Abstract
kuantum noktası (QD) nanopartiküller Geniş açılı, floresan ışık mikroskopisi ve transmisyon elektron mikroskopisi (TEM) ile insan patolojisinde doku bağıntılı immünositokimyasal çalışmaları için kullanılabilir ve böylece bir yöntem tarif edilmektedir. streptavidin konjüge 585 nm kadmiyum selenyum (CdSe) kuantum noktaları (QDS) ile biyotinlenmiş sekonder antikor ve görüntüleme ile, takiben de somatostatin birincil antikor kullanılarak, insan somatostatinoma tümör ultra-ince epoksi bölümleri immunolabeled olan protokolü, göstermek için. Kesitler daha sonra Geniş açılı, floresan ışık mikroskopisi ile, gözlem için bir cam lam üzerine yerleştirilir TEM numune ızgara üzerine monte edilmiştir. Işık mikroskopisi tümör hücre sitoplazması içinde bir zerre desen oluşturan parlak turuncu floresan gibi 585 nm QD etiketleme ortaya koymaktadır. ışık mikroskobu ile orta menzilli büyütme düşük at etiketleme desen kolayca kabul edilebilir ve non-spesifik ya da arka plan etiketleme düzeyi değerlendirilir. Bu kritikmorfolojik bağlamda sonraki TEM ile immün desen yorumlanması ve değerlendirilmesi için adım. Aynı bölüm daha sonra kuru lekelenen ve TEM tarafından görülüyor. QD problar bireysel ifrazi tanecikler içerisinde bulunan şekilsiz malzemeye bağlı olmak görülmektedir. Görüntüler bağıntılı analizi için ışık mikroskobu ile görülen faiz (ROI) aynı bölgeden elde edilir. Her modalite görüntüleri mukabil sonra ilgili bölgenin TEM ultrastrüktürü floresan verilerini bindirmek için karışık olabilir.
Introduction
Bağıntılı ışık ve elektron mikroskobu (CLEM) geçici dinamik olaylara 1, nadir olaylar 2, 3 ve karmaşık sistemler 4 analizi için güçlü bir yaklaşımdır. Sorusuna bağlı olarak 5 mevcuttur birçok farklı teknik permütasyon isteniyor vardır ancak ortak bir gereksinim tek bir örnek 6 aynı yapı birden mikroskopi modaliteleri tarafından görüntülenmiş olmasıdır. Clem bizim özel yaklaşım, arşiv insan patolojisinde dokusunun çalışma ve iyi karakterize edilmiş ve 7, daha önce yayınlanmış olan burada kullanılan durum için geliştirilmiştir. Amaç ultrastrüktürel düzeyde görülen İmmünositokimyasal etiketleme desen bağlamını netleştirmeye yardımcı olmak için floresan ışık mikroskobu kullanımı, ikincisi tek biyopsi veya cerrahi örnek ve analitik verileri en üst düzeye çıkarmak, öncelikle oldu.
Kuantum nokta nanokristaller (QD'lerin) evrensel bir işaret sistemi abl potansiyel sunmaktadırE, her iki tarafından izlenmek üzere, floresan ışık ve elektron mikroskopi 8, 9, 10. kristalin çekirdek yapısı emisyon spektrumları 11 uzak dalga boylarında ışık ile uyarıldığında, farklı boyutlarda QDS floresans emisyon tepe geniş oluşturmasına olanak sağlar. Atom ağırlığı transmisyon elektron mikroskopisi, tarama elektron mikroskopisi (STM) ya da alan emisyonu tarama elektron mikroskopisi ile tespit edilebilir, elektron yoğunluğu elde etmek için yeterlidir. Hatta tek QDS hedef moleküle 12 başına bir QD nihai bir duyarlılık veren gözlenmiştir edilebilir Özellikle immünositokimyasal çalışmalar için uygundur. Ayrıca, QD bağlı onlar haritalama için uygun bir bireysel element imza sahip olabilir kullanılır.
İnsan patoloji örnekleri translasyonel biyomedikal araştırmalar için önemli faydalar sunar. Cerrahi doku ve biyopsi örnekleri rutin biobanking ve approp ile gönderilenyaklaşımlarına yön etik açıklıklar araştırma çalışmaları için erişilebilir. İnsan doku hayvandaki veya hastalığın in vitro modellerinde oluşabilir alaka ya yorumlama sorunları yok. Ancak, patoloji örneklerinin numune hazırlama genellikle optimal değildir. dokuda gecikme sabitleştirici konuyor olabilir, uygunsuz sabitleyici gibi TEM ve uygunsuz örnekleme için formalin yerine glutaraldehit olarak kullandı. CLEM yöntemler tek bir insan numuneden temin tanısal ve prognostik bilgi optimize etmek için bir potansiyele sahiptir. Ancak, bu tür küçük Singlet Oksijen Jeneratör (miniSOG) kullananlar gibi bazı yeni geliştirilen karşılıklı yaklaşımlar nedeniyle etiket genetik ilgi 13 hücreye kodlanacak için ihtiyaç patoloji kullanılmak üzere mevcut değildir. Bu nedenle biz karşılıklı immünositokimyasal çalışmalar için rutin olarak hazırlanan TEM dokusunun QD etiketleme programı incelemiş bulunuyoruz. QDS kazınmış epoksi veya Li'den akrilik reçine bölümlere uygulananghtly aldehit sabit biyopsi ve doku örnekleri tek bir örnekten bağıntılı floresan ışık mikroskobu ve TEM veri elde etmek imkanı sunuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Doku Diseksiyon ve Fiksasyon
- doku Diseksiyon
- Bir cerrahi rezeksiyon tümör örneği veya doku biyopsisi doku parçaları incelemek.
Not: Bu çalışmada kullanılan doku rutin formalin içinde sabitlendi, ancak taze doku da uygundur. Bu rutin histolojik boyama ve anti-somatostatin immün (gösterilmemiştir) sonra, somatostatinoma tümör içeren, anatomik bir patolog tarafından teyit bildirilen bir alan seçilmiştir. - Yaklaşık 1,0 mm 3 daha büyük doku parçaları kullanın.
- Bir cerrahi rezeksiyon tümör örneği veya doku biyopsisi doku parçaları incelemek.
- Kakodilat tampon hazırlanması
- sodyum kakodilat 21.4 g eklenerek stok tampon çözeltisi (1 M) hazırlama (Malzeme Listesi) ve 90 ml damıtılmış suya ve daha sonra 100 ml'lik bir nihai hacme solüsyonu tepesi 3.0 mL% 1 kalsiyum klorür çözeltisi. çözüm karıştırın ve kristal reaktif tamamen erir, böylece gece boyunca beklemeye bırakın.
- Sabitleme hazırlanması ve kullanımlar
- sodyum kakodilat stok çözeltisi (1 M), 20 ml% 50 glutaraldehid çözeltisi, bir 10 mi ampul ekleyin. 190 ml damıtılmış su ile doldurun. pH kontrol edin ve 1 eklenerek 7.4'e ayarlayın, -% 3 hidroklorik asit (HCI) gerektiğinde 4 damla.
- 200 ml 'lik bir son hacim yapmak için damıtılmış su ile doldurun.
- Bir cam tüpte 4 o C'de 24 saat süre ile 0.1 M sodyum kakodilat tamponu pH 7.4 içinde% 2.5 glutaraldehid içeren sabitleştirici doku bırakın. 1 hafta sonra kullanılmayan fiksatif atın.
2. Doku İşleme ve katıştırma
- osmiyum Tetroxide Boyama
- tespit işlemi tamamlandıktan sonra, daha sonra 20 dakika boyunca, sodyum kakodilat tamponu (0.1 M) içerisinde doku daldırın 20 dakika daha tekrarlayın.
- Nihai bir hacim yapmak için, sodyum kakodilat tamponu stok çözeltisi (1 M) 2.0 ml damıtılmış su içinde 10.0 ml% 5 OsO 4 stok solüsyonu 8.0 ml ilave edilerek çalışma çözeltisi 2% sulu ozmiyum tetroksit (OsO 4) hazırlanması 20.0 mi.
- Tampon, daha sonra oda sıcaklığında 4 saat süre ile pH 7.4'de OsO 4 2% doku sokmak çıkarın.
Boşaltılması ve OsO 4 çözüm hazırlarken DİKKAT! Her zaman bir davlumbaz uygun kişisel koruyucu ekipman ve iş giyim, dikkatli olun.
- Uranil asetat Boyama
- Doku osmication tamamlandıktan sonra OsO 4 çözüm kaldırmak ve 10 dakika boyunca% 2 sodyum asetat içinde doku bırakın. % 2 sodyum asetat sonra 1 saat sonra% 2 uranil asetat sokmak Kaldıroda sıcaklığı.
- kurutma
- kademeli alkoller ile doku kurutmak. 10 dakika ve oda sıcaklığında 20 dakika her biri için% 100 etanolden iki değişiklik, 10 dakika,% 95 etanol için 10 dakika için% 50 etanol,% 70 etanol kullanımı.
- 30 dakika her biri için% 100 aseton iki değişiklik yapın.
- Reçine Emprenye ve Kür
- tek kullanımlık bir polietilen kap içinde düşük viskoziteli bir epoksi reçine karıştırılır. vinil sikloheksen dioksit (ERL 4221), epoksi monomer 10.0 g, polipropilen glikol diglisidil eter 6 g (DER 732) ve nonenil süksinik anhidrit (NSA) 26.0 g ekleyin. 2 dakika süreyle ahşap çubukları kullanarak elle iyice karıştırın.
- 2-dimetilaminoetanol (DMAE) epoksi hızlandırıcı on beş damla ilave edin ve 2 dakika boyunca daha karıştırıldı. tam DMAE hızlandırıcı eklemeden önce ERL, DER ve NSA bileşenleri karıştırmak için özen gösterin.
- 1 reçinesi: 1% 100 aseton değiştirerek doku reçine emprenye Başlangıç3 saat aseton 1 reçine, ve bir gece boyunca son olarak% 100 reçinesi: aseton, 1 saat boyunca, daha sonra 6 ile değiştirin.
- 8 mm micromoulds taze reçine içine doku aktarın. 70 o C gece boyunca Cure. Reçine zor ama Kuruduktan sonra kırılgan olmamalıdır.
3. ultramikrotom
- Bıçak, Kesici Parametreler ve Bölüm Kalınlığı
- ultramicrotome bir yarı ince elmas bıçak yerleştirin ve 500 nm arasında bir kalınlıkta dokudan kesitler halinde kesilmiştir.
- bıçak kenarının arkasına su banyosu üzerine bölümleri yüzer. Bir bardak slayt bölümleri Pick up ve C o yaklaşık 110 ocak gözünü kullanarak 10 ila 20 saniye boyunca onları kurutun
- 20 sn için sodyum etoksit çözeltisi ile bölümleri çözülmesi ve daha sonra% 100 etanol daha sonra damıtılmış su ile yıkayın. ocak 20 saniye% 1 boraks içinde% 2'lik metilen mavisi ile Leke, 5 saniye ocak üzerinde 5 saniye akan musluk suyu ve kuru ile durulayın. Sonra stain 20 saniye ocak ardından kuru 5 sn ocak üzerinde% 1.5 bazik fuksin ile.
- parlak alan ışık mikroskobu ile incelemek ve bu tümör hücrelerini ve faiz (ROI) bir bölge teyit bölümünde bulunmaktadır.
- ultra ince elmas bıçak yarı ince elmas bıçak değiştirin ve bıçak üreticisi tarafından tavsiye edildiği gibi doğru bıçak açısı ve kesme hızını ayarlamak.
- 90 nm kalınlığında ultra ince kesitler halinde kesilmiştir. su banyosu üzerinde yüzen bölümlerinin altın renginin gözlemleyin.
- Stretch ve bölümlerin birkaç milimetre içinde filtre kağıdı 1 cm 2 parça kloroform buharı sallayarak bölümleri dümdüz. Su yüzeyi ile temas kloroform batırılmış kağıt getirmek için özen gösterin.
- Ultra ince Bölüm Izgara Montaj
- bölüm adhesiv batırılmış olan bir 300 mesh ince çubuk nikel TEM ızgarası kullanılarak su yüzeyinden ultra ince bölümleri kaldırıne çözüm. ızgara donuk tarafında bölümleri bulun. ızgaralar bir tarafında ve diğer tarafta bir cilalı veya parlak yüzeyde donuk veya mat bir yüzeye sahiptir. Hiçbir destek filmi gereklidir. Not: forseps yapışmasını ızgaraları önlemek için anti-manyetik forseps ile bu ızgaraları işlemek için gereklidir.
- aseton 2.0 ml Şişeyi ml bir 5 açık yapışkan bant 20 cm koyarak bölüm yapıştırıcı hazırlayın. Cap ve şişeyi sallayın, yapışkan çözümü bırakarak bandı çıkarın, sonra 10 dakika bekletin.
4. ile immün
- antijeninin ortaya çıkartılması
- damıtılmış su içinde taze doymuş bir sodyum metaperiodat dağlama çözeltisi 1 ml hazırlayın ve hemen kullanımı. Temiz labfilm yüzeyinde aşındırma çözeltisi Yeri damlacıkları.
- 30 dakika için oda sıcaklığında aşağı sodyum metaperiodat çözeltisinin damlacıklarının bölümlere sahip tamamen kuru ızgaraları yerleştirin. Damıtılmış su DRO'ya ızgaraları aktarınYıkama 60 saniye boyunca plets.
- Antikor Kuluçka ve QD Probe Etiketleme
- Temiz bir Parafilm yüzeyine yerleştirilir çözümün damlacıkları tüm inkubasyon ve etiketleme gerçekleştirin.
- bölümünde artık aldehid engellemek için 10 dakika boyunca PBS içerisinde 0.05 M glisin bir damlacık ilgili kılavuz getirin. kısaca ızgara kenarına blot aldehit bloğunu çıkarın.
- 10 dakika boyunca PBS içinde% 1 normal keçi serumu (NGS) ve% 1 bsac (% 10) bir damlacık ilgili kılavuz getirin. 1000 ul nihai bir hacim verecek şekilde NGS 10 ul PBS içinde 890 ul BSAC 100 ul ilave edilerek bloke çözeltisi hazırlayın.
- 10 dakika antikor seyreltici bir damlacık üzerinde koyarak bölümleri şart.
- Antikor Seyreltici 3.47 g / L'lik bir konsantrasyon vermek 1:10 seyreltilmiş, anti-somatostatin poliklonal antikoru kullanılarak immün inkübasyon gerçekleştirin. Not: Antikor inkübasyon oda sıcaklığında bir sıcaklıkta 1 saat boyunca damlalar ızgaraları yerleştirilmesiyle yapılırnemli bir odada ure.
- daha sonra 2 x 5 dakika süreyle seyreltici ile ilgili bölümleri yıkamak ızgara kenarına blot adım 4.2.5 antikor reaktifi çıkarın.
- Oda sıcaklığında 1 saat süre ile 1:10 oranında seyreltildi ikincil antikor (biyotinile keçi anti-tavşan poliklonal) 'de inkübe edin. ikincil antikor çözüm çıkarın. 2 x 5 dakika boyunca seyreltici içinde yıkayın.
- Oda sıcaklığında 1 saat süre ile 1:10 seyreltilmiş streptavidin konjüge QDS (585 nm) 'de inkübe edin. İnkübasyon sırasında ışık maruziyeti azaltmak için alüminyum folyo ile örtün.
- 2 dakika için taze damıtılmış su içinde ızgaraları yıkayın. ızgara kuru kenarlarını kurulayın.
5. Floresan Işık Mikroskopisi
- Işık Kaynağı ve Filtre Küpleri
- geniş alan floresan ışık mikroskobu için 365 nm ışık yayan diyot (LED) aydınlatma kullanın. aşağıdaki özelliklere sahip bir filtre küpü yerleştirin: (Ex G 365 nm, BS FT 395 ve EM LP 420 nm).
Not: Bu filtre küp whasta tüm QDS emisyon spektrumları aynı dalgaboyu altında eş zamanlı olarak görüntülenmiştir için boyutları izin verir.
- geniş alan floresan ışık mikroskobu için 365 nm ışık yayan diyot (LED) aydınlatma kullanın. aşağıdaki özelliklere sahip bir filtre küpü yerleştirin: (Ex G 365 nm, BS FT 395 ve EM LP 420 nm).
- Görüntüleme ve Görüntüleme Bölümleri
- su damlacığı aşağı bir bardak slayt boyanmış ızgara bölümüne yerleştirin ve bir cam kapak slip (kalınlık numarası 1.5) ile kaplayın. etiketleme desen, herhangi bir non-spesifik etiketleme düzeyini değerlendirmek için ışık mikroskobu kullanın ve bu negatif kontroller etiketleme açık kurmak.
- ızgara çubukları ile ilgili ROI tanımlayın. Bulucu ızgaraları, hedef yapıları koordinatları oluşturulması için yararlı olabilir.
- "FL oto rengi" ve 3,200K ayarlanmış "Beyaz Dengesi" kamera ayarı ile tam renkli dijital kamerayı kullanarak bölümünde olumlu etiketleme görüntü kazanır. 1x ayarlanmış görüntülerin görünümünü ve "Analog Gain" optimize etmek 0.45 ve 1.00 arasında bir "Gamma" ayarıyla "Otomatik pozlama" modunda kamerayı kullanın."Canlı" ardından resmi odak Framestore görüntüyü yakalamak için "Ek Bileşen" tıklayın Zen 2 Lite yazılımı grafik arayüzü kamera simgesini tıklayın.
- .tif sıkıştırma ve pikselleşme belirgin olma önlemek için dosyaları olarak kaydedin.
- ızgara çubukları veya diğer önemli doku noktalara ilişkin ROI konumunu gösteren bir baskı hazırlayın. Bu baskılar daha sonraki bölümün navigasyon ve yeniden bulma transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ile İB'leri için faydalı olacaktır.
- , Slayt ızgara çıkarın distile su ile yıkayın ve yavaşça kenarları kuru kurulayın.
Not: floresan görüntüleri elde etmek için aşırı yoğun aydınlatma kullanmayın. QDS fotostabilite birkaç saniye kadar görüntüleme sürelerini tanır ama QD sinyalinin söndürme suyu yaklaşık 1 dakika sonra oluşabilir olarak poz uzatmak için özen gösterin. QD bölümleri toluen ile susuz olan etiketli zaman Genişletilmiş veya kalıcı fotostabilite sadece elde edilir veüreticilerin özelliklerine göre lamelleri altında gömülü. Ancak, bu süreç daha sonra TEM aynı bölümün karşılıklı incelenmesi olasılığını dışlamak olacaktır.
6. Transmisyon Elektron Mikroskobu
- TEM Kurma ve Görüntüleme
- 100 kV hızlanan gerilim kullanılarak inceleme için TEM ızgara aktarın. ızgara gezinmek ve ışık mikroskobu manzaralı ilişkili ROI'leri bulmak için yaklaşık 1,400X düşük büyütme kullanın. 50,000X etrafında büyütme QDS Görünüm kümeleri.
- Bireysel QD'lerin 70,000X büyütmede ya da yukarıda dikkat edin. orta elektron yoğunluğu ile düzensiz kristal yapılar olarak QD'lerin gözlemleyin.
- Görüntüleme
- TEM görüntüleme için bir dijital fotoğraf makinesi kullanın. Bir monokrom 1392 x 1040 piksel sensör yeterli.
- MICR "On" "Kamera" ikonuna tıklayarak görüntüleri EdinmeDaha sonra "Kapalı" Framestore görüntüyü saklamak için, görüntüleme yazılımının grafik arayüzü Oscope. Not: Bu işlemler kullanılan mikroskop sistemi bağlı olarak farklılık gösterecektir. 1.00 "Gamma" ayarı ile otomatik pozlama modunda kamerayı kullanın.
- dosyaları tif resim olarak kaydedin.
7. CLEM Görüntüleme
- TEM tarafından Floresan ROI bulma
- TEM ile İB'leri gelen bulmak için ışık mikroskobu görüntü bir baskı kullanın. kan damarları ve luminal yapılar gibi doku mimari özellikleri TEM kullanarak bölüm etrafında navigasyon için yararlıdır.
- TEM ile ilgili ROI bir görüntü yakalamak.
- CLEM Görüntü Bindirme
- TEM görüntüsü doğru ışık mikroskobu görüntüsü ile odaklı olduğundan emin olun ve her yöntemin görülen aynı yapı aynı boyutta olacak şekilde her genişleme düzeltin.
- Doğuışık mikroskopisi ve TEM görüntüleri yedik ve onları yan yana-ya immunolabeled ROI ultrastrüktürel özellikleri vurgulamak için bindirmeleri olarak gösterilecek.
- Photoshop CS2 kullanarak bir bindirme görüntü oluşturun. Birincisi, düşük güç TEM görüntüsü ile aynı büyütme floresan görüntüyü büyütmek. Her iki görüntüleri yönlendirmek ve daha sonra bir tuval üzerine yan yana yapıştırın.
- Görüntüyü düzleştirmek.
- Bu kompozit görüntü floresan katman oluşturun. "Dikdörtgen Marquee Tool" üzerine tıklayın floresan görüntüyü seçin ve ondan bir kopya tabakayı oluşturur.
- % 40 şeffaflık - 30 "seçenekleri karıştırma / Layer Style" ayarlayın.
- "Taşı Aracı" üzerine tıklayın ve ilgili TEM resmin üzerine floresan bindirme tabaka sürükleyin. görüntüleri hizalayın.
- uyum sağlandıktan sonra, nihai bindirme görüntü üretmek için katmanları "düzleştiriniz".
- Yeni bindirme görüntü a seçmek için "Rectangular Marquee Tool" kullanınnd yeni bir tuvale kopyalayın. Bir .tiff dosyası olarak kaydedin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışma için kullanılan somatostatinoma tümör örnek kollajen stoma dokusu ile karışık duktal yapılar oluşturan tümör hücrelerini oluşmaktadır. floresan ışık mikroskobu ile, bol salgı granülleri içeren bireysel tümör hücreleri somatostatin hormonu pozitif etiketleme gösterdi. Çekirdekler az spesifik olmayan etiketleme tespit (Şekil 1) ile birlikte koyu delikler ortaya çıktı. Düşük büyütmelerde, değişken yoğun granül-turuncu flüoresansın bu da iyi karakterize edici özelliği, tümör hücrelerine ait sitoplazmada görülmüştür. floresans turuncu renk kullanılan QD büyüklüğü ile belirlenir. Bu çalışma için biz 365 nm ışık ile uyarıldığı zaman turuncu bir sinyal yayarlar 585 nm QD'lerin kullanılır.
Aynı hücre CLEM analizi (Şekil 2) mümkün olmuştur. TEM sınav izin ROI için ışık mikroskobu ile inceledi aynı ızgara kullanarak tanınan ve im edilecekHer iki modaliteleri de yaşlı. Işık mikroskopisi tarafından görülen ızgara çubukları ile ilgili olarak aynı doku mimarisi TEM tarafından gözlemlenen ve navigasyon için kullanılmıştır. YG ızgara çubukları ile ilgili olarak doku özellikleri 20X ışık mikroskobu görüntü atıfta ve belirterek tarafından bulundu.
TEM elektron yoğunluğu değişen bol yuvarlak granülleri içeren somatostatin pozitif hücrelerin sitoplazma gösterdi. çeşitli çaplarda granülleri bireysel hücrelerinde bulunan ve granül üzerinde QD immün yoğunluğu da değişkendir. TEM görüntülerde floresan verilerinin overlaying güçlü pozitif etiketleme orta vezikül sınırlayıcı membran (Şekil 3) içinde yoğun bir malzeme elektron içeren granül karşılık önerdi.
yüksek büyütmede orta elektron yoğun granüller yoğun QD nanokristallerinin (ile immunolabeled için görülebiliyordu 
Şekil 1:. Somatostatin Hormonu için Etiketli somatostatinomanın Hücreleri ile Ultra-ince Bölüm Işık Mikroskopi Görünüm ultra ince kesit, bir TEM ızgara üzerine monte immunolabeled, daha sonra bir lamel altında suda bir cam lam üzerine konuldu. Somatostatinoma hücreleri (oklar) sitoplazmada yuvarlak çekirdekleri ve bol somatostatin hormonu olumlu granüller gösterir. Etiketleme yoğunluğu önemli farklılıklar somatostatinoma hücre popülasyonunun (200X) görülür. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. 
Şekil 2: CLEM Kompozit Görüntüle bir Ultrathin Bölümünden Somatostatin sayesinde . Somatostatin A Etiketli oma Doku) widefield floresan mikroskop ile somatostatinomanın hücreleri (120X), B), düşük büyütme (570X) de TEM tarafından görülen bir lümen (L) çevreleyen Aynı hücreler C) den parlak floresan hücre gösteren yüksek güç TEM görünümü ( A) çekirdek (N) (2,000X) ile;. D) granül (yıldız) (20,000X) içinde bulunan şekilsiz malzeme üzerinde QDS yoğun etiketleme gösteren sitoplazmik granül Detaylı bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız . 
Şekil 3:. İlgili alanda (2,000X) bir TEM görüntüsü ile harmanlanmış floresan mikroskobu gelen CLEM Yerleşimi Resim Saydam görüntü./ftp_upload/54307/54307fig3large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. 
Şekil 4:. Sitoplazma büyük ölçüde sınırlayıcı zarı içinde amorf içeriği üzerinde (oklar) göstermek QD yerelleştirme içinde somatostatinomanın Hücre Sitoplazma somatostatin hormonu olumlu granüllerden Somatostatin Olumlu Granül Transmisyon Elektron Mikroskobu (TEM) Resmi. sitoplazmik arka plan çevreleyen birkaç QD sondaları ile belirgin temiz. Bazı spesifik olmayan nükleer etiketleme görülmektedir. Granülleri (oklar) çevreleyen kese zarı hala (50,000X) görülebilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışma CLEM çalışmaları için evrensel prob olarak QDS potansiyel yarar göstermiştir. Geniş açılı ışık mikroskobu ile inceledi ve kolayca TEM gözlendi kullanılan 585 nm QD nanopartiküller parlak ve istikrarlı floresan gösterdi. Mevcut yazarlardan birinin bir önceki çalışmada da süper çözünürlük ışık mikroskobu 7 için uygun olduğu QD'lerin göstermiştir. Onların fotostabilite genişletilmiş izleme süreleri ve uzun görüntüleme pozlama için özellikle yararlı oldu. QDS farklı büyüklükte probları, aynı eksitasyon dalga boyu altındaki farklı renkli spektrumları yayan çoklu imünohistokimya için kullanılabilir.
QDS yeterli atom ağırlığı TEM ile görüntülenmiştir ama kullanılan bu nanopartikül boyutuna bağlı olarak zor olduğu bulunmuştur sahiptirler. ışık mikroskobu için, 525 nm QD'lerin (yeşil) büyük 585 nm (turuncu) ve 655 nm (kırmızı) formlara göre daha az arka plan etiketleme üretmek bulduk. Ancak, biz TEM tarafından etiketleme daha uygun görselleştirme etkinleştirmek için bu çalışmada büyük 585 nm QD kullanmayı seçti. Daha küçük 525 nm QDS büyüklükte, yaklaşık 3-8 nm ve 655 nm QDS yaklaşık 8 - - 10 nm daha büyük 585 nm formları yaklaşık 6 iken 5 nm. TEM tarafından bakıldığında 585 nm QD'lerin orta elektron yoğunluğu ile düzensiz kristal şekli sahipti. Onlar da yuvarlak veya daha geleneksel koloidal altın immünositokimyasal problar gibi yoğun elektron gibidir. Ancak, QD'lerin kolloidal altın 9 den 10X daha verimli etiketleme kadar verim gösterilmiştir ve yüksek etiketleme yoğunluğu özellikle biyotin-streptavidin prob bağlama sistemi ile kolayca elde olduğunu burada teyit etmiştir. CdSe QD'lerin ayrıca algılama ve haritalama enerji dağılım spektroskopisi (EDS), elektron enerji kaybı spektroskopisi (EELS) ya da enerji filtrelenmiş transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak izin verebilir karakteristik element imza sahip (EFTEM) 8. Tarama transmisyon elektron mikroskobu (STEM) sistemleri de Z-kontrast veya nanopartiküller ve alt atom numarası 14 biyolojik materyal arasındaki kontrastı artıracak atom numarası görüntüleme kendi sömürü nedeniyle kullanılabilir. Geniş alan haritalama ve saha emisyon taramalı elektron mikroskobu ile 3D dağıtım bilgileri 15 görselleştirme de mümkün olmalıdır.
Bizim yöntemde kritik bir adım antijen maskesinin düşürülmesi veya bölüm aşındırma işlemdir. Bu, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca, sodyum metaperiodat ile tek bir tedavi kullanımı. Bu ve yapılarına ya da zar tanımı kaybı toplulaştırılması daha uzun oluşabilir. Diğer sodyum periodat ile de-osmication ardından sodyum metoksit ile deplasticizing kapsayan, iki aşamalı bir yöntem kullanılır ve gerekli 16 bu işlemi üzerinde daha fazla kontrol sağlayabilir.
CLEM dikkatli ışık mikroskobu kullanarak mümkün olduğunuy ızgara çubukları ile ilgili olarak ROI yapısal özelliklerini açın. Aynı ızgara sonra TEM yerleştirilir ve ızgara çubukları ve görülecek ışık mikroskobu görünümüne karşılık gelecek şekilde yönlendirilir. Yaklaşık 1,400X bir düşük büyütme bunun için en uygun olanıdır. Böyle duktal oluşumlar ve çekirdeklerin desen doku yapıları dokuda İB'leri yeniden bulmak için en yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Ancak, aynı hücre çözünürlükte doğru korelasyon zor olabilir. Bakım, ışık mikroskobu ile görülen aynı yönü yansıtacak şekilde ızgara yönlendirme ile alınması gerekiyordu. Biz Photoshop kullanarak üretilen bindirme görüntüleri ile modaliteleri arasında makul doğru hücre içi mekansal ilişki elde ettik. floresan bindirme görüntü ancak bazı hiza saptanabilir oldu TEM arka plan görüntüsü ile harmanlanmıştır. Bu, her modalite veya TEM bizim desteklenmeyen ultra ince bölümlerine radyasyona karşı kullanılan farklı görüntüleme sistemleri nedeniyle olabilir. st için otomatikleştirme sistemleriışık mikroskobu ile görülen ROI koordinatlarını oring ve şimdi pazarlanmaktadır elektron mikroskobu bu transfer ve büyük ölçüde bu prosedürü kolaylaştırmak istiyorum.
Biz immünositokimyasal çalışmaları için sunduk CLEM yaklaşımının yarar, yani ağır metal boyama ve epoksi reçine gömme kaçınılmaz mevcut epitopları maskeleme, kullanılan numune hazırlama yöntemi ile sınırlı zorunluluk gereğidir. Ancak, teknik patoloji örneklerinden floresan ve TEM verileri elde önemli yararı izin vermiyor. Tek bir örnek kullanarak farklı mikroskopi modaliteleri gelen yapısal ve işlevsel bilgi edinme genellikle öncelikle tanı amaçlı işlendi insan patoloji hücre ve doku çalışmaları için kullanılabilir olmamıştır şeydir.
Daha hassas bir immünositokimyasal lokalizasyonu dondurularak sabitleme yaklaşımı yerine, bir protokol B elde edilebileceği beklenmektedirkimyasal sabitleme üzerinde ased. Cryofixation ilkelerinin benimsenmesi klasik Tokuyasu tekniği 18'deki gibi cryoultramicrotomy ve oda sıcaklığında QD bazlı immunolabeling ardından insan dokusunun biobanking için, 19, insan hastalığının patogenezinde duyarlı ve spesifik bağıntılı immünositokimyasal çalışmaları kolaylaştıracaktır 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium cacodylate | Proscitech | C0205 | Harmful chemical |
| Osmium tetroxide | Proscitech | C010 | Use only in fume hood |
| Uranyl acetate | Univar-Ajax | 569 | Hazardous chemical |
| Ethanol 100% | Fronine | JJ008 | |
| Acetone 100% | Fronine | JJ006 | |
| ERL 4221 | Proscitech | C056 | |
| DER 732 | Proscitech | C047 | |
| NSA | Proscitech | C059 | |
| DMAE | Proscitech | C050 | |
| Sodium metaperiodate | Analar BDH | 10259 | |
| anti-somatostatin antibody | Dako | A0566 | |
| Antibody diluent | Dako | S3022 | |
| Qdot 585 Streptavidin Conjugate | Invitrogen | Q10113MP | |
| Biotinylated goat anti-rabbit IgG antibody | Sigma | B7389-1ML | |
| Glutaraldehyde 50% | EMS | 16320 | |
| Normal goat serum | Invitrogen | PCN5000 | |
| PBS "Dulbecco A" | Oxoid | BR0014G | |
| BSAc (10%) | Aurion | 900.022 | |
| Parafilm | Pechiney PP | M | |
| pH indicator strips (pH 2.0 - 9.0) | Merck | 1.09584.0001 | |
| Micromoulds | Proscitech | RL063 | |
| Diamond knife | Diatome | Ultra 45 | |
| Transmission electron microscope | FEI | Morgagni 268D | |
| Fluorescence light microscope | Carl Zeiss | Axioscope A1 | |
| Grids 300 mesh nickel (thin bar) | Agar Scientific | G2740N | |
| Ultramicrotome | RMC | Powertome | |
| TEM camera control software | Soft Imaging System | AnalySIS | Version 3.0 |
| Image processing software | Adobe Systems Incorporated | Photoshop CS2 |
References
- Kukulski, W., Schorb, M., Welsch, S., Picco, A., Kaksonen, M., Briggs, J. A. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).
- Introduction to correlative light and electron microscopy. Methods Cell Biol. Müller-Reichert, T., Verkade, P. , (2012).
- De Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: ultrastructure lights up! Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).
- Faas, F. G., et al. Localization of fluorescently labeled structures in frozen-hydrated samples using integrated light electron microscopy. J Struct Biol. 181 (3), 283-290 (2013).
- Redemann, S., Müller-Reichert, T. Correlative light and electron microscopy for the analysis of cell division. J Microsc. 251 (2), 109-112 (2013).
- Spiegelhalter, C., et al. From dynamic live cell imaging to 3D ultrastructure: novel integrated methods for high pressure freezing and correlative light-electron microscopy. PLoS One. 5 (2), e9014 (2010).
- Killingsworth, M. C., Lai, K., Wu, X., Yong, J. L., Lee, C. S. Quantum dot immunocytochemical localization of somatostatin in somatostatinoma by widefield epifluorescence, super-resolution light, and immunoelectron microscopy. J Histochem Cytochem. 60 (11), 832-843 (2012).
- Nisman, R., Dellaire, G., Ren, Y., Li, R., Bazett-Jones, D. P. Application of quantum dots as probes for correlative fluorescence, conventional, and energy-filtered transmission electron microscopy. J Histochem Cytochem. 52 (1), 13-18 (2004).
- Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using quantum dots. Nat Methods. 2 (10), 743-749 (2005).
- Kuipers, J., de Boer, P., Giepmans, B. N. Scanning EM of non-heavy metal stained biosamples: Large-field of view, high contrast and highly efficient immunolabeling. Exp Cell Res. 337 (2), 202-207 (2015).
- Barroso, M. M.
- Michalet, X., et al. Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics. Science. 5, 538-544 (2005).
- Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues and organisms. PLoS Biol. 9 (4), e1001041 (2011).
- Thomas, J. M., Midgley, P. A. High-resolution transmission electron microscopy: the ultimate nanoanalytical technique. Chem Commun. , 1253-1267 (2004).
- Loussert Fonta, C., Humbel, B. M.
- Marc, R. E., Liu, W. Fundamental GABAergic amacrine cell circuitries in the retina: nested feedback, concatenated inhibition, and axosomatic synapses. J Comp Neurol. 425 (4), 560-582 (2000).
- Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochem Cell Biol. 130 (5), 877-889 (2008).
- Tokuyasu, K. T.
- Loussert Fonta, C., et al. Analysis of acute brain slices by electron microscopy: a correlative light-electron microscopy workflow based on Tokuyasu cryo-sectioning. J Struct Biol. 189 (1), 53-61 (2015).
