Introduction
Proteiner är de mest förekommande makromolekyler i celler, och de spelar en viktig roll i praktiskt taget alla biologiska processer. Den biologiska aktiviteten hos de flesta proteiner kräver deras vikning in och underhålla, de infödda tredimensionella strukturer. Proteiner med avvikande konforma inte bara förlora sina normala funktioner, men också ofta bildar lösliga oligomera arter eller aggregat som försämrar funktionen hos andra proteiner och är giftiga för celler 1,2. För att motverka protein misfolding celler använder både molekylära chaperoner, som hjälper ovikta eller delvis vikta polypeptider för att nå sin nativa konformation och nedbrytningsvägar som eliminerar felveckade proteiner 3. Med tanke på komplexiteten och stokastiska natur fällbara processen, är protein misfolding oundviklig, och det kan inte återföras i fråga om mutationer, biosyntetiska fel, och post-translationella skador 1. Hence, celler förlitar sig ytterst på degradation vägar att behålla sin proteinkvalitet.
Vikten av cellulär protein kvalitetskontroll (PQC) system understryks av förekomsten av protein-misfolding sjukdomar, inklusive cancer, diabetes, och många neurodegenerativa störningar, såsom Alzheimers sjukdom, Parkinsons sjukdom, amyotrofisk lateral skleros, Huntingtons sjukdom (HD), och spinocerebellär ataxi (SCA) 4,5. Till exempel, mutationer i tumörhämmande p53 är den enskilt vanligaste genetiska skada i tumörer, i samband med ~ 50-70% av alla fall 6. En väsentlig fraktion av p53-mutationer är missense-mutationer som förändrar konformationen av p53, vilket leder till bildningen av aggregat 7. Dessutom är proteiner med utökade polyQ sträckor genetiskt och patologiskt samband med HD och SCA. Dessa progressiva och ofta dödliga sjukdomar uppenbart när längden på den polyQ stretch i de påverkade proteinerna överskrider en viss threshålla, och blir allt allvarligare som längden på den polyQ stretch förlänger 8.
En attraktiv metod för behandling av dessa sjukdomar är att terapeutiskt stärka cellulära PQC system, särskilt nedbrytningsvägar. Men de är involverade i nedbrytningen av felaktiga proteiner, särskilt i däggdjursceller, dåligt förblir förstås. Även om det har varit känt att proteasomet är av avgörande betydelse för nedbrytningen av felveckade proteiner, förblir en viktig fråga odefinierad: hur felveckade proteiner specifikt igen och riktade för nedbrytning. Vidare, fastän PQC system har identifierats i cellulära fack inklusive cytoplasman, det endoplasmatiska retiklet, och mitokondrien, de PQC system i kärnan förblir oklara 2.
Nyligen genomförda studier från vårt laboratorium har identifierat ett system som känner igen och försämrar en mängd felveckade proteiner i kärnanav däggdjursceller 9. Detta system består av promyelocytisk protein (PML), ett nukleärt protein och en medlem av den tredelade -områdesbindande innehållande (TRIM) proteinfamiljen, och RNF4, en RING-domän innehållande protein. PML, och flera andra TRIM proteiner har SUMO (liten ubiquitin liknande modifierings) E3 ligasaktivitet, vilket underlättar specificitet och effektivitet av protein SUMOylation 10. RNF4 tillhör en liten grupp av SUMO inriktade ubiquitin ligaser (STUbL), som innehåller en eller flera sumo-interagerande motiv (SIMS), utöver den RING-domän som ger dem den ubiquitin-ligas-aktivitet 11. Vi fann att PML erkänner specifikt felveckade proteiner genom diskreta substratigenkänningsställen som kan urskilja olika egenskaper på felveckade proteiner. Vid bindning, PML taggar felveckade proteiner med poly-kedjor av SUMO2 / 3, två nästan identiska däggdjurs SUMO proteiner som kan bilda poly-kedjorna på grund av förekomsten av en intern SUMOylation webbplats. SUMOylated felveckade proteiner sedan erkänts av RNF4, vilket leder till deras ubikitinering och proteasomal nedbrytning. Vi visade vidare att PML-RNF4 systemet är viktigt för skydd mot neurodegeneration, såsom brist på PML förvärrar beteende och neuropatologiska defekter i en musmodell för SCA typ 1 (SCA1) 9.
För att skilja proteinnedbrytning från andra cellulära mekanismer som kan reglera proteinnivåer, var andelen proteinomsättningen mätt 9. Bland de mest använda metoderna för att bestämma proteinomsättning är puls jaga och cykloheximid (CHX) jaga. Dessa två metoder undersöka tiden, respektive, de radioisotopmärkta proteiner av intresse i översättnings skicklig celler och totala redan existerande proteiner av intresse i översättnings inhiberade celler. Men det är en stor utmaning för att studera patogena och felveckning benägna proteiner som halveringstiden av dessa proteiner kan vara extremt long. Till exempel, ataxin-1, ataxin-7, Huntingtin, α-synuklein, och TDP-43 har alla halveringstider på mer än 12 till 24 timmar 9,12-16. Den långsamma personalomsättning av dessa proteiner utesluter användningen av CHX jaga analysen eftersom cellerna hyser dessa proteiner inte kan överleva längre översättning inhibition, särskilt eftersom de felveckade proteiner själva kan vara mycket giftiga för celler. Puls-chase analys med isotopmärkning kan också vara en utmaning för proteiner som är mycket aggregering benägna. De flesta puls jaga analyser förlitar sig på immunoutfällning för att separera proteinet av intresse från alla andra proteiner som också är radioaktivt märkta. Detta förfarande omfattar normalt långa immunoprecipitation och tvättförfaranden, under vilken SDS-olösliga aggregat kan bildas, vilket gör analysen med SDS-PAGE-elektrofores felaktig.
Här ett protokoll för att analysera kärn felveckade proteiner med en långsam omsättningshastighet beskrivs 9. En patogen form av ataxin-1 (Atxn1) som innehåller en sträcka av 82 glutaminer (Atxn1 82Q) används för detta ändamål 8. När den uttrycks i celler, en förbättrad grönt fluorescerande protein (GFP) fusion av Atxn1 82Q former mikroskopiskt synliga inneslutningar i kärnan (Figur 1A). Puls chase analys visar att halveringstiden för Ataxn1 82Q är över 18 timmar 9. Atxn1 82Q består av arter med felveckade konformationer av olika egenskaper, liksom arter med nativ konformation. Det är troligt att dessa arter bryts ned i olika takt, och därför bör analyseras separat. Lysat från Atxn1 82Q-GFP-uttryckande celler fraktioneras i NP-40-löslig (lösligt eller NS, sannolikt representerar nativa proteiner eller felveckade mono / oligomera proteiner) och NP-40 olöslig (NI, aggregerad / felveckade) delar. Det senare kan ytterligare delas in i SDS-löslig (SS, sannolikt oordnade aggregat) eller SDS-resistenta (SR, sann amyloidfibriller) Fraktioner (Figur 1B). NS och SS-fraktioner kan analyseras genom SDS-PAGE följt av Western blotting, under det att SR-fraktionen kan detekteras genom filter retardation assays följt av immunoblotting. CHX chase kombineras med detergenten fraktioneringsmetoden, och upptäckte att halveringstiden för SS Atxn1 82Q är mycket kortare än den hos NS Atxn1 82Q och total Atxn1 82Q (figur 2A), vilket indikerar att SS-fraktionen kan kännas igen och bryts ned i celler 9. Således ger denna metod ett kraftfullt verktyg för att studera dynamiken i felveckade proteiner och jämföra deras mönster nedbrytning.
Vi beskriver också en metod som är lämplig för högeffektiv screening för identifiering av makromolekyler eller små föreningar som kan modulera nedbrytningen av felveckade proteiner. Denna metod är baserad på en konformationsmässigt destabiliserad mutant av eldflugeluciferas (LucDM) 17, en modell chaperone substrat. Vi har säkringd LucDM till en nukleär lokaliseringssignal (NLS) för att söka av PQC system i detta cellulär avdelning, och GFP (NLS-LucDM-GFP) för att underlätta detektering. NLS-LucDM-GFP former mikroskopiskt synliga kärn aggregat i en liten andel av celler (figur 3a). Liknar Atxn1 82Q, NLS-LucDM-GFP-men inte dess vildtyp motsvarighet NLS-LucWT-GFP-modifieras genom SUMO2 / 3 och reglerade av PML-RNF4 reaktionsväg 9. NLS-LucDM-GFP utgör också SS och SR arter, även om de relativa mängderna av SS och SR arter är minimal jämfört med NS, med användning av de betingelser som beskrivs i protokoll 3 nedan. För att förenkla analysen kan vi endast analysera SDS lösliga LucDM (inkluderande både NS och SS-fraktioner) genom SDS-PAGE och western blöt. Viktigare, visade CHX chase assay som halveringstiden av SDS-lösliga NLS-LucDM-GFP är mycket kortare än den hos dess vildtyp motsvarighet (figur 3B), vilket antyder att LucDM är ett specifikt substrat för systemet som känner igen och bryts nedfelveckade proteiner.
Nedbrytningen av LucDM-GFP orsakar en betydande nedgång i den totala fluorescenssignal. Därför har vi också utvecklat ett protokoll för realtidsdetektion av cellulär LucDM-GFP med hjälp av mikro fluorescens-baserad analys. Många hög genomströmning skärm (HTS) system utvecklas för läkemedel eller gener som modifierar cellulära aggregat och cellulär viabilitet orsakas av avvikande proteiner 18-20. Emellertid är mycket få HTSs särskilt utformade för inriktning nedbrytning i däggdjursceller. Detta protokoll fungerar som ett robust system för snabb och storskalig analys av effekterna av proteinuttryck, knockdown, och läkemedelsbehandling på cellulär felveckade proteinnedbrytning. Använda HeLa-celler som exempel nedan beskriver vi de protokoll för analys av dessa två felveckade proteiner. Analyserna kan också tillämpas på andra cellinjer, även om transfektion villkor och tidsförlopp kan behöva optimeras för enskilda cellinjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning av reagens
- Förbereda cellysbuffert (50 mM Tris, pH 8,8, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,5% NP-40). Supplement 2 mM DTT, 1x komplett proteas cocktail, och 250 IE / ml bensonas före användning.
- Förbereda pelletbuffert (20 mM Tris, pH 8,0, 15 mM MgCl2). Supplement 2 mM DTT, 1x komplett proteas cocktail och 250 IE / ml bensonas före användning.
- Förbereda 3x kokande buffert (6% SDS, 20 mM Tris, pH 8,0). Supplement 150 mM DTT före användning.
- Framställa låg-fluorescens DMEM-medium för analyser med användning av mikroplattfluorescensläsare. Blanda 25 mM glukos, 0,4 mM glycin, 0,4 mM arginin, 0,2 mM cystein, 4,0 mM glutamin, 0,2 mM histidin, 0,8 mM isoleucin, 0,8 mM leucin, 0,8 mM lysin, 0,2 mM metionin, 0,4 mM fenylalanin, 0,4 mM serin, 0,8 mM treonin, 0,078 mM tryptofan, 0,4 mM tyrosin, 0,8 mM valin, 1,8 mM CaCl2, 0,81 mM MgSO 4, 5,33 mM KCl, 44,0 mM NaHCOs 3, 110 mM NaCl, 0,9 mMNaH 2 PO 4. Justera pH i lösning med användning av HCl eller NaOH till pH 7,4. Sterilisera mediet genom filtrering.
OBS: Detta medium innehåller komponenterna i standard DMEM-medium med hög glukoshalt med undantag av att Fe (NO 3) 3, vitaminer och fenolrött är utelämnade. Fenolrött, riboflavin och pyridoxal regelbunden DMEM odlingsmedium på ett påtagligt sätt detekteringen av fluorescenssignalen 21. Odlingsmedium utan dessa komponenter är avgörande för framgångsrik levande cell GFP avbildning. Mediet är stabil under 12 månader vid förvaring i kylskåp.
2. Nedbrytning Analys av Atxn1 82Q GFP
- Plattan ca 3 x 10 5 HeLa-celler i 35 mm plattor med DMEM-medium som kompletterats med 10% fetalt bovint serum (FBS), så att efter O / N odling av celler växa till ett sammanflöde av 40-60% vid tiden för transfektion.
OBS: Antalet plattor som behövs är baserat på antalet tidpunkter och behandlingar described nedan. - Transfektera HeLa-celler med 0,3 mikrogram av Atxn1 82Q-GFP / pRK5-plasmid till varje brunn med hjälp av transfektion reagens enligt tillverkarens anvisningar 9. Göra en master transfektion blandning innehållande DNA och transfektionsreagens och delprov den för varje brunn.
- 4-5 h efter transfektion, undersöka levande celler under ett inverterat fluorescerande mikroskop för GFP uttryck med excitationsvåglängd 450-490 nm. Retur celler tillbaka till inkubator efter bildalstring.
OBS: Beakta båda diffunderade GFP signaler och små prickar av GFP signaler i kärnan vid denna tidpunkt. - Avlägsna mediet genom vakuumsugning och tillsätt 2 ml färskt DMEM innehållande 50 | ig / ml CHX. Behandla celler för 0, 4, 8, 12 och 16 h med CHX före skörd. För att undersöka proteasomal nedbrytning, inkluderar proteasom-inhibitor MG132 (10 ^ M) i en platta behandlades under 16 h som en kontroll.
- Skörda en platta med celler vid varje tidpunkt. Ta bort mediet genom vakuumsugning end tvätta plattorna två gånger med 3 ml iskall 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Snap-frysa plattan på torris.
- Efter den sista tidpunkten (16 h), skrapa de frysta cellerna (från alla tidpunkter) in i 150 | il iskall cellysbuffert och inkuberades på is under 30 min.
- Centrifugera cellysat i en bordscentrifug vid 17.000 xg under 15 min vid 4 ° C.
- Överför supernatanten, som innehåller NP-40-lösliga (NS) -proteiner, till ett annat rör med hjälp av en pipett.
OBS: Använd supernatanter för att mäta proteinkoncentrationer av Bradford-analys om det behövs. - Skölj pelletarna genom att försiktigt tillsätta ungefär 200 | il 1 x PBS till rören utan att störa pellets. Försiktigt bort PBS genom vakuumsugning eller pipett. Återsuspendera dem i 150 ul iskall cell pelletbuffert, följt av 15-30 min inkubation på is.
OBS: Den återsuspenderade pelleten fraktionen innehåller NP-40 olösliga (NI) proteiner. Se figur 1B för en diagbagge av detergent fraktionering. - Lägg 75 pl 3x kokande buffert i NS fraktioner och NP-40 olösliga (NI) fraktioner återsuspenderade från pellets. Värm proverna vid 95 ° C på ett värmeblock under 5 min.
OBS: Klumpar i NP-40 olösliga fraktioner löses efter värmning och prover kommer att bli klart. - Lägg SDS-gelladdningsbuffert till en delmängd av kokt NS och NI. Ladda lika stor volym av prover som tagits från alla tidpunkter till SDS-PAGE-gel. Volym laddade motsvarar cirka 20 mikrogram av NS från prov som tagits vid tiden 0. OBS: NS, liksom SDS-lösliga (SS) protein från NI fraktion, kan lösas genom SDS separerande gel. Däremot är SDS-resistent (SR) aggregat från NI fraktion fastnat i gel satsrummen (Figur 1B). För att förbättra western blot upptäckt, kan dubbla volymen av NI laddas.
- Detektera NS och SS Atxn1 82Q-GFP med Western blöt med användning av anti-GFP-antikropp och förstärkt kemiluminescens (ECL).
OBS: Atxn1 82Q i SS fraktionen i allmänhet lägre jämfört med NS fraktion när du använder detta protokoll. Längre ECL exponering behövs för optimala signaler. - Undersök SR Atxn1 82Q från pelletfraktionen av filter retardation analyser med hjälp av en dot-blot-apparaten (Figur 1B). I korthet, inrätta en dot-blot-apparat som innehar en 0,2 um cellulosaacetatmembran. Belastning 80-120 | il av kokt NI i varje brunn av dot-blot-apparaten.
OBS: Som endast små mängder av SR aggregat bildas i celler, för dot blot-analysen, ladda en volym av SR-fraktionen som är ungefär 10-15 gånger av volymen av den NS fraktion som används för Western blot-analys.- Efter filtrering av proverna genom membranet genom vakuum, kan Atxn1 82Q-GFP-aggregat fastnat på membranet detekteras genom anti-GFP-immunblotting 9,12,22.
OBS: Se tidigare rapporter 9,12,22 för detaljerad beskrivning av filter retardation analys. Detta steg är valfritteftersom SR Atxn1 82Q är minimal jämfört med SS och NS fraktioner efter kort transfektion beskrivs i detta protokoll. Dessutom är nivåerna av SR Atxn1 82Q i stort sett densamma över CHX chase (Figur 2B). Det är dock fortfarande viktigt att undersöka om de mängder av SS Atxn1 82Q påverkas över tiden för varje läkemedelsbehandling eller genuttryck i inledande experiment. SS proteinspecies stanna i SDS-PAGE-gel satsrum kan detekteras genom Western blot. Emellertid är denna metod mindre känslig och genererar fler varierande resultat (figur 1B).
- Efter filtrering av proverna genom membranet genom vakuum, kan Atxn1 82Q-GFP-aggregat fastnat på membranet detekteras genom anti-GFP-immunblotting 9,12,22.
3. Nedbrytning Analys av NLS-luciferas-GFP med användning av SDS-PAGE och Western Blöt
- Plattan ca 3 x 10 5 HeLa-celler i 35 mm plattor med DMEM-medium som kompletterats med 10% fetalt bovint serum (FBS). Efter O / N odling, är ett sammanflöde av 40-60% uppnåtts vid tidpunkten för transfektion. Antalet plattor som behövs är baserat på antalet tIME punkter och behandlingar som beskrivs nedan.
- Transfektera HeLa-celler med 1,0 | j, g NLS-luciferas-GFP / pRK5-plasmid in i varje brunn med hjälp av transfektionsreagens enligt tillverkarens instruktioner 9. Göra en master transfektion blandning innehållande DNA och transfektion reagens för alikvot av varje brunn.
- Efter O / N transfektion (ca 15 tim), undersöka levande celler under ett inverterat fluorescerande mikroskop för GFP uttryck med excitationsvåglängd 450-490 nm. Retur celler tillbaka till inkubator efter bildalstring.
OBS: Diffust nukleär GFP-signal kan observeras i de flesta av cellerna (70%). En liten andel (5%) av celler har kärn aggregat. - Avlägsna mediet genom vakuumsugning och tillsätt 2 ml färskt DMEM innehållande 50 | ig / ml CHX. Behandla celler för 0, 1,5, 3, 4,5 och 6 timmar med CHX före skörd. För att undersöka proteasomal nedbrytning, omfattar ytterligare proteasomhämmaren MG132 (10 ^ M) i en platta behandlades i 6 timmar som kontroll.
- Skörda en platta med celler vid varje tidpunkt. Avlägsna mediet genom vakuumsugning och tvätta plattorna två gånger med 3 ml iskall fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Snap-frysa plattan på torris.
- Efter den sista tidpunkten (6 tim) är klar, celler frystes vid all-time punkter skrapas ned i 150 pl iskall cellysbuffert och inkuberades på is under 30 min.
- Lägga SDS-gel-laddningsbuffert till helcellslysat för en slutkoncentration av 2% SDS och 50 mM DTT. Inkubera proverna på ett värmeblock vid 95 ° C under 5 min.
- Analysera NLS-luciferas-GFP genom SDS-PAGE och Western blöt med användning av anti-GFP-antikropp. Ladda lika stor volym av prover som tagits från alla tidpunkter till SDS-PAGE-gel. Volymen laddade motsvarar cirka 20 mikrogram av hela cellysat från prov som tagits vid tiden 0.
4. Realtids Nedbrytning Analys av NLS-luciferas-GFP användning av fluorescensmikroplattläsare
- Seed cirka 1 x 10 4HeLa-celler i svarta 96-brunnars vävnadskulturplattor med transparent botten. Efter O / N odling, är ett sammanflöde av 50-70% uppnåtts vid tidpunkten för transfektion.
OBS: 60 | il medium innehållande fullständigt suspenderade HeLa celler ympas direkt i varje brunn. Inte lägga till ytterligare medium eller stenplatta fram och tillbaka efter sådd, annars celler kan fördelas ojämnt. - Transfektera HeLa-celler med 0,05-0,1 pg av NLS-luciferas-GFP / pRK5 plasmid 9 till varje brunn med hjälp av transfektion reagens enligt tillverkarens anvisningar. Göra en master transfektion blandning innehållande DNA och transfektionsreagens och delprov den för varje brunn. Tre brunnar med celler är inte transfekteras med DNA, som tjänar som kontroll för bakgrundsfluorescenssignalen för varje behandlingsbetingelse.
OBS: Ett alternativt sätt att minska transfektion variant är att transfektera celler innan sådd. Emellertid en stor del av celler transfekterade med felvikt proteins misslyckas med att fästa eller uppvisa minskad livsduglighet med denna metod. Det är troligt att vissa celler kanske inte stå stress som orsakas av trypsin matsmältningen när uttrycka toxiska felveckade proteiner. Som ett resultat, är den totala fluorescenssignalen minskas betydligt. - 20-24 timmar efter transfektion, undersöka levande celler under ett inverterat fluorescerande mikroskop för GFP uttryck med excitationsvåglängd 450-490 nm.
- Ta bort mediet genom vakuumsugning. Tillsätt ca 200 | j, l 1 x PBS till varje brunn och därefter aspirera den för att avlägsna kvarvarande mängd av DMEM-medium.
- Tillsätt 60 | il av låg fluorescens DMEM-medium med 5% FBS och 50 | ig / ml CHX. För att undersöka proteasomal nedbrytning, omfattar ytterligare proteasomhämmaren MG132 (10 ^ M) i en uppsättning av prover. Ställ triplikat av brunnar för varje behandling / skick.
OBS: MG132 behandling ingår som kontroller för proteasomal nedbrytning, eftersom det är viktigt att utesluta andra faktorer som kan orsaka droppe fluorescence signal, inklusive celldöd och fluorescenssläckning. - Mät fluorescenssignalen av GFP omedelbart på en fluorescerande plattläsare efter tillsats CHX.
OBS: Inställningarna för mätning programvara visas i tabell 1. - Läs plattan varje timme för upp till 8-10 timmar. Efter att ha läst tillbaka plattan tillbaka till cellodlingsinkubator.
- Exportera data som kalkylark. Använd medelvärdet av multi-läser för varje brunn som fluorescensintensitet. Normalisera värdena för varje datapunkt till medelvärden of Time 0 i respektive grupp. Plotta den normaliserade fluorescensintensiteten över tiden såsom visas i fig 4A och 4B, och fig 5, högra panelerna.
- Utför statistisk analys av nedbrytningshastigheten mellan två villkor med hjälp av tvåvägs ANOVA med upprepade mätningar 23.
OBS: I denna analys är "fluorescensintensitet" den beroende variabeln medan "behandlingsrument förhållanden "och" tid "är de två faktorer. I stället för att jämföra data vid enskilda tidpunkter, tvåvägs ANOVA med upprepade mätningar analyserar skillnaden mellan de två behandlingsgrupperna under hela tidsförloppet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I ett stabilt tillstånd analys, kan observeras mikroskopiskt synliga Atxn1 82Q-GFP-nukleära aggregat hos 30 - 50% av HeLa-celler 20 h efter transfektion (Figur 1A). Western blot-analys av NS och SS fraktioner med användning av anti-GFP-antikropp visar en distinkt band av Atxn1 82Q-GFP mellan 100 kDa och 150 kDa markörer, vilket motsvarar proteinets molekylvikt (Figur 1B). Atxn1 82Q-GFP i SR-fraktionen kan detekteras antingen genom filter retardation analys eller genom SDS-PAGE och western blot som arter på toppen av uppstaplingsgelen (Figur 1B). För halveringstiden analys med användning av protokoll som beskrivs ovan, börjar CHX chase 4-5 h efter initial transfektion innan några stora nukleära aggregat bildas. Halveringstiden av Atxn1 82Q-GFP i SS-fraktionen är ca 5 h, i motsats till en liten eller ingen minskning av Atxn1 82Q-GFP i den NS-fraktionen över 16 h (figur 2A). den Degradation av Atxn1 82Q-GFP är delvis inhiberas genom behandling av cellerna med MG132 (Figur 2A). Vi visade tidigare att PML stimulerar nedbrytningen av felveckade proteinet genom att främja deras SUMOylation. Här använder vi PML knockdown som ett exempel på förändrad nedbrytningsväg. PML siRNA behandling förlängde halveringstiden för Atxn1 82Q-GFP i SS fraktionen (Figur 2A). Inga uppenbara förändringar i SR Atxn1 82Q-GFP detekteras i antingen kontroll eller PML siRNA-behandlade celler (figur 2B och 2C).
Tjugo timmar efter transfektion, NLS-LucDM-GFP aggregat blir mikroskopiskt synliga i 5-15% av HeLa-celler, men detta kan variera beroende på mängden DNA som transfekteras (Figur 3A). Halveringstiden av SDS lösliga NLS-LucDM-GFP är 2-3 h (fig 3B och 3C). Fluorescensintensiteten hos transfekterade celler minskar också övertid på CHX behandling (figur 4A och 4B). Sex timmar efter CHX behandling, når fluorescensintensiteten ett stabilt stadium och slutar att minska (figur 4A och 4B). Vid samma tidpunkt, är löslig NLS-LucDM-GFP i hög grad nedbrutna (fig 3B och 3C), vilket antyder att den kvarvarande fluorescensen genereras från aggregerade arter som är resistenta mot nedbrytning. Konsekvent, sammanställd, men inte sprids förblir GFP i celler nio timmar efter CHX behandling (Figur 4C). Interestingly, transfektion med användning av en högre mängd av NLS-LucDM-GFP plasmid genererar fler nukleära aggregat såväl som högre intensitet av återstående fluorescens, även om nedbrytningshastigheten inte påverkas (figur 4A och 4B). Med användning av antingen SDS-PAGE följt av Western blöt eller fluorescensavläsning, har vi möjlighet att detektera inhibering av NLS-LucDM-GFP nedbrytning genom MG132 behandling eller PML siRNA (figurerna 3C, 4A, 4B och 5).
Figur 1. Detektion av Atxn1 82Q-GFP genom fluorescerande mikroskopi och tvättmedel fraktionering. (A) HeLa-celler transfekterades med Atxn1 82Q-GFP och färgades med DAPI. Individuella och sammanslagna bilder visas. Skalstreck = 10 | im. (B) ett diagram som visar detergentfraktionering av Atxn1-82Q uttryckande celler som beskrivs i protokoll 2. Molekylviktmarkörer indikeras till vänster om västra blot bilder av Atxn1-Atxn 82Q. Klicka här för att se en större version av denna siffra .
66 / 54266fig2.jpg "/>
. Figur 2. Nedbrytning analys av Atxn1 82Q-GFP använder detergentfraktionering HeLa-celler som tidigare behandlats med kontroll (-) eller PML siRNA (A och C) eller obehandlade (B). Celler transfekterades med Atxn1 82Q-GFP och behandlades med CHX i frånvaro eller närvaro av MG132. Cellysat Fraktionerna analyserades med SDS-PAGE följt av Western blöt (A, för NS och SS fraktioner) eller retardation analysfilter (B och C, för SR fraktion) med hjälp av anti-GFP-antikropp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Analys av NLS-LucDM-GFP nedbrytning av fluorescens microscopy och Western blöt. (A) HeLa-celler transfekterade med NLS-LucDM-GFP färgades med DAPI. Individuella och sammanslagna bilder visas. Skalstreck = 25 | im. Pilspets indikerar en cell med nukleära aggregat. (B och C) HeLa-celler transfekterades med NLS-LucDM-GFP och vildtyp luciferas-fusionsprotein NLS-LucWT-GFP (B), eller transfekterade med kontroll eller PML siRNA, följt av transfektion med NLS-LucDM-GFP ( C). Celler behandlades med CHX och MG132 såsom anges. Hela cellysat analyserades genom Western blöt med användning av anti-GFP-antikropp. Bilden ändras från föregående publicering med tillstånd 9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Fluorescerande mikroplattbaserad analys för NLS-LucDM-GFP nedbrytning. HeLa-celler ympades på plattor med 96 brunnar transfekterades med 0,05 | j, g (A) eller 0,1 | j, g (B och C) NLS-LucDM-GFP och behandlades med CHX i närvaro eller frånvaro av MG132. (A och B) fluorescensintensiteterna av brunnarna mättes vid de angivna tidpunkterna (Medelvärden ± standardavvikelser, n = 3). Paneler till vänster visar den ursprungliga fluorescens läsning, medan panelerna till höger visar de värden normaliserade till värden vid tiden 0 i respektive behandlingsgrupperna. Skillnaden mellan de grupper som behandlades med och utan MG132 analyserades genom tvåvägs ANOVA med upprepade mätningar. P-värden mellan de två behandlingsgrupperna är indikerade. (C) Wells undersöktes före eller efter nio timmar CHX behandling, eller efter CHX och MG132 behandling av fluorescensmikroskop. För att bättre visa både celler med ljus aggregerade NLC-LucDM-GFP och de med svag diffust proteinet, gammavärdet på 1,5 tillämpas på alla bilder. Skalstreck = 100 nm. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. En reducerad nedbrytning av NLS-LucDM-GFP i PML knockdown celler. HeLa-celler som tidigare behandlats med kontroll eller PML siRNA såddes i plattor med 96 brunnar. Nedbrytning av NLS-LucDM-GFP analyserades såsom beskrivs i figur 4 (tvåvägs ANOVA, p <0,0001). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
54.266 / 54266fig6.jpg "/>
Figur 6. Fluorescens av Atxn1 82Q-GFP är oförändrad över CHX chase. HeLa-celler transfekterades med Atxn1 82Q-GFP. 24 timmar efter transfektion, nedbrytning av Atxn1 82Q-GFP analyserades såsom beskrivs i figur 4. Figuren visar den ursprungliga fluorescensavläsning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7. Fluorescerande mikroplattbaserad analys för nedbrytning av cytoplasmiska LucDM-GFP. HeLa-celler sådda på 96-brunnsplattor transfekterades med 0,1 ^ g LucDM-GFP behandlades med CHX i närvaro eller frånvaro av MG132. Resultaten analyserades såsom beskrivs i figur 4 (två-vägs ANOVA, p <0,0001).TPS: //www.jove.com/files/ftp_upload/54266/54266fig7large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1 .: Mätnings inställningar på fluorescensmikroplattläsare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mekanismer som reglerar nedbrytningen av felveckade proteiner är nödvändiga för att bibehålla homeostas cellulära proteiner, och de representerar sannolikt värdefulla läkemedelsmål för behandling av neurodegenerativa sjukdomar och andra protein misfolding sjukdomar. Här är analyser som undersöker nedbrytningen av felveckade proteiner som beskrivs med hjälp av en patogen Atxn1 protein (Atxn1 82Q) och en nukleär lokaliserad luciferas mutant (NLS-LucDM) som exempel.
För att undersöka nedbrytningen Atxn1 82Q, som har en halveringstid över 18 timmar, införde vi en ny metod genom att kombinera cellfraktionering med klassisk CHX 9. Denna metod visade en mycket snabbare avslut av felveckade arter av Atxn1 82Q över tiden. Dessutom ger införandet av LucDM en modell felvikt substrat för att studera allmänna nedbrytningsmekanismer av felveckade proteiner. Att ta itu med behovet av en HTS system för detektering av felveckade proteinnedbrytning i däggdjurscellers, utvecklade vi en snabb analys nedbrytning för LucDM användning av fluorescensmikroplattläsare. Systemet fungerar som ett kraftfullt verktyg för kemiska och genetiska skärmar.
Den Atxn1 82Q proteinet är närvarande i NS, SS och SR fraktioner av cellysat. SR fraktionerna blivit allt vanligare under långvarig odling efter transfektion, vilket tyder på att det är i en form som är svår att vördas eller försämras, till exempel, de amyloidfibriller. Utveckling av giftiga felveckade arter eller aggregat som inte lätt kan brytas ned kan blockera proteinnedbrytningsvägar, vilket hindrar analys av endogena cellulära maskineriet styra avvikande proteiner 24, 25,26. Att undvika bildning av en stor mängd av SR, börjar vi CHX chase 4-5 h efter initial transfektion. Vi har funnit att detta är avgörande för analysen av cellulära betingelser som kan fördröja nedbrytningen av SS-fraktionen. I tillägg till transfektion tid, är det också viktigt att inte överwhelm celler genom att uttrycka Atxn1 82Q-protein vid mycket höga nivåer. Om ingen eller mycket långsam nedbrytning observeras för alla fraktioner, bör mindre mängd Atxn1 82Q plasmiden användas för transfektion. Helst bör analysen vara klar inom 12 timmar som apoptotiska celler märkt bortom denna tidpunkt. I figur 2A, är mängden SS Atxn1 82 i kontrollceller slående olik från den i PML siRNA-behandlade celler så korta som 8 tim. Försiktighet måste tas om en skillnad i den behandlade gruppen endast observeras efter 12 timmar, eftersom det kan bero på andra faktorer som påverkar cellviabiliteten snarare än proteinnedbrytning.
Jämfört med NS Atxn1 82Q, Atxn1 82Q i SS-fraktionen elimineras snabbt, vilket tyder på att den representerar en felveckade arter som lätt kan brytas ned av proteasomen (Figur 2A). Däremot halterna av SR Atxn1 82Q oförändrade under samma tidsförlopp (figur 2B), vilket bekräftaratt det är en icke-nedbrytbara arter. Ändå bör analys av SR fraktionen vara viktigt för analys av mekanismer som direkt avlägsnar cytoplasmiska aggregat (t.ex. Autophagy) eller påverka bildningen av dessa aggregat. Märkbart verkar MG132 att vara mindre effektiva för att förhindra Atxn1 82Q minskning av SS-fraktionen. Detta kan bero på höjden i ROS nivåer vid proteasomhämning 27, som kan främja sammanläggning av Atxn1 82Q.
En stor fördel med LucDM-GFP-analysen är att den kan anpassas till HTS-analys med användning fluorescensplattläsare. Vi försökte först att utveckla ett HTS-system för Atxn1 82Q. Men eftersom endast en liten del av den totala Atxn1 82Q protein bryts ned över tiden, fluorescens av celler som uttrycker GFP-Atxn1 82Q stort sett oförändrad under loppet av CHX jaga (Figur 6). Andra felveckade proteiner med totala lång halveringstid skulle ha liknande problem med realtids fluorescent assay. I motsats härtill är en markant minskning av den totala NLS-lucDM-GFP-proteinet observerade (figurerna 3 och 4). Denna funktion, tillsammans med dess korta halveringstid (2-3 timmar), gör den här modellen förkläde substrat som lätt detekteras genom fluorescensspektroskopi. I tidigare studier, GFPu, GFP-proteinet smält till en konstruktiv signal nedbrytning (CL-1) har använts i stor utsträckning används som en reporter för funktionaliteten av ubiquitin-proteasom systemet 28,29. Det är också en framstående surrogat felvikt protein i cell- och djurmodeller 30. Jämfört med GFPu, är en fördel med den analys nedbrytning beskrivs här att felvikt luciferas är en flitigt modell chaperone substrat. Genom att undersöka luciferasaktivitet, kan man enkelt bedöma de infödda, denaturerade, och återveckade konforma av luciferas in vitro och in vivo. Således fungerar vårt system som en mycket användbar plattform för att ansluta proteinbindning och hopfällbara analyser medcellulärt system nedbrytning med användning av samma substrat 9.
Genom realtidsfluorescensmätning följande värden kan erhållas: Utgångsfluorescensintensiteten, stabil återstående fluorescens intensitet och protein halveringstid. Dessa värden är korrelerade respektive med mängden totalprotein före chase, mängden proteiner som är resistenta mot nedbrytning, och hastigheten för proteinomsättning. Därför är det möjligt att använda realtidsfluorescensanalys för att göra en omfattande analys av nivåer och dynamiken i olika felveckade proteinarter. Ibland, är en relativt stor variation av utgångs fluorescensen hos replikaten observeras (t.ex., Figur 5, vänstra panelen). Detta är sannolikt orsakas av variationer i cellsådd eller transfektion. Trots skillnaden i utgångsfluorescensintensiteten sjunker signalen av alla replikat på en mycket liknande hastighet. Normalisering av signaler from varje gång pekar på intensiteten vid tiden 0 kan minska väl till brunnar variation och bättre speglar de nedbrytningshastigheter (Figur 4A, 4B och figur 5, vänster mot höger sida).
Förutom kärn formen, analyserade vi även cytoplasmisk LucDM-GFP. Cytoplasma LucDM-GFP har ett liknande mönster nedbrytning utom högre andel av kvarvarande fluorescens observerades när samma experimentella förfarande tillämpas som beskrivs i protokoll 4 (Figur 7). Nedbrytningen kunde fullständigt inhiberas MG132, vilket indikerar denna analys kan användas för att övervaka cytoplasmaproteinet kvalitetskontroll genom proteasomal nedbrytning. För framtida studier, skulle det vara intressant att undersöka om LucDM-GFP kan tillämpas på andra cellulära avdelningar, t.ex., mitokondrier eller endoplasmatiskt retikulum, när de fuseras till specifika cellulära fack lokaliseringssignaler.
Som påpekas i protokollet för lysrörsbaserad analys, är det viktigt att använda låg-fluorescerande medium för att minska fluorescerande bakgrund och att använda huvudblandning av DNA och transfektion reagens för att minska väl till brunnar transfektion variation. Förstärkningsstyr kan justeras på vissa fluorescerande plattläsare. Det är viktigt att ställa in förstärkningen till manuell istället för optimerad och använda samma värde genom hela analysen (Tabell 1). Värdet av förstärkningen kan justeras för att maximera läsningen från den cellulära GFP fluorescens så länge behandlingen inte går utöver detektionsgränsen.
I detta skede är vi fortfarande beroende av transfektion att uttrycka LucDM. För att minska variation och förenkla analysen för HTS, är ett framtida mål att etablera en stabil cellinje med inducerbart uttryck av LucDM. Eftersom mikro och odlingsmedium båda har bakgrundsfluorescens, är det viktigt att ha GFP signal betydligt högre än bakgrunden. UnforVärre de stabila linjerna vi etablerade nyligen alla har lågt uttryck av LucDM. Sålunda kommer utvecklingen av en stabil linje med högre proteinuttryck avsevärt förbättra screening effektivitet.
Nedbrytnings analyser som beskrivs här kan också tillämpas på andra felveckade proteiner. På grund av den dynamiska inslag i felveckade proteiner, dessa analyser måste förenas med andra analyser för att avslöja den fördjupade mekanismer kontroller proteinkvalitet. Dessa analyser inkluderar mätning av steady state-nivåer av aggregat och deras partitioner i olika cellfraktioner (Figur 1) och analysera proteiner hopfällbara eller aggregering med hjälp av renade rekombinanta proteiner. Dessa analyser kommer att hjälpa att skilja direkta eller indirekta effekter av läkemedel eller genuttryck på proteinnedbrytning eller aggregation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11995-092 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10082147 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | NP40S-500ML | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| MG132 | Sigma-Aldrich | M8699 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | 45000232 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Boehringer Mannheim | 4693159001 | |
| Bio-Dot Apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Living Colors GFP Monoclonal Antibody | Clonetech | 632375 | |
| Anti-Actin mAb Rabbit, IgG | Sigma-Aldrich | A45060-200UL | |
| Amino acids | Sigma-Aldrich | Amino acids are used for making low fluorecence culturing medium | |
| Olympus IX-81 Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX71/IX81 | |
| 96 Well Black TC Plate w/ Transluscent Clear Bottom | Sigma-Greiner | 89135-048 | |
| Fluorescence Bottom Plate Reader Infinite 200® PRO | TECAN | Infinite 200® PRO | |
| Cellulose acetate membrane 0.2 µm | Sterlitech | CA023001 | |
| Prism 5 | GraphPad | Statistical analysis software |
References
- Dobson, C. M.
- Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426, 895-899 (2003).
- Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature. 475, 324-332 (2011).
- Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H.
- Selkoe, D. J.
- Vousden, K. H., Prives, C. Blinded by the Light: The Growing Complexity of p53. Cell. 137, 413-431 (2009).
- Xu, J., et al. Gain of function of mutant p53 by coaggregation with multiple tumor suppressors. Nat Chem Biol. 7, 285-295 (2011).
- Orr, H. T., Zoghbi, H. Y.
- Guo, L., et al. A cellular system that degrades misfolded proteins and protects against neurodegeneration. Mol Cell. 55, 15-30 (2014).
- Chu, Y., Yang, X. SUMO E3 ligase activity of TRIM proteins. Oncogene. 30, 1108-1116 (2011).
- Sun, H., Leverson, J. D., Hunter, T. Conserved function of RNF4 family proteins in eukaryotes: targeting a ubiquitin ligase to SUMOylated proteins. EMBO J. 26, 4102-4112 (2007).
- Janer, A., et al. PML clastosomes prevent nuclear accumulation of mutant ataxin-7 and other polyglutamine proteins. J Cell Biol. 174, 65-76 (2006).
- Bauer, P. O., et al. Harnessing chaperone-mediated autophagy for the selective degradation of mutant huntingtin protein. Nat Biotechnol. 28, 256-263 (2010).
- Austin, J. A., et al. Disease causing mutants of TDP-43 nucleic acid binding domains are resistant to aggregation and have increased stability and half-life. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 4309-4314 (2014).
- Barmada, S. J., et al. Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models. Nat Chem Biol. 10, 677-685 (2014).
- Paxinou, E., et al. Induction of alpha-synuclein aggregation by intracellular nitrative insult. J Neurosci. 21, 8053-8061 (2001).
- Gupta, R., et al. Firefly luciferase mutants as sensors of proteome stress. Nat Methods. 8, 879-884 (2011).
- Cooper, A. A., et al. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models. Science. 313, 324-328 (2006).
- Elden, A. C., et al. Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS. Nature. 466, 1069-1075 (2010).
- Fortini, M. E., Bonini, N. M. Modeling human neurodegenerative diseases in Drosophila: on a wing and a prayer. Trends Genet. 16, 161-167 (2000).
- Bogdanov, A. M., Kudryavtseva, E. I., Lukyanov, K. A. Anti-fading media for live cell GFP imaging. PLoS One. 7, (2012).
- Wanker, E. E., et al. Membrane filter assay for detection of amyloid-like polyglutamine-containing protein aggregates. Methods Enzymol. 309, 375-386 (1999).
- McDonald, J. H. Handbook of Biological Statistics. 3, 3rd, 173-179 (2014).
- Holmberg, C. I., Staniszewski, K. E., Mensah, K. N., Matouschek, A., Morimoto, R. I. Inefficient degradation of truncated polyglutamine proteins by the proteasome. EMBO J. 23, 4307-4318 (2004).
- Verhoef, L. G., Lindsten, K., Masucci, M. G., Dantuma, N. P. Aggregate formation inhibits proteasomal degradation of polyglutamine proteins. Human molecular genetics. 11, 2689-2700 (2002).
- Jana, N. R., Zemskov, E. A., Wang, G., Nukina, N. Altered proteasomal function due to the expression of polyglutamine-expanded truncated N-terminal huntingtin induces apoptosis by caspase activation through mitochondrial cytochrome c release. Human molecular genetics. 10, 1049-1059 (2001).
- Fribley, A., Zeng, Q., Wang, C. Y. Proteasome inhibitor PS-341 induces apoptosis through induction of endoplasmic reticulum stress-reactive oxygen species in head and neck squamous cell carcinoma cells. Molecular and cellular biology. 24, 9695-9704 (2004).
- Bence, N. F., Sampat, R. M., Kopito, R. R. Impairment of the ubiquitin-proteasome system by protein aggregation. Science. 292, 1552-1555 (2001).
- Chen, Q., et al. Intrasarcoplasmic amyloidosis impairs proteolytic function of proteasomes in cardiomyocytes by compromising substrate uptake. Circulation research. 97, 1018-1026 (2005).
- Link, C. D., et al. Conversion of green fluorescent protein into a toxic, aggregation-prone protein by C-terminal addition of a short peptide. The Journal of biological chemistry. 281, 1808-1816 (2006).
