Abstract
É descrito um método em que as nanopartículas de quantum dot (QD) pode ser utilizado para estudos imunocitoquímicos correlativos de tecido patologia humana usando microscopia de luz e de fluorescência de campo amplo microscopia electrónica de transmissão (TEM). Para demonstrar o protocolo temos immunolabeled epoxi secções ultrafinas de tumor Somatostatinoma humana utilizando um anticorpo primário para somatostatina, seguido por um anticorpo secundário biotinilado e estreptavidina conjugada com visualização 585 nm cádmio-selênio (CdSe) quantum dots (QDs). As secções são montadas sobre uma grelha TEM espécime, em seguida, colocado sobre uma lâmina de vidro para observação ao microscópio óptico de fluorescência de campo amplo. A microscopia de luz revela rotulagem QD 585 nm como fluorescência laranja brilhante formando um padrão granular dentro do citoplasma da célula de tumor. Em baixa para ampliação de gama média por microscopia de luz do padrão de marcação pode ser facilmente reconhecido e o nível de rotulagem não-específica ou de fundo avaliada. Esta é uma críticapasso subsequente para interpretação do padrão de imunomarcação por TEM e avaliação morfológica do contexto. A mesma seção é então seco com papel absorvente e visualizado por TEM. QD sondas são vistos para ser ligado a material amorfo contidos em grânulos de secreção individuais. As imagens são adquiridas a partir da mesma região de interesse (ROI) visto por microscopia de luz para análise de correlação. Correspondendo imagens de cada modalidade pode então ser misturada para sobrepor os dados de fluorescência em MET ultraestrutura da região correspondente.
Introduction
Luz- correlativa e microscopia eletrônica (CLEM) é uma abordagem poderosa para a análise de eventos dinâmicos transitórios 1, eventos raros 2, 3 e complexos sistemas de 4. Há muitas permutações diferentes técnicas disponíveis 5, dependendo da questão que se coloca no entanto um requisito comum é que a mesma estrutura em uma única amostra 6 é fotografada por várias modalidades de microscopia. Nossa abordagem específica para CLEM foi desenvolvido para o estudo do tecido patologia humana de arquivo eo caso usada aqui foi bem caracterizada e publicado anteriormente 7. O objectivo era, em primeiro lugar, para maximizar os dados analíticos de uma única amostra de biópsia ou cirurgia e, por outro, para usar a microscopia de fluorescência de luz para ajudar a esclarecer o contexto do padrão de marcação imunocitoquímica visto ao nível ultra-estrutural.
nanocristais de pontos quânticos (QDs) oferecem o potencial de um marcador universal abl sistemaE para ser visto por tanto, a microscopia de luz de fluorescência e microscopia electrónica 8, 9, 10. A sua estrutura de núcleo cristalino permite QDs de tamanhos diferentes para gerar uma vasta gama de picos de emissão de fluorescência quando excitada pela luz em comprimentos de onda para longe dos seus espectros de emissão 11. O seu peso atômico é suficiente para produzir densidade de elétrons que é detectável por microscopia eletrônica de transmissão, microscopia eletrônica de transmissão de varredura (STEM) ou microscopia eletrônica de varredura de emissão de campo. Eles são particularmente adequados para estudos imunocitoquímicos como até mesmo QDs individuais podem ser observados dando uma sensibilidade final de um QD por molécula-alvo 12. Além disso, dependendo do QD utilizados podem possuir uma assinatura elementar indivíduo adequado para mapeamento.
amostras de patologia humana oferecem benefícios significativos para a investigação biomédica translacional. amostras de tecido cirúrgico e biópsia são rotineiramente submetidos à biobanking e com appropfolgas ética riate pode ser acessado por estudos de investigação. Tecido humano não tem questões de relevância ou de interpretação que podem ocorrer em animais ou em modelos in vitro de doença. No entanto, a preparação de amostras de amostras de patologia muitas vezes não é o ideal. Pode haver atraso no tecido a ser colocado no fixador, inadequado fixador utilizado tal como formalina, em vez de glutaraldeído por TEM e inadequado amostragem. CLEM métodos têm o potencial para optimizar a informação de diagnóstico e de prognóstico disponível a partir de uma única amostra humana. No entanto, algumas abordagens correlativos recentemente desenvolvidas, tais como as que utilizam mini-gerador de oxigénio singuleto (miniSOG) não estão disponíveis para utilização em patologia, devido à necessidade de que a etiqueta seja geneticamente codificados na célula de interesse 13. Por esta razão temos explorado a utilidade de rotulagem QD de tecido TEM rotineiramente preparados para estudos imunocitoquímicos correlativos. QDs aplicado a epoxi gravado ou secções de resina acrílica de Liamostras de biópsia e tecidos ghtly aldeído fixos oferecem a possibilidade de obtenção de microscopia de luz de fluorescência correlativa e os dados TEM partir de uma única amostra.
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Protocol
1. Tissue Dissecção e Fixação
- Dissecção de tecido
- Dissecar pedaços de tecido a partir de uma amostra ou tecido tumoral biópsia cirurgicamente ressecado.
Nota: O tecido utilizado no presente estudo foi rotineiramente fixadas em formalina tecido fresco mas também é adequado. Nós seleccionada uma área confirmada e comunicada por um patologista para conter anatómica tumoral Somatostatinoma após a coloração histológica de rotina e imunocoloração anti-somatostatina (não mostrado). - Use pedaços de tecido não maiores que aproximadamente 1,0 mm3.
- Dissecar pedaços de tecido a partir de uma amostra ou tecido tumoral biópsia cirurgicamente ressecado.
- Cacodilato de tampão de preparação de
- Prepara-se uma solução de tampão de estoque (1 M), adicionando 21,4 g de cacodilato de sódio (ver Lista de Materiais) e 3,0 ml de 1% de solução de cloreto de cálcio a 90 ml de água destilada e, em seguida, cobrindo-se a solução para um volume final de 100 ml. Agitar a solução e deixá-lo repousar durante a noite para que o reagente cristalino dissolve totalmente.
- Fixador Preparação e Utilização
- Adicionar uma ampola de 10 ml de solução de glutaraldeído a 50% a 20 ml da solução de cacodilato de sódio (1 M). Encha com água destilada para 190 ml. Verificar o pH e ajustar para 7,4 por adição de 1 - 4 gotas de ácido clorídrico a 3% (HCl), se necessário.
- Completar com água destilada para perfazer um volume final de 200 ml.
- Mergulha-se o tecido em fixador contendo 2,5% de glutaraldeído em tampão de cacodilato de sódio 0,1 M, pH 7,4 durante 24 horas a 4 ° C num tubo de ensaio de vidro. Descarte fixador não utilizados após 1 semana.
2. Processamento de Tecidos e Embedding
- ósmio TetroXide coloração
- Após a fixação é completa, mergulhar o tecido em tampão de cacodilato de sódio (0,1 M) durante 20 min, em seguida, repetir durante mais 20 min.
- Prepara-se uma tetróxido de ósmio aquoso a 2% (OsO 4) solução de trabalho através da adição de 8,0 ml de uma OsO solução 4 estoque de 5% a 2,0 ml da solução de tampão de cacodilato de sódio (1 M) e 10,0 ml de água destilada para fazer um volume final de 20,0 ml.
- Remover o tampão depois imergir o tecido em 2% de OsO4 em pH 7,4 durante 4 h à temperatura ambiente.
ATENÇÃO! Tenha cuidado ao decantação e preparar OsO 4 soluções, usar equipamento de proteção pessoal adequado e trabalhar em um exaustor em todos os momentos.
- Acetato de uranilo Coloração
- Após osmication tecido estiver concluída, remova a solução OsO 4 e mergulhe o tecido em 2% acetato de sódio por 10 min. Retirar 2% de acetato de sódio, em seguida imerso em 2% de acetato de uranilo durante 1 hora atemperatura do quarto.
- Desidratação
- Desidratar tecido através de álcoois graduados. Use% de etanol a 50 durante 10 minutos, 70% de etanol durante 10 min, 95% de etanol durante 10 minutos e duas mudas de etanol a 100% durante 20 minutos cada à temperatura ambiente.
- Executar duas mudanças de 100% de acetona, durante 30 min cada.
- Impregnação de resina e cura
- Misture resina epóxi de baixa viscosidade em um copo de polietileno descartáveis. Adicionar 10,0 g de dióxido de vinil ciclohexeno (ERL 4221) monómero epoxi, 6 g de éter diglicidílico de polipropileno-glicol (DER 732) e 26,0 g de anidrido succínico nonenilo (NSA). Mexa bem à mão usando varas de madeira por 2 min.
- Adicionar quinze gotas de 2-dimetilaminoetanol acelerador (DMAE) epoxi e agitar novamente durante 2 min. Tome cuidado para misturar completamente os componentes ERL, DER e NSA antes de adicionar o acelerador DMAE.
- Comece a impregnação de resina do tecido através da substituição de 100% de acetona com 1: 1 de resinaacetona durante 1 hora, em seguida, substitua com 6: resina 1 a acetona, durante 3 horas, e, finalmente, 100% de resina durante a noite.
- Transferir o tecido em resina fresca em 8 micromoulds mm. Cure a 70 o C durante a noite. Resina deve ser difícil, mas não frágil após a cura.
3. ultramicrotomia
- Faca, corte Parâmetros e Seção Espessura
- Coloque uma faca de diamante cortes semifinos na ultramicrótomo e cortar secções de tecido com uma espessura de 500 nm.
- Flutuar seções para o banho de água atrás do fio da navalha. Pegar as seções sobre uma lâmina de vidro e seque-as para baixo por 10 a 20 segundos usando uma chapa quente em cerca de 110 o C.
- Etch as secções com solução de etóxido de sódio durante 20 segundos e depois lave com 100% de etanol água, em seguida destilada. Stain com 2% de azul de metileno em 1% de bórax por 20 s sobre a placa, lavar com água corrente da torneira durante 5 segundos e seco sobre a placa por 5 s. Então stain com 1,5% fucsina básica sobre a placa por 5 segundos, em seguida, seco sobre a placa por 20 s.
- Na análise por microscopia de luz de campo brilhante e confirmar que as células tumorais e uma região de interesse (ROI) estão presentes na secção.
- Alterar a faca de diamante cortes semifinos a uma faca de diamante ultrafino e definir o ângulo da faca e corte velocidade correta como recomendado pelo fabricante faca.
- Corte cortes ultrafinos a 90 nm de espessura. Observar a coloração de ouro quando as secções de flutuação no banho de água.
- Esticar e achatar as seções acenando vapor clorofórmio a partir de 1 cm 2 pedaço de papel de filtro dentro de poucos milímetros de seções. Tome cuidado para não trazer o papel clorofórmio embebido em contacto com a superfície da água.
- Ultrathin Seção grade de montagem
- Levante os cortes ultrafinos da superfície da água usando um thin-bar grelha de níquel TEM 300-mesh que foi mergulhado na seção adhesive solução. Localize as seções do lado chato da grade. As grades têm uma superfície baça ou fosco de um lado e uma superfície polida ou brilhante do outro lado. No filme de suporte é necessário. Nota: É necessário para lidar com essas grades com pinças anti-magnéticas para evitar grades que adere a fórceps.
- Prepara-se o adesivo por secção de colocação 20 cm de fita adesiva clara num frasco de 5 ml com 2,0 ml de acetona. Tampa e agite o frasco, deixe descansar por 10 min, em seguida, retire a fita deixando a solução adesiva.
4. imunomarcação
- antígeno Unmasking
- Prepare 1 ml de solução de gravação fresco saturada de metaperiodato de sódio em água destilada e utilizá-lo imediatamente. gotículas lugar da solução de gravação em uma superfície labfilm limpa.
- Coloque grades completamente secas com secções para baixo em gotículas de solução de metaperiodato de sódio à temperatura ambiente durante 30 min. Transferir as grades para dro água destiladaplets para 60 seg de lavar.
- A incubação do anticorpo e QD sonda identificadora
- Executar todas as incubações e rotulagem em gotas de solução colocados sobre uma superfície Parafilm limpo.
- Coloque a grade sobre uma gota de 0,05 M de glicina em PBS durante 10 min para bloquear o aldeído residual na secção. Remover o bloco de aldeído por blotting brevemente a borda da grelha.
- Coloque a grade sobre uma gota de soro normal de cabra 1% (NGS) e 1% bsac (10%) em PBS durante 10 min. Preparar a solução de bloqueio por adição de 10 ul de NGS e 100 ul de bsac para 890 ul de PBS para dar um volume final de 1000 uL.
- Acondicionar as secções colocando sobre uma gota de diluente de anticorpo durante 10 min.
- Realizar a incubação imunomarcação utilizando o anticorpo policlonal anti-somatostatina diluída 1:10 com o diluente de anticorpo, dando uma concentração de 3,47 g / L. Nota: incubação do anticorpo é feito colocando grades em gotas durante 1 h à temperat quartoure em câmara úmida.
- Remover o reagente de anticorpo a partir do passo 4.2.5 por blotting da borda da grelha, em seguida, lavar secções em diluente durante 2 x 5 min.
- Incubar em anticorpo secundário (de cabra biotinilado anti-coelho policlonal) diluída 1:10 durante 1 h à temperatura ambiente. Remover a solução de anticorpo secundário. Lavar em diluente para 2 x 5 min.
- Incubar em QDs estreptavidina conjugada (585 nm) diluído 1:10 durante 1 h à temperatura ambiente. Cubra com papel alumínio para reduzir a exposição à luz durante a incubação.
- Lave as redes na água destilada fresca por 2 min. Seque as bordas da grade seco.
5. Fluorescência Microscopia de Luz
- Fonte de Luz e Filtro Cubes
- Use diodo emissor de luz (LED) 365 nm luz por microscopia de luz de fluorescência de campo amplo. Inserir um cubo de filtro com as seguintes características: (L Ex 365 nm, a BS 395 FT e EM LP 420 nm).
Nota: Este cubo de filtro wdoente permitir que o espectro de emissão de todos os QDs tamanhos para ser visualizados simultaneamente sob o mesmo comprimento de onda de excitação.
- Use diodo emissor de luz (LED) 365 nm luz por microscopia de luz de fluorescência de campo amplo. Inserir um cubo de filtro com as seguintes características: (L Ex 365 nm, a BS 395 FT e EM LP 420 nm).
- Visualização e criação de imagens Secções
- Coloque a seção de grade imunocoradas para baixo sobre uma lâmina de vidro em uma gota de água e cobrir com uma lamela de vidro (espessura número 1.5). Use microscopia óptica para avaliar o padrão de marcação, o nível de qualquer rotulagem não específica e estabelecer que os controlos negativos são claras de rotulagem.
- Identificar o ROI em relação às barras da grade. grades Finder pode ser útil para o estabelecimento de co-ordenadas de estruturas alvo.
- Adquirir imagens de rotulagem positivo na seção usando uma câmera digital cor completa com a definição da câmara no "color auto FL" e "Balanço de Branco" fixado em 3,200K. Utilizar a câmara no modo "automático de exposição", com uma configuração "gama" compreendida entre 0,45 e 1,00 para optimizar a aparência das imagens e "Ganho analógico" definido em 1x.Clique no ícone da câmera na interface gráfica software Zen 2 Lite com "Live", focalizar a imagem e clique em "Snap" para capturar a imagem para o framestore.
- Salvar imagens como arquivos .tif para evitar compressão e pixelation se tornando aparente.
- Prepare uma impressão mostrando a posição do ROI em relação às barras da grade ou outros pontos do tecido significativos. Estas cópias serão úteis para navegação posterior da secção e re-encontrar ROIs por microscopia eletrônica de transmissão (TEM).
- Retirar a grade do slide, lavar em água destilada e suavemente apagar as bordas seca.
Nota: Não use a iluminação demasiado intensa para adquirir imagens de fluorescência. A fotoestabilidade de QDs permite tempos de imagem de até alguns segundos, mas tome cuidado para não prolongar a exposição como extinção do sinal QD pode ocorrer após cerca de 1 min em água. fotoestabilidade prolongado ou permanente só é obtida quando QD marcado seções são desidratados com tolueno eembutido sob lamelas conforme as especificações do fabricante. No entanto, este processo irá então excluir a possibilidade de exame correlativo da mesma secção por TEM.
6. Transmission Electron Microscopy
- TEM Set Up e visualização
- Transferir a grade para o TEM para exame usando uma voltagem de aceleração de 100 kV. Use baixa ampliação de aproximadamente 1,400X para navegar ao redor da grade e encontrar ROIs que se correlacionam com os pontos de vista de microscopia de luz. Visualização de grupos de QDs em ampliações ao redor 50,000X.
- Observe QDs individuais em 70,000X ampliação ou acima. Observe os QDs como estruturas cristalinas irregulares com densidade de elétrons moderado.
- imagiologia
- Use uma câmera digital para imagens TEM. A monocromática 1392 x 1040 pixel sensor é adequada.
- Adquirir imagens clicando no ícone "Camera" para "On" no microscope interface gráfica do software de imagem, em seguida, para "Off" para armazenar a imagem na framestore. Nota: estas operações vão variar de acordo com o sistema de microscópio que está sendo usado. Use a câmera no modo de exposição automática com um ajuste de "Gamma" de 1,00.
- Salvar imagens como arquivos .tif.
7. CLEM Imagiologia
- Localizando um ROI de fluorescência por TEM
- Use uma impressão a partir da imagem de microscopia de luz para localizar ROIs correspondente por TEM. Tecidos características arquitectónicas tais como vasos sanguíneos e estruturas luminais são úteis para a navegação em torno da seção usando TEM.
- Capturar uma imagem do ROI correspondente por TEM.
- CLEM sobreposição de imagens
- Certifique-se a imagem TEM está correctamente orientado com a imagem de microscopia de luz e corrigir o alargamento de cada um de modo que a mesma estrutura visto em cada modalidade é o mesmo tamanho.
- Orientarcomeu a microscopia de luz e imagens de TEM e exibi-los lado a lado ou como sobreposições para destacar as características ultra-estruturais de ROIs immunolabeled.
- Criar uma imagem de sobreposição usando o Photoshop CS2. Em primeiro lugar, ampliar a imagem de fluorescência para a mesma ampliação como uma imagem de baixa potência TEM. Orientar as duas imagens e colá-los lado a lado em uma tela.
- Achatar a imagem.
- Criar a sobreposição de fluorescência a partir desta imagem composta. Clique no botão "Rectangular Marquee Tool", selecione a imagem de fluorescência e criar uma camada duplicada a partir dele.
- Ajuste o "Layer Style / Mistura opções" para 30 - a transparência de 40%.
- Clique no botão "Move Tool" e arraste a camada de sobreposição de fluorescência sobre a imagem TEM correspondente. Alinhar as imagens.
- Depois de atingir o alinhamento, "achatar" as camadas para produzir a imagem de sobreposição final.
- Use a "Rectangular Marquee Tool" para selecionar a nova imagem sobreposta and copiá-lo para uma nova tela. Salve como um arquivo .tiff.
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Representative Results
A amostra de tumor Somatostatinoma utilizados para este estudo foi composta por células tumorais que formam estruturas ductal misturadas com o tecido stomal colágeno. Por microscopia de luz de fluorescência, as células tumorais individuais que continham grânulos de secreção abundante mostrou rotulagem positivo para o hormônio somatostatina. Núcleos apareceu como furos escuras com marcação não-específica mínima detectável (Figura 1). A baixas ampliações, variavelmente intensa fluorescência laranja granular foi visto no citoplasma destas células tumorais bem caracterizados. A cor laranja de fluorescência foi determinada pelo tamanho de QD utilizado. Para este estudo foram utilizados 585 QDs nm que emitem um sinal de laranja quando excitadas com 365 nm de luz.
CLEM análise da mesma célula era possível (Figura 2). Usando a mesma grade como visualizado por microscopia de luz para exame de MET permitiu ROIs para ser reconhecido e imenvelhecido em ambas as modalidades. A mesma arquitetura do tecido em relação às barras da grade, como visto por microscopia de luz foi observada por TEM e usado para navegação. O ROI foi encontrado por referindo-se a imagem de microscopia de luz a 20X e observando características de tecido em relação às barras da grade.
TEM mostraram o citoplasma das células positivas de somatostatina para conter grânulos redondos abundante de variação de densidade de electrões. Os grânulos de vários diâmetros estavam presentes em células individuais e QD densidade imunomarcação sobre os grânulos também foi variável. O revestimento dos dados de fluorescência em imagens TEM sugerido forte marcação positiva corresponde a grânulos contendo electrões moderadamente material denso dentro da membrana limitante da vesícula (Figura 3).
Na maior ampliação dos grânulos moderadamente elétron densas poderia ser visto para ser intensamente immunolabeled com nanocristais QD ( 
Figura 1:. Microscopia de Luz Vista de uma Seção Ultra-fino com células Somatostatinoma rotulado para hormona somatostatina A seção ultrafina foi montado em uma grade TEM, immunolabeled, em seguida, colocado sobre uma lâmina de vidro em água sob uma lamela. células Somatostatinoma (setas) mostram núcleos redondos e grânulos positivos de hormônio somatostatina abundantes no citoplasma. Considerável variação na densidade de rotulagem é visto na população de células Somatostatinoma (200X). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 
Figura 2: CLEM Composite View a partir de um ponto ultrafinos Através de somatostatina Tissue oma Marcadas para somatostatina A) células Somatostatinoma por microscopia de campo amplo de fluorescência (120X);. B) mesmas células em torno de um lúmen (L) visto por TEM em baixa ampliação (570X); C) Superior vista TEM poder mostrando células brilhantemente fluorescente ( a) com núcleo (N) (2,000X);. D) Detalhe de grânulos citoplasmáticos que mostram intensa marcação com QDs sobre o material amorfo contido dentro do grânulo (asterisco) (20,000X) por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura . 
Figura 3:. CLEM Sobreposição de Imagem A imagem transparente de microscopia de fluorescência misturados uma imagem TEM da área correspondente (2,000X) com./ftp_upload/54307/54307fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 
Figura 4: Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM) Vista de somatostatina Granulados positiva a partir de grânulos positivos Somatostatinoma celular hormonais citoplasma somatostatina no citoplasma (setas) mostram QD localização sobre o conteúdo amorfos em grande parte dentro da membrana limitante.. Circundante fundo citoplasmática é limpo com poucas sondas QD evidente. Alguns rotulagem nuclear não-específica é visto. A membrana da vesícula em torno dos grânulos (setas) é ainda visível (50,000X). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este estudo demonstrou a utilidade potencial de QDs como sondas universais para estudos Clem. Os 585 nanopartículas nm QD utilizados mostraram fluorescência brilhante e estável quando visto por microscopia óptica de campo amplo e foram prontamente observadas por TEM. Um estudo anterior por um dos presentes autores mostrou QDs também ser apropriado para a microscopia de luz de super-resolução 7. Sua fotoestabilidade foi particularmente útil para períodos de visionamento estendidos e exposições de imagem longos. QDs também pode ser utilizado para imuno-histoquímica multiplex com sondas de tamanhos diferentes emissores simultaneamente diferentes espectros coloridas com o mesmo comprimento de onda de excitação.
QDs possuem peso atómico suficiente para ser visualizado por TEM mas isso foi encontrado para ser um desafio, dependendo do tamanho das nanopartículas utilizadas. Para microscopia de luz, descobrimos que 525 QDs nm (verde) produzem menos rotulagem fundo em comparação com a maior 585 nm (laranja) e 655 formas nm (vermelho). No entanto, optamos por usar o maior 585 nm QD no presente estudo para permitir a visualização mais conveniente da rotulagem por TEM. Os menores 525 QDs nm são dimensionados aproximadamente 3-5 nm enquanto que as 585 formas nm maiores são cerca de 6-8 nm e 655 nm QDs cerca de 8-10 nm. Os 585 QDs nm possuía uma forma cristalina irregular com densidade de elétrons moderada quando visto por TEM. Eles não eram tão redonda ou como elétron denso quanto as sondas imunocitoquímicos ouro coloidal mais tradicionais. No entanto, QDs foram mostrados para produzir até 10 vezes mais eficiente do que a rotulagem de ouro coloidal e 9 que aqui confirmaram que uma elevada densidade de marcação foi prontamente realizáveis, particularmente com o sistema de sonda de ligação biotina-estreptavidina. CdSe QDs também possuem uma assinatura elemental característica que pode permitir a detecção e mapeamento usando espectroscopia de energia dispersiva (EDS), espectroscopia de elétrons perda de energia (EELS) ou microscopia eletrônica de transmissão de energia filtrada (EFTEH) 8. Microscopia eletrônica de transmissão de varredura (STEM) sistemas também podem ser utilizados devido a sua exploração de Z-contraste ou imagiologia número atômico que melhorar o contraste entre nanopartículas e material biológico de menor número atômico 14. Mapeamento de uma área grande e visualização de informações de distribuição 3D 15 com microscopia eletrônica de varredura de emissão de campo também deve ser possível.
Um passo crítico no nosso método é o procedimento desmascaramento antigénio ou secção de condicionamento. Usamos um único tratamento com metaperiodato de sódio, durante 30 min à temperatura ambiente. Mais do que isso e agregação de estruturas ou perda da definição da membrana pode ocorrer. Outros têm utilizado um método de dois passos envolvendo deplasticizing com metóxido de sódio seguido de de-osmication com periodato de sódio e isto pode proporcionar um maior controlo sobre o processo, se necessário 16.
CLEM era possível por meio de microscopia de luz para CAREFULLy log as características estruturais da ROIs em relação às barras da grade. A mesma grelha é então colocado no TEM e orientada de modo a que as barras da grelha e a pontos de referência corresponde à vista da microscopia de luz. Um pequeno aumento de aproximadamente 1,400X é mais adequado para este. estruturas de tecidos, tais como formações e padrões de núcleos ductais provou ser mais útil para re-encontrando ROIs no tecido. No entanto, uma correlação exacta com mesma resolução célula pode ser um desafio. Cuidados teve que ser levado com a orientação da grelha de modo a reflectir a mesma orientação visto por microscopia de luz. Temos conseguido correlação espacial subcelular razoavelmente precisa entre as modalidades com imagens de sobreposição produzidos usando o Photoshop. A imagem de sobreposição de fluorescência foi misturado com a imagem de fundo TEM porém alguns desalinhamento era detectável. Isto pode ser devido aos diferentes sistemas de imagiologia utilizadas por cada modalidade ou para os danos da radiação para os cortes ultrafinos não suportados no MET. sistemas automáticos de storing coordenadas de ROIs visto por microscopia de luz e transferindo-os para o microscópio eletrônico já estão sendo comercializados e simplificaria muito este procedimento.
A utilidade da abordagem CLEM temos apresentado por estudos imunocitoquímicos é limitada pela necessidade de o método de preparação de amostra utilizado, isto é, coloração de metal pesado e a incorporação de resina epoxi inevitavelmente mascarar epitopos disponíveis. No entanto, a técnica não permite a obtenção de um benefício considerável de dados de fluorescência e de MET a partir de amostras de patologia. Obtenção de informações estruturais e funcionais de diferentes modalidades de microscopia usando uma única amostra é algo que não tem sido geralmente disponível para estudos de células de patologia e tecidos humanos que foram processados principalmente para fins de diagnóstico.
Seria de esperar que a localização imunocitoquímica mais sensível pode ser obtida a partir de uma abordagem de congelamento de fixação em vez de um protocolo based na fixação química. A adopção de princípios criofixação 17 para biobanking de tecido humano seguido por cryoultramicrotomy e à temperatura ambiente à base de imunomarcação QD como na técnica Tokuyasu clássico 18, 19 iria facilitar estudos imunocitoquímicos correlativos sensíveis e específicos da patogênese da doença humana.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium cacodylate | Proscitech | C0205 | Harmful chemical |
| Osmium tetroxide | Proscitech | C010 | Use only in fume hood |
| Uranyl acetate | Univar-Ajax | 569 | Hazardous chemical |
| Ethanol 100% | Fronine | JJ008 | |
| Acetone 100% | Fronine | JJ006 | |
| ERL 4221 | Proscitech | C056 | |
| DER 732 | Proscitech | C047 | |
| NSA | Proscitech | C059 | |
| DMAE | Proscitech | C050 | |
| Sodium metaperiodate | Analar BDH | 10259 | |
| anti-somatostatin antibody | Dako | A0566 | |
| Antibody diluent | Dako | S3022 | |
| Qdot 585 Streptavidin Conjugate | Invitrogen | Q10113MP | |
| Biotinylated goat anti-rabbit IgG antibody | Sigma | B7389-1ML | |
| Glutaraldehyde 50% | EMS | 16320 | |
| Normal goat serum | Invitrogen | PCN5000 | |
| PBS "Dulbecco A" | Oxoid | BR0014G | |
| BSAc (10%) | Aurion | 900.022 | |
| Parafilm | Pechiney PP | M | |
| pH indicator strips (pH 2.0 - 9.0) | Merck | 1.09584.0001 | |
| Micromoulds | Proscitech | RL063 | |
| Diamond knife | Diatome | Ultra 45 | |
| Transmission electron microscope | FEI | Morgagni 268D | |
| Fluorescence light microscope | Carl Zeiss | Axioscope A1 | |
| Grids 300 mesh nickel (thin bar) | Agar Scientific | G2740N | |
| Ultramicrotome | RMC | Powertome | |
| TEM camera control software | Soft Imaging System | AnalySIS | Version 3.0 |
| Image processing software | Adobe Systems Incorporated | Photoshop CS2 |
References
- Kukulski, W., Schorb, M., Welsch, S., Picco, A., Kaksonen, M., Briggs, J. A. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).
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- De Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: ultrastructure lights up! Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).
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