Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

RNA הפרעה מבוססת חקירת הפונקציה של חלבון מחממי הלם 27 במהלך הקרנית אפיתל לריפוי פצעים

Published: September 27, 2016 doi: 10.3791/54280
Automatic Translation
*1, *2, 2, 2, 2, 2
1Department of Ophthalmology, Saevit Eye Hospital, 2Department of Ophthalmology, University of Ulsan College of Medicine, Asan Medical Center
* These authors contributed equally

Introduction

תאי אפיתל קרניים (CECs) הם לשפוך ברציפות לתוך שכבת דמעות, בזמן שהם מוחלפים בו זמנית על ידי תאים מן לימבוס ושכבות הבזליים אפיתל קרניים. 1 לחצים חיצוניים שונים יכולים לגרום אפופטוזיס קלוף של CECs. 2 חלבוני הלם החום (HSPs) שמורים מאוד ניתן לחלק לשתי משפחות לפי גודל מולקולרי. 3 מש' HSP הגדולה כולל Hsp90, HSP70, ו HSP60, והמשפחה הקטנה כולל HSP27. 4 זירחון של HSP27 ידוע לשחק תפקיד חשוב בהישרדות תא והוא נחוץ לצורך נדידת תאים עקב התפקיד של חלבון זה שיפוץ יקטין. 5-7 לכן, ניסינו לבחון את התפקיד הפוטנציאלי של זירחון HSP27 גירת CEC ו אפופטוזיס מודל במבחנה של ריפוי פצע אפיתל.

התערבות RNA (RNAi) באף אחת קטנה או קצר RNAs התערבות (siRNA) יש geעניין nerated בשתי ביולוגיה בסיסית ויישומים, כפי שהוא עשוי לאפשר את הביטוי של כל גן של עניין להיות דפק למטה. 8 בזאת, השתמשנו siRNA ספציפי-HSP27 להעריך את התרומה של HSP27 לריפוי אפופטוזיס פצע CEC. שיטות RNAi מסורתית עבור הגן לדפוק למטה בתאים להשתמש דופלקסים RNA סינתטיים, לרבות שני oligonucleotides 21-mer ללא שינוי, אשר ניתן לקבץ ליצור siRNAs. RNAi siRNA כי השתמשנו במחקר הנוכחי הוא שיטה פשוטה ויעילה מאוד transfect תאים, מגיב זה עובד עם שורות תאים הנציחו שונות. במחקר הנוכחי, אנחנו מדגימים את השיטות בהן השתמשו בניתוח זה, כולל assay הפצע כיוונית הנגרמת מאפס, סופג המערבי, assay transfection siRNA, assay immunofluorescence, cytometry הזרימה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

שורת תאים 1.

  1. תרבות 10 6 תאים אפיתל הקרנית אדם הנציח טלומרז (HCECs) בצלחת 6-היטב (צפיפות: 1039.9 תא / מ"מ 2) בתוך 37 ° C חממה עם אווירה 5% CO 2 באמצעות מדיום הגידול האפיתל הסימפונות (BEGM) עד הם מגיעים למפגש 95%.

2. ניתוח כתם המערבי לאחר יצירת פצעים Scratch אפיתל

  1. Streak קצה פיפטה 200 μl סטרילי על פני באר HCECs תרבותי ומחוברות ארבע פעמים לכל צלחת בארון בטיחות ביולוגית (Class II, A2 סוג) דגירה HCECs בנפרד 37 ° C חממה עם אווירה 5% CO 2 עבור 1, 5, 10, 30, 60, ו -120 דקות.
  2. השתמש צלחת אחת 6-היטב מזה שישה מדגמים שונים בהתאם לזמן הדגירה לאחר פציעת אפיתל קרנית.
  3. לשטוף monolayers HCEC נפצע שלוש פעמים עם 1x PBS ולאחר מכן להוסיף 2.0 מ"ל BEGM היטב כל אחד.
  4. ניתוק HCECs באמצעות 2מ"ל 0.25% טריפסין-ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) לכל היטב במשך 5 דקות, צנטריפוגות ב 900 XG במשך 5 דקות בתוך שפופרת 15 מ"ל, ואת לשאוב טריפסין-EDTA בעזרת פיפטה 1 מ"ל.
  5. להשעות HCECs עם 1 מ"ל 1x PBS ולהעבירם צינור 1.5 מ"ל.
  6. HCECs צנטריפוגה ב XG 10,000 במשך 15 שניות ו PBS 1x לשאוב בעזרת פיפטה 1 מ"ל.
  7. Resuspend HCECs ב 100 חיץ μl קרים כקרח תמוגה (10 מ"מ טריס, 10 mM NaCl, 2 מ"מ EDTA, 25 מ"מ NaF, 2 מ"מ Na 3 VO 4, 1 מ"מ פלואוריד phenylmethanesulfonyl [PMSF], מעכבי פרוטאז [1 מיקרומטר pepstatin A, 1 מיקרומטר leupeptin, ו -0.1 מיקרומטר aprotinin] ו -0.5% Triton X-100 [pH 7]) ומערבבים אותם היטב.
  8. דגירה תאים עבור 30 דקות על הקרח כדי לגרום תמוגה התא.
  9. lysates צנטריפוגה ב 4 ° C. ב XG 10,000 במשך 15 דקות, ולאחר מכן להעביר supernatants 1.5 מ"ל צינורות טרי (90 aliquots μl) ולאחסן אותם ב -80 מעלות צלזיוס.
  10. לקבוע ריכוזי חלבון סך של lysates התא באמצעות יחסי ציבור ברדפורדassay otein. 9
  11. חלבונים הכולל תא טען 30 מיקרוגרם לג'ל acrylamide 10% או 12% עבור ג'ל אלקטרופורזה סולפט-polyacrylamide dodecyl נתרן (SDS-PAGE), ולאחר מכן electrophoretically העברת מופרדים להקות חלבון מסנני nitrocellulose עם זרם 200 מיליאמפר עבור שעה 1 ב 4 ° C להשתמש מבחני כתם מערביים.
  12. ממברנות מסנן nitrocellulose בלוק עם 5% חלב רזה מלוחים טריס שנאגרו עם Tween 20 (TBST) במשך שעה 1, להוסיף נוגדנים polyclonal ארנב העיקרי נגד HSP27 הלא פוספורילציה (1: 1,000 דילול) או נוגדנים polyclonal ארנב העיקרי נגד HSP27 פוספורילציה (1 דילול 1,000) ב אלבומין 5% שור (BSA), ו דגירה ממברנות לילה ב 4 ° C על שייקר:.
  13. זיהוי להקות immunoreactive באמצעות נוגדנים נגד ארנב peroxidase מצומדות חזרת עיזים (1: 10,000 דילול) ב 5% BSA לאחר הכביסה במשך 10 דקות 3 פעמים עם TBST.
  14. דגירה הממברנה של ריאגנטים לומינול המערבי סופג (6-7 מ 'l לכל 10 ס"מ × קרום 5 ס"מ) עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר.
  15. הסר את הקרום מפתרון מגיב, להסיר נוזל עודף עם מגבה סופגת, ומניח מגן יריעת פלסטיק.
  16. עבודה בחדר חשוך עם אור בטוח, להציב קרום מכוסה קלטת סרט עם צד חלבון הפונה כלפי מעלה.
  17. מניחים הסרט X-ray על גבי הממברנה ולחשוף דקות 1.

3. siRNA Transfection Assay 10

  1. HCECs תרבות ב 5 × 10 5 תאים / גם בצלחת 6-היטב בתוך 37 ° C חממה עם אווירה 5% CO 2 באמצעות BEGM עד שהם מגיעים למפגש 95%.
  2. לדלל את מגיב transfection (2.5 או 7.5 μl) עם 100 μl בינוני סרום מופחת עבור transfection (גורם לדילול היה 41 או 14.3) ו לפזר את HSP27 הספציפי מקושקש השליטה siRNA ב 100 μl בינוני סרום מופחת ליצור 10 או 50 ננומטר של HSP27 ספציפי מקושקש siRNA שליטה.
  3. מערבבים 100 μ; פתרון siRNA l עם מגיב transfection 100 μl מדולל (1: 1 יחס) דגירה את התערובת במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. מוסיפים את מתחמי השומנים-siRNA לתאים. אז אחרי 4 תקשורת hr שינוי להשלים BEGM דגירת התאים למשך 2 ימים ב 37 מעלות צלזיוס.
  5. לנתח תאי transfected על ידי מערבי סופג, כמתואר מ בסעיפים 4.1 ל -4.7 ילדים.

4. Assay כתם המערבי עבור תאים-טרנספקציה siRNA 11

  1. חלץ HSP27 ספציפיים מקושקשות HCECs שליטה transfected-siRNA בתוך ארון בטיחות ביולוגית באמצעות 100 חיץ תמוגה μl קרים כקרח (10 טריס מ"מ, 10 מ"מ NaCl, 2 מ"מ חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA), 25 מ"מ NaF, 2 מ"מ Na 3 VO 4, 1 מ"מ פלואוריד phenylmethanesulfonyl (PMSF), מעכבי פרוטאז, ו -0.5% Triton X-100, pH 7).
  2. דגירה תאים עבור 30 דקות על הקרח כדי לגרום תמוגה התא.
  3. lysates גלולה ב XG 10,000 במשך 15 דקות ולאחר מכן להעביר supernatants אל גיגית 1.5 מיליליטר טריes (90 μl aliquots) ולאחסן אותם ב -80 ° C.
  4. לקבוע ריכוזי חלבון של התא lysates באמצעות השיטה ברדפורד. 9
  5. דגימות טענו עם כמויות שווות של חלבוני תא הכוללים על ג'ל acrylamide 10% או 12%, לייחד את הג'ל על SDS-PAGE, ו electrophoretically להעביר את להקות חלבון המופרדות כדי מסנני nitrocellulose עם זרם 200 מיליאמפר עבור שעה 1 ב 4 ° C עד להשתמש מבחני כתם מערביים.
  6. ממברנות nitrocellulose מסנן בלוק עם 5% חלב רזה מלוחים טריס שנאגרו עם Tween 20 (TBST) במשך שעה 1, להוסיף נוגדנים ראשוניים נגד HSP27 פוספורילציה הלא פוספורילציה (1: 1,000 דילול), Akt פוספורילציה (1: 1,000 דילול) הלא פוספורילציה Akt (1: 1,000 דילול, לשמש כסמן הישרדות התא), Bcl-2 הקשורים חלבון X (1: 1,000 דילול, משמש חלבון פרו-אפופטוטיים), ו dehydrogenase 3-פוספט glyceraldehyde (GAPDH; 1 : דילול 200, משמש כביקורת טעינה) ב אלבומין 5% שור (BSA), ודגירת ממברנות הלילה ב 4 ° C על שייקר.
  7. זיהוי להקות immunoreactive באמצעות נוגדנים נגד ארנב peroxidase מצומדות חזרת עיזים (1: 10,000 דילול) BSA 5% לאחר הכביסה 3 פעמים עם TBST, 10 דקות כל אחד לשטוף.
  8. דגירה הממברנה של ריאגנטים לומינול המערבי סופג (6-7 מ"ל לכל 10 ס"מ × 5 ס"מ קרום) עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר.
  9. הסר את הקרום מפתרון מגיב, להסיר נוזל עודף עם מגבה סופגת, ומניח מגן יריעת פלסטיק.
  10. עבודה בחדר חשוך עם אור בטוח, מניח את הקרום המכוסה קלטת סרט עם צד החלבון הפונה כלפי מעלה.
  11. מניח סרט X-ray על גבי הקרום ולחשוף דקות 1.

5. נגרמת Scratch ערכת Assay פציעה כיוונית של נדידת תאי 12

  1. בארון בטיחות ביולוגית, להפוך פצע ידי גרירת קצה פיפטה סטרילית על פני באר תרבויות ומחוברות שלHSP27 ספציפי-טרנספקציה siRNA או HCECs המלא המקושקש טרנספקציה-siRNA.
  2. מיד לאחר פציעה, לשטוף את התאים פעמיים עם בופר פוספט 1x (PBS) ולשמור אותם בתרבויות BEGM באינקובטור 37 מעלות צלזיוס עם אווירה 5% CO 2 למשך 24 שעות לאחר פציעה.
  3. לצלם תמונות HCEC באמצעות מיקרוסקופ זקוף בהגדלה 100X 24 שעות לאחר ופצע ולבצע משטחת רקע באמצעות מסנן פקודת תוכנת ניתוח תמונה.
  4. באמצעות פקודת המדידות בוחרות, להגדיר השטח של עניין (AOI) עם אותה הצורה מצולע בגודל שיכול לכסות בניצב מקצה לקצה של פצע ראשוני, ולקבוע שלושה AOI שונים באזור הפצוע של כל דגימה.
  5. באופן אוטומטי לספור את המספר הסלולרי בכל תחום באמצעות אפשרויות תפריט מדוד רוזן / גודל.

6. ניתוח cytometry זרימה של אפופטוזיס

  1. תרבות siRNA-טרנספקציה HSP27 ספציפי ובקרה שלאירנ"א-טרנספקציה HCECs המכילים כל 10 ננומטר siRNA בריכוז של 5 × 10 5 תאים / גם ב 6 צלחות היטב עד התאים מגיעים 95 מפגש% בתוך 37 ° C חממה עם אווירה 5% CO 2 ב BEGM.
  2. ניתוק HCECs באמצעות 2 מ"ל 0.25% טריפסין-EDTA לכל טוב במשך 5 דקות, צנטריפוגות ב 900 XG במשך 5 דקות בתוך שפופרת 15 מ"ל, ואת לשאוב טריפסין-EDTA בעזרת פיפטה 1 מ"ל.
  3. שטפו תאים פעמיים עם קר PBS ולאחר מכן resuspend התאים 1x חיץ מחייב (0.1 M HEPES / NaOH [pH 7.4], 1.4 M NaCl, ו -25 מ"מ CaCl 2) בריכוז של 10 6 תאים / מ"ל.
  4. העברת 100 μl ההשעיה תא (1 x 10 5 תאים) לתוך צינור תרבות 5 מ"ל.
  5. הוסף 5 μl והעמסת מצומדות isothiocyanate V Annexin ו יודיד propidium 5 μl.
  6. בעדינות מערבולת התאים דגירה אותם במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
  7. הוסף 200 μl של חיץ מחייב 1x על צינור אחד ולנתח את התאים על ידי ג זרימהytometer בתוך שעה 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הביטוי של HSP27 פוספורילציה גדל באופן משמעותי ב 5, 10, ו -30 דקות לאחר שריטה ופצע לעומת HCECs unwounded 13. ניתוח כתם המערבי גילה כי הביטוי של פוספורילציה HSP27 ו פוספורילציה Akt הופחתו הן באופן משמעותי, ואילו הביטוי של Bax הוגדל משמעותית HCECs-טרנספקציה siRNA ספציפיים-HSP27 (איור 1 א-ה). הביטוי HSP27 פוספורילציה הופחת ב -30% ו -40% ב 10 ננומטר ו -50 ננומטר של HSP27 ספציפי בתאי-טרנספקציה siRNA, בהתאמה, לעומת תאי-טרנספקציה siRNA שליטה, אבל הביטוי HSP27 פוספורילציה לא הופחת (איור 1A-B ). יתר על כן, הביטוי HSP27 הלא פוספורילציה הופחת ב -20% ו -30% ב 10 ננומטר ו -50 ננומטר של HSP27 ספציפי siRNA תאים transfected, בהתאמה, אבל הביטוי HSP27 הלא פוספורילציה לא מופחת (איור 1A ו- C </ Strong>).

את assay ופציעתם כיוונית הנגרמת מאפס עולה כי ב 24 שעות לאחר פציעה, HSP27 ספציפי בתאי-טרנספקציה siRNA בשעה 10 ו -50 ננומטר הציג מופחת ההגירה (איור 2). יתר על כן, HCECs-טרנספקציה siRNA הספציפי-HSP27 עבר יותר אפופטוטיים מוות של תאי נימקים לעומת תאים-טרנספקציה siRNA שליטה מקושקשת על ידי cytometry זרימה (איור 3).

איור 1
איור 1. ניתוח כתם המערבי באמצעות נוגדנים נגד HSP27 פוספורילציה (p-HSP27), HSP27 הלא פוספורילציה (לא p-HSP27), פוספורילציה Akt (p-Akt) כסמן תא-הישרדות, הלא פוספורילציה Akt (לא p-Akt), חלבון X-2eassociated Bcl (Bax) כחלבון פרו-אפופטוטיים, ו GAPDH (א). הביטוי של HSP27 פוספורילציה nonphosphorylated ו פוספורילציה Akt ירד משמעותי (B - D), לעומת זאת, הביטוי של Bax עלה באופן ניכר במהלך HCECs HSP27 ספציפי טרנספקציה-siRNA (E), בהשוואה לזו שנצפתה תאי שליטת transfected-siRNA (כל p <0.05). הביטוי HSP27 פוספורילציה הופחת ב -30% ו -40% ב 10 ננומטר ו -50 ננומטר של HSP27 ספציפי בתאי-טרנספקציה siRNA לעומת שליטה מדומה, בהתאמה, אבל הביטוי HSP27 פוספורילציה לא הופחת ב 10 ננומטר ו -50 ננומטר של siRNA שליטה תאי -transfected (B). **, *; †, ††; ‡, ‡‡; §, §§: הבדל מובהק סטטיסטית בין הקבוצות (p <0.05). ברי השגיאה מייצגים סטיית תקן (SD). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

"> איור 2
איור 2. assay ופציעתם כיוונית Scratch הנגרמת להעריך נדידת תאים לאחר ופצע ב HCECs-טרנספקציה siRNA. פצע שריטה נברא מלאה HSP27 ספציפי בתאי-טרנספקציה siRNA (א). תאים הוסרו מאזורי 'גרר'. בגיל 24 שעות לאחר הפציעה, 10 ו -50 ננומטר של תאי-טרנספקציה siRNA ספציפי-HSP27 הציגו מספרים נמוכים יותר של תאים נודדים לעומת שליטת ננומטר 10 ו -50 תאים-טרנספקציה siRNA (B). ** ו * להצביע על הבדל מובהק סטטיסטית בין הקבוצות (p <0.05). הנתונים מוצגים כאמצעי ± סטיית התקן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3 <br /> cytometry זרימה איור 3. של 50 ננומטר של siRNA שליטה מקושקשות ותאי אפיתל הקרנית האדם HSP27 ספציפי טרנספקציה-siRNA (HCECs) שכותרתו עם Annexin V ו- PI (A ו- B). אחוז התאים סכים רביעים תואמים מוקדם תאים אפופטוטיים (Annexin V-חיוביים ותאי PI-שליליים, Q4, בפינה ימנית תחתון), מאוחר תאים אפופטוטיים (Annexin V-חיובי ותאי PI-חיובי, Q2, ימני עליונה), ותאי נימקים (Annexin V-שלילי PI החיוב תאים, Q1, שמאלי עליון). HSP27 הספציפי siRNA-transfect HCECs היה יותר אפופטוטיים מוות של תאי נימקים מאשר לשלוט תאים-טרנספקציה siRNA. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש המחברים שום אינטרסים כלכליים או קניינים כל חומר או שיטות שהוזכר במחקר זה.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי מענק מחקר סטודנטים (13-14) של אוניברסיטת אולסן המכללה לרפואה, בסיאול, קוריאה ומענק (2014-464) ממכון אסאן למדעי החיים, בסיאול, קוריאה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biological safety cabinet CHC LAB Co.Ltd,  Daejeon, Republic of Korea  CHC-777A2-06 Class II, Type A2 
Stealth RNAi™ siRNA Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA RNAi siRNA; scrambled control-siRNA and HSP27-specific siRNA
BEGMTM Lonza, Inc., Walkersville, MD CC-3171, CC4175 Bronchial epithelium growth medium 
Protease inhibitor  Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO P8340 ,P7626 1 μM Pepstatin A, 1 μM Leupeptin, 0.1 μM Aprotinin
Bradford protein assay  Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA #500-0001 Bradford protein assay 
Nitrocellulose filters  Amersham, Little Chalfont, UK RPN3032D Western blotting membrane
Non-phosphorylated HSP27  Abcam Inc., Cambridge, MA ab12351 1:1,000 dilution (Total HSP27)
Phosphorylated HSP27 (Ser85) Abcam Inc., Cambridge, MA ab5594 1:1,000 dilution HSP27 was phosphorylated at Ser85
Lipofectamine® RNAiMAX reagent  Invitrogen, Carlsbad, CA 13-778-075 Transfection reagent
Phosphorylated Akt (Ser473) Cell Signaling Technology, Danvers, MA No. 4060 1:1,000 dilution Akt was phosphorylated at Ser473 (cell survival marker)
Non-phosphorylated Akt  Cell Signaling Technology, Danvers, MA No. 4061 1:1,000 dilution (Total Akt)
Bcl-2-associated X protein  Cell Signaling Technology, Danvers, MA No. 4062 1:1,000 (anti-apoptotic protein marker)
GAPDH Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA No. 4063 1:1,000 loading control marker (house keeping gene)
Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit antibodies Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA NCI1460KR 1:10,000 dilution
OPTI-MEM Invitrogen, Carlsbad, CA 31985 reduced serum medium for transfection
Image analysis software Olympus, Inc., Tokyo, Japan Image-Pro Plus 5.0
Skimed milk powder  Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlstruhe, Germany T145.2
Tris  Amresco LCC, Inc. Solon, OH No-0497
Sodium Chloride  Amresco LCC, Inc. Solon, OH No-0241
Six well culture plate Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA 140675 35.00 mm diameter / well
24-well culuture dish Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA 142475
Orbital shaker N-Bioteck, Inc., Seoul, South Korea NB1015
Bovine serum albumin Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA sc-2323 
BDFACSCantoTM II BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ Flow cytometry
X-Ray Film Kodak, Rochester, NY Medical X-Ray Cassette with Green 400 Screen 
western blotting luminol reagent Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA sc-2048 
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ 556547

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dua, H. S., Gomes, J. A., Singh, A. Corneal epithelial wound healing. Br. J. Ophthalmol. 78 (5), 401-408 (1994).
  2. Estil, S., Primo, E. J., Wilson, G. Apoptosis in shed human corneal cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41 (11), 3360-3364 (2000).
  3. Guay, J., et al. Regulation of actin filament dynamics by p38 map kinase-mediated phosphorylation of heat shock protein 27. J. cell. Sci. 110, Pt 3 357-368 (1997).
  4. Park, J. W., et al. Differential expression of heat shock protein mRNAs under in vivo glutathione depletion in the mouse retina. Neurosci. Lett. 413 (3), 260-264 (2007).
  5. Rane, M. J., et al. Heat shock protein 27 controls apoptosis by regulating Akt activation. J. Biol. Chem. 278 (30), 27828-27835 (2003).
  6. Shin, K. D., et al. Blocking tumor cell migration and invasion with biphenyl isoxazole derivative KRIBB3, a synthetic molecule that inhibits Hsp27 phosphorylation. J. Biol. Chem. 280 (50), 41439-41448 (2005).
  7. Jain, S., et al. Expression of phosphorylated heat shock protein 27 during corneal epithelial wound healing. Cornea. 31 (7), 820-827 (2012).
  8. Alekseev, O. M., Richardson, R. T., Alekseev, O., O'Rand, M. G. Analysis of gene expression profiles in HeLa cells in response to overexpression or siRNA-mediated depletion of NASP. Reprod. Biol. Endocrinol. 7, 45 (2009).
  9. Park, H. Y., Kim, J. H., Lee, K. M., Park, C. K. Effect of prostaglandin analogues on tear proteomics and expression of cytokines and matrix metalloproteinases in the conjunctiva and corea. Exp. Eye. Res. 94 (1), 13-21 (2012).
  10. Voegeli, T. S., Currie, R. W. siRNA knocks down Hsp27 and increases angiotensin II-induced phosphorylated NF-kappaB p65 levels in aortic smooth muscle cells. Inflamm. Res. 58 (6), 336-343 (2009).
  11. Shi, B., Isseroff, R. R. Arsenite pre-conditioning reduces UVB-induced apoptosis in corneal epithelial cells through the anti-apoptotic activity of 27 kDa heat shock protein (HSP27). J. Cell. Physiol. 206 (2), 301-308 (2006).
  12. Shen, E. P., et al. Comparison of corneal epitheliotrophic capacity among different human blood-derived preparations. Cornea. 30 (2), 208-214 (2011).
  13. Song, I. S., et al. Heat shock protein 27 phosphorylation is involved in epithelial cell apoptosis as well as epithelial migration during corneal epithelial wound healing. Exp Eye Res. 118 (1), 36-41 (2014).

Tags

גנטיקה גיליון 115 חום הלם חלבון 27 אפיתל הקרנית ריפוי הפצע אפיתל הקרנית אפופטוזיס תא אפיתל הגירה אפיתל התערבות RNA siRNA ביולוגיה מולקולרית
RNA הפרעה מבוססת חקירת הפונקציה של חלבון מחממי הלם 27 במהלך הקרנית אפיתל לריפוי פצעים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yoo, A., Park, H. M., Kang, S. S.,… More

Yoo, A., Park, H. M., Kang, S. S., Kim, E. S., Tchah, H., Kim, J. Y. RNA Interference-based Investigation of the Function of Heat Shock Protein 27 during Corneal Epithelial Wound Healing. J. Vis. Exp. (115), e54280, doi:10.3791/54280 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter