettivo. Nota: Se necessario, rimuovere il condensatore e il suo vettore.
  3. Nello strumento Channels (gruppo utensili Acquisition parametro), definire il Ti: lunghezza d'onda del laser zaffiro a 830 nm a bassa potenza (cioè, meno di 1% della potenza piena). Nello strumento modalità di acquisizione, di ridurre l'area di scansione di un punto, al fine di illuminare il fotodiodo con il fascio più piccolo. Accendere il laser a scansione facendo clic sul pulsante Continua.
  4. Premere AUTOSET sul pannello anteriore dell'oscilloscopio e spostare manualmente la posizione del fotodiodo per ottenere i treni di impulsi sullo schermo. Premere il tasto RUN / STOP per bloccare il display.
    1. Per salvare una copia del display dell'oscilloscopio, inserire un 3,5inch floppy disk nell'unità disco floppy o collegare la porta GPIB sul pannello posteriore di un computer. Quindi premere SHIFT HARDCOPY MENU, premere FORMAT (principale) per selezionare il formato immagine TIFF e specificare nel menu Port canale di uscita. Premere il pulsante HARDCOPY per registrare la visualizzazione oscilloscopio dei treni di impulsi del Ti: zaffiro laser.
  5. Spegnere il Ti: zaffiro scansione laser facendo clic sul pulsante Stop. Cliccando strumento Canali definire il segnale OPO a 1.107 nm di potenza e bassa. Accendere la scansione laser OPO e registrare i treni di impulsi del laser OPO sull'oscilloscopio. Spegnere la scansione laser OPO.
  6. Confrontare il passaggio temporale tra la Ti: zaffiro ed i segnali OPO.
    NOTA: Il temporale spostamento t spostamento dà la lunghezza L Delayline linea di ritardo che deve essere implementato seguente equazione: L Delayline = c5; t shift dove c è la velocità della luce.
  7. Scegliere una delle linee laser.
    NOTA: In questo lavoro, la Ti: zaffiro linea laser è stato scelto perché lo spazio libero era disponibile nelle vicinanze di questa linea laser. Inoltre, questa scelta permette di ottenere il riallineamento della linea laser con una luce laser visibile.
  8. Aprire la linea laser rimuovendo i tubi di protezione nella posizione in cui verrà attuata la linea di ritardo.
    Attenzione! Indossare occhiali di protezione e rimuovere bracciali a catena o guardare da polsi.
  9. Selezionare una lunghezza d'onda nell'intervallo visibile per poter osservare facilmente il fascio laser (700 nm per esempio, a bassa potenza nello strumento Canali del software). Accendere la scansione laser.
  10. Posizionare e impostare con i messaggi di montaggio ottici due iris diaframmi lungo la linea laser aperto. Posizionare una iris all'uscita della linea di ritardo e posizionare gli altri diaframma all'ingresso del periscopio.
    NOTA: Il pecontrolli riscope di due specchi motorizzati pilotati dal software dell'angolo di ingresso del fascio laser nella testa di scansione del microscopio a scansione laser.
  11. Diminuire il diaframma di apertura del diaframma e regolare le posizioni diaframma per adattare il percorso del raggio laser. fissarli sul tavolo ottico. Regolare la posizione verticale di un terzo diaframma mobile per controllare l'altezza del fascio laser, mentre successivamente posizionare i quattro specchi della linea di ritardo.
    NOTA: Questi iris diaframmi serviranno come controllo per la procedura di riallineamento mostrando il percorso da seguire.
  12. Posizionare lo specchio M1 montato su uno specchio cinematica compatta montare all'ingresso della linea di ritardo (come mostrato in figura 1) e regolare la sua posizione e il suo orientamento di mantenere l'altezza del fascio con l'uso del cellulare diaframma. Luogo rispecchia M2 e M3 (montato anche su supporti compatti specchio cinematica) a 90 ° sul palco di traduzione che sarà posizionata a MidcoUrse. Posizionare loro di adattarsi alla lunghezza della linea di ritardo come precedentemente calcolato.
  13. Regolare l'orientamento M2 e M3 con l'uso del cellulare diaframma. Impostare M4 (anch'esso fissato su un supporto compatto) all'uscita della linea di ritardo (poco prima iris I 1 come mostrato in figura 1) e con attenzione regolarne la posizione e l'angolo per misura il percorso del raggio laser attraverso i due dell'iride diaframmi fissi.
  14. Posizionare la scheda di visualizzazione laser in uscita dell'obiettivo microscopio e controllare il profilo fascio laser cliccando su continua per attivare la scansione laser. Osservare un disco luminoso uniforme. Se necessario, regolare leggermente l'orientamento della M4.
  15. Posizionare nuovamente il fotodiodo veloce sotto il raggio laser nel piano focale campione del microscopio. Osservare lo spostamento temporale tra il Ti: zaffiro fascio laser e il fascio OPO sull'oscilloscopio.
    Nota: Se necessario, modificare la lunghezza della linea di ritardo spostando l'intero sistema M2, M3 montato sullafase di traduzione (senza cambiare l'accordatura fase di traduzione) per sincronizzare entrambi gli impulsi. possono essere necessarie modifiche di pochi centimetri.

4. spaziale sovrapposizione dei fasci

Nota: Per produrre un segnale AUTOMOBILI, è necessaria la sovrapposizione spaziale dei due fasci laser. L'illuminazione alternate di entrambi i fasci sugli stessi perline colorate dappertutto con due coloranti fluorescenti differenti può essere utilizzato per indicare lo spostamento spaziale. regolazioni fini delle posizioni speculari possono quindi ridurre al minimo lo spostamento.

  1. Utilizzare pre-montato microsfere fluorescenti. O montare microsfere in sospensione su vetrini da microscopio pulito come descritto di seguito:
    1. Prima di campionamento, mix (di un mixer corteccia o sonicating) la soluzione perline per essere sicuri che le perle sono uniformemente sospesi.
    2. Applicare 5 ml di sospensione di sferette alla superficie di un vetrino e diffondere con la punta della pipetta. Attendere che la goccia ad asciugare e quindi applicare 5 ml di monteing media, ad esempio glicerolo, acqua o olio per immersione sul campione secco di perline. Coprire il campione con un vetrino e sigillare il vetrino con colla ad asciugatura rapida o paraffina fuso.
  2. Posizionare le perle di polistirene fluorescenti fissate su un vetrino da microscopio nell'ambito dell'obiettivo acqua 20X. Aggiungere qualche goccia di acqua per immergere l'obiettivo.
  3. Per ottenere l'attenzione per le perline, aprire la scheda Individuare nel software per passare dalla modalità di scansione laser per l'osservazione diretta del campione con l'occhio, premendo il pulsante Online. Aprire lo strumento oculare per selezionare il filtro ad hoc e accendere la lampada alogena, cliccando sulle icone.
  4. Rimuovere manualmente lo specchio dicroico nel cursore porta laterale nello spazio infinito e utilizzare il di messa a fuoco del microscopio per mettere a fuoco il piano di campionamento osservando le perline con gli oculari. Sostituire lo specchio dicroico.
  5. NelIndividuare scheda, passare alla modalità di scansione laser premendo il tasto Offline. Vai alla scheda di acquisizione per definire i parametri per la scansione: selezionare la dimensione del frame a 512 pixel, una velocità di scansione di 9, una media di 1, una profondità di 8 bit e di aumentare l'area di scansione al massimo.
  6. Nello strumento Canali della scheda di acquisizione, aggiungere una traccia (traccia 1) se non è già stato creato. Selezionare la lunghezza d'onda a 830 nm e bassa potenza per la TI:. Raggio laser zaffiro Spunta il colore verde nella casella Traccia 1 dalla finestra Canali e nel PMT3 o la casella PMT4 dalla finestra percorso ottico.
  7. Nello strumento Canali della scheda di acquisizione, aggiungere una seconda traccia (Track 2). Selezionare la lunghezza d'onda a 1.107 nm di potenza e bassa per il raggio laser OPO. Spuntare il colore rosso nella casella Traccia 2 dalla finestra Canali e nella casella PMT3 dal
  8. Regolare il guadagno di entrambe le tracce a 600. Quindi, applicare sequenzialmente la scansione dei due fasci sul campione cliccando su continua.
  9. Osservare l'immagine nell'area schermo in vista 2D. Nella visualizzazione View blocco di controllo opzione, regolare l'intensità del display.
    Nota: Se necessario, spostare leggermente la di messa a fuoco per trovare il piano di messa a fuoco delle perline. Regolare il Crop e ingrandire l'immagine in un unico tallone o in un gruppo di sfere adiacenti.
  10. Utilizzare il controller periscopio di sovrapporre le travi in ​​piano xy. Nel software, aprire la scheda Manutenzione. Clicca sulle opzioni di sistema e visualizzare la finestra dello strumento motorizzato Periscope. Utilizzare le regolazioni grossolane e fini degli specchi periscopio del Ti: zaffiro raggio laser in modo da sincronizzare nello spazio entrambe le immagini.
  11. Per la manipolazione periscopio, usare le prime battute di regolazione verticale e il second uno per i movimenti orizzontali del fascio laser. Spostare il fascio con lo specchio di ingresso finché l'immagine è leggermente visibile, e quindi compensare l'intensità del laser con lo specchio di uscita del periscopio cliccando su "ingresso" e "uscita".
  12. Per sovrapporsi verticalmente le travi, nella scheda Mantenere, aprire lo strumento collimatore e regolare il valore della distanza focale del Ti: zaffiro raggio laser.
  13. Spostare leggermente la posizione dell'obiettivo verticale per verificare la differenza di attenzione per entrambe le immagini. Oppure, prendere un z-stack del campione con l'apertura nella scheda di acquisizione dello strumento Z-Stack e scegliere i diversi parametri (serie, numero di fette). Premere Ortho nell'area schermata sull'immagine per vedere le travi in ​​sezione assiale. Massimizzare la Z-sovrapposizione facendo la stessa procedura più volte.

5. Le regolazioni finali e coerente anti-Stokes Raman (CARS) Segnale di osservazione da olio di oliva Droplets

  1. Mettere una goccia di olio su una lastra di vetro e coprire con un vetrino di vetro. Aggiungere qualche goccia di acqua per immergere un obiettivo ad immersione 20X acqua. Fuoco al bordo del vetrino in base alle oculari (come spiegato in precedenza in 4.2).
  2. Nello strumento Canali della scheda di acquisizione, selezionate nella pista 1 della lunghezza d'onda a 830 nm per la TI: raggio laser zaffiro e in 1.107 nm per la OPO. Tick ​​entrambi i laser in pista 1 per ottenere una scansione simultanea di entrambi i laser. Set poteri a basso valore per un inizio.
  3. Nella finestra Light Path, selezionare PMT1. Accendere le scansioni laser facendo clic sul pulsante di continuo. Spostare leggermente la messa a fuoco di consegnare la luce laser nello strato sottile di olio.
  4. Se necessario, aumentare la potenza ottica di entrambi i laser. Regolare l'intensità del display nella visualizzazione View blocco di controllo Option. Lentamente spostare la fase di traduzione della linea di ritardo fino a quando il segnale diventa sigsignificativamente migliorata.
  5. Dopo le belle allineamenti sono completi, controllare se è davvero un segnale AUTO: Spostare leggermente la fase di traduzione; l'intensità del segnale deve diventare più debole. E / o disattivare uno del raggio laser, o laser Ti: zaffiro o OPO. Anche in questo caso ci deve essere un forte decadimento di intensità rispetto al segnale AUTO.
  6. Per ottenere il segnale AUTO massimi, seleziona l'opzione sul software per fornire un valore di intensità media dell'intera immagine (nella vista Histo della scheda dello schermo). Regolare la lunghezza d'onda (pochi nm), allora x, y, z posizioni della trave messa a fuoco per massimizzare il valore intensità media.

6. Allegato della Luce percorso della linea di ritardo

  1. Dal momento che il sistema finale è dedicato ai non-fisici, racchiudere il percorso della luce della linea di ritardo con tubi o una scatola di recinzione, per evitare l'accesso diretto alla trave dannoso non visibile picco laser di potenza. Fare attenzione a fornire un accesso alla fase di traduzionepomello.

7. lunghezza d'onda di sintonia per AUTOMOBILI

  1. Usare l'equazione Equazione 1 per regolare le lunghezze d'onda laser per la vibrazione Raman desiderato. Per riprodurre i risultati presentati in questo lavoro per immagine Automobili segnale da legami CH con stiramento vibrazioni di 3.015 centimetri -1, selezionare λ Ti: zaffiro = 830 nm e λ OPO = 1.095 nm.
    NOTA: Raman caratteristici frequenze vibrazionali osservate in campioni biologici, quali acqua, legame CH può essere trovato in Evans et al 13 o in Ellis et al 29...
  2. Usare l'equazione Equazione 2 per determinare la lunghezza d'onda di emissione del segnale AUTO. Per l'imaging legame CH da CARS, scegliere un filtro a banda stretta a 670 nm da CARS l = 670 nm con lunghezze d'onda laser presentata in 7.1.
    NOTA: Un'applicazione telefono cellulare è available per calcolare CARS lambda da λ P e S λ valori (vedi riferimento 30).

8. Osservazione di CARS segnale e macchiato mielina da tagli nervo sciatico

Nota: tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con le normative istituzionali.

  1. Preparare i tagli del nervo sciatico assiali e longitudinali su un vetrino da microscopio, come presentato nel Ozcelik et al. 31.
  2. Preparare la soluzione colorante rosso fluoromyelin diluendo la soluzione madre di 300 volte in PBS. Inondare i tagli nervosi con la soluzione colorante per 20 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere la soluzione e lavare 3 volte per 10 minuti con PBS.
  3. Posizionare i tagli nell'ambito dell'obiettivo 20X immersione in acqua. Posizionare un vetrino. Aggiungere qualche goccia di PBS per immergere l'obiettivo e regolare la messa a fuoco l'obiettivo di ottenere una chiara immagine dei tagli attraverso gli oculari (come già descritto in 4.2).
    4. <li> In pista 1, selezionare il Ti: zaffiro e la OPO laser e definire le loro lunghezze d'onda di 830 nm e 1.095 nm, rispettivamente. Nella finestra Light Path, selezionare PMT1 e il colore verde.
  4. In Track 2, selezionare il laser OPO unico (lunghezza d'onda a 1.095 nm). Nella finestra Light Path, selezionare PMT4 e il colore rosso.
  5. Per entrambi i laser, selezionare bassa potenza e impostare il guadagno di 600 per un inizio. Accendere il scansioni laser e regolare i seguenti parametri per migliorare la CARS e segnale di fluorescenza contrasti: valori di potenza, manopola fase di traduzione (molto poco), lunghezze d'onda (pochi nm), intensità del display.
  6. Per registrare le immagini finali ad alta risoluzione, selezionare nella strumento modalità di acquisizione dei seguenti parametri: dimensione del frame di 1.024 pixel, velocità di scansione di 7, una media di 4. Fare clic sul pulsante di scatto per registrare una singola immagine. Salvare l'immagine in forma proprietariaa per registrare l'immagine ei parametri di acquisizione completi.

9. L'osservazione di auto e segnali SHG dai tagli nervo sciatico

  1. Preparare il nervo sciatico, come presentato nel Ozcelik et al. 31.
  2. Seguire la procedura come spiegato nella parte 8 per ottenere un'immagine attraverso gli oculari e per selezionare AUTO parametro del segnale (traccia 1).
  3. In Track 2, selezionare il laser OPO unico (lunghezza d'onda a 1095 nm). Nella finestra Light Path, selezionare PMT3 e il colore magenta.
  4. Seguire la procedura come spiegato nella parte 8 per accendere le scansioni laser e salvare immagini ad alta risoluzione.

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Representative Results

La frequenza treno di impulsi di Ti di serie: laser zaffiro è tipicamente intorno a 80 MHz. Il OPO ha la stessa frequenza in quanto è pompato dal Ti: zaffiro laser. è pertanto necessario un oscilloscopio veloce di almeno 200 MHz. Un fotodiodo veloce nella gamma è richiesta anche 600 a 1.100 nm. Lo spostamento temporale massima si verifica quando il Ti: zaffiro ed i segnali OPO sono spostati di 1 / (2 × 80 × 10 6) = 6,2 nanosecondi. Essa corrisponde a un cambiamento di percorso massimo fascio di 1,9 m Figura 2 mostra il treno di impulsi registrati dal raggio laser OPO (A) e dal Ti:. Raggio laser zaffiro senza la linea di ritardo (B) e con la linea di ritardo impostato (C ). I treni di impulsi sono quindi all'incirca sincronizzati in fase con la linea di ritardo implementato come mostrato nella Figura 2A e 2C.

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Registrazioni Figura treno di impulsi 2. Laser per la sincronizzazione temporale registrazione di treni di impulsi in corrispondenza del piano del campione microscopio con un obiettivo 10X del fascio OPO (A), il Ti: zaffiro. Raggio laser senza (B) e con la linea di ritardo (C ). La curva superiore di ogni trame grafico il segnale direttamente registrato dal connettore BNC sul retro del Ti: zaffiro laser (connettore SYNC OUT.). Il trigger oscilloscopio è regolato su questo segnale. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

La sovrapposizione spaziale dei due fasci può essere ottenuta con la visualizzazione di perle di polistirene fluorescenti fissati su di un vetrino da microscopio (Figura 3A). La Figura 3B mostra l'immagine di tre branelli vicini inlaser OPO a 1.107 nm (rosso falsi colori) e dal laser Ti: zaffiro a 830 nm (falsi colori verde). Lo spostamento spaziale tra due raggi laser è stata compensata seguendo la procedura di sincronizzazione spaziale precedentemente descritto (Figura 3C).

Figura 3
Figura 3. sovrapposizione spaziale delle travi. Vista generale delle microsfere fluorescenti (A). Zoom su 3 microsfere adiacenti. L'illuminazione di perline a 830 e 1.107 nm mostra uno spostamento spaziale delle immagini tallone (falsi colori) (B). Dopo x, y, z regolazioni, le immagini perline vengono fuse (C). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Il finalepasso per ottenere la regolazione temporale precisa per attivare AUTOMOBILI può essere facilmente realizzato da formazione immagine gocce di olio d'oliva (contenente numerosi legami CH 32) e spostando leggermente gli specchi della linea di ritardo per completare la sincronizzazione in tempo di due treni di impulsi laser. Figura 4 mostra le immagini di una gocciolina di olio d'oliva consegnato dal Ti: zaffiro illuminazione laser solo (figura 4a) e dalla illuminazione OPO unico (Figura 4B). Entrambe le travi applicati contemporaneamente inducono un chiaro miglioramento del segnale (Figura 4C) a 670 nm, che corrisponde a una AUTOMOBILI segnale dalla intrinseca carbonio-idrogeno (CH) si estende vibrazione con una gamma di vibrazioni Raman circa 2.800 - 3.100 centimetri -1. AUTO del segnale (C) scompare quando uno dei due fasci è spento. Poiché l'olio di oliva contiene fluorofori naturali 33, in particolare le molecole di clorofilla emettono nell'intervallo 650 - 670 nm, il segnale debole (A) e (B) è un mulprocesso di fluorescenza tiphoton. L'intensità di questi segnali è di diversi ordini di grandezza inferiore rispetto al segnale AUTO. Pertanto, non perturba la misurazione del segnale AUTO.

Figura 4
Figura 4. finali regolazioni temporali pregiati per le auto segnale scoppio. Gocce di olio d'oliva può essere utilizzato per entrare in sintonia con il tempo entrambi i fasci regolando la lunghezza della linea di ritardo con la fase di traslazione lineare con azionamento micrometrica. Goccioline sotto (A) 830 nm solo e sotto la luce laser (B) 1.107 nm luce laser mostrano solo un segnale debole. Sotto accensione contemporanea (C), la valorizzazione chiaro segnale si osserva, corrispondente al segnale CARS. Barre di scala sono 100 micron. Raman vibrazioni picco a 3.015 cm -1. Cliccate suoe per vedere una versione più grande di questa figura.

La guaina mielinica è una struttura biologica prodotta da cellule specifiche che avvolgono e condensati loro membrana plasmatica intorno assoni dei neuroni nel sistema nervoso centrale e periferico 34. Questa guaina è altamente arricchito in diversi lipidi. Abbiamo usato qui guaine mieliniche del nervo sciatico di un mouse. Trasversale e tratti a sezione nervo sciatico longitudinali sono state colorate per due fotoni imaging di fluorescenza della mielina a 1.095 nm, come mostrato in Figura 5B e Figura 5E rispettivamente. Un colorante rosso fluoromyelin, che ha selettività per mielina è stato utilizzato 35. Questi campioni sono stati contemporaneamente illuminati a 830 ed a 1.095 nm e il segnale di macchine era constatato (Figura 5A e Figura 5D). Nella Figura 5A-C, i cerchi corrispondono alle guaine di mielina intorno assoni (spazio vuotolato gli anelli) in taglio trasversale. Come mostrato in Figura 5C e 5F, la stessa struttura è trovato mentre sovrapposizione AUTO e immagini di fluorescenza. Concludiamo che simile livello di dettaglio può essere ottenuto con le auto e quindi senza l'utilizzo di marcatura fluorescente.

Figura 5
Figura 5. AUTO e l'imaging mielina macchiato di tagli nervo sciatico. (A) trasversali e (D) tagli longitudinali senza etichetta AUTO immagini di guaine mieliniche. (B) trasversale e (E) tagli longitudinali dello stesso campione colorate con il colorante rosso fluoromyelin sotto fluorescenza illuminazione due fotoni a 1.095 nm. (C) e trasversali (F) taglio longitudinale sovrapposizione di entrambe le immagini. Barre di scala sono 10 micron. poteri ottici medi erano 5 mW a 830 nm e 16mW a 1.095 nm per il segnale AUTO. potenza ottica media era di 8 MW a 1.095 nm per l'imaging di fluorescenza a due fotoni. Raman picco di vibrazioni a 2.915 cm -1. Segnale AUTO scompare interrompendo la scansione di un laser o spostando la fase di traduzione di risonanza Raman. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Inoltre a vetture di imaging, il sistema di microscopia a disposizione permette di generare simultaneamente seconda armonica dalle fibre collagene sulla superficie esterna dei nervi sciatico. Questa immagine aggiuntivo richiede solo l'uso di un rivelatore diverso per registrare un segnale a 550 nm (metà della lunghezza d'onda della OPO) poiché un filtro passa-banda stretta a 670 nm viene utilizzata per la registrazione del segnale AUTO. Figura 6 mostra un'immagine di contrasto di guaine mieliniche raffigurati in colore verde falso (CARS segnale oNly in Figura 6A) circondato da fibre collagene illustrati in falsi colori magenta (SHG solo in Figura 6B). segnale CARS è stato raggiunto con poteri ottici media di 4 MW a 830 nm e 13 mW a 1.095 nm, mentre è richiesto 50 mW a 1.095 nm per ottenere il segnale SHG. Pertanto energia ottica molto più bassa è necessaria per ottenere AUTOMOBILI segnale rispetto al SHG o THG (non mostrato) segnali nei nostri campioni biologici.

Figura 6
Figura 6. AUTO e l'imaging SHG di topo nervo sciatico. (A) AUTOMOBILI di imaging, (B) per immagini SHG e (C) la visualizzazione simultanea di mielina da CARS Imaging (in falsi colori verde) e del collagene mediante imaging SHG (in magenta) sul mouse nervo sciatico. poteri ottici medi erano 4 mW a 830 nm e 13 mW a 1.095 nm per AUTOMOBILI. potenza ottica media era di 50 mW a 1.095nm per SHG. barra della scala è di 10 micron. Raman vibrazioni picco a 2.915 cm -1. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

La parte più impegnativa del lavoro è la sincronizzazione temporale dei raggi laser. Richiede un fotodiodo veloce combinato con un oscilloscopio veloce, ma solo una sovrapposizione ruvida nel tempo può essere eseguita in un primo momento. Poi è necessario un ulteriore aggiustamento di pochi cm. Infine, micrometro si muove da una fase di traslazione lineare permette di eseguire la regolazione fine definitiva della lunghezza della linea di ritardo al fine di innescare il segnale AUTO. Questo segnale viene mantenuto in un range ristretto di circa 20 micrometri, come osservato dalla messa a punto del azionamento micrometrico di traduzione. Esso corrisponde ad uno spostamento di picco dei fasci di circa la metà della durata dell'impulso, cioè, 140 fsec. La sovrapposizione spaziale dei due fasci che è richiesto per il segnale AUTOMOBILI è simile ad un allineamento del fascio normale sistema di scansione microscopio tale laser.

L'attuazione della linea di ritardo può essere raggiunto in poche settimane biologi aventi una bassa base nell'esperimentoAl ottica o in collaborazione con i fisici. Particolare cura deve essere presa per la scelta degli specchi per minimizzare le perdite di riflessione. Se la maggior parte dei materiali per costruire la linea di ritardo è conveniente, l'oscilloscopio che è richiesto non è un oscilloscopio standard. Così, dal momento che pochi giorni sono sufficienti per completare la procedura di sincronizzazione temporale, prendendo in prestito l'oscilloscopio da un laboratorio fisico sembra essere l'opzione migliore. sovrapposizione spaziale può richiedere molto tempo dal momento che richiede la messa a punto di diversi specchi e lenti (che può essere motorizzato a seconda del sistema di scansione laser). In precedenza il sistema CARS laser sulla base di due Ti sincronizzati elettronicamente: laser zaffiro avuto un problema con il lungo termine (decine di minuti a ore) temporale sovrapposizione degli impulsi. Questo problema è stato completamente risolto con OPO pompata con una sorgente laser unico 20,21. Con un tale sistema laser, e con l'ottica saldamente bloccati, non temporale walk-off tra pompa e Stokes travi stato osservato sopramesi di funzionamento.

Una limitazione importante della tecnica CARS è che il segnale AUTO può avvenire senza la presenza di molecole risonanti (dal solvente o dei diffusori) 11. Questo sfondo non risonante può limitare la sensibilità. Modi per minimizzare questo contesto includono la configurazione di rilevamento (in avanti o all'indietro di rilevamento), le caratteristiche laser (femtosecondi o picosecondi), la scelta della soluzione utilizzata per immergere il trattamento obiettivo o l'immagine. Un rilevamento all'indietro permette di minimizzare lo sfondo non risonante 11 come è stato utilizzato in questo lavoro (Figura 1). Femtosecondi Ti: zaffiro laser forniscono intensità di picco elevate altamente desiderabili per processi ottici non lineari. Tuttavia, nel dominio spettrale, la larghezza della maggior parte delle linee Raman è inferiore alla larghezza spettrale di un impulso a femtosecondi che si adatta alla larghezza spettrale di un impulso picosecondi. Pertanto l'uso di laser a picosecondi aumenta il rapporto of del segnale di risonanza di sfondo non risonante. Per legami CH in lipidi, a causa della elevata densità di legami, lo sfondo non risonante è trascurabile per un laser a femtosecondi. Per ridurre l'effetto di sfondo, la sottrazione di un'immagine di riferimento registrato sotto off-risonanza può anche essere applicato (non fatto per questo lavoro).

Nonostante l'utilizzo di raggi laser nel vicino infrarosso permettendo profonda penetrazione nel tessuto (200 - 300 micron), la profondità di penetrazione pratica ottenuta nell'imaging nervo era di circa 50 micron con gli esperimenti condotti in questo lavoro. Tuttavia questo parametro è fortemente dipendente del tessuto biologico ripreso e, in quanto tutte le fibre mieliniche sono allineate e concentrate in un piccolo spazio, nervi periferici probabilmente non costituiscono le migliori campioni per valutare la penetrazione della luce. Inoltre, pochi secondi sono tenuti a registrare le immagini ad alta risoluzione (1.024 × 1.024 pixel), che possono limitare la visualizzazione in vivo

AUTOMOBILI microscopia permette chimicamente specifica immagini selettiva con risoluzione vicino al limite di diffrazione. Questa tecnica non richiede alcuna etichettatura, e poiché il laser Ti: zaffiro è sintonizzabile da 700 a 1000 nm e il laser OPO da 1.100 a 1.300 nm, copre l'intera regione spettro delle vibrazioni molecolari in sistemi biologici (da 500 a 7000 centimetri -1). Così, è applicabile e altamente discriminante al DNA, proteine, lipidi, o acqua, mentre il segnale più forte deriva dal vincolo allungamento lipidi CH. Photodamage è ridotto a causa del basso livello di potenza del laser utilizzato per generare il segnale CARS rispetto imaging seconda armonica generazione. Dal momento che AUTOMOBILI di imaging può essere realizzato con una potenza laser a bassa e senza modifiche invasive, è quindi uno strumento di scelta per gli studi in vivo.

Laser microscopi a scansione wiTh A Ti femtosecondi: sorgente laser zaffiro combinato con un OPO sono diventati in gran parte disponibile per la microscopia a due fotoni in molti laboratori biologici. Poiché la sincronizzazione spaziale è già attuato in questi sistemi, la procedura sovrapposizione temporale dei due fasci descritti in questo lavoro porta una tecnica aggiuntiva della microscopia senza costose apparecchiature aggiuntive. Così, la modifica di set-up consente per l'imaging simultaneo di cellule o tessuti viventi con Second o terza armonica Generation (SHG, THG), a due fotoni di fluorescenza e automobili. Tecnica CARS ha dimostrato un grande potenziale per l'imaging in vivo di animali vivi che permettono lo studio dei processi dinamici (senza macchie o manipolazioni genetiche). Promettenti applicazioni includono imaging in vivo senza etichetta non invasivo lipidi, utilizzato per esempio per l'imaging in tempo reale della mielina dei neuroni spinali nei tessuti vivi 36, per lo studio delle malattie lipidi legati (obesità, demielinizzante e cardiovmalattie ascular) 37, i meccanismi di penetrazione della pelle umana di 22 o disturbi della pelle 38. Noi crediamo che i futuri miglioramenti riguarderanno l'uso di lenti dell'obiettivo speciali, come micro-obiettivi GRIN o obiettivo in miniatura per aumentare la profondità di penetrazione del segnale AUTO.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Oscilloscope Tektronix TDS 520D 500 MHz 
Photodetector Thorlabs DET08C/M, T4290 5 GHz InGaAs, 800 - 1,700 nm
Ti:Sapphire laser Chameleon Ultra Family II Coherent
Optical parametric oscillator OPO Compact Family APE Berlin
Axio Examiner microscope LSM 7 MP Carl Zeiss
Motorized periscope Newport
Objective W Plan-Apochromat 20X/1.0 Carl Zeiss
Beam combiner Carl Zeiss
Acousto-optic modulator Carl Zeiss
OPO power attenuator Carl Zeiss
Photomultiplier tube Carl Zeiss
ZEN software Carl Zeiss
Bandpass filters Carl Zeiss LSM BiG 1935-176 400 - 480 nm; 500 - 550 nm; 465 - 610 nm
Dichroic mirror Carl Zeiss Cutoff wavelength 760 nm
Silver mirrors Newport 10D20ER.2  λ/10, 480 - 20,000 nm, Quantity 4
Single-axis translation stage with standard micrometer Thorlabs PT1/M Quantity 1
Aluminium breadboard Thorlabs MB1015/M  Quantity 1
Mirror mount Thorlabs KMSS/M  Quantity 4
Mirror holder for Ø1" Optics  Thorlabs MH25 Quantity 4
Iris diaphragms  Thorlabs ID8/M Quantity 3
Protective box Thorlabs TB4, XE25L900/M, T205-1.0, RM1S Quantity 1
Optical posts Thorlabs TR40/M, PH50/M, PH75/M, BA2/M Quantity 8 (lengths depending on the set-up)
661 - 690 nm bandpass filter Semrock 676/29 nm BrightLine® single-band bandpass filter Quantity 1
Fluorescent beads ThermoFisher TetraSpeck™ Fluorescent Microspheres Size Kit
Laser viewing card Thorlabs IR laser viewing card
Laser safety glass Newport LV-F22.P5L07 
FluoroMyelin™ Red Fluorescent Myelin Stain  ThermoFisher F34652

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Implementazione di un sistema coerente anti-Stokes Raman Scattering (CARS) su un Ti: zaffiro e OPO laser basata su standard Laser Scanning Microscope
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Mytskaniuk, V., Bardin, F., Boukhaddaoui, H., Rigneault, H., Tricaud, N. Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope. J. Vis. Exp. (113), e54262, doi:10.3791/54262 (2016).

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