Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

التحقيق استنادا التدخل-RNA من وظيفة من حرارة صدمة بروتين 27 خلال شفاء القرنية طلائي الجرح

Published: September 27, 2016 doi: 10.3791/54280
Automatic Translation
*1, *2, 2, 2, 2, 2
1Department of Ophthalmology, Saevit Eye Hospital, 2Department of Ophthalmology, University of Ulsan College of Medicine, Asan Medical Center
* These authors contributed equally

Introduction

الخلايا الظهارية القرنية (CECS) يتم تسليط مستمر في فيلم المسيل للدموع، في حين يتم استبدالها في وقت واحد من قبل خلايا من حوف والقرنية الطبقات القاعدية الظهارية. يمكن 1 مختلف الضغوطات خارجي تحفز الخلايا والتقشر من CECS. 2 بروتينات الصدمة الحرارية (شركائنا HSPs) يتم حفظها للغاية ويمكن تقسيمها إلى عائلتين وفقا لحجم الجزيئي. وتضم 3 أسرة أكبر HSP HSP90، HSP70، وHSP60، وتضم الأسرة الصغيرة HSP27. 4 ومن المعروف أن الفسفرة من HSP27 للعب دورا هاما في بقاء الخلية ومطلوب للهجرة الخلايا بسبب دور هذا البروتين في إعادة الأكتين 5-7 لذلك، حاولنا لاختبار الدور المحتمل للHSP27 الفسفرة في الهجرة لجنة الانتخابات المركزية وموت الخلايا المبرمج في نموذج في المختبر من التئام الجروح الظهارية.

تدخل الحمض النووي الريبي (رني) باستخدام إما صغيرة أو قصيرة الرنا التدخل (سيرنا) له جنرال الكتريكالفائدة nerated في كل الأحياء الأساسية والتطبيقية، كما يحتمل أن يسمح للتعبير عن أي الجينات في المصالح أن طرقت إلى أسفل. 8 وهنا، كنا سيرنا HSP27 محددة لتقييم مساهمة HSP27 لالتئام الجروح لجنة الانتخابات المركزية وموت الخلايا المبرمج. طرق رني التقليدية لجين تدق إلى أسفل في الخلايا تستخدم الدوبلكس RNA الاصطناعية، من بينهم اثنان معدلة أليغنوكليوتيد] 21-مير التي يمكن تجميعها لإنشاء الرناوات siRNAs. ورني سيرنا التي استخدمناها في هذه الدراسة هي طريقة بسيطة وفعالة للغاية ل transfect الخلايا، وهذا كاشف يعمل مع مختلف خطوط الخلايا خلد. في هذه الدراسة، ونحن لشرح الطرق المستخدمة لهذا التحليل، بما في ذلك فحص الناجم عن الصفر الجرح الاتجاه، النشاف الغربي، سيرنا ترنسفكأيشن الفحص، الفحص المناعي، والتدفق الخلوي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

الخط 1. خلية

  1. الثقافة 10 6 خلايا خلدت التيلوميراز الإنسان القرنية الطلائية (HCECs) في لوحة 6 جيدا (الكثافة: 1039.9 خلية / ملم 2) في الحاضنة 37 درجة مئوية مع CO 2 جو 5٪ باستخدام متوسط النمو ظهارة الشعب الهوائية (BEGM) حتى أن تصل إلى 95٪ التقاء.

2. الغربية تحليل وصمة عار بعد إنشاء طلائي الجروح خدش

  1. خط العقيمة 200 ميكرولتر ماصة على سطح بئر متموجة HCECs مثقف أربع مرات في طبق في خزانة السلامة البيولوجية (الدرجة الثانية، نوع A2)، واحتضان HCECs بشكل منفصل في الحاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 جو ل1، 5، 10، 30، 60، و 120 دقيقة.
  2. استخدام واحد لوحة 6 جيدا لمدة ستة عينات مختلفة وفقا لفترة حضانة بعد إصابة الظهارية القرنية.
  3. غسل جرح الطبقات الوحيدة HCEC ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X ثم قم بإضافة 2.0 مل BEGM إلى كل بئر.
  4. فصل HCECs باستخدام 2مل 0.25٪ حمض التربسين ethylenediaminetetraacetic (EDTA) لكل بئر لمدة 5 دقائق، الطرد المركزي في 900 x ج لمدة 5 دقائق في أنبوب 15 مل، ونضح التربسين-EDTA باستخدام ماصة 1 مل.
  5. تعليق HCECs مع 1 مل برنامج تلفزيوني 1X ونقلها إلى أنبوب 1.5 مل.
  6. الطرد المركزي HCECs في 10000 x ج لمدة 15 ثانية، ونضح برنامج تلفزيوني 1X باستخدام ماصة 1 مل.
  7. و resuspend HCECs في 100 العازلة تحلل الجليد الباردة ميكرولتر (10 ملم تريس، 10 مم كلوريد الصوديوم، 2 ملي EDTA، 25 مم ناف، 2 مم نا 3 VO 4، 1 ملم phenylmethanesulfonyl فلوريد [PMSF]، مثبطات الأنزيم البروتيني [1 ميكرومتر pepstatin A، 1 ميكرومتر leupeptin، و 0.1 ميكرومتر أبروتينين] و 0.5٪ تريتون X-100 [درجة الحموضة 7])، ومزجها جيدا.
  8. احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة على الجليد للحث على تحلل الخلية.
  9. لست] أجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية في 10000 x ج لمدة 15 دقيقة، ثم نقل supernatants إلى الطازجة 1.5 مل أنابيب (90 مكل) وتخزينها في -80 درجة مئوية.
  10. تحديد مجموع تركيزات بروتين الخلية لست] باستخدام العلاقات العامة برادفوردفحص otein 9.
  11. تحميل 30 ميكروغرام البروتين الكلي الخلية إلى 10٪ أو 12٪ هلام الأكريلاميد لدوديسيل الصوديوم وكبريتات إس دي إس بايج (SDS-PAGE)، ثم electrophoretically نقل فصل العصابات البروتين لمرشحات النيتروسليلوز مع 200 مللي أمبير الحالية لمدة 1 ساعة على 4 درجات C لاستخدامها في المقايسات لطخة غربية.
  12. كتلة النيتروسليلوز مرشح الأغشية مع 5٪ حليب منزوع الدسم في مخزنة المالحة تريس، مع توين 20 (TBST) لمدة 1 ساعة، إضافة الأجسام المضادة أرنب الأساسي ضد HSP27 غير فسفرته (1: 1000 تمييع) أو الأساسي الضد الأرنب بولكلونل ضد فسفرته HSP27 (1 : 1000 تمييع) في 5٪ الزلال المصل البقري (BSA)، واحتضان الأغشية بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية على شاكر.
  13. كشف عصابات مناعيا باستخدام الفجل-البيروكسيديز مترافق الماعز أضداد الأرانب (1: 10،000 تمييع) في 5٪ BSA بعد الغسيل لمدة 10 دقيقة 3 مرات مع TBST.
  14. احتضان الغشاء في غرب الكواشف مينول النشاف (6-7 ملتر لكل 10 سم × 5 سم غشاء) لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  15. إزالة غشاء من حل كاشف، إزالة السائل الزائد مع منشفة ماصة، ووضعه في حامية ورقة من البلاستيك.
  16. العمل في غرفة مظلمة مع الضوء الآمن، وضع غشاء المشمولة في شريط كاسيت فيلم مع الجانب البروتين مواجهة.
  17. وضع فيلم الأشعة السينية على رأس الغشاء وفضح لمدة 1 دقيقة.

3. سيرنا ترنسفكأيشن الفحص 10

  1. HCECs الثقافة في 5 × 5 10 خلايا جيدا / في لوحة 6 جيدا في الحاضنة 37 درجة مئوية مع CO 2 جو 5٪ باستخدام BEGM حتى تصل إلى 95٪ التقاء.
  2. تمييع كاشف ترنسفكأيشن (2.5 أو 7.5 ميكرولتر) مع 100 ميكرولتر خفض سيرم لترنسفكأيشن (كان عامل التخفيف 41 أو 14.3) وحل HSP27 محددة وسارعت تحكم سيرنا في 100 ميكرولتر خفض سيرم لإنشاء 10 أو 50 نانومتر من HSP27 محددة وسارعت سيرنا السيطرة.
  3. مزيج 100 μ؛ ل حل سيرنا مع 100 ميكرولتر المخفف كاشف ترنسفكأيشن (نسبة 1: 1)، واحتضان الخليط لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. إضافة المجمعات سيرنا الدهون في الخلايا. ثم بعد 4 وسائل الاعلام التغيير ساعة لاستكمال BEGM واحتضان الخلايا لمدة 2 أيام عند 37 درجة مئوية.
  5. تحليل خلايا transfected من قبل النشاف الغربي، كما هو موضح من أقسام 4،1-4،7.

4. ويسترن صمة عار الفحص مقابل transfected سيرنا خلايا 11

  1. استخراج HSP27 محددة وسارعت السيطرة HCECs-transfected سيرنا في خزانة السلامة البيولوجية باستخدام 100 ميكرولتر العازلة تحلل الجليد الباردة (10 ملي تريس، 10 مم كلوريد الصوديوم، 2 مم ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA)، 25 ملي ناف، 2 مم نا 3 VO 4، 1 ملم فلوريد phenylmethanesulfonyl (PMSF)، مثبطات الأنزيم البروتيني، و 0.5٪ تريتون X-100، ودرجة الحموضة 7).
  2. احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة على الجليد للحث على تحلل الخلية.
  3. لست] بيليه في 10000 x ج لمدة 15 دقيقة ثم نقل supernatants إلى حوض 1.5 مل جديدةوفاق (90 ميكرولتر قسامات) وتخزينها في -80 درجة مئوية.
  4. تحديد تركيز البروتين في الخلية لست] استخدام البروتين مقايسة برادفورد. 9
  5. عينات الحمل مع كميات متساوية من البروتين الكلي خلية على 10٪ أو 12٪ هلام الأكريلاميد، إخضاع هلام لSDS-PAGE، وelectrophoretically نقل العصابات البروتين فصلها لمرشحات النيتروسليلوز مع 200 مللي أمبير الحالية لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية ل استخدام في فحوصات لطخة غربية.
  6. كتلة مرشح النيتروسليلوز الأغشية مع 5٪ حليب منزوع الدسم في مخزنة المالحة تريس، مع توين 20 (TBST) لمدة 1 ساعة، إضافة الأجسام المضادة الأولية ضد فسفرته وغير فسفرته HSP27 (1: 1000 تمييع)، فسفرته AKT (1: 1000 تمييع)، غير فسفرته AKT (1: 1000 تخفيف، وتستخدم كعلامة بقاء الخلية)، المصاحب بي سي إل 2 X البروتين (1: 1000 تخفيف، كما تستخدم بروتين الموالية لأفكارك)، وغليسيرألدهيد نازعة 3-الفوسفات (GAPDH؛ (1) : 200 التخفيف، وتستخدم كعنصر تحكم التحميل) في 5٪ الزلال المصل البقري (BSA)، واحتضان الأغشية بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية على شاكر.
  7. كشف عصابات مناعيا باستخدام الفجل-البيروكسيديز مترافق الماعز أضداد الأرانب (1: 10،000 تمييع) في 5٪ BSA بعد الغسيل 3 مرات مع TBST، 10 دقيقة كل غسل.
  8. احتضان الغشاء في غرب الكواشف مينول النشاف (6-7 مل لكل 10 سم × 5 سم غشاء) لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  9. إزالة غشاء من حل كاشف، إزالة السائل الزائد مع منشفة ماصة، ووضعه في حامية ورقة من البلاستيك.
  10. العمل في غرفة مظلمة مع الضوء الآمن، وضع غشاء المشمولة في شريط كاسيت فيلم مع الجانب البروتين مواجهة.
  11. وضع فيلم الأشعة السينية على رأس الغشاء وفضح لمدة 1 دقيقة.

5. خدش الناجم عن الاتجاه إصابة الفحص تقييم هجرة الخلية 12

  1. في خزانة السلامة البيولوجية، وجعل الجرح عن طريق سحب طرف ماصة معقمة على سطح بئر الثقافات متموجة منHSP27 محددة، transfected سيرنا أو مشوشة السيطرة HCECs-transfected سيرنا.
  2. مباشرة بعد اصابة، وغسل الخلايا مرتين مع 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) والمحافظة عليها في الثقافات BEGM في الحاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 الغلاف الجوي لمدة 24 ساعة بعد اصابة.
  3. تصوير الصور HCEC باستخدام مجهر تستقيم في التكبير 100X 24 ساعة بعد اصابة وتنفيذ خلفية سوى بالارض باستخدام تصفية القيادة في صورة برامج التحليل.
  4. باستخدام الأمر تحديد القياسات، وتحديد مجال الاهتمام (الهيئة العربية للتصنيع) مع نفس الشكل المضلع الحجم التي يمكن أن تغطي عموديا من اقصاه الى اقصاه الجرح الأولي، وتحديد ثلاثة الهيئة العربية للتصنيع مختلفة في منطقة الجرحى من كل عينة.
  5. العد تلقائيا عدد الخلايا في كل حقل باستخدام عدد / الحجم خيارات القائمة التدبير.

6. تحليل التدفق الخلوي من موت الخلايا المبرمج

  1. ثقافة HSP27 محددة، transfected سيرنا والسيطرة الصورةHCECs تحتوي كل منها على 10 نانومتر سيرنا الجمهورية الاسلامية الايرانية-transfected بتركيز 5 × 5 10 خلايا / جيد في 6 لوحات جيدا حتى خلايا تصل إلى 95٪ التقاء في الحاضنة 37 درجة مئوية مع CO 2 جو 5٪ في BEGM.
  2. فصل HCECs باستخدام 2 مل 0.25٪ التربسين-EDTA لكل بئر لمدة 5 دقائق، الطرد المركزي في 900 x ج لمدة 5 دقائق في أنبوب 15 مل، ونضح التربسين-EDTA باستخدام ماصة 1 مل.
  3. غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني الباردة ثم resuspend الخلايا في 1X العازلة (0.1 M HEPES / هيدروكسيد الصوديوم [درجة الحموضة 7.4] و 1.4 M كلوريد الصوديوم، و 25 ملي CaCl 2) ملزمة بتركيز 10 6 خلية / مل.
  4. نقل 100 ميكرولتر تعليق الخلية (1 × 10 5 خلايا) في أنبوب ثقافة 5 مل.
  5. إضافة 5 ميكرولتر فلوريسئين-ثيوسيانات مترافق Annexin V و 5 ميكرولتر يوديد propidium.
  6. دوامة بلطف الخلايا واحتضان لهم لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
  7. إضافة 200 ميكرولتر من العازلة ملزمة 1x إلى كل أنبوب وتحليل الخلايا عن طريق تدفق جytometer حدود 1 ساعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

التعبير عن HSP27 فسفرته زيادة كبيرة في 5 و 10 و 30 دقيقة بعد الصفر اصابة شخص مقارنة مع HCECs المعافين 13. وكشف تحليل لطخة غربية أن التعبير عن فسفرته HSP27 وفسفرته AKT كانت كل خفضت بشكل ملحوظ، في حين تم زيادة التعبير عن باكس كبير في HCECs-transfected سيرنا HSP27 معينة (الشكل 1A-E). تم تخفيض التعبير HSP27 فسفرته بنسبة 30٪ و 40٪ في 10 نانومتر و 50 نانومتر من HSP27 محددة الخلايا transfected سيرنا، على التوالي، مقارنة مع سيطرة الخلايا transfected سيرنا، ولكن التعبير HSP27 فسفرته لم يقل (الشكل 1A-B ). وعلاوة على ذلك، تم تخفيض التعبير HSP27 غير فسفرته بنسبة 20٪ و 30٪ في 10 نانومتر و 50 نانومتر من HSP27 محددة سيرنا خلايا transfected، على التوالي، ولكن التعبير HSP27 غير فسفرته لم تخفض (الشكل 1A و C </ قوي>).

وأشار اتجاهي جرح فحص الناجم عن الصفر التي في 24 ساعة بعد إصابة الخلايا HSP27 محددة، transfected سيرنا في 10 و 50 نانومتر معارضها انخفاض الهجرة (الشكل 2). وعلاوة على ذلك، خضع HCECs HSP27 محددة، transfected سيرنا أكثر أفكارك ونخرية موت الخلايا مقارنة مع السيطرة سارعت الخلايا transfected سيرنا التدفق الخلوي (الشكل 3).

شكل 1
الرقم تحليل 1. لطخة غربية باستخدام الأجسام المضادة ضد HSP27 فسفرته (ف HSP27)، HSP27 غير فسفرته (غير ف-HSP27)، فسفرته AKT (ف AKT) كعلامة خلية البقاء على قيد الحياة، غير فسفرته-AKT (غير ف AKT)، 2eassociated بي سي-X البروتين (باكس)، وبروتين الموالية لأفكارك، وGAPDH (A). التعبير عن HSP27 فسفرته وnonphosphorylated و انخفضت فسفرته AKT بشكل ملحوظ (B - D)، ومع ذلك، والتعبير عن باكس زيادة كبيرة في HCECs-HSP27 محددة، transfected سيرنا (E)، مقارنة مع تلك التي لوحظت في الخلايا transfected سيرنا التحكم (جميع ف <0.05). تم تخفيض التعبير HSP27 فسفرته بنسبة 30٪ و 40٪ في 10 نانومتر و 50 نانومتر من HSP27 محددة الخلايا transfected سيرنا مقارنة مع سيطرة وهمية، على التوالي، ولكن لم يقل التعبير HSP27 فسفرته في 10 نانومتر و 50 نانومتر من سيرنا السيطرة خلايا -transfected (B). **، *؛ †، ††. ‡، ‡‡. §، §§: فروق ذات دلالة إحصائية بين المجموعات (P <0.05). أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري (SD). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

"> الشكل 2
الشكل 2. الصفر التي يسببها الاتجاه فحص جرح لتقييم الهجرة الخلية بعد اصابة في HCECs-transfected سيرنا. تم إنشاء الجرح الصفر في السيطرة والخلايا transfected سيرنا HSP27 محددة (A). تم إزالة الخلايا من المناطق "جر". في 24 ساعة بعد اصابة و 10 و 50 نانومتر من الخلايا transfected سيرنا HSP27 محدد أظهرت انخفاض أعداد الخلايا المهاجرة مقارنة مع الخلايا transfected سيرنا 10 و 50 نانومتر السيطرة (B). ** و* تشير إلى وجود فروق ذات دلالة إحصائية بين المجموعات (P <0.05). وتظهر البيانات كما يعني ± الانحراف المعياري. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3) <ر /> الشكل 3. التدفق الخلوي من 50 نانومتر من السيطرة سارعت سيرنا والخلايا HSP27 محددة، transfected سيرنا الإنسان القرنية الطلائية (HCECs) المسمى مع annexin الخامس وPI (A و B). النسبة المئوية من مجموع الخلايا في الأرباع يتفق مع مطلع الخلايا أفكارك (خلايا إيجابية الخامس annexin وPI-السلبية، Q4، أسفل اليمين)، وخلايا أفكارك في وقت متأخر (annexin الخامس إيجابي والخلايا، Q2، والحق العلوي-PI إيجابي)، والخلايا الميتة (annexin خلايا السلبي-V و-PI إيجابي، Q1، أعلى اليسار). كان HCECs سيرنا transfect-HSP27 محددة موت الخلايا أكثر أفكارك ونخرية من السيطرة على الخلايا transfected سيرنا. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم مصالح مالية أو في ملكية أي مواد أو أساليب المشار إليها في هذه الدراسة.

Acknowledgments

وأيد هذه الدراسة من قبل منحة بحثية طالب (13-14) من جامعة كلية للطب أولسان، سيول، كوريا ومنحة (2014-464) من معهد اسان لعلوم الحياة، سيول، كوريا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biological safety cabinet CHC LAB Co.Ltd,  Daejeon, Republic of Korea  CHC-777A2-06 Class II, Type A2 
Stealth RNAi™ siRNA Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA RNAi siRNA; scrambled control-siRNA and HSP27-specific siRNA
BEGMTM Lonza, Inc., Walkersville, MD CC-3171, CC4175 Bronchial epithelium growth medium 
Protease inhibitor  Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO P8340 ,P7626 1 μM Pepstatin A, 1 μM Leupeptin, 0.1 μM Aprotinin
Bradford protein assay  Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA #500-0001 Bradford protein assay 
Nitrocellulose filters  Amersham, Little Chalfont, UK RPN3032D Western blotting membrane
Non-phosphorylated HSP27  Abcam Inc., Cambridge, MA ab12351 1:1,000 dilution (Total HSP27)
Phosphorylated HSP27 (Ser85) Abcam Inc., Cambridge, MA ab5594 1:1,000 dilution HSP27 was phosphorylated at Ser85
Lipofectamine® RNAiMAX reagent  Invitrogen, Carlsbad, CA 13-778-075 Transfection reagent
Phosphorylated Akt (Ser473) Cell Signaling Technology, Danvers, MA No. 4060 1:1,000 dilution Akt was phosphorylated at Ser473 (cell survival marker)
Non-phosphorylated Akt  Cell Signaling Technology, Danvers, MA No. 4061 1:1,000 dilution (Total Akt)
Bcl-2-associated X protein  Cell Signaling Technology, Danvers, MA No. 4062 1:1,000 (anti-apoptotic protein marker)
GAPDH Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA No. 4063 1:1,000 loading control marker (house keeping gene)
Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit antibodies Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA NCI1460KR 1:10,000 dilution
OPTI-MEM Invitrogen, Carlsbad, CA 31985 reduced serum medium for transfection
Image analysis software Olympus, Inc., Tokyo, Japan Image-Pro Plus 5.0
Skimed milk powder  Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlstruhe, Germany T145.2
Tris  Amresco LCC, Inc. Solon, OH No-0497
Sodium Chloride  Amresco LCC, Inc. Solon, OH No-0241
Six well culture plate Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA 140675 35.00 mm diameter / well
24-well culuture dish Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA 142475
Orbital shaker N-Bioteck, Inc., Seoul, South Korea NB1015
Bovine serum albumin Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA sc-2323 
BDFACSCantoTM II BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ Flow cytometry
X-Ray Film Kodak, Rochester, NY Medical X-Ray Cassette with Green 400 Screen 
western blotting luminol reagent Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA sc-2048 
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ 556547

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dua, H. S., Gomes, J. A., Singh, A. Corneal epithelial wound healing. Br. J. Ophthalmol. 78 (5), 401-408 (1994).
  2. Estil, S., Primo, E. J., Wilson, G. Apoptosis in shed human corneal cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41 (11), 3360-3364 (2000).
  3. Guay, J., et al. Regulation of actin filament dynamics by p38 map kinase-mediated phosphorylation of heat shock protein 27. J. cell. Sci. 110, Pt 3 357-368 (1997).
  4. Park, J. W., et al. Differential expression of heat shock protein mRNAs under in vivo glutathione depletion in the mouse retina. Neurosci. Lett. 413 (3), 260-264 (2007).
  5. Rane, M. J., et al. Heat shock protein 27 controls apoptosis by regulating Akt activation. J. Biol. Chem. 278 (30), 27828-27835 (2003).
  6. Shin, K. D., et al. Blocking tumor cell migration and invasion with biphenyl isoxazole derivative KRIBB3, a synthetic molecule that inhibits Hsp27 phosphorylation. J. Biol. Chem. 280 (50), 41439-41448 (2005).
  7. Jain, S., et al. Expression of phosphorylated heat shock protein 27 during corneal epithelial wound healing. Cornea. 31 (7), 820-827 (2012).
  8. Alekseev, O. M., Richardson, R. T., Alekseev, O., O'Rand, M. G. Analysis of gene expression profiles in HeLa cells in response to overexpression or siRNA-mediated depletion of NASP. Reprod. Biol. Endocrinol. 7, 45 (2009).
  9. Park, H. Y., Kim, J. H., Lee, K. M., Park, C. K. Effect of prostaglandin analogues on tear proteomics and expression of cytokines and matrix metalloproteinases in the conjunctiva and corea. Exp. Eye. Res. 94 (1), 13-21 (2012).
  10. Voegeli, T. S., Currie, R. W. siRNA knocks down Hsp27 and increases angiotensin II-induced phosphorylated NF-kappaB p65 levels in aortic smooth muscle cells. Inflamm. Res. 58 (6), 336-343 (2009).
  11. Shi, B., Isseroff, R. R. Arsenite pre-conditioning reduces UVB-induced apoptosis in corneal epithelial cells through the anti-apoptotic activity of 27 kDa heat shock protein (HSP27). J. Cell. Physiol. 206 (2), 301-308 (2006).
  12. Shen, E. P., et al. Comparison of corneal epitheliotrophic capacity among different human blood-derived preparations. Cornea. 30 (2), 208-214 (2011).
  13. Song, I. S., et al. Heat shock protein 27 phosphorylation is involved in epithelial cell apoptosis as well as epithelial migration during corneal epithelial wound healing. Exp Eye Res. 118 (1), 36-41 (2014).

Tags

علم الوراثة، العدد 115، حرارة صدمة بروتين 27، ظهارة القرنية، القرنية التئام الجروح الظهارية، موت الخلايا المبرمج الخلايا الظهارية، والهجرة الظهارية، تدخل الحمض النووي الريبي، سيرنا، والبيولوجيا الجزيئية
التحقيق استنادا التدخل-RNA من وظيفة من حرارة صدمة بروتين 27 خلال شفاء القرنية طلائي الجرح
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yoo, A., Park, H. M., Kang, S. S.,… More

Yoo, A., Park, H. M., Kang, S. S., Kim, E. S., Tchah, H., Kim, J. Y. RNA Interference-based Investigation of the Function of Heat Shock Protein 27 during Corneal Epithelial Wound Healing. J. Vis. Exp. (115), e54280, doi:10.3791/54280 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter