Introduction
단백질은 세포 내에서 가장 풍부한 거대 분자이며, 이들은 거의 모든 생물학적 과정에서 중요한 역할을한다. 대부분의 단백질의 생물학적 활성에 자신 폴딩 필요하며, 천연 입체 구조를 유지. 비정상적인 단백질 입체 형태로는 정상적인 기능을 상실 할뿐만 아니라 자주 다른 단백질의 기능을 저해 세포 독성에 1,2- 수용성 올리고머 종 또는 응집체를 형성하지. 단백질 미스 폴딩 대응하기 위해 세포는 잘못 접힌 단백질 (3)을 제거하는 두 분자 그 나라의 형태에 도달하기 위해 펼친 또는 부분적으로 접힌 폴리 펩타이드를 지원 보호자, 및 분해 경로를 사용합니다. 복잡성과 폴딩 과정의 확률 적 특성상, 단백질 미스 폴딩은 불가피하며, 이는 돌연변이 생합성 오류 및 번역 후 손상 한 경우에 반전 될 수 없다. 따라서, 세포는 궁극적으로 degradat에 의존이온 통로 단백질은 품질을 유지한다.
세포 단백질의 품질 관리의 중요성 (PQC) 시스템은 암, 당뇨, 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 근 위축성 측삭 경화증, 헌팅 톤병 (HD)와 같은 다수의 신경 퇴행성 장애를 포함한 단백질 미스 폴딩 질환의 보급에 의해 강조되고 척수 소 뇌성 운동 실조증 (SCA) 4,5. 예를 들면, p53 유전자의 돌연변이는 모든 경우 6 % - 50-70과 연관된 종양에서 가장 자주 유전자 병변이다. p53의 돌연변이의 실질적인 응집체 분획 (7)의 형성으로 이어지는 p53과의 형태를 변경 과오 돌연변이이다. 또한, 확장 된 polyQ 뻗어와 단백질은 유전자 및 병리 HD 및 SCA와 연결되어 있습니다. 영향을받는 단백질의 polyQ 스트레칭의 길이가 특정 Thres를 초과하면이 진보적이고 자주 치명적인 질병 매니페스트보유하고 polyQ 스트레칭의 길이가 8 연장으로 점점 심각해진다.
이들 질환을 치료하기위한 매력적인 방법은 치료 PQC 셀룰러 시스템, 특히 열화 경로를 강화하기위한 것이다. 그러나, 결함이있는 단백질, 포유 동물 세포에서, 특히 이들의 분해에 관여하는 경로가 제대로 이해 남아. 는 프로 테아 좀이 잘못 접힌 단백질의 분해 매우 중요하다는 것을 인식되었지만, 중요한 문제는 정의되지 않은 남아 : 구체적으로 인식 저하를 대상으로하는 방법을 잘못 접힌 단백질. PQC 시스템은 세포질, 소포체 및 미토콘드리아를 포함한 세포 구획에서 확인되었지만 또한, 핵의 PQC 시스템이 불분명 남아있다.
우리 연구소의 최근 연구는 핵으로 잘못 폴딩 된 단백질의 다양성을 인식하고 분해 시스템을 확인한의 포유 동물 세포 9. 이 시스템은 전 골수성 단백질 (PML), 핵 단백질과 노사정 모티브 함유 (TRIM) 단백질 가족의 구성원, 그리고 RNF4, 단백질을 포함하는 RING 도메인으로 구성되어 있습니다. PML 및 다른 여러 TRIM 단백질은 단백질 SUMOylation (10)의 특이성 및 효율을 촉진 SUMO (소 유비퀴틴 같은 개질제) E3 리가 아제 활성을 갖는다. RNF4 그들에게 유비퀴틴 리가 활동 (11)을 준다 링 도메인 이외에 하나 이상의 스모-상호 작용 모티브 (심즈)를 포함 SUMO-대상 유비퀴틴 리가 (STUbL)의 작은 그룹에 속한다. 우리는 PML 특별히 잘못 접힌 단백질에 고유 한 기능을 식별 할 수있다 분리 된 기판 인식 사이트를 통해 잘못 접힌 단백질을 인식하는 것으로 나타났습니다. 바인딩시에, PML 태그 내부 SUMOylation 사이트의 존재로 인해, 폴리 고리를 형성 할 수 SUMO2 / 3의 다결정 체인 거의 동일한 두 개의 포유류 SUMO 단백질과 단백질 미스 폴딩. 에스UMOylated 잘못 접힌 단백질은 그들의 유비퀴틴과 프로 테아 좀 저하로 연결 RNF4에 의해 인식됩니다. 우리는 상기에서 PML 결핍 SCA 유형의 마우스 모델 1 (SCA1) (9)의 행동 및 신경 병리학 적 결함을 악화로 PML-RNF4 시스템은 신경 퇴행에 대한 보호를 위해 중요하다는 것을 보여 주었다.
단백질 수준을 조절할 수있는 다른 셀룰러 메커니즘에서 단백질 분해를 구별하기 위해, 단백질 회전율의 비율은 9를 측정 하였다. 단백질 회전율을 결정하기 위해 가장 많이 사용되는 방법 중 펄스 추적 및 사이클로 헥시 미드 (CHX) 체이스 있습니다. 이 두 가지 방법은 시간이 지남에 따라 조사, 각각 번역-실력 세포와 번역 - 억제 세포에 대한 관심의 총 기존의 단백질에 대한 관심의 방사성 동위 원소 표지 단백질. 그러나, 병원성 및 미스 폴딩하기 쉬운 단백질 연구에 대한 주요 과제는 상기 단백질의 반감기는 매우 싸다 될 수 있다는NG. 예를 들어, Ataxin-1 Ataxin-7, 헌팅, α-시누 클레인 및 TDP-43 모두는 24 시간 이상에 9,12-16 (12)의 반감기를 갖는다. 이들 단백질을 형질 세포, 장기 번역 억제 생존 할 수 특히 잘못 접힌 단백질 때문에 그 자체가 세포에 독성이 높은 수 있기 때문에 이들 단백질의 느린 회전율은 CHX 체이스 분석의 사용을 배제. 동위 원소 표지와 펄스 추적 분석은 매우 집계-경향이 단백질 도전 할 수있다. 대부분의 펄스 체이스 분석은 방사성 표지 된 모든 다른 단백질로부터 관심의 단백질을 분리하는 면역 침전에 의존하고 있습니다. 이 절차는 일반적으로 부정확 한 SDS-PAGE 전기 영동으로 분석을하고, SDS-불용성 집계를 형성 할 수있는 동안 긴 면역 침전 및 세척 절차를 포함한다.
느린 회전율이 9 설명과 함께 여기 프로토콜은 핵 잘못 접힌 단백질을 분석하는. 82 glutamines (Atxn1 82Q)의 스트레칭을 포함 Ataxin-1 (Atxn1)의 병원성 형태는이 목적을 팔에 사용됩니다. 세포에서 발현되면, 핵 (도 1a)에 Atxn1 82Q의 미시적 형태 보이는 개재물의 개선 된 녹색 형광 단백질 (GFP) 융합. 펄스 추적 분석 Ataxn1 82Q의 반감기를 통해 18 시간 9 있음을 알 수있다. Atxn1 82Q는 기본 형태와 미스 폴딩 다른 특성의 입체뿐만 아니라 종 종으로 구성되어있다. 이들 종은 다른 속도로 분해되는 것으로, 따라서 개별적으로 분석해야한다. 에서 해물 Atxn1 82Q-GFP 발현 세포가 NP-40 수용성 (수용성 또는 NS 가능성 천연 단백질 또는 잘못 폴딩 올리고머 / 모노머 단백질을 나타내는)와 NP-40 불용성 (NI, 집계 / 미스 폴딩) 부분으로 분별된다. (; 가능성 무질서 응집체 SS) 또는 (SDS 내성 SR 후자는 또한 SDS 가용성으로 나눌 수있다 가능성 아밀로이드 피 브릴을) 분수 (그림 1B). 스케줄링 분획 면역 다음 여과 지연 분석에 의해 검출 될 수있는 반면에 SS 및 NS 분획 웨스턴 블 롯팅 한 다음 SDS-PAGE로 분석 될 수있다. CHX 체이스 세제 분류 방식을 조합 한 SS Atxn1 82Q의 반감기는 SS 분획 쉽게 인식되고 분해 될 수 있다는 것을 나타내는, NS Atxn1 82Q 총 Atxn1 82Q (도 2a)의 것보다 훨씬 짧다는 것을 발견 세포 9인치 따라서,이 방법은 잘못 폴딩 된 단백질의 동역학을 연구 및 분해 패턴을 비교하는 강력한 도구를 제공한다.
또한 미스 폴딩 된 단백질의 분해를 조절할 수있는 작은 고분자 화합물을 식별하기위한 고 처리량 스크리닝을위한 적합한 방법을 설명한다. 이 방법은 개똥 벌레 루시퍼 라제 (LucDM) (17), 모델 샤페론 기판의 입체 형태 불안정화 변이에 기초한다. 우리는 퓨즈가핵 지역화 신호 (NLS)을 개발 LucDM 검출의 편의를 위해이 세포 구획에서 PQC 시스템을 조사하고 GFP (NLS-LucDM-GFP)합니다. 현미경 NLS-LucDM-GFP 형성 세포 (그림 3A)의 작은 비율에 표시 핵 집계. Atxn1 82Q, NLS는-LucWT --GFP 된 PML-RNF4 경로 9 SUMO2 / 3에 의해 수정 및 규제 NLS-LucDM-GFP-하지만 그 야생형 상대 유사합니다. SS 및 SR 종의 상대적인 양에 비해 최소 NS 있지만 NLS-LucDM-GFP는 아래 프로토콜 3에 기재된 조건을 이용하여, SS 및 SR 종을 형성한다. 분석을 단순화하기 위해, 우리는 SDS에게 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯으로합니다 (NS 및 SS 분획 모두 포함) 가용성 LucDM을 분석 할 수 있습니다. 중요한 CHX 체이스 분석은 SDS 수용성 NLS-LucDM-GFP의 반감기 LucDM 인식하고 열화 시스템의 특정 기판임을 시사는 야생형 카운터 파트 (도 3b)보다 훨씬 짧은 것으로 밝혀잘못 접힌 단백질.
LucDM-GFP의 열화 전체 형광 신호의 현저한 저하를 야기한다. 따라서, 우리는 마이크로 플레이트 형광 계 분석을 이용하여 세포 LucDM-GFP의 실시간 검출에 대한 프로토콜을 개발했다. 많은 높은 처리량 화면 (HTS) 시스템은 비정상적인 단백질 18 ~ 20에 의한 세포 단위 및 세포 생존을 수정하는 약물이나 유전자에 대한 개발된다. 그러나, 거의 HTSs은 특히 포유 동물 세포 저하를 대상으로 설계되었습니다. 이 프로토콜은 셀룰러 미스 폴딩 된 단백질 분해에 대한 단백질 발현, 최저 및 약물 치료 효과의 신속한 대규모 분석을위한 강력한 시스템으로서 기능한다. 우리는 이러한 두 미스 폴딩 된 단백질의 분석 프로토콜을 설명하는 아래의 예로서 HeLa 세포를 사용. 형질 전환 조건으로 시간 경과에 개별 세포주에 대해 최적화 될 필요가있을 수 있지만 분석은 또한, 다른 세포주에 적용 할 수있다.
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Protocol
시약 1. 준비
- 세포 용해 버퍼를 준비한다 (50mM 트리스, pH가 8.8, 100 mM의 NaCl을 5 밀리미터의 MgCl 2, 0.5 % NP-40). 부록 2 mM의 DTT, 1X 완전한 단백질 분해 효소 칵테일, 250 IU / ml의 벤조 나제 사용하기 전에.
- 펠렛 버퍼를 준비합니다 (20 mM 트리스, 산도 8.0, 15 밀리미터의 MgCl 2). 부록 2 mM의 DTT, 사용하기 전에 1 배 완전한 단백질 분해 효소 칵테일 250 IU / ml의 벤조 나제.
- 3X 비점 버퍼 (6 % SDS, 20 mM 트리스, pH를 8.0)을 준비한다. 사용하기 전에 150 mM의 DTT를 보충합니다.
- 마이크로 형광 판독기를 사용하여 분석을위한 낮은 형광 DMEM 매체를 준비합니다. 25 mM의 글루코스, 0.4 mM의 글리신, 0.4 mM의 아르기닌 0.2 mM의 시스테인, 4.0 mM의 글루타민, 0.2 mM의 히스티딘 0.8 밀리미터 이소류신, 0.8mm의 류신 0.8 밀리미터 리신, 0.2 mM의 메티오닌, 0.4mm의 페닐알라닌, 0.4mm의 세린 0.8 믹스 MM의 쓰 레오 닌, 0.078 mM의 트립토판, 0.4 mM의 티로신, 0.8 MM의 발린, 1.8 mM의 염화칼슘 (2), 0.81 mM의 황산, 5.33 mM의 KCl을, 44.0 밀리미터의 NaHCO3, 110 mM의 염화나트륨, 0.9 mM의의 NaH 2 PO 4. pH가 7.4에 염산 또는 수산화 나트륨을 사용하여 용액의 pH를 조정합니다. 여과를 통해 매체를 소독.
참고 :이 매체는 그 철을 제외하고 높은 포도당과 표준 DMEM 매체의 구성 요소가 포함되어 있습니다 (NO 3) 3, 비타민, 페놀 레드는 생략한다. 페놀 레드, 리보플라빈 정규 DMEM 배지에서 피리 독살 크게 형광 신호 (21)의 검출을 방해. 이들 성분이없는 배지 성공적인 생균 GFP 이미징 중요하다. 냉장 저장 될 때 매체는 12 개월 동안 안정하다.
Atxn1 82Q의 GFP 2. 열화 분석
- 접시 약 10 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충 된 DMEM 배지 35mm 접시에 3 × 105 HeLa 세포, O / N 배양 세포가 트랜시 40-60 %의 합류로 성장 후에되도록.
주 : 필요한 판의 수는 시점 및 치료 (D)의 수에 기초아래 escribed. - 제조업체의 지시에 9에 따라 각 잘 사용하여 형질 전환 시약에 Atxn1 82Q-GFP / pRK5 플라스미드의 0.3 μg의와 형질 헬라 세포. DNA와 형질 감염 시약을 함유하는 마스터 형질 감염 혼합물을 각 웰에 대 나누어지는.
- 4 ~ 5 시간 게시물 형질 전환, 여기 파장 450-490 nm의와 GFP 발현 거꾸로 형광 현미경으로 살아있는 세포를 검사합니다. 촬영 후 인큐베이터에 다시 세포를 돌려줍니다.
참고 :이 시점에서 핵 모두 확산 GFP 신호와 GFP 신호의 작은 얼룩을 준수하십시오. - 진공 흡인에 의해 매체를 제거하고 50 μg의 / ㎖의 CHX을 포함하는 2 ml의 신선한 DMEM를 추가합니다. 수확 전에 CHX으로 0, 4, 8, 12 및 16 시간 동안 세포를 처리한다. 프로 테아 좀 저하를 검사하려면 제어로 16 시간 동안 처리 한 접시에 프로 테아 좀 억제제 MG132 (10 μM)를 포함한다.
- 각 시점에서 셀의 한 플레이트를 수확. 진공 흡입에 의해 매체를 제거3 ㎖ 빙냉 1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS)로 두 번 씻어 d는 판. 드라이 아이스에 접시를 스냅 동결.
- 마지막 시점 (16 시간) 후, 얼음처럼 차가운 세포 용해 완충액 150 μL로 (모든 시점에서) 고정 된 세포를 긁어 30 분 동안 얼음 위에서 배양 하였다.
- 4 ℃에서 15 분 동안 17,000 XG에서 벤치 탑 원심 분리기에서 세포 용 해물을 원심 분리기.
- 피펫을 사용하여 다른 튜브에, NP-40 수용성 (NS) 단백질을 포함하는 상층 액을 전송합니다.
주 : 필요한 경우 브래드 포드 분석에 의해 단백질 농도를 측정하기 위해 상청액을 사용한다. - 부드럽게 펠렛을 방해하지 않고 튜브를 약 200 μL의 1X PBS를 첨가하여 펠릿을 씻어. 조심스럽게 진공 흡인 또는 피펫으로 PBS를 제거합니다. 얼음에 15-30 분간 배양 한 후, 150 μl의 빙냉 세포 펠렛을 완충액을 다시 일시.
주 : 재 부유 펠렛 분율은 NP-40 불용성 (NI) 단백질이 포함되어 있습니다. DIAG 그림 1B를 참조하십시오세제 분별의 램. - 펠렛에서 재현 탁 NS 분수와 NP-40 불용성 (NI) 분획으로 3 배 끓는 버퍼의 75 μl를 추가합니다. 5 분간 가열 블록에 95 ° C에서 샘플을 가열한다.
참고 : NP-40 불용의 덩어리는 가열 및 샘플 명확해질 것이다 후 용해시킨다. - 삶은 NS와 NI의 분취 량을 SDS - 겔 로딩 버퍼를 추가합니다. SDS-PAGE 겔에 모든 시간 지점에서 수집 된 샘플의 동일한 볼륨을로드합니다. 시간 0 주에서 수집 된 샘플에서 약 20 μg의 NS의 부피로드에 대응 : NI 파에서 NS뿐만 아니라, SDS-가용성 (SS) 단백질은 SDS 분리 겔 해결할 수 있습니다. 반면, NI 분획에서 SDS-방지 (SR) 집계 겔로드 웰 (그림 1B)에 갇혀있다. 서양 얼룩 검출을 개선하기 위해, NI의 더블 볼륨을로드 할 수 있습니다.
- 반 GFP 항체 및 강화 된 화학 발광 (ECL)를 사용하여 서양 얼룩에 의해 NS 및 SS Atxn1 82Q-GFP를 감지합니다.
주 :이 프로토콜을 사용할 때 SS 분율 Atxn1 82Q 일반적 이하 NS 분수와 비교된다. 긴 ECL 노출은 최적의 신호 필요합니다. - 도트 오 장치 (그림 1B)를 사용하여 필터 지연 분석하여 펠렛 분획에서 SR Atxn1 82Q를 검사합니다. 간단히, 0.2 μm의 셀룰로오스 아세테이트 멤브레인을 들고 도트 오 장치를 설정합니다. 도트 오 장치의 각 웰에 삶은 NI의 부하 80 ~ 120 μL.
주 : SR 응집체의 단지 작은 양의 셀에 형성되기 때문에, 도트 블롯 분석을 위해, 웨스턴 블롯 분석에 사용 된 NS 분획의 부피의 약 10 ~ 15 배이며 SR 분획의 부피를로드.- 진공 막을 통해 시료를 여과 한 후, 멤브레인에 부착 Atxn1 82Q-GFP 응집체는 안티 GFP의 면역 9,12,22에 의해 검출 될 수있다.
참고 : 필터 지연 분석의 자세한 설명은 이전 보고서를 9,12,22를 참조하십시오. 이 단계는 선택 사항입니다SR Atxn1 82Q이 프로토콜에 설명 된 짧은 트랜 따라 SS 및 NS 분획에 비해 최소화하기 때문이다. 또한, SR Atxn1 82Q의 레벨은 크게 CHX 체이스 (도 2B)에 걸쳐 동일하게 유지. 그러나, SS Atxn1 82Q의 양이 초기 실험에서 어떠한 약물 치료 나 유전자 발현을위한 시간이 지남에 따라 영향을 받는지의 여부를 검사하는 것이 여전히 중요하다. SS 단백질 종은 서양 얼룩에 의해 검출 될 수 SDS-PAGE 겔 로딩 우물에 머물. 그러나,이 방법은 덜 민감 이상의 가변 결과 (도 1b)를 생성한다.
- 진공 막을 통해 시료를 여과 한 후, 멤브레인에 부착 Atxn1 82Q-GFP 응집체는 안티 GFP의 면역 9,12,22에 의해 검출 될 수있다.
SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯을 사용하여 NLS-루시 페라 제-GFP 3. 열화 분석
- 접시 약 10 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충 된 DMEM 배지 35mm 접시에 3 × 105 HeLa 세포. O / N 배양 후 40-60 %의 합류 트랜시 도달된다. 필요한 판의 번호 t의 수에 기초IME 점 치료 후술.
- 제조업체의 지시에 9에 따라 각 잘 사용하여 형질 전환 시약으로 1.0 μg의 NLS - 루시 페라 제-GFP / pRK5의 플라스미드 형질 HeLa 세포. 물론 각각의 나누어지는에 대한 DNA 및 형질 전환 시약을 포함하는 마스터 형질 믹스를 확인합니다.
- O / N 형질 전환 (시간 15 정도) 한 후, 여기 파장 450-490 nm의와 GFP 발현 거꾸로 형광 현미경으로 살아있는 세포를 검사합니다. 촬영 후 인큐베이터에 다시 세포를 돌려줍니다.
주 : 핵 확산 GFP 신호가 세포 (70 %)의 대부분에서 관찰 될 수있다. 세포의 작은 비율 (5 %) 핵 집계 있습니다. - 진공 흡인에 의해 매체를 제거하고 50 μg의 / ㎖의 CHX을 포함하는 2 ml의 신선한 DMEM를 추가합니다. 수확 전에 CHX와 0, 1.5, 3, 4.5, 6 시간 동안 세포를 치료. 프로 테아 좀 저하를 검사하려면 제어로 6 시간 동안 처리 한 접시에 추가 프로 테아 좀 억제제 MG132 (10 μM)를 포함한다.
- 각 시점에서 셀의 한 플레이트를 수확. 진공 흡인 배지를 제거하고 3ml를 빙냉 인산염 완충 식염수 (PBS)로 두 번 플레이트를 세척한다. 드라이 아이스에 접시를 스냅 동결.
- 마지막 시점 (6 시간) 후, 세포는 모든 타임 포인트 빙냉 세포 용해 완충액 150 μL로 긁어 30 분 동안 얼음 위에서 배양 냉동 완료된다.
- 최종 2 % SDS의 농도가 50 mM의 DTT에 대한 전체 세포 용 해물에 SDS 겔 로딩 버퍼를 추가합니다. 5 분 동안 95 ℃의 열 블록의 샘플을 인큐베이션.
- SDS-PAGE 및 안티 GFP 항체를 이용하여 웨스턴 블롯에 의해 NLS-루시 페라 제-GFP를 분석합니다. SDS-PAGE 겔에 모든 시간 지점에서 수집 된 샘플의 동일한 볼륨을로드합니다. 볼륨은 약 20 μg의 시간 0에서 수집 된 샘플에서 전체 세포 용 해물의와 일치로드.
형광 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 NLS-루시 페라 제-GFP 4. 실시간 열화 분석
- 종자는 약 1 × 104투명 바닥을 가진 블랙 96- 웰 조직 배양 플레이트에 HeLa 세포. O / N 배양 후 50-70 %의 합류 트랜시 도달된다.
주 : 완전히 현탁 HeLa 세포를 포함하는 배지 60 ㎕를 각 웰에 직접 파종한다. 파종 후 앞뒤로 추가 매체 또는 바위 플레이트를 추가하지 마십시오, 그렇지 않으면 세포가 고르게 분산 될 수있다. - 제조업체의 지시에 따라 각 잘 사용하여 형질 전환 시약에 NLS-루시 페라 제-GFP / pRK5 플라스미드 9 0.05-0.1 μg의와 형질 헬라 세포. DNA와 형질 감염 시약을 함유하는 마스터 형질 감염 혼합물을 각 웰에 대 나누어지는. 세포와 세 개의 우물 각 처리 조건에 대한 배경 형광 신호 제어 역할을 DNA로 형질 전환되지 않습니다.
주 : 형질 변화를 감소시키는 다른 방법은 파종 전 세포를 형질 감염이다. 그러나, 세포의 대부분은 잘못 폴딩 된 단백질로 형질의 연결하거나이 방법을 사용하여 감소 가능성을 보여주기 위해 실패합니다. 몇 가지 세포 독성 잘못 접힌 단백질을 표현할 때 트립신 소화로 인한 스트레스를 참을 수 가능성이 높습니다. 그 결과, 전체의 형광 신호는 크게 감소된다. - 20 ~ 24 시간 형질 전환 한 후, 여기 파장 450-490 nm의와 GFP 발현 거꾸로 형광 현미경으로 살아있는 세포를 검사합니다.
- 진공 흡인에 의해 매체를 제거합니다. 각 웰에 PBS 1X 약 200 μL를 추가 한 후 DMEM 배지의 잔량을 제거 할 대기음.
- 5 % FBS, 50 μg의 / ㎖의 CHX와 낮은 형광 DMEM 매체의 60 μl를 추가합니다. 프로 테아 좀의 열화를 검사하기 위해, 한 세트의 샘플에 추가 테아 좀 억제제 MG132 (10 μM)를 포함한다. 각각의 치료 / 조건 우물 세중를 설정합니다.
참고 :이 FLUO의 저하를 일으킬 수있는 다른 요인을 배제하는 것이 중요하기 때문에 MG132 처리는 프로 테아 좀의 분해 컨트롤로 포함되어 있습니다세포 사멸 형광 소광 포함 rescence 신호. - CHX를 추가 한 후, 형광 플레이트 판독기에 즉시 GFP의 형광 신호를 측정한다.
주 : 소프트웨어 측정 설정을 표 1에 나타낸다. - 최대 8 ~ 10 시간 동안 접시마다 시간을 읽으십시오. 읽은 후, 세포 배양 인큐베이터에 다시 접시를 돌려줍니다.
- 스프레드 시트 파일로 데이터를 내 보냅니다. 형광 강도로 잘 각각의 멀티 - 읽기의 평균 값을 사용합니다. 각 그룹의 시간 0의 평균값을 각 데이터 포인트의 값을 정규화한다. 도 4a 및도 4b,도 5, 우측 패널에 도시 된 바와 같이, 시간이 지남에 따라 표준화 형광 강도를 플롯.
- 반복 측정 (23) 양방향 ANOVA를 사용하여 두 가지 조건 사이의 분해 속도의 통계 분석을 수행합니다.
주 :이 분석에서는, "형광 강도"는 "treatm 반면 종속 변수이며엔트 조건 "및"시간 "은 두 가지 요소이다. 대신 개별 시점에서 데이터를 비교, 반복 측정과 양방향 ANOVA 전체 시간 걸쳐서 두 처리 군 사이의 차이를 분석한다.
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Representative Results
HeLa 세포의 50 %의 형질 감염 (도 1A) 후 20 시간 - 안정된 상태 분석에서, 미시적으로 볼 Atxn1 82Q-GFP의 핵 집합체 (30)에서 관찰 할 수있다. 반 GFP 항체를 이용하여 NS 및 SS 분수의 웨스턴 블롯 분석은 단백질의 분자량 (그림 1B)에 해당하는 100 kDa의 150 kDa의 마커 사이의 Atxn1 82Q-GFP의 고유 한 밴드를 보여줍니다. 스케줄링 분율 Atxn1 82Q-GFP 필터 지연 분석에 의해, 또는 SDS-PAGE 및 스태킹 겔 (도 1b)의 상단 종인 웨스턴 블롯에 의해 어느 하나를 검출 할 수있다. 어떤 대형 핵 집계가 형성되기 전에 상기 프로토콜을 사용하여 반감기 분석을 위해, CHX 체이스 초기 형질 전환 후 4 ~ 5 시간을 시작합니다. SS는 분획 Atxn1 82Q-GFP의 반감기는 약간 또는 16 시간 (도 2a)을 통해 NS 분율 Atxn1 82Q-GFP없이 감소에 대비 약 5 시간이다. degraAtxn1 82Q-GFP의 현지에서 거주 부분적 MG132 (도 2A)로 세포를 처리함으로써 억제된다. 우리는 이전에 PML 자신의 SUMOylation을 홍보하여 잘못 폴딩 된 단백질의 분해를 자극하는 것으로 나타났다. 여기에 우리가 변경된 분해 경로의 예를 들어 PML 최저를 사용합니다. PML siRNA의 치료는 SS 분획 (도 2A)에 Atxn1 82Q-GFP의 반감기를 연장. SR Atxn1 82Q-GFP의 명백한 변화는 제어 또는 PML siRNA를 처리 한 세포 (그림 2B와 2C) 중 하나에서 발견되지 않습니다.
스물 시간 형질 전환 후, NLS-LucDM-GFP 집계는 5 현미경으로 볼 수있게 - 헬라 세포의 15 %, 그러나 이것은 (그림 3A)를 형질 전환되는 DNA의 양에 따라 달라질 수 있습니다. 3 시간 (그림 3B 및 3C) - SDS 용해 NLS-LucDM-GFP의 반감기는 2입니다. 형질 감염된 세포의 형광 강도는 저하 위에CHX 처리 (도 4a 및도 4b)에 따라 시간. 여섯 인사 CHX 처리 후, 형광 강도는 안정 단계에 도달 감소 중지 (도 4a 및도 4b). 동일한 시점에서, 수용성 NLS-LucDM-GFP 나머지 형광 열화에 강한 응집 종으로부터 생성되는 것을 시사한다 (도 3b 및도 3c) 크게 저하된다. 지속적으로, 집계,하지만 확산, GFP는 9 시간 CHX 치료 (그림 4C) 후 세포에 남아 있습니다. 열화 속도가 (도 4a 및 4b)의 영향을받지 않지만 흥미롭게 NLS-LucDM-GFP 플라스미드 더 많은 양을 사용하여 형질 더 핵 응집체뿐 아니라 나머지 형광 높은 강도를 생성한다. 웨스턴 블롯 또는 형광 판독 한 다음 SDS-PAGE를 사용하여, 우리는 MG132 처리 또는 의해 NLS-LucDM-GFP 저하의 억제를 검출 할 수있다 PML의 siRNA (도 3C,도 4a,도 4b 및도 5).
형광 현미경 및 세제 분류하여 Atxn1 82Q-GFP 그림 1. 감지. (A) 헬라 세포는 Atxn1 82Q-GFP로 형질 및 DAPI로 염색 하였다. 개인 및 병합 된 이미지가 표시됩니다. 스케일 바는 10 μm의 =. (B) 2 분자량 마커가 Atxn1 - Atxn 82Q의 웨스턴 블롯 이미지의 왼쪽에 표시되는 프로토콜에 설명 된대로 Atxn1-82Q 발현 세포의 세제 분류를 보여주는 도면이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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. (-) 또는 PML의 siRNA (A 및 C) 또는 처리되지 않은 (B) 세제를 사용하여 분별 Atxn1 82Q-GFP도 2의 분해 분석 HeLa 세포는 이전 제어 처리 하였다. 세포는 Atxn1 82Q-GFP로 형질과 부재 또는 MG132의 존재 CHX 처리 하였다. 세포 용 해물의 분획을 방지 GFP 항체를 사용하여 (NS 및 SS 분수에 대한 A,) 서양 얼룩 뒤에 SDS-PAGE 또는 (SR 부분에 대한 B 및 C) 필터 지연 분석에 의해 분석 하였다. 여기를 클릭하십시오이의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다 이 그림.
NLS-LucDM-GFP 저하의 분석 형광 MICR에 의해 그림 3NLS-LucDM-GFP로 형질 oscopy 및 웨스턴 블롯. (A) 헬라 세포는 DAPI로 염색 하였다. 개인 및 병합 된 이미지가 표시됩니다. 스케일 바는 25 μm의 =. 화살촉은 핵 집계와 셀을 나타냅니다. (B 및 C) 헬라 세포 NLS-LucDM-GFP로 형질 감염 (뒤에 NLS-LucDM-GFP 및 야생형 루시페라아제 융합 단백질 NLS-LucWT-GFP (B)로 형질 감염 또는 제어 또는 PML siRNA를 형질 감염시켰다 C). 나타낸 바와 같이 세포 CHX 및 MG132로 처리 하였다. 전체 세포 용 해물을 항 GFP 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 분석 하였다. 이미지 권한 9 이전의 출판물에서 수정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
NLS-LucDM-GFP 저하 그림 4. 형광 마이크로 기반의 분석. HeLa 세포를 96 웰 플레이트에 접종은 0.05 μg의 (A) 또는 0.1 μg의 (B 및 C) NLS-LucDM-GFP로 형질과의 CHX 처리 하였다 존재 또는 MG132의 부재. (A 및 B)은 웰 형광 강도는 (표준 편차 평균값 ± N = 3) 지시 된 시점에서 측정했다. 오른쪽에있는 패널은 각 치료 그룹에서 시간 0 수치로 정규화 값을 표시하는 반면 왼쪽에 패널은 원래 형광 판독을 보여줍니다. MG132와없이 처리 된 그룹 간의 차이는 반복 측정과 양방향 ANOVA로 분석 하였다. 두 치료군 사이의 P 값이 표시됩니다. (C) 웰 형광 현미경으로 전 또는 9 시간의 CHX 처리 후의 조사 나 CHX 및 MG132 처리 후의 하였다. 더 나은 모두 밝은 집계 NLC-LucDM-GFP와 세포와 희미한 확산 단백질 사람들을 표시하려면, 1.5의 감마 값은 모든 이미지에 적용되었다. 스케일 바 = 100 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5 A는 PML 넉다운 세포 NLS-LucDM-GFP의 열화 속도를 감소시켰다. HeLa 세포는 이미 제어 처리 또는 PML siRNA를 96 웰 플레이트에 접종 하였다. 그림 4에 설명 된대로 NLS-LucDM-GFP의 분해 분석 하였다 (양방향 ANOVA, p <0.0001). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Atxn1 82Q-GFP 그림 6. 형광 CHX의 추적을 통해 변경되지 않습니다. 헬라 세포가 Atxn1 82Q-GFP로 형질했다. 그림 4에 기술 된 바와 같이 24 시간 후 형질 전환, Atxn1 82Q-GFP의 저하를 분석 하였다. 그림은 원래 형광 독서를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
96 웰 플레이트에 시딩 세포질 LucDM-GFP. HeLa 세포의 분해 형광도 7 마이크로 기반 분석법 MG132의 존재 또는 부재하에 처리 CHX 0.1 μg의 LucDM-GFP로 형질 감염시켰다. 도 4에 설명 된 바와 같이 그 결과를 분석 하였다 (양방향 ANOVA; p <0.0001).TPS : //www.jove.com/files/ftp_upload/54266/54266fig7large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1 : 형광 마이크로 플레이트 리더에 측정 설정.
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Discussion
잘못 폴딩 된 단백질의 분해를 조절하는 기전은 세포 단백질의 항상성 유지에 필수적이며, 그들은 가능성 신경 퇴행성 장애 및 기타 단백질 미스 폴딩 질환의 치료를위한 유용한 약물 표적을 나타낸다. 여기서, 미스 폴딩 된 단백질의 분해를 조사 분석은 병원성 Atxn1 단백질 (Atxn1 82Q)와로서는 핵 국부 루시퍼 라제 돌연변이 (NLS-LucDM)를 이용하여 설명한다.
분해 18 시간 이상 반감기가 Atxn1 82Q를 조사하기 위해, 우리는 고전 CHX 9 셀 분류를 결합하여 새로운 방법을 도입했다. 이 방법은 시간이 지남에 Atxn1 82Q의 잘못 폴딩 종의 훨씬 빨리 정리를 한 것으로 밝혀졌습니다. 또한 LucDM의 도입은 잘못 폴딩 된 단백질을 분해 일반적인 메커니즘을 연구하는 모델 미스 폴딩 된 기판을 제공한다. 포유 동물 세포에서 단백질의 미스 폴딩 저하를 검출하는 HTS 시스템에 대한 필요성을 해결하기 위해,S, 우리 LucDM 형광 마이크로 플레이트 리더를 사용하는 빠른 분해 분석을 개발 하였다. 이 시스템은 화학 및 유전 화면을위한 강력한 도구 역할을한다.
Atxn1 82Q 단백질 NS, SS와 세포 용 해물의 SR 분획에 존재한다. 스케줄링 분수는 존경 또는 저하, 예를 들어, 아밀로이드 원 섬유되기 어려운 형태로되어 있음을 시사 형질 전환 후 장기 문화 동안 점점 유행이된다. 쉽게 단백질 분해 경로를 차단할 수 열화 될 수없는 독성 미스 폴딩 종 또는 응집체의 생성, 비정상적인 단백질 24, 25, 26을 제어하는 내인성 세포 장치의 분석을 방해. SR 많은 양의 형성을 방지하기 위해, 우리는 CHX 추격을 초기 형질 전환 후 4 ~ 5 시간을 시작합니다. 우리는 이것이 SS 분획의 분해를 지연시킬 수 세포 조건의 분석에 중요한 것으로 나타났습니다. 형질 전환 시간에 더하여, 그 위에하지 결정적이기도매우 높은 수준 Atxn1 82Q 단백질을 발현하는 세포에 의해 압도하다. 없거나 매우 느린 분해 모든 분획이 관찰되지 않은 경우 Atxn1 82Q 플라스미드 적은 양은 형질 전환을 위해 사용되어야한다. 세포 사멸 세포가이 시점을 넘어 발견 될 때 이상적으로, 분석은 12 시간 이내에 완료해야합니다. 도 2a에서, 제어 셀 SS Atxn1 (82)의 양이 8 시간 짧게 PML siRNA를 처리 한 세포와는 현저하게 다르다. 주의 처리 군에서 차이가 겨우 12 시간 이상이 관찰 된 경우는 세포 생존율이 아닌 단백질 분해에 영향을 미치는 다른 요인에 의해 야기 될 수 있으므로주의해야한다.
NS Atxn1 82Q에 비해 Atxn1 82Q는 SS 분획이 용이 테아 (도 2a)에 의해 분해 될 수있는 미스 폴딩 종류를 나타내는 표시, 신속하게 제거된다. 대조적으로 SR Atxn1 82Q의 수준이 확인하는 동시에 과정 (도 2b) 위에 변하지그것은 취소 분해 종이다. 여전히, SR 분획 분석 직접 세포질 응집체 (예를 들어, 자식 작용)을 제거하는기구를 분석 중요 이들 응집체의 형성에 영향을 미칠 것이다. 눈에 띄게, MG132은 SS 분획에 Atxn1 82Q 감소 방지에 덜 효과적인 것으로 나타납니다. 이것은 Atxn1 82Q의 응집을 촉진 할 수 프로 테아 좀 억제 27시 ROS 수준의 상승으로 인해 발생할 수 있습니다.
LucDM-GFP 분석의 큰 장점은, 형광 플레이트 판독기를 사용하는 HTS 분석에 적용 할 수 있다는 것이다. 우리는 처음에 Atxn1 82Q에 대한 HTS 시스템을 개발하려고 시도했습니다. 전체 Atxn1 82Q 단백질의 작은 분획은 시간이 지남에 따라 저하되기 때문에, GFP-Atxn1 82Q을 발현하는 세포의 형광 CHX 체이스 과정 (도 6)에 걸쳐 크게 변하지. 전체적으로 긴 반감기 다른 잘못 폴딩 된 단백질은 실시간 불소와 유사한 문제가있을 것escent 분석. 대조적으로, 전체 NLS-lucDM-GFP 단백질의 현저한 감소가 관찰된다 (도 3 및도 4). 이 기능은 함께 짧은 반감기 (2-3 시간)으로,이 모델의 보호자 기판이 쉽게 형광 분광법에 의해 검출 될 수 있습니다. 이전 연구에서, GFPu, GFP 단백질은 건설 분해 신호 (CL-1)에 융합 널리 유비퀴틴 - 프로 테아 좀 시스템 (28, 29)의 기능에 대한 리포터로서 사용되어왔다. 또한 세포 및 동물 모델 (30)에서 눈에 띄는 대리 잘못 접힌 단백질이다. GFPu 비교하여, 여기 기재된 분해 분석의 장점은 잘못 폴딩 루시퍼가 널리 사용 모델 샤페론 기판이라는 것이다. 루시페라아제 활성을 조사함으로써, 용이 한 시험 관내 및 생체 내에서 루시퍼 라제의 네이티브 변성 및 폴딩 배좌를 평가할 수있다. 따라서, 우리의 시스템과 단백질 바인딩 및 접는 분석을 연결하는 매우 유용한 플랫폼 역할동일한 기판 (9)을 사용하여 세포 분해 시스템.
출발 형광 강도, 안정된 잔류 형광 강도, 단백질 반감기는 다음의 값을 얻을 수있는 실시간 형광 측정 스루. 이러한 값은 체이스 전에 전체적인 단백질의 양, 분해에 내성 단백질의 양, 단백질 회전율의 비율과 각각 연관된다. 따라서, 서로 다른 레벨과 잘못 폴딩 된 단백질 종의 역학의 포괄적 분석을 실시간 형광 분석을 사용하는 것이 가능하다. 때때로, 복제 중 출발 형광의 상대적으로 큰 변화가 관찰되었다 (예,도 5, 왼쪽 패널). 이것은 셀 시드 또는 형질의 변화에 의해 발생되기 쉽다. 그러나, 출발 형광 강도의 차이에도 불구하고, 모든 복제의 신호는 매우 유사한 속도로 떨어진다. 신호의 정규화 이리저리시간 0에서의 강도에 대한 각 시점보다 정확하게 웰 - 투 - 웰 변동을 줄일 수 m은 분해율 (도 4a,도 4b 및도 5 대 오른쪽 패널 좌)을 반영한다.
핵 형태에 더하여, 또한 세포질 LucDM-GFP를 분석 하였다. 세포질 LucDM-GFP 프로토콜은도 4 (도 7)에서 설명한 것과 동일한 실험 방법이 적용되었을 때, 나머지 형광 높은 비율이 관찰 한 것을 제외하고는 유사한 분해 패턴을 갖는다. 열화 완전이 분석은 테아 저하 통한 세포질 단백질 품질 관리를 모니터링 할 수 나타내는 MG132을 억제 할 수있다. 미래 연구를 들면, 특정 세포 구획 현지화 신호에 융합 할 때 LucDM-GFP가, 다른 세포 구획, 예를 들어, 미토콘드리아 또는 소포체에 적용 할 수 있는지 여부를 탐구하는 흥미로운 일이 될 것이다.
형광 계 분석을위한 프로토콜에 명시된 바와 같이, 형광 배경을 감소시키기 위해 잘 - 투 - 웰 형질 변화를 감소시키기 위해 DNA와 형질 감염 시약 마스터 믹스를 사용하여 낮은 형광 매질을 사용하는 것이 중요하다. 이득 제어 일부 형광 플레이트 판독기에서 조정될 수있다. 대신 최적화 수동으로 게인을 설정하고, 전체 분석 (표 1)에 걸쳐 같은 값을 사용하는 것이 중요하다. 게인의 값이 기록이 검출 한도를 초과하지 않는 한 세포에서 GFP 형광 판독을 최대화하도록 조정될 수있다.
현재 단계에서, 우리는 여전히 LucDM을 표현 형질에 의존하고 있습니다. 편차를 줄이기위한 HTS 분석을 단순화하기 위해, 이후 목표 LucDM의 유도 식 안정한 세포주를 확립하는 것이다. 모두 배경 형광이 마이크로 배양액 그러나, 배경보다 훨씬 높은 GFP 신호를 갖는 중요하다. Unfor하게도, 우리는 최근에 설립 된 안정적인 라인은 모든 LucDM의 낮은 표현이있다. 따라서, 높은 단백질 식 안정된 라인의 개발이 상당히 선별 효율을 향상 할 것이다.
여기서 설명하는 분해 분석은 다른 잘못 폴딩 된 단백질에 적용될 수있다. 인해 잘못 폴딩 된 단백질의 동적 특성으로,이 분석법은 단백질 품질 관리의 심층 메커니즘을 밝히기 위해 다른 분석으로 결합 될 필요가있다. 이러한 분석에는 다른 세포 분획에서 정상 응집체 수준 및 파티션 (도 1)를 측정하고 정제 된 재조합 단백질을 이용하여 접히는 단백질 또는 응집 분석을 포함한다. 이러한 분석은 단백질 분해 또는 집계에 약물이나 유전자 발현의 직접 또는 간접적 인 영향을 구별하는 데 도움이 될 것입니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11995-092 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10082147 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | NP40S-500ML | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| MG132 | Sigma-Aldrich | M8699 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | 45000232 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Boehringer Mannheim | 4693159001 | |
| Bio-Dot Apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Living Colors GFP Monoclonal Antibody | Clonetech | 632375 | |
| Anti-Actin mAb Rabbit, IgG | Sigma-Aldrich | A45060-200UL | |
| Amino acids | Sigma-Aldrich | Amino acids are used for making low fluorecence culturing medium | |
| Olympus IX-81 Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX71/IX81 | |
| 96 Well Black TC Plate w/ Transluscent Clear Bottom | Sigma-Greiner | 89135-048 | |
| Fluorescence Bottom Plate Reader Infinite 200® PRO | TECAN | Infinite 200® PRO | |
| Cellulose acetate membrane 0.2 µm | Sterlitech | CA023001 | |
| Prism 5 | GraphPad | Statistical analysis software |
References
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