Introduction
それらは同時に縁と角膜上皮の基底層の細胞に置き換えられている間に角膜上皮細胞（のCEC）を連続的に、涙液膜に流されている。1様々な外因性ストレスが、のCECのアポトーシスおよび落屑を誘発することができる。2熱ショックタンパク質（HSP）高度に保存され、分子サイズに係る二のファミリーに分類することができる。3最大HSPファミリーは、HSP90、HSP70およびHSP60を含み、より小さいファミリーはHSP27を含む4 HSP27のリン酸化が細胞の生存に重要な役割を果たすことが知られていますそして、理由アクチンリモデリングにおけるこのタンパク質の役割の細胞移動のために必要とされる。5-7。したがって、我々は、上皮創傷治癒のin vitroモデルでCECの移行とアポトーシスにおけるHSP27のリン酸化の潜在的な役割をテストしようとしました。
RNA干渉（RNAi）小さいまたは短い干渉RNAのいずれかを使用して（siRNA）がGEを持っていますそれが潜在的に可能にするように両方の基礎および応用生物学のnerated関心は、目的の任意の遺伝子の発現をノックダウンする。8ここで、我々はCEC創傷治癒およびアポトーシスに対するHSP27の寄与を評価するために、HSP27特異的siRNAを使用しました。細胞における遺伝子ノックダウンのための従来のRNAi法は、siRNAを作成するために組み立てることができる2つの未修正の21-merのオリゴヌクレオチドを含む合成RNA二重鎖を、使用しています。我々は、この本研究で使用したRNAi siRNAは、細胞をトランスフェクトするための単純かつ非常に効率的な方法であり、この試薬は、種々の不死化細胞株と連動します。この本研究では、我々は、傷誘導性の方向性創傷アッセイ、ウェスタンブロッティング、siRNAトランスフェクションアッセイ、免疫蛍光アッセイを含む、この分析のために使用される方法を、デモンストレーション、およびフローサイトメトリー。
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Protocol
1.細胞株
- 6ウェルプレートで培養10 6テロメラーゼ不死化ヒト角膜上皮細胞（HCECs）：気管支上皮増殖培地（BEGM）を使用して、5％CO 2雰囲気で37℃のインキュベーター中（密度1039.9セル/ mm 2）となるまで彼らは、95％のコンフルエンスに達します。
2.ウェスタンブロット分析上皮スクラッチ傷を作成した後
- コンフルエント培養HCECsのウェルの表面を横切るストリーク滅菌200μlのピペットチップを生物学的安全キャビネット内の皿当たり4回（クラスII、タイプA2）および5％CO 2雰囲気で37℃のインキュベーターで別々にHCECsをインキュベート1、5、10、30、60、及び120分。
- 角膜上皮創傷後のインキュベーション時間に応じて6の異なるサンプルのための1つの6ウェルプレートを使用してください。
- 1×PBSで負傷したHCEC単層を3回洗浄した後、各ウェルに2.0ミリリットルBEGMを追加します。
- 2を使用してHCECsを切り離し5分間、15mlチューブ中で5分間、900×gで遠心分離し、吸引トリプシンEDTA 1mLのピペットを用いてウェル当たりmlの0.25％トリプシン - エチレンジアミン四酢酸（EDTA）。
- PBS 1×1ミリリットルでHCECsを中断し、1.5 mlチューブに移します。
- 1ミリリットルピペットを用いて15秒、吸引1×PBS、10,000×gで遠心分離HCECs。
- 再懸濁HCECs100μlの氷冷溶解緩衝液（10mMのトリス、10mMの塩化ナトリウム、2mMのEDTA、25mMのNaFを、2ミリモルのNa 3 VO 4、1 mMのフッ化物をフェニルメタン[PMSF]、プロテアーゼ阻害剤[Aペプスタチン、1μM、 1μMのロイペプチン、および0.1μMアプロチニン]および0.5％トリトンX-100 [pHが7]）とそれらをよく混ぜます。
- 細胞溶解を誘導するために、氷上で30分間細胞をインキュベートします。
- その後、遠心分離機15分間万×gで4℃で溶解物、および新しい1.5 mlチューブ（90μlのアリコート）に上清を移し、-80℃で保管してください。
- ブラッドフォードPRを使用して細胞溶解物の総タンパク質濃度を決定しますアッセイotein。9
- 次いでドデシル硫酸ナトリウム - ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）、および10％または12％アクリルアミドゲルに負荷30μgの全細胞タンパク質を電気泳動的転写を4℃で1時間、200ミリアンペアの電流でニトロセルロースフィルターへのタンパク質バンドを分離しましたウェスタンブロットアッセイで使用するC。
- 5％のブロックニトロセルロースフィルター膜は、非リン酸化HSP27に対する一次ウサギポリクローナル抗体を追加し、1時間のTween 20（TBST）を有するトリス緩衝生理食塩水でスキムミルク（1：1,000希釈）またはリン酸化HSP27に対する一次ウサギポリクローナル抗体（1 ：1,000 5％ウシ血清アルブミン（BSA）で希釈）、そしてシェーカー上で4℃で一晩、膜をインキュベートします。
- TBSTで10分間3回洗浄した後、5％BSA中の（1：10,000希釈）西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体を用いて免疫反応性バンドを検出します。
- ウェスタンブロッティングルミノール試薬で膜をインキュベート（6〜7メートル室温で1分間5cmの膜×10 cm）のあたりL。
- 、試薬溶液から膜を取り外し、吸収性タオルで余分な液体を除去し、プラスチックシートプロテクター内の場所。
- 安全な光で暗い部屋での作業、タンパク質側を上に向けてフィルムカセットに覆われた膜を配置します。
- 膜の上にX線フィルムを置き、1分間さらします。
3. siRNAのトランスフェクションアッセイ10
- BEGMを使用して、5％CO 2雰囲気で37℃のインキュベーター中で6ウェルプレート中のウェル5×10 5細胞/で培養HCECs彼らが95％コンフルエンスに達するまで。
- の10または50 nMのを作成するために、低血清培地をトランスフェクション（希釈倍率は41または14.3であった）のために、100μlの低血清培地でのトランスフェクション試薬（2.5または7.5μl）を希釈し、HSP27固有を溶解し、100μlのコントロールsiRNAをスクランブルHSP27特異的および対照siRNAをスクランブル。
- 100μミックス、100μlの希釈されたトランスフェクション試薬のL siRNA溶液（1：1の比）、室温で15分間混合物をインキュベートします。
- 細胞へのsiRNA - 脂質複合体を追加します。その後4時間の変化媒体の後、37℃で2日間細胞をBEGMを完了し、インキュベートします。
- 4.7へのセクション4.1から説明したように、ウェスタンブロッティングによってトランスフェクトされた細胞を分析します。
siRNAでトランスフェクトされた細胞11 4.ウエスタンブロットアッセイ
- HSP27特異抽出し、100μlの氷冷溶解緩衝液（10mMのトリス、10mMの塩化ナトリウム、2mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、25mMのNaFを、2ミリモルのNa 3 VOを使用して生物学的安全キャビネット内でコントロールsiRNAトランスフェクトHCECsスクランブル4、1mMのフェニルメタンスルホニルフルオリド（PMSF）、プロテアーゼ阻害剤、及び0.5％のTriton X-100、pHが7）。
- 細胞溶解を誘導するために、氷上で30分間細胞をインキュベートします。
- 15分10,000×gでペレットの溶解物およびそれから新鮮1.5ミリリットル浴槽に上清を移しますエス（90μlのアリコート）し、-80℃で保管してください。
- Bradfordタンパク質アッセイを用いて細胞溶解物のタンパク質濃度を決定します。9
- 10％または12％アクリルアミドゲル上で全細胞タンパク質の等量を有する負荷サンプルは、SDS-PAGEのゲルの対象、および電気泳動を4℃で1時間、200ミリアンペアの電流でニトロセルロースフィルターに分離したタンパク質バンドを転送しますウェスタンブロットアッセイに使用します。
- （：1,000希釈1）、リン酸化Akt 5％ブロックニトロセルロースフィルター膜は、リン酸化および非リン酸化HSP27に対する一次抗体を追加し、1時間のTween 20（TBST）でトリス緩衝食塩水にスキムミルク（1：1,000希釈）、 Aktの非リン酸化（1：1,000希釈、細胞生存のマーカーとして使用される）のBcl-2関連Xタンパク質（1：1,000希釈、プロアポトーシスタンパク質として使用される）、およびグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH; 1 200 5％ローディング対照として用い希釈）ウシ血清アルブミン（BSA）、およびシェーカー上で4℃で一晩膜をインキュベートします。
- TBSTで3回洗浄した後、5％BSAで、10分各洗浄：西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体（10,000希釈1）を用いて免疫反応性バンドを検出します。
- ウェスタンブロッティングルミノール試薬で膜をインキュベート室温で1分間（6〜7ミリリットルあたり10センチメートル×5センチメートル膜）。
- 、試薬溶液から膜を取り外し、吸収性タオルで余分な液体を除去し、プラスチックシートプロテクター内の場所。
- 安全な光で暗い部屋での作業、タンパク質側を上に向けてフィルムカセットに覆われた膜を配置します。
- 膜の上にX線フィルムを置き、1分間さらします。
5.スクラッチによって誘発される細胞遊走12の指向の傷つけアッセイ評価
- 生物学的安全キャビネットでは、のコンフルエント培養のウェルの表面全体に、滅菌ピペットチップをドラッグして傷を作りますHSP27特異的siRNAトランスフェクトまたはスクランブル対照siRNAトランスフェクトHCECs。
- 直ちに創傷後、1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回細胞を洗浄し、創傷後24時間、5％CO 2雰囲気中で37℃のインキュベーター中BEGM培養でそれらを維持します。
- 創傷後100X倍率24時間で直立顕微鏡を用いて写真HCEC画像とフィルタを使用して平坦化の背景を行います 画像解析ソフトでコマンド。
- 選択測定コマンドを使用して、初期傷の端から端まで垂直にカバーすることができ、同じ大きさの多角形状とインタレスト（AOI）のエリアを定義し、各サンプルの創傷領域に三つの異なるAOIを決定します。
- 自動的にカウント/サイズMeasureメニューオプションを使用して、各フィールドのセルの数を数えます。
アポトーシスの6.フローサイトメトリー分析
- 文化HSP27特異的siRNAトランスフェクトし、コントロールの6ウェルプレート中のウェル5×10 5細胞/の濃度でそれぞれ10 nMのsiRNAを含有するiRNAトランスフェクトHCECs細胞はBEGM中で、5％CO 2雰囲気下で37℃のインキュベーター中で95％コンフルエンスに達するまで。
- 1ミリリットルピペットを用いて5分間、15mlチューブ中で5分間、900×gで遠心分離し、吸引トリプシンEDTAのためにウェル当たり2ミリリットル0.25％トリプシン-EDTAを使用してHCECsを外します。
- 冷PBSで細胞を2回洗浄した後、10 6細胞/ mlの濃度で緩衝液（0.1 M HEPES / NaOHを[pHは7.4]、1.4 MのNaCl、および25mMのCaCl 2）に結合1Xで細胞を再懸濁します。
- 5ミリリットル培養チューブに100μlの細胞懸濁液（1×10 5細胞）を転送。
- ヨウ化プロピジウムμlの5μlのフルオレセインイソチオシアネート結合アネキシンVと5を追加します。
- 細胞を穏やかにボルテックスし、暗所で室温で15分間、それらをインキュベートします。
- 各チューブに1×結合緩衝液200μlを加え、フローcで細胞を分析1時間以内にytometer。
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Representative Results
リン酸化HSP27の発現が有意に無傷HCECs 13と比較して創傷スクラッチした後、5から10に増加し、30分。ウェスタンブロット分析は、Baxの発現が有意にHSP27特異的siRNAでトランスフェクトHCECs（ 図1A-E）で増加したのに対し、リン酸化HSP27及びリン酸化Aktの発現は両方の有意に減少したことが明らかになりました。 （ 図1A-Bリン酸化HSP27の発現は、対照siRNAをトランスフェクトした細胞と比較して、それぞれ、30％および10 nMの中で40％とHSP27特異的siRNAでトランスフェクトした細胞の50 nMの減少したが、リン酸化HSP27の発現が減少しませんでした）。また、非リン酸化HSP27の発現は、10 nMの20％及び30％減少したsiRNAをトランスフェクトされた細胞、それぞれが、非リン酸化HSP27の発現は減少しなかった（ 図1A HSP27特異的およびCの50 nMの</強いです>）。
スクラッチによって誘発される方向性創傷アッセイは、創傷後24時間で、10〜50 nmでHSP27特異的siRNAトランスフェクト細胞が減少し、移行（ 図2）を示したことを示しました。また、HSP27特異的siRNAでトランスフェクトHCECsは、フローサイトメトリーによるスクランブルコントロールsiRNAをトランスフェクトした細胞（ 図3）と比較してより多くのアポトーシスおよび壊死性細胞死を受けました。
細胞生存のマーカーとしてのリン酸化HSP27（P-HSP27）、非リン酸化HSP27（非P-HSP27）、リン酸化Akt（P-Aktの）に対する抗体を用いて、図1ウエスタンブロット分析、非リン酸化Akt（非プロアポトーシスタンパク質としてのp-Aktを）、のBcl-2eassociated Xタンパク質（Baxの）、およびGAPDH（A）。リン酸化および非リン酸化HSP27の発現と対照siRNAをトランスフェクトした細胞において観察されたものと比較して、しかし、Baxの発現が有意に、HSP27特異的siRNAでトランスフェクトHCECs（E）で増加- （D B）（すべてP <0.05）、リン酸化Aktは有意に減少しました。リン酸化されたHSP27の発現は、それぞれ、30％および10 nMの中で40％とモック対照と比較してHSP27特異的siRNAでトランスフェクトした細胞の50 nMの減少したが、リン酸化HSP27の発現は10 nMので減少し、対照siRNAの50 nMのされませんでしたトランスフェ細胞（B）。 **、*。 †、††。 ‡、‡‡。 §§、§：群間で統計学的に有意な差（p <0.05）。エラーバーは、標準偏差（SD）を表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
siRNAをトランスフェクトHCECsに創傷後細胞遊走を評価するための図2.スクラッチによって誘発される方向性創傷アッセイ。スクラッチ傷を制御し、HSP27特異的siRNAトランスフェクト細胞（A）で作成されました。細胞を「ドラッグ」領域から除去されました。創傷後24時間で、HSP27特異的siRNAでトランスフェクトした細胞の10と50 nMのは10〜50 nmのコントロールsiRNAをトランスフェクトした細胞（B）と比較して移動する細胞の低い数字を示しました。 **、*は群間で統計学的に有意な差（p <0.05）を示しています。データは±標準偏差を意味するように示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
<スクランブル対照siRNAおよびアネキシンV及びPI（A及びB）で標識したHSP27特異的siRNAをトランスフェクトしたヒト角膜上皮細胞（HCECs）の50nmのBR /> 図3のフローサイトメトリー。象限中の全細胞の割合は、早期アポトーシス細胞（アネキシンV陽性かつPI陰性細胞、Q4、右下）、後期アポトーシス細胞（アネキシンV陽性かつPI陽性細胞、Q2、右上）、に相当しますおよび壊死細胞（アネキシンV陰性およびPI陽性細胞、Q1、左上）。 HSP27特異的siRNAトランスフェクトのHCECsは、コントロールsiRNAをトランスフェクトした細胞よりも、アポトーシスおよび壊死性細胞死を持っていた。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Disclosures
著者らは、この研究で言及した任意の材料または方法には金融や独自の利害関係はありません。
Acknowledgments
この研究は、医学、ソウル、韓国の蔚山大学の大学の学生の研究助成（13-14）と牙山生命科学研究所、ソウル、韓国からの助成金（2014から464）によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biological safety cabinet | CHC LAB Co.Ltd, Daejeon, Republic of Korea | CHC-777A2-06 | Class II, Type A2 |
| Stealth RNAi™ siRNA | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA | RNAi siRNA; scrambled control-siRNA and HSP27-specific siRNA | |
| BEGMTM | Lonza, Inc., Walkersville, MD | CC-3171, CC4175 | Bronchial epithelium growth medium |
| Protease inhibitor | Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO | P8340 ,P7626 | 1 μM Pepstatin A, 1 μM Leupeptin, 0.1 μM Aprotinin |
| Bradford protein assay | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | #500-0001 | Bradford protein assay |
| Nitrocellulose filters | Amersham, Little Chalfont, UK | RPN3032D | Western blotting membrane |
| Non-phosphorylated HSP27 | Abcam Inc., Cambridge, MA | ab12351 | 1:1,000 dilution (Total HSP27) |
| Phosphorylated HSP27 (Ser85) | Abcam Inc., Cambridge, MA | ab5594 | 1:1,000 dilution HSP27 was phosphorylated at Ser85 |
| Lipofectamine® RNAiMAX reagent | Invitrogen, Carlsbad, CA | 13-778-075 | Transfection reagent |
| Phosphorylated Akt (Ser473) | Cell Signaling Technology, Danvers, MA | No. 4060 | 1:1,000 dilution Akt was phosphorylated at Ser473 (cell survival marker) |
| Non-phosphorylated Akt | Cell Signaling Technology, Danvers, MA | No. 4061 | 1:1,000 dilution (Total Akt) |
| Bcl-2-associated X protein | Cell Signaling Technology, Danvers, MA | No. 4062 | 1:1,000 (anti-apoptotic protein marker) |
| GAPDH | Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA | No. 4063 | 1:1,000 loading control marker (house keeping gene) |
| Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit antibodies | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA | NCI1460KR | 1:10,000 dilution |
| OPTI-MEM | Invitrogen, Carlsbad, CA | 31985 | reduced serum medium for transfection |
| Image analysis software | Olympus, Inc., Tokyo, Japan | Image-Pro Plus 5.0 | |
| Skimed milk powder | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlstruhe, Germany | T145.2 | |
| Tris | Amresco LCC, Inc. Solon, OH | No-0497 | |
| Sodium Chloride | Amresco LCC, Inc. Solon, OH | No-0241 | |
| Six well culture plate | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA | 140675 | 35.00 mm diameter / well |
| 24-well culuture dish | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA | 142475 | |
| Orbital shaker | N-Bioteck, Inc., Seoul, South Korea | NB1015 | |
| Bovine serum albumin | Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA | sc-2323 | |
| BDFACSCantoTM II | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ | Flow cytometry | |
| X-Ray Film | Kodak, Rochester, NY | Medical X-Ray Cassette with Green 400 Screen | |
| western blotting luminol reagent | Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA | sc-2048 | |
| FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ | 556547 |
References
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