Introduction
البروتينات هي الجزيئات الأكثر وفرة في الخلايا، وأنها تلعب دورا أساسيا في جميع العمليات الحيوية تقريبا. النشاط البيولوجي لمعظم البروتينات يتطلب قابلة للطي وبياناتهم إلى والمحافظة عليها، والأم هياكل ثلاثية الأبعاد. البروتينات مع التشكل الشاذة ليس فقط على فقدان وظائفهم العادية، ولكن أيضا في كثير من الأحيان تشكل الأنواع بلازميدة قليلة القسيمات القابلة للذوبان أو المجاميع التي تعوق وظائف بروتينات أخرى، وهي مواد سامة للخلايا 1،2. لمواجهة misfolding البروتين وخلايا توظف كل من المحرمين الجزيئية، التي تساعد البروتينية المطوية أو مطوية جزئيا للوصول إلى التشكل وطنهم، ومسارات التحلل، والتي تزيل البروتينات تتجمع 3. نظرا لتعقيد وطبيعة العشوائية لعملية قابلة للطي، والبروتين misfolding أمر لا مفر منه، وأنه قد لا يكون عكس في حالة من الطفرات، وأخطاء السكروز، والأضرار بعد متعدية 1. وبالتالي، فإن الخلايا تعتمد في نهاية المطاف على degradatمسارات أيون للحفاظ على نوعية البروتين.
وشدد على أهمية مراقبة الجودة البروتين الخلوي (PQC) نظم من قبل انتشار الأمراض misfolding البروتين، بما في ذلك السرطان والسكري والعديد من الأمراض العصبية مثل مرض الزهايمر ومرض باركنسون، التصلب الجانبي الضموري، مرض هنتنغتون (HD)، و الرنح النخاعي المخيخي (SCA) 4،5. على سبيل المثال، والطفرات في البروتين p53 الكابتة للورم هي الآفة الأكثر الوراثية في كثير من الأحيان واحدة في الأورام، ويرتبط مع ~ 50-70٪ من جميع حالات 6. وجزء كبير من الطفرات البروتين p53 والطفرات مغلطة التي تغير التشكل من البروتين p53، مما يؤدي إلى تشكيل المجاميع 7. علاوة على ذلك، وراثيا ومرضي البروتينات المرتبطة مع مساحات polyQ موسع مع HD وهيئة السلع التموينية. هذه الأمراض التقدمية وغالبا مميتة واضح عندما يتجاوز طول امتداد polyQ في البروتينات المتضررة معينة thresعقد، وتصبح شديدة على نحو متزايد على طول امتداد polyQ يطيل 8.
مقاربة جذابة لعلاج هذه الأمراض هو تعزيز علاجيا أنظمة PQC الخلوية، وخصوصا مسارات التحلل. ومع ذلك، فإن الممرات المشتركة في تدهور البروتينات التالفة، ولا سيما في خلايا الثدييات، لا تزال غير مفهومة. وعلى الرغم من الاعتراف بأن proteasome ومهم للغاية لتحلل البروتينات تتجمع، تبقى مسألة حيوية غير محددة: كيف البروتينات تتجمع معترف بها على وجه التحديد والمستهدفة للتدهور. وعلاوة على ذلك، على الرغم من أن أنظمة PQC تم تحديدها في مقصورات الخلوية بما في ذلك السيتوبلازم، الشبكة الإندوبلازمية، والحبيبات الخيطية، لا تزال أنظمة PQC في نواة واضحة 2.
وقد حددت الدراسات الأخيرة التي مختبرنا نظام يعترف ويحط مجموعة متنوعة من البروتينات تتجمع في النواةخلايا الثدييات من 9. ويتألف هذا النظام من البروتين البرولمفوسيت (الرابطة الاسلامية الباكستانية)، وهو بروتين النووي وعضوا في أسرة البروتين الثلاثية التي تحتوي على عزر (TRIM)، وRNF4، حلقة المجال تحتوي على البروتين. حزب الرابطة الاسلامية، والعديد من البروتينات TRIM أخرى، تمتلك سومو (صغير مثل اليوبيكويتين معدل) E3 النشاط يغاز، مما يسهل خصوصية وكفاءة البروتين SUMOylation 10. RNF4 ينتمي إلى مجموعة صغيرة من ligases اليوبيكويتين المستهدفة سومو (STUbL)، التي تحتوي على واحد أو أكثر من الزخارف-التفاعل السومو (بالمشترك) بالإضافة إلى المجال RING التي تتيح لهم النشاط يغاز اليوبيكويتين 11. وجدنا أن حزب الرابطة الاسلامية تعترف تحديدا البروتينات تتجمع من خلال مواقع التعرف على الركيزة المنفصلة التي يمكن أن نتبين سمات مميزة على البروتينات تتجمع. على الربط، والعلامات حزب الرابطة الاسلامية تتجمع البروتينات مع بولي سلاسل من SUMO2 / 3، اثنين من البروتينات SUMO الثدييات متطابقة تقريبا التي يمكن أن تشكل بولي سلاسل بسبب وجود موقع SUMOylation الداخلي. Sثم يتم التعرف على البروتينات تتجمع UMOylated التي كتبها RNF4، الأمر الذي يؤدي إلى ubiquitination وproteasomal تدهورها. أثبتنا أيضا أن نظام حزب الرابطة الاسلامية-RNF4 مهم للحماية من التنكس العصبي، ونقص في حزب الرابطة الاسلامية يفاقم من العيوب السلوكية وعصبية مرضية من نموذج الفأر من نوع SCA 1 (SCA1) 9.
للتمييز تدهور البروتين من الآليات الخلوية الأخرى التي يمكن أن تنظم مستويات البروتين، تم قياس معدلات دوران البروتين 9. من بين الأساليب الأكثر استخداما لتحديد دوران البروتين هي مطاردة النبض وسيكلوهيكسيميد (فروج) مطاردة. هاتين الطريقتين تدرس على مر الزمن، على التوالي، والبروتينات وصفت النظائر المشعة من الاهتمام في خلايا الترجمة يتقن ومجموع البروتينات الموجودة مسبقا من الفائدة في الخلايا تحول دون ترجمة. ومع ذلك، تحديا كبيرا لدراسة البروتينات المسببة للأمراض وعرضة للmisfolding هو أن عمر النصف لهذه البروتينات يمكن أن يكون لو للغايةنانوغرام. على سبيل المثال، Ataxin-1، Ataxin-7، هنتنغتين، ألفا-synuclein، وTDP-43 جميعا حياة نصف من أكثر من 12 إلى 24 ساعة 9،12-16. معدلات دوران بطيئة من هذه البروتينات تمنع استخدام تحليل فروج مطاردة لأن الخلايا إيواء هذه البروتينات قد لا البقاء على قيد الحياة لفترة طويلة تثبيط الترجمة، خصوصا لأن البروتينات تتجمع أنفسهم يمكن أن تكون شديدة السمية للخلايا. تحليل نبض مطاردة مع وضع العلامات النظائر قد يكون أيضا تحديا للبروتينات التي تكون عرضة تجميع-للغاية. معظم فحوصات نبض مطاردة تعتمد على مناعي لفصل البروتين من الاهتمام من جميع البروتينات الأخرى التي هي أيضا المسمى بالإشعاع. ويشمل هذا الإجراء عادة مناعي وغسل الإجراءات المطولة خلالها المجاميع SDS-غير قابلة للذوبان يمكن أن تشكل، مما يجعل تحليل مع SDS-PAGE الكهربائي غير دقيقة.
هنا بروتوكول لتحليل البروتينات تتجمع النووية مع يوصف معدل دوران بطيء 9. ويستخدم شكلهما من Ataxin-1 (Atxn1) الذي يحتوي على امتداد 82 glutamines (Atxn1 82Q) لهذا الغرض (8). عندما أعرب في الخلايا، وتعزيز الخضراء بروتين فلوري (GFP) انصهار أشكال Atxn1 82Q مجهريا شوائب مرئية في نواة (الشكل 1A). ويكشف تحليل نبض مطاردة أن نصف عمر Ataxn1 82Q هي أكثر من 18 ساعة 9. يتكون Atxn1 82Q الأنواع مع التشكل تتجمع من خصائص مختلفة، فضلا عن الأنواع مع التشكل الأصلي. ومن المرجح أن هذه الأنواع تدهور بمعدلات مختلفة، وبالتالي يجب أن يتم تحليلها بشكل منفصل. لست] من Atxn1 82Q، معربا عن GFP ومجزأة الخلايا في NP-40 للذوبان (قابل للذوبان أو NS، من المرجح أن تمثل البروتينات الأم أو البروتينات أحادى / بلازميدة قليلة القسيمات تتجمع) و (NI، مجمعة / تتجمع) أجزاء NP-40-غير قابلة للذوبان. هذا الأخير يمكن تقسيمها الى مزيد من SDS للذوبان (SS، ومن المحتمل المجاميع المختلين) أو SDS مقاومة (SR، الألياف اميلويد المرجح) كسور (الشكل 1B). ويمكن تحليل NS و SS الكسور SDS-PAGE تليها النشاف الغربي، في حين يمكن أن يتم الكشف عن جزء ريال عن طريق فحوصات مرشح التخلف تليها immunoblotting. يتم الجمع بين فروج مطاردة مع أسلوب تجزئة المنظفات، واكتشفوا أن نصف عمر SS Atxn1 82Q أقصر بكثير من NS Atxn1 82Q ومجموعه Atxn1 82Q (الشكل 2A)، مشيرا إلى أن جزء SS يمكن التعرف بسهولة وتتحلل في الخلايا 9. وهكذا، وهذه الطريقة توفر أداة قوية لدراسة ديناميات البروتينات تتجمع ومقارنة نمط تدهورها.
وصفنا أيضا الأسلوب الذي هو مناسبة لفحص إنتاجية عالية لتحديد الجزيئات أو المركبات الصغيرة التي يمكن أن تعدل تدهور البروتينات تتجمع. ويستند هذا الأسلوب على متحولة مزعزع conformationally من وسيفيراز يراعة (LucDM) 17، ركيزة نموذج كوصي. لدينا الصماماتد LucDM إلى إشارة توطين النووية (NLS) للتحقيق في أنظمة PQC في هذا الحيز الخلوية، وGFP (NLS-LucDM-GFP) لتسهيل الكشف. أشكال NLS-LucDM-GFP مجهريا المجاميع النووية واضحة في نسبة صغيرة من الخلايا (الشكل 3A). على غرار Atxn1 82Q، NLS-LucDM-GFP، ولكن ليس في البرية من نوع نظيره NLS-LucWT-GFP-يتم تعديل من قبل SUMO2 / 3 والتي تخضع لرقابة مسار حزب الرابطة الاسلامية-RNF4 9. كما يشكل NLS-LucDM-GFP SS والأنواع ريال، على الرغم من أن كميات النسبية لقوات الأمن الخاصة والأنواع ريال ضئيلة مقارنة NS، وذلك باستخدام الشروط الواردة في بروتوكول 3 أدناه. لتبسيط الفحص، نقوم بتحليل فقط SDS LucDM للذوبان (بما في ذلك كل من NS وكسور SS) بواسطة SDS-PAGE وصمة عار الغربية. الأهم من ذلك، أظهر فروج مطاردة الفحص أن نصف عمر SDS للذوبان NLS-LucDM-GFP أقصر بكثير من أن لها من النوع البري نظيره (الشكل 3B)، مما يوحي بأن LucDM هو الركيزة محددة للنظام يقر ويحطالبروتينات تتجمع.
تدهور LucDM-GFP يؤدي إلى انخفاض كبير في إشارة مضان الشاملة. لذلك، وقد وضعنا أيضا على بروتوكول للكشف في الوقت الحقيقي الخلوية LucDM-GFP باستخدام فحص أساس مضان صفيحة. يتم تطوير العديد من الأنظمة شاشة عالية الإنتاجية (HTS) للعقاقير أو الجينات تعديل المجاميع الخلوية والجدوى الخلوية التي تسببها البروتينات الشاذة 18-20. ومع ذلك، فقد تم تصميم عدد قليل جدا HTSs خصيصا لاستهداف التدهور في خلايا الثدييات. يخدم هذا البروتوكول على أنه نظام قوي للتحليل واسع النطاق السريع ومن آثار تعبير البروتين، ضربة قاضية، والعلاج من تعاطي المخدرات على الخلوي تدهور البروتين تتجمع. باستخدام خلايا هيلا كمثال أدناه ونحن تصف بروتوكولات لتحليل هذه البروتينات تتجمع اثنين. يمكن أن تطبق أيضا على فحوصات للخطوط الخلايا الأخرى، على الرغم من الظروف ترنسفكأيشن وبالطبع الوقت قد يحتاج إلى أن يكون الأمثل لخطوط الخلايا الفردية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد الكاشف
- إعداد عازلة خلية تحلل (50 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.8، 100 مم كلوريد الصوديوم، و 5 ملي MgCl 2، 0.5٪ NP-40). الملحق 2 ملي DTT، 1X كامل كوكتيل البروتيني، و 250 وحدة دولية / مل benzonase قبل الاستخدام.
- إعداد عازلة بيليه (20 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.0، 15 ملي MgCl 2). الملحق 2 ملي DTT، 1X كامل كوكتيل البروتيني و 250 وحدة دولية / مل benzonase قبل الاستخدام.
- إعداد عازلة الغليان بقوة 3x (6٪ SDS، 20 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.0). تكملة 150 ملي DTT قبل الاستخدام.
- إعداد ومضان منخفض المتوسطة DMEM لفحوصات باستخدام قارئ صفيحة مضان. مزيج 25 ملي الجلوكوز، 0.4 ملي الجلايسين، 0.4 ملي أرجينين، 0.2 ملي السيستين، 4.0 مم الجلوتامين، 0.2 ملي الحامض الاميني، 0.8 ملي آيسولوسين، 0.8 ملم ليسين، 0.8 ملم ليسين، 0.2 ملي ميثيونين، 0.4 ملي الفنيل الأنين، 0.4 ملي سيرين، 0.8 ملي ثريونين، 0.078 ملي التربتوفان، 0.4 ملم التيروزين، 0.8 ملي حمض أميني أساسي، 1.8 ملي CaCl 2، 0.81 ملي MgSO 4 و 5.33 ملي بوكل، 44.0 ملم NaHCO 3، 110 مم كلوريد الصوديوم، 0.9 مليناه 2 ص 4. ضبط درجة الحموضة من الحل باستخدام حمض الهيدروكلوريك أو هيدروكسيد الصوديوم لدرجة الحموضة 7.4. تعقيم المتوسطة من خلال الترشيح.
ملاحظة: هذه الوسيلة يحتوي على مكونات المتوسطة DMEM القياسية مع ارتفاع نسبة الجلوكوز إلا أن الحديد (NO 3) 3، ويتم حذف الفيتامينات والفينولات الأحمر. الفينول الأحمر والريبوفلافين وبيريدكسال في مستنبت DMEM منتظمة تتداخل بشكل كبير مع الكشف عن إشارة مضان 21. الثقافة وسيط وبدون هذه المكونات هو أمر حاسم لنجاح يعيش التصوير الخلية GFP. المتوسط مستقرة لمدة 12 شهرا عند تخزينها في مكان بارد.
الفحص 2. تدهور Atxn1 82Q GFP
- لوحة حوالي 3 × 10 5 خلايا هيلا إلى 35 ملم لوحات مع DMEM المتوسطة تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، وذلك بعد نمو O / N خلايا زراعة لالتقاء مجموعة من 40-60٪ في وقت ترنسفكأيشن.
ملاحظة: يقوم عدد من لوحات اللازمة على عدد من النقاط الزمنية والعلاجات دescribed أدناه. - خلايا Transfect هيلا مع 0.3 ميكروغرام من Atxn1 82Q-GFP / pRK5 البلازميد في كل بئر باستخدام كاشف ترنسفكأيشن وفقا لتعليمات الشركة الصانعة 9. جعل مزيج ترنسفكأيشن رئيسية تحتوي على الحمض النووي وكاشف ترنسفكأيشن وقسامة أنه لكل بئر.
- 4-5 ساعة بعد ترنسفكأيشن، ودراسة الخلايا الحية تحت المجهر الفلورسنت المقلوب للتعبير GFP مع الطول الموجي الإثارة 450-490 نانومتر. عودة الخلايا إلى حاضنة بعد التصوير.
ملاحظة: لاحظ كل من الإشارات GFP تنتشر وبقع صغيرة من إشارات GFP في نواة في هذا الوقت. - إزالة المتوسط عن طريق الشفط وإضافة 2 مل DMEM الطازجة التي تحتوي على 50 ميكروغرام / مل فروج. علاج الخلايا لل0، 4، 8، 12 و 16 ساعة مع فروج قبل الحصاد. لدراسة تدهور proteasomal، وتشمل proteasome والمانع MG132 (10 ميكرومتر) في لوحة واحدة المعالجة لمدة 16 ساعة كمجموعة تحكم.
- حصاد لوحة واحدة من الخلايا في كل نقطة زمنية. إزالة المتوسط عن طريق الشفط لد تغسل الصحون مرتين مع 3 مل الجليد الباردة 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). الأداة الإضافية تجميد لوحة على الثلج الجاف.
- بعد آخر نقطة زمنية (16 ساعة)، كشط الخلايا المجمدة (من جميع نقاط الوقت) إلى 150 ميكرولتر من العازلة خلية تحلل الجليد الباردة وحضنت على الجليد لمدة 30 دقيقة.
- أجهزة الطرد المركزي في الخلية لست] في جهاز للطرد المركزي الفوق في 17000 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- نقل طاف، التي تحتوي على NP-40-القابلة للذوبان (NS) البروتينات، إلى أنبوب آخر باستخدام ماصة.
ملاحظة: استخدم supernatants لقياس تركيزات البروتين برادفورد فحص إذا لزم الأمر. - شطف الكريات بإضافة بلطف حوالي 200 1X ميكرولتر PBS للأنابيب من دون إزعاج الكريات. إزالة بعناية برنامج تلفزيوني عن طريق الشفط أو ماصة. إعادة تعليق عليها في 150 العازلة خلية بيليه الجليد الباردة ميكرولتر، تليها 15-30 دقيقة حضانة على الجليد.
ملاحظة: بيليه جزء معلق يحتوي NP-40 غير قابلة للذوبان (NI) البروتينات. انظر الشكل 1B لدياجكبش تجزئة المنظفات. - إضافة 75 ميكرولتر من 3X عازلة المغلي إلى كسور NS و 40 NP الكسور غير القابلة للذوبان (NI) معلق من الكريات. تسخين العينات عند 95 درجة مئوية في كتلة الحرارة لمدة 5 دقائق.
تذوب كتل في NP-40 الكسور غير القابلة للذوبان بعد التسخين وسوف عينات أصبح واضحا: ملاحظة. - إضافة العازلة تحميل SDS-جل لقسامة من NS المغلي وNI. تحميل حجم مساو من العينات التي تم جمعها من جميع نقاط الوقت لهلام SDS-PAGE. حجم تحميل يتوافق مع ما يقرب من 20 ميكروغرام من NS من عينة تم جمعها في وقت 0. ملاحظة: م، وكذلك SDS للذوبان (SS) البروتين من فصيل NI، يمكن حلها بواسطة SDS فصل هلام. في المقابل، عالقون SDS مقاومة لل(SR) مجاميع من NI جزء في الآبار هلام تحميل (الشكل 1B). لتحسين الكشف عن وصمة عار الغربي، يمكن تحميل حجم مزدوج من NI.
- كشف NS و SS Atxn1 82Q-GFP بواسطة طخة غربية باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة GFP وتعزيز لمعان كيميائي (ECL).
ملاحظة: Atxn1 82Q في جزء SS عموما أقل مقارنة إلى جزء NS عند استخدام هذا البروتوكول. وهناك حاجة أطول التعرض أطلق بيت التمويل الخليجي لإشارات الأمثل. - فحص ريال Atxn1 82Q من جزء بيليه بواسطة فحوصات التخلف تصفية باستخدام جهاز نقطة وصمة عار (الشكل 1B). لفترة وجيزة، وإنشاء جهاز نقطة وصمة عار عقد غشاء خلات 0.2 ميكرومتر السليلوز. تحميل 80-120 ميكرولتر من NI المغلي في كل بئر من جهاز نقطة وصمة عار.
ملاحظة: كما تتشكل كميات صغيرة فقط من المجاميع ريال في الخلايا، لطخة فحص نقطة، تحميل حجم جزء ريال أي ما يقرب من 10-15 مرة من حجم جزء NS المستخدمة في تحليل لطخة غربية.- بعد تصفية العينات من خلال الغشاء فراغ، وحدات Atxn1 82Q-GFP عالقا على الغشاء يمكن الكشف عنها من قبل مكافحة GFP immunoblotting 9،12،22.
ملاحظة: انظر التقارير السابقة 9،12،22 لوصف مفصل لفحص فلتر التخلف. هذه الخطوة اختياريةلأن ريال Atxn1 82Q هو الحد الأدنى بالمقارنة مع SS و NS كسور بعد ترنسفكأيشن قصيرة الموصوفة في هذا البروتوكول. وبالإضافة إلى ذلك، تبقى مستويات ريال Atxn1 82Q في حد ذاته على فروج مطاردة (الشكل 2B). ومع ذلك، فإنه لا يزال حاسما لدراسة ما إذا كانت تتأثر كميات SS Atxn1 82Q مع مرور الوقت لأي العلاج من تعاطي المخدرات أو التعبير الجيني في التجارب الأولية. البقاء أنواع البروتين SS في الآبار تحميل هلام SDS-PAGE يمكن الكشف عنها بواسطة طخة غربية. ومع ذلك، هذا الأسلوب هو أقل حساسية ويولد المزيد من النتائج متفاوتة (الشكل 1B).
- بعد تصفية العينات من خلال الغشاء فراغ، وحدات Atxn1 82Q-GFP عالقا على الغشاء يمكن الكشف عنها من قبل مكافحة GFP immunoblotting 9،12،22.
3. تدهور الفحص من NLS-وسيفيراز-GFP باستخدام SDS-PAGE وصمة عار الغربية
- لوحة حوالي 3 × 10 5 خلايا هيلا إلى 35 ملم لوحات مع DMEM المتوسطة تستكمل مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS). بعد O / N زراعة، تم التوصل إلى التقاء 40-60٪ في وقت ترنسفكأيشن. ويستند عدد من لوحات المطلوبة على عدد من رووصفت نقطة والعلاجات IME أدناه.
- خلايا Transfect هيلا مع 1.0 ميكروغرام NLS-وسيفيراز-GFP / pRK5 البلازميد في كل بئر باستخدام كاشف ترنسفكأيشن وفقا لتعليمات الشركة الصانعة 9. جعل مزيج ترنسفكأيشن رئيسية تحتوي على الحمض النووي وكاشف ترنسفكأيشن لقسامة من كل بئر.
- بعد O / N ترنسفكأيشن (حوالي 15 ساعة)، ودراسة الخلايا الحية تحت المجهر الفلورسنت المقلوب للتعبير GFP مع الطول الموجي الإثارة 450-490 نانومتر. عودة الخلايا إلى حاضنة بعد التصوير.
ملاحظة: منتشر إشارة GFP النووي يمكن ملاحظتها في معظم الخلايا (70٪). وهناك نسبة صغيرة (5٪) من الخلايا لديها المجاميع النووية. - إزالة المتوسط عن طريق الشفط وإضافة 2 مل DMEM الطازجة التي تحتوي على 50 ميكروغرام / مل فروج. علاج الخلايا لل0، 1.5، 3، 4.5 و 6 ساعات مع فروج قبل الحصاد. لدراسة تدهور proteasomal، وتشمل إضافية MG132 proteasome والمانع (10 ميكرومتر) في لوحة واحدة للعلاج من 6 ساعات عن السيطرة.
- حصاد لوحة واحدة من الخلايا في كل نقطة زمنية. إزالة المتوسط عن طريق الشفط وتغسل الصحون مرتين مع 3 مل الجليد الباردة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). الأداة الإضافية تجميد لوحة على الثلج الجاف.
- بعد آخر نقطة زمنية (6 ساعات) يتم الانتهاء من خلايا مجمدة في كل مرة يتم كشط نقطة إلى 150 ميكرولتر من العازلة خلية تحلل الجليد الباردة وحضنت على الجليد لمدة 30 دقيقة.
- إضافة SDS عازلة هلام التحميل للست] خلية كاملة لتركيز النهائي من 2٪ SDS و 50 ملي DTT. احتضان العينات على كتلة الحرارة على 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- تحليل NLS-وسيفيراز-GFP بواسطة SDS-PAGE وصمة عار الغربية باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة GFP. تحميل حجم مساو من العينات التي تم جمعها من جميع نقاط الوقت لهلام SDS-PAGE. حجم تحميل يتوافق مع ما يقرب من 20 ميكروغرام من لست] خلية كاملة من عينة تم جمعها في وقت 0.
4. في الوقت الحقيقي تدهور الفحص من NLS-وسيفيراز-GFP عن طريق الإسفار صفيحة قارئ
- البذور حوالي 1 × 10 4خلايا هيلا في 96-جيدا لوحات زراعة الأنسجة سوداء مع أسفل شفافة. بعد O / N زراعة، تم التوصل إلى التقاء 50-70٪ في وقت ترنسفكأيشن.
ملاحظة: هي المصنفة 60 ميكرولتر من المتوسط تحتوي على خلايا هيلا توقف تماما مباشرة في كل بئر. لا تضيف إضافية متوسطة أو الصخور لوحة ذهابا وإيابا بعد الغرس، وإلا قد لا تكون موزعة بشكل غير متساو الخلايا. - خلايا Transfect هيلا مع ،05-،1 ميكروغرام من NLS-وسيفيراز-GFP / pRK5 البلازميد 9 في كل بئر باستخدام كاشف ترنسفكأيشن وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. جعل مزيج ترنسفكأيشن رئيسية تحتوي على الحمض النووي وكاشف ترنسفكأيشن وقسامة أنه لكل بئر. لا و transfected ثلاث آبار مع الخلايا التي تحتوي على الحمض النووي، والتي هي بمثابة السيطرة للإشارة الخلفية مضان لكل حالة العلاج.
ملاحظة: طريقة بديلة للحد من التفاوت ترنسفكأيشن ل transfect الخلايا قبل البذر. ومع ذلك، وجزء كبير من الخلايا transfected مع البروتين تتجمعالصورة تفشل في إرفاق أو تظهر انخفاض قابلية استخدام هذا الأسلوب. ومن المرجح أن بعض الخلايا قد لا تصمد أمام الضغوط الناجمة عن هضم التربسين عند التعبير عن البروتينات تتجمع السامة. ونتيجة لذلك، يتم خفض كبير في إشارة الفلورسنت الشاملة. - 20-24 ساعة بعد ترنسفكأيشن، ودراسة الخلايا الحية تحت المجهر الفلورسنت المقلوب للتعبير GFP مع الطول الموجي الإثارة 450-490 نانومتر.
- إزالة المتوسط عن طريق الشفط. إضافة ما يقرب من 200 ميكرولتر برنامج تلفزيوني 1X إلى كل بئر ثم نضح لإزالة المبلغ المتبقي من DMEM المتوسطة.
- إضافة 60 ميكرولتر من مضان منخفض DMEM المتوسطة مع 5٪ FBS و 50 ميكروغرام / مل فروج. لدراسة تدهور proteasomal، وتشمل إضافية MG132 proteasome والمانع (10 ميكرومتر) في مجموعة واحدة من العينات. تعيين ثلاث نسخ الآبار للكل معاملة / حالة.
يتم تضمين العلاج MG132 والضوابط لتدهور proteasomal لأنه لا بد من استبعاد العوامل الأخرى التي يمكن أن تسبب قطرة من فلوو ملاحظة:إشارة rescence، بما في ذلك موت الخلايا وتبريد مضان. - قياس إشارة مضان من GFP مباشرة على قارئ لوحة الفلورسنت بعد إضافة فروج.
ملاحظة: يتم عرض الإعدادات قياس البرمجيات في الجدول 1. - قراءة لوحة في كل ساعة لمدة تصل إلى 8-10 ساعة. بعد القراءة، والعودة لوحة إلى حاضنة الثقافة الخلية.
- تصدير البيانات في ملف البيانات. استخدام القيمة الوسطية لمتعددة يقرأ في كل جانب كثافة مضان. تطبيع قيم كل نقطة البيانات إلى القيم المتوسطة من الوقت 0 في كل مجموعة على حدة. رسم كثافة مضان تطبيع مع مرور الوقت كما هو مبين في الشكل 4A و 4B، والشكل (5)، لوحات اليمين.
- أداء التحليل الإحصائي لمعدلات التدهور بين شرطين باستخدام اتجاهين أنوفا مع التدابير المتكررة 23.
ملاحظة: في هذا التحليل، "كثافة مضان" هي المتغير التابع في حين أن "treatmشروط والأنف والحنجرة "و" الوقت "هي العوامل اثنين. وبدلا من مقارنة البيانات في نقطة زمنية الفردية، في اتجاهين أنوفا مع التدابير المتكررة يحلل الفرق بين مجموعات العلاج اثنين على مدار الساعة بأكمله.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في تحليل حالة مستقرة، وحدات النووية مرئية المجهر Atxn1 82Q-GFP يمكن ملاحظتها في 30 - 50٪ من خلايا هيلا 20 ساعة بعد ترنسفكأيشن (الشكل 1A). تحليل لطخة الغربي من كسور NS و SS باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة GFP يظهر الفرقة متميزة من Atxn1 82Q-GFP بين 100 كيلو دالتون و 150 كيلو دالتون علامات الموافق البروتين الوزن الجزيئي (الشكل 1B). يمكن الكشف عن Atxn1 82Q-GFP في جزء ريال إما عن طريق تصفية التخلف الفحص، أو عن طريق SDS-PAGE وصمة عار الغربية كأنواع في الجزء العلوي من هلام التراص (الشكل 1B). لتحليل نصف العمر باستخدام بروتوكول المذكورة أعلاه، فروج مطاردة تبدأ 4-5 ساعة بعد ترنسفكأيشن الأولي قبل أن يتم تشكيل أي المجاميع نووية كبيرة. في نصف عمر Atxn1 82Q-GFP في جزء SS حوالي 5 ساعة، على النقيض من طفيف أو أي بانخفاض قدره Atxn1 82Q-GFP في جزء NS أكثر من 16 ساعة (الشكل 2A). وdegradation من Atxn1 82Q-GFP هو تحول جزئيا عن طريق علاج الخلايا مع MG132 (الشكل 2A). لقد أظهرنا في وقت سابق ان حزب الرابطة الاسلامية يحفز تدهور البروتين تتجمع من خلال تشجيع SUMOylation بهم. هنا نستخدم الرابطة الاسلامية الباكستانية ضربة قاضية كمثال على مسار تدهور تغير. حزب الرابطة الاسلامية سيرنا العلاج لفترات طويلة من عمر نصف Atxn1 82Q-GFP في جزء SS (الشكل 2A). يتم الكشف عن أي تغييرات واضحة في ريال Atxn1 82Q-GFP في أي تحكم أو الخلايا المعالجة سيرنا حزب الرابطة الاسلامية (الشكل 2B و2C).
عشرين ساعة بعد ترنسفكأيشن، وحدات NLS-LucDM-GFP تصبح مرئية مجهريا في 5-15٪ من خلايا هيلا، ولكن هذا يمكن أن تختلف تبعا لكميات من الحمض النووي التي و transfected (الشكل 3A). عمر النصف من SDS ذوبان NLS-LucDM-GFP هي 2-3 ساعة (الشكل 3B و 3C). كثافة مضان من الخلايا transfected يقلل أيضا علىالوقت على العلاج فروج (الشكل 4A و 4B). ستة ساعة بعد العلاج فروج، وشدة مضان تصل إلى مرحلة مستقرة وتوقف التناقص (الشكل 4A و 4B). في نقطة زمنية واحدة، قابلة للذوبان NLS-LucDM-GFP تتردى إلى حد كبير (الشكل 3B و 3C)، مما يدل على أن مضان المتبقية يتم إنشاء من الأنواع تجميع مقاومة للتدهور. باستمرار، مجمعة، لكن تنتشر لا، لا يزال GFP في الخلايا 9 ساعة بعد العلاج فروج (الشكل 4C). ومن المثير للاهتمام، ترنسفكأيشن باستخدام كمية أعلى من NLS-LucDM-GFP البلازميد يولد المزيد من المجاميع النووية وكذلك كثافة أعلى من تبقى مضان، على الرغم من أن معدل التحلل لا يتأثر الشكل (4A و4B). باستخدام SDS-PAGE تليها طخة غربية أو القراءة مضان، ونحن قادرون على كشف تثبيط تدهور NLS-LucDM-GFP عن طريق العلاج MG132 أو حزب الرابطة الاسلامية سيرنا (أرقام 3C، 4A، 4B، و 5).
و transfected الشكل 1. الكشف عن Atxn1 82Q-GFP بواسطة المجهر الفلورسنت وتجزئة المنظفات. (A) خلايا هيلا مع Atxn1 82Q-GFP وملطخة دابي. وتظهر الصور الفردية والمدمجة. شريط النطاق = 10 ميكرون. (ب) رسم تخطيطي يظهر تجزئة المنظفات Atxn1-82Q معربا عن الخلايا كما هو موضح في البروتوكول وأشار 2. علامات الوزن الجزيئي على الجهة اليسرى من الصور لطخة الغربية Atxn1-Atxn 82Q. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم .
66 / 54266fig2.jpg "/>
وعولج الشكل 2. تدهور فحص من Atxn1 82Q-GFP باستخدام المنظفات تجزئة خلايا هيلا سابقا مع السيطرة. (-) أو حزب الرابطة الاسلامية سيرنا (A و C) أو برنامج الأمم المتحدة للتعامل (B). و transfected الخلايا مع Atxn1 82Q-GFP وتعامل مع فروج في غياب أو وجود MG132. وقد تم تحليل كسور المحللة الخلية SDS-PAGE تليها طخة غربية (A، لNS و SS كسور) أو مرشح التخلف فحص (B و C، لجزء ريال) استخدام الألغام المضادة للGFP الأضداد. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. تحليل تدهور NLS-LucDM-GFP بواسطة ميكر مضانكانت ملطخة oscopy وصمة عار الغربية. (A) خلايا هيلا transfected مع NLS-LucDM-GFP مع دابي. وتظهر الصور الفردية والمدمجة. شريط النطاق = 25 ميكرون. رأس السهم يشير إلى وجود خلية مع المجاميع النووية. و transfected خلايا (B و C) هيلا مع NLS-LucDM-GFP والبرية من نوع البروتين وسيفيراز الانصهار NLS-LucWT-GFP (B)، أو transfected مع سيطرة أو حزب الرابطة الاسلامية سيرنا، تليها ترنسفكأيشن مع NLS-LucDM-GFP ( C). تم علاج الخلايا مع فروج وMG132 كما هو محدد. وقد تم تحليل لست] خلية كاملة من لطخة غربية استخدام الألغام المضادة للGFP الأضداد. يتم تعديل صورة من المنشور السابق بإذن 9. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
و transfected الشكل 4. الفلورسنت فحص القائم على صفيحة لتدهور NLS-LucDM-GFP الخلايا هيلا المصنف على 96 لوحات جيدة مع 0.05 ميكروغرام (A) أو 0.1 ميكروغرام (B و C) NLS-LucDM-GFP وتعامل مع فروج في وجود أو عدم وجود MG132. (A و B) تم قياس شدة الإسفار من الآبار في النقاط الزمنية المشار إليها (متوسط القيم ± الانحراف المعياري، ن = 3). تظهر لوحات على اليسار القراءة مضان الأصلية، في حين أن لوحات على اليمين تظهر القيم تطبيع للقراءات في الوقت 0 في مجموعات العلاج منها. تم تحليل الفرق بين المجموعات المعالجة مع وبدون MG132 من اتجاهين أنوفا مع التدابير المتكررة. يشار إلى القيم ف المعاملة بين الجماعات اثنين. تم فحص (C) ويلز قبل أو بعد 9 ساعة العلاج فروج، أو بعد العلاج فروج وMG132، من خلال المجهر مضان. لإظهار أفضل كل من الخلايا مع مشرق مجمعة NLC-LucDM-GFP والذين يعانون من البروتين تنتشر خافت، تم تطبيق قيمة جاما من 1.5 إلى جميع الصور. مقياس شريط = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5. انخفاض معدل تدهور NLS-LucDM-GFP في الخلايا الرابطة الاسلامية الباكستانية ضربة قاضية. خلايا هيلا تعامل سابقا مع سيطرة أو كانت المصنفة الرابطة الاسلامية الباكستانية سيرنا في 96 لوحات جيدة. تم تحليل تدهور NLS-LucDM-GFP كما هو موضح في الشكل (4) (اتجاهين أنوفا، ف <0.0001). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
54266 / 54266fig6.jpg "/>
يبقى الشكل 6. الإسفار من Atxn1 82Q-GFP دون تغيير خلال مطاردة فروج. و transfected خلايا هيلا مع Atxn1 82Q-GFP. تم تحليل 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن، وتدهور Atxn1 82Q-GFP كما هو موضح في الشكل (4). ويوضح الشكل القراءة مضان الأصلية. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
و transfected الشكل 7. الفلورسنت فحص القائم على صفيحة لتدهور LucDM-GFP الخلايا هيلا هيولي المصنف على 96 لوحات جيدة مع 0.1 ميكروغرام LucDM-GFP تعامل مع فروج في وجود أو عدم وجود MG132. وقد تم تحليل النتائج كما هو موضح في الشكل (4) (اتجاهين أنوفا، ف <0.0001).TPS: //www.jove.com/files/ftp_upload/54266/54266fig7large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: ضبط القياس على القارئ مضان صفيحة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الآليات التي تنظم تدهور البروتينات تتجمع ضرورية للحفاظ على توازن البروتينات الخلوية، وعلى الأرجح أنها تمثل أهدافا المخدرات قيمة لعلاج الاضطرابات العصبية وغيرها من الأمراض misfolding البروتين. هنا، يتم وصف المقايسات التي تدرس تدهور البروتينات تتجمع، وذلك باستخدام بروتين الإمراض Atxn1 (Atxn1 82Q) والمترجمة متحولة وسيفيراز النووي (NLS-LucDM) على سبيل المثال.
لدراسة تدهور Atxn1 82Q، والتي لديها نصف العمر أكثر من 18 ساعة، قدمنا طريقة جديدة من خلال الجمع بين تجزئة الخلية مع فروج الكلاسيكية 9. وكشف هذا الأسلوب إزالة أسرع بكثير من الأنواع تتجمع من Atxn1 82Q مع مرور الوقت. وبالإضافة إلى ذلك، وإدخال LucDM يوفر نموذجا تتجمع الركيزة لدراسة آليات تدهور العامة من البروتينات تتجمع. لمعالجة الحاجة إلى نظام HTS للكشف عن تدهور البروتين تتجمع في خلايا الثديياتالصورة، قمنا بتطوير فحص تدهور سريع لLucDM باستخدام مضان قارئ صفيحة. يقدم نظام كأداة قوية للشاشات الكيميائية والوراثية.
البروتين Atxn1 82Q موجود في NS، SS، وكسور ريال من الخلية لست]. تصبح كسور ريال تنتشر بشكل متزايد خلال ثقافة طويلة بعد ترنسفكأيشن، مما يشير إلى أنه في شكل يمكن أن يكون من الصعب أن التبجيل أو المتدهورة، على سبيل المثال، والألياف اميلويد. جيل من الأنواع أو المجاميع تتجمع السامة التي لا يمكن أن يتحلل بسهولة قد منع مسارات التحلل من البروتين، مما يعوق تحليل الآلية الخلوية الذاتية السيطرة على البروتينات الشاذة 24، 25،26. لتجنب تشكيل كمية كبيرة من ريال، ونحن نبدأ فروج مطاردة 4-5 ساعة بعد ترنسفكأيشن الأولي. لقد وجدنا أن هذا أمر بالغ الأهمية لتحليل الظروف الخلوية التي قد تؤخر تدهور جزء SS. بالإضافة إلى وقت ترنسفكأيشن، كما أنها حاسمة عدم الإفراطwhelm الخلايا عن طريق التعبير عن بروتين Atxn1 82Q عند مستويات مرتفعة جدا. إذا لوحظ أي أو بطيئة جدا التدهور لجميع الكسور، وكمية أقل من Atxn1 82Q البلازميد يجب أن تستخدم لترنسفكأيشن. من الناحية المثالية، ينبغي أن يتم الانتهاء من الفحص خلال 12 ساعة كما هي لاحظت خلايا أفكارك أبعد من هذه النقطة الزمنية. في الشكل 2A، وكمية SS Atxn1 82 التحكم في الخلايا غير افت للنظر مختلفة عن تلك في الخلايا المعالجة سيرنا حزب الرابطة الاسلامية قصيرة قدر 8 ساعة. يجب أن يؤخذ إذا كان الفرق في المجموعة التي تلقت العلاج لوحظ فقط أكثر من 12 ساعة، كما قد يكون سببه عوامل أخرى تؤثر على بقاء الخلية بدلا من تدهور البروتين الحذر.
مقارنة NS Atxn1 82Q، Atxn1 82Q في جزء SS يتم القضاء بسرعة، مشيرا إلى أنه يمثل نوعا تتجمع التي يمكن أن تتحلل بسهولة من قبل proteasome و(الشكل 2A). في المقابل، لا تزال مستويات ريال Atxn1 82Q دون تغيير على نفس دوام (الشكل 2B)، مما يؤكدأنه من الأنواع الامم المتحدة للتحلل. ومع ذلك، يجب أن يكون تحليل جزء ريال المهم لتحليل الآليات التي تزيل الركام مباشرة هيولي (على سبيل المثال، الالتهام الذاتي) أو يؤثر على تشكيل هذه المجاميع. بشكل ملحوظ، MG132 يبدو أقل فعالية في الوقاية من انخفاض Atxn1 82Q في SS الكسر. قد يكون سبب هذا الارتفاع في مستويات ROS على proteasome وتثبيط 27، التي يمكن أن تعزز تجميع Atxn1 82Q.
وهناك ميزة كبيرة من LucDM-GFP الفحص هو أنه يمكن تكييفها لتحليل HTS باستخدام قارئ لوحة مضان. لقد حاولنا في البداية لتطوير نظام HTS لAtxn1 82Q. ومع ذلك، لأنه فقط جزء صغير من العام البروتين Atxn1 82Q وتتحلل مع مرور الوقت، ومضان من الخلايا معربا عن GFP-Atxn1 82Q لم يطرأ تغيير كبير على مدى مطاردة فروج (الشكل 6). ان البروتينات تتجمع أخرى مع طويلة الشاملة نصف العمر لديهم مشاكل مماثلة في الوقت الحقيقي مع فلورفحص escent. في المقابل، لوحظ انخفاض ملحوظ في العام البروتين NLS-lucDM-GFP (الشكلان 3 و 4). هذه الميزة، جنبا إلى جنب مع لقصيرة نصف الحياة (2-3 ساعة)، وتمكن هذا النموذج كوصي الركيزة ليتم الكشف بسهولة عن طريق التحليل الطيفي مضان. في دراسات سابقة، البروتين GFPu، GFP تنصهر إلى تدهور إشارة بناءة (CL-1)، وقد استخدمت على نطاق واسع لمراسل وظائف نظام اليوبيكويتين proteasome و28،29. بل هو أيضا أحد أبرز البروتين تتجمع بديلة في الخلية الحيوانية ونماذج 30. مقارنة GFPu، ميزة واحدة للمقايسة تدهور الموصوفة هنا هي أن وسيفيراز تتجمع هو يستخدم على نطاق واسع الركيزة نموذج كوصي. من خلال دراسة luciferase النشاط، يمكن للمرء أن يقيم بسهولة التشكل الأم، التشويه والتحريف، وrefolded من وسيفيراز في التجارب المختبرية والحية. وبالتالي، يعمل نظامنا كمنصة مفيدة للغاية للاتصال بروتين ملزمة وقابلة للطي المقايسات معنظام تدهور الخلوية باستخدام نفس الركيزة 9.
من خلال قياس الوقت الحقيقي مضان يمكن الحصول على القيم التالية: بدء كثافة مضان، مستقرة كثافة مضان المتبقية، والبروتين نصف العمر. ترتبط هذه القيم على التوالي مع كمية البروتين الكلي قبل مطاردة، وكمية من البروتينات المقاومة للتحلل، ومعدل دوران البروتين. وبالتالي، فمن الممكن استخدام الوقت الحقيقي مضان الاختبار لإجراء تحليل شامل لمستويات وديناميات مختلفة الأنواع بروتين تتجمع. في بعض الأحيان، لوحظ تفاوت كبير نسبيا من مضان تبدأ بين مكررات (على سبيل المثال، الشكل (5)، لوحة اليسرى). هذا ومن المرجح أن يكون سبب التغير في زرع خلية أو ترنسفكأيشن. ومع ذلك، على الرغم من الاختلاف في كثافة مضان ابتداء، إشارة من جميع مكررات قطرات بمعدل مماثل جدا. تطبيع إشارات جيئة وذهابام كل النقاط الزمنية لشدة في وقت 0 يمكن أن تقلل من التباين بشكل جيد إلى جيد وأكثر دقة يعكس معدلات التحلل (الشكل 4A، 4B و الشكل 5، غادر مقابل لوحات اليمين).
بالإضافة إلى النموذج النووي، ونحن أيضا تحليل حشوية LucDM-GFP. حشوية LucDM-GFP لديه نمط تدهور مماثل إلا لوحظ ارتفاع نسبة المتبقية مضان عندما تم تطبيق نفس الإجراء التجريبي كما هو موضح في بروتوكول 4 (الشكل 7). تدهور يمكن أن تحول دون تماما MG132، مشيرا إلى هذا الفحص يمكن استخدامها لمراقبة السيطرة هيولي جودة البروتين من خلال تدهور proteasomal. للدراسات المستقبلية، وسيكون من المثير للاهتمام أن استكشاف ما إذا كان LucDM-GFP يمكن تطبيقها على الأجزاء الأخرى الخلوية، على سبيل المثال، الميتوكوندريا أو الشبكة الإندوبلازمية، عندما تنصهر لإشارات محددة توطين مقصورة الخلوية.
كما لوحظ في بروتوكول لفحص مقرها الفلورسنت، لا بد من استخدام المنخفض الفلورسنت المتوسطة للحد من الخلفية الفلورسنت واستخدام مزيج الرئيسي من الحمض النووي وكاشف ترنسفكأيشن للحد من ترنسفكأيشن تباين جيد إلى جيد. ويمكن تعديل السيطرة على بعض القراء لوحة الفلورسنت. ومن المهم لضبط الربح إلى دليل بدلا من الوجه الأمثل، واستخدام نفس القيمة في جميع أنحاء فحص كامل (الجدول 1). ويمكن تعديل قيمة الأرباح لتحقيق أقصى قدر من القراءة من مضان GFP الخلوي طالما لا تذهب لقراءة ما وراء الحد من الكشف.
في المرحلة الراهنة، ما زلنا الاعتماد على ترنسفكأيشن للتعبير عن LucDM. للحد من التباين وتبسيط الفحص لHTS، وهو الهدف المستقبلي هو إقامة خط الخلية مستقرة مع التعبير محرض من LucDM. لكن، وكما صفيحة ومستنبت لديهما مضان الخلفية، فمن الأهمية بمكان أن يكون GFP إشارة أعلى بكثير من الخلفية. Unforولحسن الحظ، فإن خطوط مستقرة أنشأنا مؤخرا عن أن يكون التعبير انخفاض LucDM. وبالتالي، فإن تطوير خط مستقر مع تعبير البروتين العالي تحسن بشكل كبير من كفاءة الفحص.
ويمكن أيضا أن المقايسات تدهور الموصوفة هنا يتم تطبيقها على البروتينات تتجمع أخرى. ويرجع ذلك إلى ميزة ديناميكية من البروتينات تتجمع، تحتاج إلى أن يكون مقرونا تحليل آخر للكشف عن آليات متعمقة للضوابط جودة البروتين هذه المقايسات. وتشمل هذه التحاليل قياس مستويات ثابتة الدولة من وحدات العمل وأقسام في أجزاء مختلفة من الخلايا (الشكل 1) وتحليل البروتينات القابلة للطي أو التجميع باستخدام البروتينات المؤتلف النقاء. وهذه المقايسات تساعد على التمييز بين الآثار المباشرة أو غير المباشرة للتعبير المخدرات أو الجينات على تدهور البروتين أو التجميع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11995-092 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10082147 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | NP40S-500ML | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| MG132 | Sigma-Aldrich | M8699 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | 45000232 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Boehringer Mannheim | 4693159001 | |
| Bio-Dot Apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Living Colors GFP Monoclonal Antibody | Clonetech | 632375 | |
| Anti-Actin mAb Rabbit, IgG | Sigma-Aldrich | A45060-200UL | |
| Amino acids | Sigma-Aldrich | Amino acids are used for making low fluorecence culturing medium | |
| Olympus IX-81 Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX71/IX81 | |
| 96 Well Black TC Plate w/ Transluscent Clear Bottom | Sigma-Greiner | 89135-048 | |
| Fluorescence Bottom Plate Reader Infinite 200® PRO | TECAN | Infinite 200® PRO | |
| Cellulose acetate membrane 0.2 µm | Sterlitech | CA023001 | |
| Prism 5 | GraphPad | Statistical analysis software |
References
- Dobson, C. M.
- Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426, 895-899 (2003).
- Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature. 475, 324-332 (2011).
- Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H.
- Selkoe, D. J.
- Vousden, K. H., Prives, C. Blinded by the Light: The Growing Complexity of p53. Cell. 137, 413-431 (2009).
- Xu, J., et al. Gain of function of mutant p53 by coaggregation with multiple tumor suppressors. Nat Chem Biol. 7, 285-295 (2011).
- Orr, H. T., Zoghbi, H. Y.
- Guo, L., et al. A cellular system that degrades misfolded proteins and protects against neurodegeneration. Mol Cell. 55, 15-30 (2014).
- Chu, Y., Yang, X. SUMO E3 ligase activity of TRIM proteins. Oncogene. 30, 1108-1116 (2011).
- Sun, H., Leverson, J. D., Hunter, T. Conserved function of RNF4 family proteins in eukaryotes: targeting a ubiquitin ligase to SUMOylated proteins. EMBO J. 26, 4102-4112 (2007).
- Janer, A., et al. PML clastosomes prevent nuclear accumulation of mutant ataxin-7 and other polyglutamine proteins. J Cell Biol. 174, 65-76 (2006).
- Bauer, P. O., et al. Harnessing chaperone-mediated autophagy for the selective degradation of mutant huntingtin protein. Nat Biotechnol. 28, 256-263 (2010).
- Austin, J. A., et al. Disease causing mutants of TDP-43 nucleic acid binding domains are resistant to aggregation and have increased stability and half-life. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 4309-4314 (2014).
- Barmada, S. J., et al. Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models. Nat Chem Biol. 10, 677-685 (2014).
- Paxinou, E., et al. Induction of alpha-synuclein aggregation by intracellular nitrative insult. J Neurosci. 21, 8053-8061 (2001).
- Gupta, R., et al. Firefly luciferase mutants as sensors of proteome stress. Nat Methods. 8, 879-884 (2011).
- Cooper, A. A., et al. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models. Science. 313, 324-328 (2006).
- Elden, A. C., et al. Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS. Nature. 466, 1069-1075 (2010).
- Fortini, M. E., Bonini, N. M. Modeling human neurodegenerative diseases in Drosophila: on a wing and a prayer. Trends Genet. 16, 161-167 (2000).
- Bogdanov, A. M., Kudryavtseva, E. I., Lukyanov, K. A. Anti-fading media for live cell GFP imaging. PLoS One. 7, (2012).
- Wanker, E. E., et al. Membrane filter assay for detection of amyloid-like polyglutamine-containing protein aggregates. Methods Enzymol. 309, 375-386 (1999).
- McDonald, J. H. Handbook of Biological Statistics. 3, 3rd, 173-179 (2014).
- Holmberg, C. I., Staniszewski, K. E., Mensah, K. N., Matouschek, A., Morimoto, R. I. Inefficient degradation of truncated polyglutamine proteins by the proteasome. EMBO J. 23, 4307-4318 (2004).
- Verhoef, L. G., Lindsten, K., Masucci, M. G., Dantuma, N. P. Aggregate formation inhibits proteasomal degradation of polyglutamine proteins. Human molecular genetics. 11, 2689-2700 (2002).
- Jana, N. R., Zemskov, E. A., Wang, G., Nukina, N. Altered proteasomal function due to the expression of polyglutamine-expanded truncated N-terminal huntingtin induces apoptosis by caspase activation through mitochondrial cytochrome c release. Human molecular genetics. 10, 1049-1059 (2001).
- Fribley, A., Zeng, Q., Wang, C. Y. Proteasome inhibitor PS-341 induces apoptosis through induction of endoplasmic reticulum stress-reactive oxygen species in head and neck squamous cell carcinoma cells. Molecular and cellular biology. 24, 9695-9704 (2004).
- Bence, N. F., Sampat, R. M., Kopito, R. R. Impairment of the ubiquitin-proteasome system by protein aggregation. Science. 292, 1552-1555 (2001).
- Chen, Q., et al. Intrasarcoplasmic amyloidosis impairs proteolytic function of proteasomes in cardiomyocytes by compromising substrate uptake. Circulation research. 97, 1018-1026 (2005).
- Link, C. D., et al. Conversion of green fluorescent protein into a toxic, aggregation-prone protein by C-terminal addition of a short peptide. The Journal of biological chemistry. 281, 1808-1816 (2006).
